nghiên cứu hệ gen của virus cúm ah5n1 phân lập từ gà nuôi tại hậu giang tóm tắt

1
MỞ ðẦU

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ðỀ TÀI
Bệnh cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc ñộ lây
lan nhanh, với tỷ lệ chết cao trong ñàn gia cầm nhiễm bệnh do các phân
týp (subtype) của nhóm virus cúm A (Influenza virus A) thuộc họ
Orthomyxoviridae gây ra. Bệnh gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho ngành
chăn nuôi của nhiều nước trên thế giới, và có khả năng lây nhiễm từ ñộng
vật sang người.
Bệnh cúm gia cầm do phân týp H5N1 xuất hiện lần ñầu tiên tại Việt
Nam năm 2003. Trong một thời gian rất ngắn, bệnh ñã lây lan trên toàn
bộ ñất nước, hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy, gây thiệt hại rất lớn
cho nền kinh tế quốc dân; và từ ñó ñến nay bệnh xảy ra liên tục trở thành
một vấn ñề dịch tễ phức tạp cần giải quyết tại nước ta.
Virus cúm A/H5N1 có hệ gen luôn biến ñổi, tái tổ hợp biến chủng và
thay ñổi cấu trúc kháng nguyên ñể thích ứng gây bệnh. Trình tự nucleotide hệ
gen là cơ sở ñể xác lập mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa của các biến chủng
virus cúm A/H5N1. Kết quả giải mã hệ gen là nguồn dữ liệu cung cấp thông
tin về nguồn gốc xuất xứ, sự tiến hóa của virus, giúp phát hiện những biến
chủng mới trong quần thể virus cúm gia cầm.
Thông qua việc giải mã hệ gen, so sánh, phân tích trình tự nucleotide
và amino acid có thể xác ñịnh những vùng gen thường biến ñổi, vùng gen
ổn ñịnh làm cơ sở dữ liệu gen học và protein học của các chủng H5N1
xuất hiện từ những năm ñầu tiên tại nước ta làm cơ sở lựa chọn loại
vaccine thích hợp trong công tác phòng chống dịch cúm gia cầm.
ðể có thêm nguồn gen của virus cúm A/H5N1 lưu hành tại Việt Nam, từ
ñó làm cơ sở dữ liệu cho những nghiên cứu về gen/hệ gen của virus cúm
A/H5N1 và nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học thế hệ mới ứng dụng
trong chẩn ñoán và phòng bệnh, chúng tôi tiến hành ñề tài: Nghiên cứu hệ
gen của virus cúm A/H5N1 phân lập từ gà nuôi tại Hậu Giang.

MỤC TIÊU CỦA ðỀ TÀI
(1) Giải mã ñược toàn bộ hệ gen gồm 8 phân ñoạn của một chủng
virus cúm A/H5N1 từ gà nuôi tại Hậu Giang.
(2) Phân tích ñược một số ñặc ñiểm sinh học phân tử của hệ gen
nhằm thu ñược thêm dữ liệu làm cơ sở cho nghiên cứu vaccine
phòng bệnh hiệu quả.
2
Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI
- ðây là luận án nghiên cứu khá ñầy ñủ, có hệ thống về sinh học phân
tử hệ gen virus cúm A/H5N1 ở gà nuôi tại Hậu Giang.
- Luận án là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho giảng dạy và nghiên
cứu khoa học về virus cúm A/H5N1.
Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ðỀ TÀI
- Kết quả nghiên cứu của ñề tài giúp hiểu biết thêm về tính ña dạng
của virus cúm. Trên cơ sở ñó góp phần xây dựng phương pháp chẩn ñoán
và lựa chọn vaccine phòng bệnh phù hợp.
- Kết quả nghiên cứu của ñề tài góp phần làm sáng tỏ thêm mối quan
hệ nguồn gốc phả hệ của virus cúm A/H5N1 phân lập trong những năm
ñầu tiên dịch xuất hiện ở vùng ñồng bằng sông Cửu Long.
NHỮNG ðÓNG GÓP MỚI CỦA ðỀ TÀI
(1) Giải trình tự và nghiên cứu hoàn chỉnh, có hệ thống hệ gen của
một chủng virus cúm A/H5N1 thuộc thể ñộc lực cao (HPAI) phân lập từ
gà tại Hậu Giang năm 2005 (ký hiệu chủng là CkHG4) trong ñợt dịch
cúm gia cầm lần ñầu tiên xuất hiện ồ ạt ở Việt Nam.
(2) ðã phân tích ñặc ñiểm gen học hệ gen/gen của chủng CkHG4, bao
gồm trình tự nucleotide/amino acid, cấu trúc, ñồng nhất/tương ñồng; so
sánh với các chủng trong vùng và thế giới.
(3) ðã làm sáng tỏ mối quan hệ phả hệ, nguồn gốc và tương quan
gen/hệ gen của virus cúm A/H5N1 cường ñộc dòng Quảng ðông (chủng
CkHG4), góp phần hiểu biết thêm về virus cúm A/H5N1 gây bệnh và

ñóng góp dữ liệu cho ñối chiếu với các vaccine sử dụng tại Việt Nam.
(4) ðã khảo sát và xác ñịnh ñược các cặp mồi sử dụng có hiệu quả ñể
thu nhận và giải trình tự hệ gen của virus cúm A/H5N1 thuộc những phân
dòng lần ñầu tiên xuất hiện và hiện còn lưu hành tại Việt Nam.
BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN:
luận án gồm 159 trang (không kể phần phụ
lục), chia thành các phần như sau: Mở ñầu (3 trang), Chương 1: Tổng
quan tài liệu (52 trang), Chương 2: Nội dung, nguyên liệu và phương
pháp nghiên cứu (14 trang), Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận
(66 trang), Kết luận và kiến nghị (2 trang), Các công trình ñã công bố liên
quan ñến luận án (1 trang), Tài liệu tham khảo (21 trang). Luận án có 31
bảng biểu, 28 hình minh họa. Tổng số tài liệu tham khảo là 170, gồm 32
tài liệu tiếng Việt, 138 tài liệu tiếng Anh (có 3 trang web).
3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 ðẠI CƯƠNG VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM
Cúm gia cầm (avian influenza) là bệnh truyền nhiễm cấp tính, do
nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. ðây là nhóm virus
có biên ñộ chủ rộng, ñược phân chia thành nhiều phân týp khác nhau dựa
trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus. Nhóm
virus cúm A có 16 phân týp HA (từ H1 ñến H16) và 9 phân type NA (từ
N1 ñến N9).
Dịch cúm gia cầm do virus cúm A phân týp H5N1 thể ñộc lực cao
xuất hiện ở vùng Quảng ðông, Trung Quốc năm 1996 và ñã lan ra hơn 60
nước trên thế giới ở châu Á, châu Âu và châu Phi, ñược chứng minh là có
khả năng lây nhiễm từ ñộng vật sang người. Bệnh cúm gia cầm A/H5N1
lần ñầu tiên xuất hiện tại Việt Nam vào cuối năm 2003, từ ñó ñến nay
bệnh xảy ra liên tục, ñang là vấn ñề dịch tễ phức tạp do xuất hiện nhiều
phân dòng virus mới và là dịch bệnh cần phải giải quyết tại nước ta.

1.2. HỆ GEN CỦA VIRUS CÚM A
Hệ gen virus cúm A là RNA sợi ñơn âm, bao gồm 8 phân ñoạn gen riêng
biệt mang tên từ 1-8, mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus gồm: PB2,
PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS (NS1 và NS2).
Các phân ñoạn 1, 2 và 3 là những phân ñoạn mã hoá tổng hợp các
enzym trong phức hợp polymerase (RNA transcriptase) của virus, có ñộ
dài ổn ñịnh và có tính bảo tồn cao bao gồm:
- Phân ñoạn 1 (gen PB2) mã hoá tổng hợp protein enzym PB2, có
kích thước 2341 bp.
- Phân ñoạn 2 (gen PB1) cũng có kích thước 2341 bp, mã hoá tổng
hợp enzym PB1.
- Phân ñoạn 3 (gen PA) là phân ñoạn gen bảo tồn cao, mã hoá tổng
hợp protein enzym PA, có kích thước 2233 bp.
Các phân ñoạn 4 và 6 mã hoá cho các protein (HA và NA) bề mặt
capsid của virus, có tính kháng nguyên ñặc trưng theo từng chủng virus
cúm A, bao gồm:
- Phân ñoạn 4 (gen HA) có ñộ dài thay ñổi tùy theo từng chủng virus
cúm A (ở A/H1N1 là 1778 bp, ở H9N1 là 1714 bp, ở H5N1 là khoảng
1704 - 1707 bp). ðây là gen chịu trách nhiệm mã hoá tổng hợp protein
HA - kháng nguyên bề mặt của virus cúm.
- Phân ñoạn 6 (gen NA) là gen mã hóa tổng hợp protein NA, kháng
nguyên bề mặt capsid của virus, có chiều dài thay ñổi theo từng chủng
4
virus cúm A (ở A/H1N1 là 1413 bp, ở A/H5N1 thay ñổi khoảng từ 1350 -
1410 bp).
Các phân ñoạn gen M, NP và NS mã hóa tổng hợp các protein chức
năng khác nhau của virus, có ñộ dài tương ñối ổn ñịnh giữa các chủng
virus cúm A, bao gồm:
- Phân ñoạn 5 (gen NP) mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP), kích
thước khoảng 1565 bp.

- Phân ñoạn 7 (gen M) có kích thước khoảng 1027 bp, mã hoá cho
protein ñệm (matrix protein) gồm hai tiểu phần là M1 và M2 ñược tạo ra
bởi những khung ñọc mở khác nhau của cùng một phân ñoạn RNA.
- Phân ñoạn 8 (gen NS) là gen mã hoá protein không cấu trúc, có ñộ
dài ổn ñịnh nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp,
mã hoá tổng hợp hai protein là NS1 và NS2.
Như vậy, virus cúm A (cụ thể: cúm A/H5N1) có hệ gen ñược cấu trúc
từ 8 phân ñoạn riêng biệt và không có gen mã hóa enzym sửa chữa RNA,
tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện các ñột biến ñiểm trong các phân
ñoạn gen/hệ gen qua quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao ñổi
các phân ñoạn gen giữa các chủng virus cúm ñồng nhiễm trên cùng một tế
bào, rất có thể dẫn ñến thay ñổi ñặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng
virus cúm A mới.
1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS CÚM
A/H5N1 TẠI VIỆT NAM
Nghiên cứu ñặc tính sinh học phân tử (ñịnh týp, biến ñổi di truyền và gen
học tiến hoá) của virus gây bệnh cúm gia cầm H5N1 ñược các cơ quan
nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ những tháng ñầu tiên xảy ra dịch
cúm gia cầm cuối năm 2003. Các chuỗi gen giúp xác ñịnh phân týp H5, phân
týp N1 và các gen cấu trúc ñã ñược Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh,
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Trung tâm chẩn
ñoán thú y trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen.
Các nhà khoa học Việt Nam kết hợp nghiên cứu với các tổ chức thế
giới xây dựng các phương pháp chẩn ñoán, phát hiện nhanh virus gây
bệnh, phân biệt cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác,
cũng như phân biệt các phân týp HA và NA. Các phương pháp phát hiện
nhanh virus cúm A/H5N1 và các phân týp khác bao gồm việc sử dụng
kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học phân tử cũng ñã ñược xây
dựng. Các nhà khoa học Việt Nam ñã có những ñóng góp nhất ñịnh trong
lĩnh vực nghiên cứu vaccine và miễn dịch. Những chế phẩm kháng nguyên,

vaccine di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợp trên nền virus cúm A/H5N1
của Việt Nam cũng ñã ñược tạo ra.
5
Những kết quả nghiên cứu về cúm A/H5N1 ở gia cầm và người trên
nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam ñã và ñang làm sáng tỏ thêm về
mối quan hệ tiến triển bệnh học lây nhiễm, dịch tễ học phân tử, phát triển
tiến hoá và genotype, và kháng nguyên-miễn dịch-vaccine của cúm gia
cầm tại Việt Nam.
CHƯƠNG 2
NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
ðối tượng nghiên cứu của ñề tài là virus cúm A/H5N1 từ gà mắc bệnh
cúm gia cầm nuôi tại tỉnh Hậu Giang, Việt Nam, phân lập năm 2005.
2.2 ðỊA ðIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
ðề tài ñược tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học
và Công nghệ Việt Nam).
Thời gian thực hiện ñề tài: từ tháng 10/2005 ñến tháng 10/2009.
2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.3.1 Giải trình tự toàn bộ hệ gen chủng virus cúm A/H5N1 (CkHG4)
phân lập từ gà Hậu Giang
- Giải trình tự gen kháng nguyên HA và NA
- Giải trình tự gen polymerase PB2, PB1 và PA
- Giải trình tự các gen NP, M và NS
2.3.2 Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả
hệ chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới
- Phân tích thành phần nucleotide và amino acid.
- Phân tích ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid.
- Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ.
2.4 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu nghiên cứu là dịch khí quản - phế quản chứa virus cường

ñộc cúm A/H5N1 thu nhận từ gà bị bệnh tại Hậu Giang năm 2005 (ký hiệu
chủng: A/Ck/Vietnam/HG4/2005(H5N1), viết tắt CkHG4). Bệnh phẩm ñã
ñược vô hoạt ở nhiệt ñộ 100
o
C trong 30 giây, ñảm bảo an toàn sinh học, bảo
quản ở -20
o
C cho ñến khi sử dụng ñể tách RNA tổng số.
2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Sử dụng bộ sinh phẩm QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN) ñể tách
RNA tổng số theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.5.2 Phương pháp RT-PCR
Chúng tôi sử dụng phản ứng RT-PCR một bước (QIAGEN) ñể thu
nhận các phân ñoạn gen của virus cúm A/H5N1.
6
2.5.3 Phương pháp kiểm tra sản phẩm RT-PCR
Sản phẩm RT-PCR ñược kiểm tra bằng cách ñiện di ở 100-120V, 400
mA trong 25-30 phút trên thạch agarose 1%. Chỉ thị DNA sử dụng trong
nghiên cứu là DNA thực khuẩn thể Lamda, có kích thước 43 kb, ñược
cắt bằng enzym giới hạn HindIII.
2.5.4 Phương pháp dòng hóa
Sản phẩm PCR/RT-PCR tinh sạch ñược dòng hóa vào vector là pCR2.1
hay pCR2.1TOPO (Invitrogen).
2.5.5 Phương pháp giải trình tự
Sản phẩm giải trình tự sau khi tinh sạch, ñược ñông khô và ñọc trình
tự trên máy tự ñộng ABI-3100 Avant Genetic Analyzer (Mỹ).
2.5.6 Phương pháp xử lý số liệu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xử lý giản ñồ chromatogram của
chuỗi nucleotide thô bằng chương trình SeqEd1.03, sau ñó sử dụng chương

trình AsemblyLIGN1.9 ñể so sánh các chuỗi, phân tích thành phần
nucleotide và amino acid hoặc các ñặc tính gen và polypeptide bằng hệ
chương trình MacVector8.2 (Accelrys Inc.) trên máy tính Macintosh. Các
chuỗi nucleotide hay amino acid ñược sắp xếp và tính toán mức ñộ tương
ñồng bằng chương trình GeneDoc 2.5; phân tích và xây dựng phả hệ bằng
chương trình MEGA4.0.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 KẾT QUẢ GIẢI MÃ HỆ GEN VIRUS CÚM A/H5N1 CHỦNG CkHG4
3.1.1 Giải trình tự gen H5 (HA)
ðể thu nhận gen kháng nguyên H5 (HA) của chủng CkHG4 chúng tôi sử
dụng phương pháp RT-PCR trực tiếp với khuôn là RNA tổng số có chứa
RNA hệ gen của virus cúm A/H5N1.

Plasmid tái tổ hợp sau khi giải trình tự chúng tôi thu ñược chuỗi gen H5
(HA) gồm 1707 nucleotide của chủng CkHG4 và ñăng ký trong Ngân hàng
gen số EF051513.
3.1.2 Giải trình tự gen N1 (NA)
DNA plasmid tái tổ hợp ñược giải trình tự, thu nhận chuỗi DNA của
gen N1 (NA) chủng CkHG4 gồm 1350 nucleotide và ñăng ký trong Ngân
hàng gen số EF057803.
3.1.3 Giải trình tự gen PB2
Phân ñoạn 1 của hệ gen virus cúm A/H5N1 mã hóa cho protein PB2
gồm 759 amino acid. Do phân ñoạn 1 có kích thước 2355 bp nên không
thể bằng một phản ứng RT-PCR ñể nhân lên ñược mà phải thực hiện 2
phản ứng RT-PCR thu 2 ñoạn lồng vào nhau. Cặp mồi PB2F-PB2R1
7
ñược sử dụng ñể thu nhận ñoạn ñầu và cặp mồi PB2F3-PB2R dùng ñể thu
nhận ñoạn sau của phân ñoạn 1 (gen PB2). Sản phẩm cuối cùng gồm 2
ñoạn DNA: phần ñầu của phân ñoạn 1 có kích thước khoảng 1kb (cặp mồi

PB2F-PB2R1), và phần sau của phân ñoạn 1 có ñộ dài khoảng 1,4 kb (cặp
mồi PB2F3-PB2R).

DNA plasmid tái tổ hợp sau ñó ñược giải trình tự, sắp xếp nối chuỗi và
phân tích bằng các chương trình tin-sinh học chuyên biệt, chúng tôi thu ñược
chuỗi DNA của gen PB2 gồm 2280 nucleotide.
3.1.4 Giải trình tự gen PB1
Phân ñoạn 2 (gen PB1) của chủng CkHG4 ñược nhân lên bằng phản
ứng RT-PCR từ nguồn khuôn RNA tổng số, bằng 2 phản ứng sử dụng 2
cặp mồi PB1F1-PB1R2 và PB1F3-PB1R3. Phản ứng RT-PCR với cặp
mồi PB1F1-PB1R2 cho ñoạn DNA sản phẩm (ñầu phân ñoạn) có ñộ dài
1,7 kb. Kết quả phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi PB1F3-PB1R3 cho
sản phẩm 0,75 kb (cuối phân ñoạn), tổng ñộ dài của toàn bộ phân ñoạn 2
khoảng 2,35 kb ñã ñược thu nhận.
Các DNA plasmid tái tổ hợp ñược giải trình tự và chuỗi DNA của
phân ñoạn 2 chủng CkHG4 thu ñược chứa toàn bộ gen PB1 gồm 2274 bp.

3.1.5 Giải trình tự gen PA
Phân ñoạn 3 (gen PA) ñược nhân lên từ nguồn khuôn RNA tổng số
bằng các phản ứng RT-PCR sử dụng các cặp mồi thiết kế cho gen PA. Sản
phẩm cuối cùng của phản ứng RT-PCR bằng cặp mồi PAF-PAR là phần
ñầu của phân ñoạn 3 có ñộ dài khoảng 0,75 kb; với cặp mồi PAF2-PAR2 là
phần giữa của phân ñoạn có kích thước khoảng 1,2 kb và với cặp mồi
PAF3-PAR3 là phần sau của
phân ñoạn có ñộ dài khoảng 0,73 kb; tổng ñộ
dài của toàn bộ phân ñoạn 3 thu nhận ñược là khoảng 2,23 kb.
DNA plasmid tái tổ hợp của các clone ñược giải trình tự và thu ñược
chuỗi DNA của gen PA gồm 2151 nucleotide.
3.1.6 Giải trình tự gen NP
Phân ñoạn 5 chứa gen NP của virus cúm A/H5N1 chủng CkHG4

ñược nhân lên từ nguồn khuôn RNA tổng số bằng phản ứng RT-PCR sử
dụng cặp mồi NPF-NPR.
DNA plasmid tái tổ hợp của clone tương ứng ñược giải trình tự và
chúng tôi thu ñược chuỗi DNA của phân ñoạn 5 chủng CkHG4 chứa toàn
bộ gen NP gồm 1497 nucleotide.
3.1.7 Giải trình tự gen M
DNA plasmid chứa gen M1 và M2 sau khi giải trình tự, chúng tôi thu
ñược chuỗi DNA của phân ñoạn 7 gồm 2 gen M1 (759 bp) và M2 (294
bp).
8
3.1.8 Giải trình tự gen NS
Phân ñoạn 8 chứa gen NS của virus cúm A/H5N1 chủng CkHG4
ñược nhân lên bằng phản ứng RT-PCR từ nguồn khuôn RNA tổng số sử
dụng cặp mồi NSF1-NSR1.
DNA plasmid tái tổ hợp sau ñó ñược giải trình tự và thu nhận ñược
chuỗi DNA của phân ñoạn 8 chứa 2 gen NS1 gồm 678 bp và NS2 gồm
366 bp.
3.2 PHÂN TÍCH SO SÁNH THÀNH PHẦN GEN, MỐI QUAN HỆ NGUỒN
GỐC PHẢ HỆ CỦA CHỦNG CkHG4 VỚI CÁC CHỦNG CỦA VIỆT NAM VÀ
THẾ GIỚI

3.2.1 Phân tích gen H5
3.2.1.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid
Trình tự nucleotide và amino acid gen H5 của chủng CkHG4 ñược so
sánh với 26 chủng cúm A/H5N1 thuộc phân dòng Quảng ðông và phân
dòng Phúc Kiến của Việt Nam và thế giới phân lập trong các năm 2003-
2009. Kết quả so sánh, phân tích cho thấy:
- Gen H5 của virus cúm A/H5N1 chủng CkHG4 có kích thước 1707
bp, mã hóa cho 568 amino acid, khởi ñầu bằng bộ mã ATG (methionine)
và kết thúc bằng bộ mã TAA.

- Chuỗi nucleotide và polypeptide gen H5 chủng CkHG4 có cùng
kích thước với gen tương ứng của các chủng thuộc phân dòng Quảng
ðông là 1707 bp và 568 amino acid so với 1704 bp (thiếu hụt 3
nucleotide) và 567 amino acid (thiếu hụt 1 amino acid) của các chủng
phân dòng Phúc Kiến.
- Chủng CkHG4 có tổng cộng 363 vị trí sai khác nucleotide với các
chủng so sánh, chủ yếu là ñột biến ñồng hoán (transition) (ñột biến xảy ra
giữa các base trong cùng nhóm purine hay pyrimidine với nhau, giữa A và G
hoặc C và T).
- Gen H5 của chủng CkHG4 có 15 vị trí sai khác nucleotide với hầu
hết các chủng so sánh và 10 nucleotide sai khác so với các chủng cùng phân
lập ở vùng Hậu Giang (thứ tự 2-5) tại các vị trí 159, 415, 445, 582, 676, 677,
933, 945, 1170 và 1494.
Trong tổng số 363 sai khác về nucleotide của chủng CkHG4 với các
chủng so sánh có một số sai khác không làm thay ñổi amino acid, nhưng
một số sai khác ñã làm biến ñổi bộ mã của amino acid dẫn ñến thay ñổi
amino acid tại 104 vị trí. Do ñó có thể ảnh hưởng ñến tính kháng nguyên -
miễn dịch và tính gây bệnh của các chủng ñó.
- Chuỗi polypeptide H5 của chủng CkHG4 có 5 vị trí sai khác về
amino acid với tất cả các chủng so sánh tại các vị trí: F11V, I242M,
9
R275K, T325N và V512A (
Bảng 3.1).
- Thành phần chuỗi polypeptide nối giữa HA
1
và HA
2
của chủng
CkHG4 bao gồm các amino acid RRRKK, và motif này không biến ñổi
qua các năm 2003–2009 ở hầu hết các chủng thuộc phân dòng Quảng

ðông. Ở các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến chuỗi nối này bị xóa 1
amino acid (K) do ñột biến mất ñi 3 nucleotide (AAG) trong trình tự
chuỗi nối của gen H5.
Bảng 3.1: So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide H5
giữa 27 chủng virus cúm
Vị trí sai khác về amino acid Chủng
8 11 102 110 140 156 171 191 228 242 243 275 279 285 298 325 326 512 529
1
F F V D S K S M R I E R T L I T R V I
2
F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
3
F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
4
F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
5
F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
6
F V V D S K S L R M E K T L M N R A I
7
L V A D N R S L K M E K A L M N R A T
8
F V V D S K S L R M E K T L M N R A I
9
F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
10
F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
11
F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
12

F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
13
F V V D S K S M R M E K T L M N R A I
14
F V V V S K S I R M E K T L M N R A I
15
F V V V S K S M R M E K T L V N R A I
16
L I A N N N N L K M D K A L I N R A T
17
L T A N E R D L K M E K T L M N K S T
18
L T A N D R D L K M E K T L V N R S T
19
L V A N D T N L K M D K A V I N K A T
20
L V A N D T N L K M D K A V I N K A T
21
I V A N D S N L K M D K A V M N K A T
22
L I A D D V N L K M D K A V I N K A T
23
L I A N D V N L K M D K A V I N K A T
24
L V A N D S N L K M D K A V M N K A T
25
F V A N D N N L K I D K T V M N K A T
26
L V A N D T N L K M D K A V M N K A T
27

L V A N D T N L K M D E A V M N K A T
Ghi chú: Các chủng ñược ñánh số thứ tự từ 1 ñến 5 là các chủng phân lập ở
vùng Hậu Giang, 1-18 là các chủng thuộc phân dòng Quảng ðông, 19-27 là các
chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến.
- Chuỗi polypeptide H5 của chủng CkHG4 và các chủng so sánh có 7
vị trí glycosyl hóa, bao gồm 5 vị trí trên HA
1
và 2 vị trí trên HA
2
. Không
có sự khác biệt về các vị trí liên quan ñến khả năng glycosyl hóa của
Ch
ủng
10
chuỗi protein H5 giữa hầu hết các chủng thuộc phân dòng Quảng ðông.
Protein H5 của các chủng phân dòng Phúc Kiến chỉ có 6 vị trí glycosyl
hóa tương ứng với các chủng phân dòng Quảng ðông. ðã có sự thay thế
amino acid S (vị trí 171) thành N ở các chủng phân dòng Phúc Kiến tại vị
trí thứ III (170 -172) ñể chuyển từ motif NST ở các chủng phân dòng
Quảng ðông tạo thành motif NNT ở các chủng phân dòng Phúc Kiến.
3.2.1.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid
Trình tự nucleotide gen H5 của 27 chủng cúm A/H5N1 so sánh
ñược ñưa vào chương trình GeneDoc2.5 ñể phân tích sự ñồng nhất
(identity) về thành phần nucleotide và tương ñồng (homology) về amino
acid. Kết quả phân tích cho thấy:
- So sánh giữa các chủng vùng Hậu Giang với nhau, tỷ lệ ñồng nhất
nucleotide và tương ñồng amino acid biến ñộng ít (96-98%). Mức ñộ
ñồng nhất và tương ñồng cao nhất là 98%, thấp nhất là 96%.
- So sánh các chủng phân dòng Quảng ðông với nhau, tỷ lệ ñồng nhất
và tương ñồng biến ñộng rất lớn, 91-99% về nucleotide và 87-100% về

amino acid, chủ yếu là do có sự biến ñộng lớn giữa các chủng phân lập
năm 2003-2007 với 3 chủng phân lập năm 2008-2009.
- So sánh các chủng phân dòng Phúc Kiến với nhau, tỷ lệ ñồng nhất
nucleotide biến ñộng rất lớn (94-99%); tương tự, tỷ lệ tương ñồng amino
acid cũng phản ánh ñúng mức ñộ biến ñổi lớn (94-100%).
- Tỷ lệ ñồng nhất nucleotide và tương ñồng amino acid của các chủng
phân dòng Quảng ðông so với các chủng phân dòng Phúc Kiến là rất thấp,
90-96% về nucleotide và 88-96% về amino acid.
3.2.1.3 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ
Gen hemagglutinin HA (H5) thu nhận từ chủng CkHG4 ñược ñưa vào
phân tích phả hệ cùng với 54 chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
giới phân lập qua các năm 1996-2011 (
Hình 3.1).
Hình 3.1 cho thấy, chủng CkHG4 tập hợp trong cùng một nhóm với
các chủng cúm A/H5N1 phân lập ở phía Nam của Việt Nam giai ñoạn
2004-2007, ñó là: Ck-VN-DT-171-04 (DQ099759), Ck-VN-TG-023-04
(DQ099758), Dk-VN-HG680F-05 (ISDN230184), Ck-VN-LA636-05
(ISDN230180), Dk-VN-1231-05 (CY029519), Dk-VN-1771-05
(CY029551), Ck-VN-29-07 (CY029631); và một số chủng phân lập từ
Thái Lan là Ck-TL-NIAH7618-04 (AB450562), Ck-Uthaithani-05
(FJ265572), Ck-TL-CU-354-08 (CY047457). ðiều này cho phép nhận xét,
có thể các chủng cúm A/H5N1 từ gia cầm Hậu Giang, ðồng Tháp, Tiền
Giang, Long An, Sóc Trăng là có cùng nguồn gốc và thuộc nhóm di
11
truyền 1 (clade 1). ðây là các chủng thuộc phân dòng Quảng ðông,
genotype Z.
Hình 3.1 cũng cho thấy, các chủng phân lập ở phía Nam của Việt
Nam giai ñoạn 2008-2011, bao gồm Dk-VN-VL-NCVD080162-08, Dk-
VN-CT-NCVD-361-09, Ck-VN-ST-R6-2-10, Ck-VN-TG-R6-2819-11
cũng tạo thành một nhóm kháng nguyên phụ khác, ñược xác ñịnh thuộc

nhóm di truyền 1.1
.
























Hình 3.1: Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa chủng CkHG4 với các chủng
cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới trên cơ sở gen kháng nguyên H5 về
thành phần nucleotide và amino acid
MDk-VN-OIE-559-11

Ck-VN-TG-R6-2819-11
Dk-VN-VL-NCVD080162-08
Dk-VN-CT-NCVD-361-09
Ck-VN-ST-R6-2-10
Dk-VN-CaMau498-06
Dk-VN-BL-07-09-07
Ck-VN-15-07
Ck-VN-29-07
Dk-HG-07-12-07
Dk-VN-1771-05
Ck-VN-LA636-05
Dk-VN-HG680F-05
Dk-VN-1231-05
VN-CL2009-05
Ck-VN-NCVD12-05
Ck-VN-TG-023-04
Ck-VN-36-04
Ck-VN-HG4-05
Ck-VN-DT-171-04
Ck-TL-NIAH7618-04
Ck-Uthaithani-05
Ck-VN-5-03
Ck-TL-CU-354-08
Ck-VN-27-03
Ck-India-NIV96526-09
Ck-Bangladesh-418-09
Ck-HK-YU324-03
Ck-Indo-BL-03
Ck-Hunan-8-08
Ck-VN-20346-09

A-Hubei-1-10
Dk-VN-QT801-11
Ck-VN-10-05
Ck-Guangxi-3154-05
MDk-VN-1455-06
Ck-Guangxi604-05
Dk-HN-101-04
Ck-GY-3570-05
Dk-TL-KU-56-07
Dk-VN-37-07
Dk-VN-HaiPhong-208-06
Ck-Laos-1-08
Ck-Fujian-584-06
Dk-VN-50-07
VN-HN31242-07
Dk-PhuTho-07-92-07
Dk-VN-53-07
Ck-VN-Ncvd8-03
Dk-GD-07-2000
Gs-GD-1-96
A-HK-156-97
Ck-VN-NCVD-093-08
Ck-VN-NCVD-135-08
Ck-VN-NCVD-016-08
96
100
100
100
100
97

55
100
88
100
99
54
61
100
68
71
98
99
90
99
70
39
35
30
41
98
39
47
95
72
71
90
77
42
47
86

95
85
58
96
97
39
37
39
35
43
99
20
32
32
0.01
H5
Nucleotide
7
0
5
2.3.4
2.3.3
2.3.1
2.3.2
2.3.2.1
2.1
2.2
1
1.1
Dk-VN-CT-NCVD-361-09

Ck-VN-ST-R6-2-10
Dk-VN-VL-NCVD080162-08
MDk-VN-OIE-559-11
Ck-VN-TG-R6-2819-11
Dk-VN-BL-07-09-07
Ck-VN-15-07
Dk-VN-CaMau498-06
Ck-VN-29-07
Dk-HG-07-12-07
Dk-VN-1771-05
Ck-VN-LA636-05
Dk-VN-HG680F-05
Dk-VN-1231-05
VN-CL2009-05
Ck-VN-NCVD12-05
Ck-VN-HG4-05
Ck-VN-TG-023-04
Ck-VN-DT-171-04
Ck-VN-36-04
Ck-Uthaithani-05
Ck-TL-NIAH7618-04
Ck-VN-5-03
Ck-TL-CU-354-08
Ck-VN-27-03
Ck-HK-YU324-03
Ck-Indo-BL-03
Ck-India-NIV96526-09
Ck-Bangladesh-418-09
Dk-VN-HaiPhong-208-06
Ck-Laos-1-08

Ck-Fujian-584-06
Dk-TL-KU-56-07
Dk-PhuTho-07-92-07
Dk-VN-50-07
Dk-VN-53-07
VN-HN31242-07
Dk-VN-37-07
Dk-HN-101-04
Ck-GY-3570-05
MDk-VN-1455-06
Ck-Guangxi-3154-05
Ck-Guangxi604-05
Ck-VN-10-05
Ck-Hunan-8-08
Ck-VN-20346-09
A-Hubei-1-10
Dk-VN-QT801-11
Ck-VN-Ncvd8-03
Dk-GD-07-2000
Gs-GD-1-96
A-HK-156-97
Ck-VN-NCVD-093-08
Ck-VN-NCVD-135-08
Ck-VN-NCVD-016-08
93
100
91
72
99
66

98
82
51
27
48
40
23
39
88
65
50
32
80
58
43
61
81
65
57
21
24
31
62
74
21
79
28
31
59
60

76
61
46
35
57
23
18
15
56
99
17
21
0.02
H5
Amino acid
1.1
2.2
1
2.1
2.3.2.1
2.3.2
2.3.1
2.3.3
2.3.4
5
0
7
MDk-VN-OIE-559-11
Ck-VN-TG-R6-2819-11
Dk-VN-VL-NCVD080162-08

Dk-VN-CT-NCVD-361-09
Ck-VN-ST-R6-2-10
Dk-VN-CaMau498-06
Dk-VN-BL-07-09-07
Ck-VN-15-07
Ck-VN-29-07
Dk-HG-07-12-07
Dk-VN-1771-05
Ck-VN-LA636-05
Dk-VN-HG680F-05
Dk-VN-1231-05
VN-CL2009-05
Ck-VN-NCVD12-05
Ck-VN-TG-023-04
Ck-VN-36-04
Ck-VN-HG4-05
Ck-VN-DT-171-04
Ck-TL-NIAH7618-04
Ck-Uthaithani-05
Ck-VN-5-03
Ck-TL-CU-354-08
Ck-VN-27-03
Ck-India-NIV96526-09
Ck-Bangladesh-418-09
Ck-HK-YU324-03
Ck-Indo-BL-03
Ck-Hunan-8-08
Ck-VN-20346-09
A-Hubei-1-10
Dk-VN-QT801-11

Ck-VN-10-05
Ck-Guangxi-3154-05
MDk-VN-1455-06
Ck-Guangxi604-05
Dk-HN-101-04
Ck-GY-3570-05
Dk-TL-KU-56-07
Dk-VN-37-07
Dk-VN-HaiPhong-208-06
Ck-Laos-1-08
Ck-Fujian-584-06
Dk-VN-50-07
VN-HN31242-07
Dk-PhuTho-07-92-07
Dk-VN-53-07
Ck-VN-Ncvd8-03
Dk-GD-07-2000
Gs-GD-1-96
A-HK-156-97
Ck-VN-NCVD-093-08
Ck-VN-NCVD-135-08
Ck-VN-NCVD-016-08
96
100
100
100
100
97
55
100

88
100
99
54
61
100
68
71
98
99
90
99
70
39
35
30
41
98
39
47
95
72
71
90
77
42
47
86
95
85

58
96
97
39
37
39
35
43
99
20
32
32
0.01
H5
Nucleotide
7
0
5
2.3.4
2.3.3
2.3.1
2.3.2
2.3.2.1
2.1
2.2
1
1.1
MDk-VN-OIE-559-11
Ck-VN-TG-R6-2819-11
Dk-VN-VL-NCVD080162-08

Dk-VN-CT-NCVD-361-09
Ck-VN-ST-R6-2-10
Dk-VN-CaMau498-06
Dk-VN-BL-07-09-07
Ck-VN-15-07
Ck-VN-29-07
Dk-HG-07-12-07
Dk-VN-1771-05
Ck-VN-LA636-05
Dk-VN-HG680F-05
Dk-VN-1231-05
VN-CL2009-05
Ck-VN-NCVD12-05
Ck-VN-TG-023-04
Ck-VN-36-04
Ck-VN-HG4-05
Ck-VN-DT-171-04
Ck-TL-NIAH7618-04
Ck-Uthaithani-05
Ck-VN-5-03
Ck-TL-CU-354-08
Ck-VN-27-03
Ck-India-NIV96526-09
Ck-Bangladesh-418-09
Ck-HK-YU324-03
Ck-Indo-BL-03
Ck-Hunan-8-08
Ck-VN-20346-09
A-Hubei-1-10
Dk-VN-QT801-11

Ck-VN-10-05
Ck-Guangxi-3154-05
MDk-VN-1455-06
Ck-Guangxi604-05
Dk-HN-101-04
Ck-GY-3570-05
Dk-TL-KU-56-07
Dk-VN-37-07
Dk-VN-HaiPhong-208-06
Ck-Laos-1-08
Ck-Fujian-584-06
Dk-VN-50-07
VN-HN31242-07
Dk-PhuTho-07-92-07
Dk-VN-53-07
Ck-VN-Ncvd8-03
Dk-GD-07-2000
Gs-GD-1-96
A-HK-156-97
Ck-VN-NCVD-093-08
Ck-VN-NCVD-135-08
Ck-VN-NCVD-016-08
96
100
100
100
100
97
55
100

88
100
99
54
61
100
68
71
98
99
90
99
70
39
35
30
41
98
39
47
95
72
71
90
77
42
47
86
95
85

58
96
97
39
37
39
35
43
99
20
32
32
0.01
H5
Nucleotide
7
0
5
2.3.4
2.3.3
2.3.1
2.3.2
2.3.2.1
2.1
2.2
1
1.1
Dk-VN-CT-NCVD-361-09
Ck-VN-ST-R6-2-10
Dk-VN-VL-NCVD080162-08

MDk-VN-OIE-559-11
Ck-VN-TG-R6-2819-11
Dk-VN-BL-07-09-07
Ck-VN-15-07
Dk-VN-CaMau498-06
Ck-VN-29-07
Dk-HG-07-12-07
Dk-VN-1771-05
Ck-VN-LA636-05
Dk-VN-HG680F-05
Dk-VN-1231-05
VN-CL2009-05
Ck-VN-NCVD12-05
Ck-VN-HG4-05
Ck-VN-TG-023-04
Ck-VN-DT-171-04
Ck-VN-36-04
Ck-Uthaithani-05
Ck-TL-NIAH7618-04
Ck-VN-5-03
Ck-TL-CU-354-08
Ck-VN-27-03
Ck-HK-YU324-03
Ck-Indo-BL-03
Ck-India-NIV96526-09
Ck-Bangladesh-418-09
Dk-VN-HaiPhong-208-06
Ck-Laos-1-08
Ck-Fujian-584-06
Dk-TL-KU-56-07

Dk-PhuTho-07-92-07
Dk-VN-50-07
Dk-VN-53-07
VN-HN31242-07
Dk-VN-37-07
Dk-HN-101-04
Ck-GY-3570-05
MDk-VN-1455-06
Ck-Guangxi-3154-05
Ck-Guangxi604-05
Ck-VN-10-05
Ck-Hunan-8-08
Ck-VN-20346-09
A-Hubei-1-10
Dk-VN-QT801-11
Ck-VN-Ncvd8-03
Dk-GD-07-2000
Gs-GD-1-96
A-HK-156-97
Ck-VN-NCVD-093-08
Ck-VN-NCVD-135-08
Ck-VN-NCVD-016-08
93
100
91
72
99
66
98
82

51
27
48
40
23
39
88
65
50
32
80
58
43
61
81
65
57
21
24
31
62
74
21
79
28
31
59
60
76
61

46
35
57
23
18
15
56
99
17
21
0.02
H5
Amino acid
1.1
2.2
1
2.1
2.3.2.1
2.3.2
2.3.1
2.3.3
2.3.4
5
0
7
Dk-VN-CT-NCVD-361-09
Ck-VN-ST-R6-2-10
Dk-VN-VL-NCVD080162-08
MDk-VN-OIE-559-11
Ck-VN-TG-R6-2819-11

Dk-VN-BL-07-09-07
Ck-VN-15-07
Dk-VN-CaMau498-06
Ck-VN-29-07
Dk-HG-07-12-07
Dk-VN-1771-05
Ck-VN-LA636-05
Dk-VN-HG680F-05
Dk-VN-1231-05
VN-CL2009-05
Ck-VN-NCVD12-05
Ck-VN-HG4-05
Ck-VN-TG-023-04
Ck-VN-DT-171-04
Ck-VN-36-04
Ck-Uthaithani-05
Ck-TL-NIAH7618-04
Ck-VN-5-03
Ck-TL-CU-354-08
Ck-VN-27-03
Ck-HK-YU324-03
Ck-Indo-BL-03
Ck-India-NIV96526-09
Ck-Bangladesh-418-09
Dk-VN-HaiPhong-208-06
Ck-Laos-1-08
Ck-Fujian-584-06
Dk-TL-KU-56-07
Dk-PhuTho-07-92-07
Dk-VN-50-07

Dk-VN-53-07
VN-HN31242-07
Dk-VN-37-07
Dk-HN-101-04
Ck-GY-3570-05
MDk-VN-1455-06
Ck-Guangxi-3154-05
Ck-Guangxi604-05
Ck-VN-10-05
Ck-Hunan-8-08
Ck-VN-20346-09
A-Hubei-1-10
Dk-VN-QT801-11
Ck-VN-Ncvd8-03
Dk-GD-07-2000
Gs-GD-1-96
A-HK-156-97
Ck-VN-NCVD-093-08
Ck-VN-NCVD-135-08
Ck-VN-NCVD-016-08
93
100
91
72
99
66
98
82
51
27

48
40
23
39
88
65
50
32
80
58
43
61
81
65
57
21
24
31
62
74
21
79
28
31
59
60
76
61
46
35

57
23
18
15
56
99
17
21
0.02
H5
Amino acid
1.1
2.2
1
2.1
2.3.2.1
2.3.2
2.3.1
2.3.3
2.3.4
5
0
7
12
3.2.2 Phân tích gen N1
3.2.2.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid
Gen N1 thu nhận từ chủng CkHG4 có ñộ dài 1350 nucleotide, mã hóa
cho 449 amino acid, khởi ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã
TAG. Trình tự nucleotide và amino acid của gen N1 chủng CkHG4 ñược
so sánh với các chuỗi gen N1 tương ứng của 26 chủng Việt Nam và thế

giới phân lập qua các năm 2003-2009.
Bảng 3.2: So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide N1
giữa 27 chủng virus cúm
Vị trí sai khác về amino acid
Chủng
17 26 39 56 64 75 80 233 250 320 434
1
T V H N K N Y H N S G
2
T V H T K N Y H D S G
3
T V H N K N Y H D S G
4
T V H T K N Y H D S G
5
T V H T K N Y H D S G
6
T V H T K N Y H N S G
7
T L H T K N Y H D S G
8
T V H T K N Y H D S G
9
T I H T K N Y H D S G
10
T I H T K N Y H D S G
11
T V H T K N Y H D S G
12
T V N T K N Y H D S G

13
I I Q T T R H Y D P S
14
I I Q T T R H Y N P S
15
I I Q T T R H Y D H S
16
T V H T K N Y H D S G
17
T V H T K N Y H D S G
18
I I Q T T S H Y D P G
19
I I Q T T R H Y D P S
20
T I H T K N Y H D S G
21
T I H T K N Y H D S G
22
I I Q T T R H Y N P S
23
V I Q T T R H Y N P S
24
I V Q T T R H Y D P S
25
I I Q T T R H Y N P S
26
I I Q T T S H Y D L G
27
I I Q A T S Y Y D L S

Ghi chú: Các chủng ñược ñánh số thứ tự từ 1 ñến 5 là các chủng phân lập ở
vùng Hậu Giang, 1-18 là các chủng phân lập tại Việt Nam, 19-27 là các chủng
của thế giới.
Kết quả so sánh cho thấy, chủng CkHG4 có tổng cộng 262 vị trí sai khác
về nucleotide với các chủng so sánh. Các ñột biến chủ yếu xảy ra ở vùng 5’
của gen N1 và hầu hết là các ñột biến ñồng hoán (A↔G hoặc C↔T). Chủng
13
CkHG4 chỉ có 4 nucleotide sai khác với phần lớn các chủng Việt Nam và thế
giới ở các vị trí: 30, 167, 748 và 867. Trong ñó, sai khác ở 2 vị trí 167 và 748
là có dẫn ñến sai khác amino acid.
Các sai khác về nucleotide ñã làm biến ñổi tổng cộng 91 amino acid giữa
chủng CkHG4 với các chủng so sánh. Các biến ñổi lớn chủ yếu tập trung ở
vùng tận cùng N của 80 amino acid ñầu tiên. Mười một vị trí có biến ñổi lớn
về amino acid giữa các chủng so sánh ñược trình bày ở Bảng 3.2. Chuỗi
polypeptide N1 của chủng CkHG4 chỉ có 2 amino acid sai khác với phần lớn
các chủng so sánh ở 2 vị trí N56T và N250D (tương ứng với 2 vị trí sai khác
về nucleotide 167 và 784 trong gen N1).
Phân tích ñặc tính glycosyl hoá của protein N1 ở các chủng cúm
A/H5N1
Kết quả phân tích ñặc tính glycosyl hóa cho thấy, chuỗi polypeptide N1
của chủng CkHG4 và 26 chủng so sánh cùng có 3 vị trí glycosyl hóa. Vị trí I
có motif là NSS (amino acid 68-70), vị trí II là NGT (amino acid 126-128)
và vị trí thứ III là NGS (amino acid 214-216). ðiều này chứng tỏ, không có
sự biến ñổi vị trí có tiềm năng glycosyl hóa trong protein N1 ở các chủng
cúm A/H5N1 phân lập trong các năm 2003-2009.
3.2.2.2 Phân tích ñột biến “trượt–xoá” gen N1 qua thời gian tiến hóa
41 chủng virus cúm A/H5N1 phân lập trong 50 năm qua, trong ñó có
chủng CkHG4 do chúng tôi giải trình tự gen N1, ñược ñối chiếu so sánh
về thành phần nucleotide và amino acid của gen N1.
Các chủng so sánh ñược phân thành 3 nhóm chính: (i) nhóm các

chủng phân lập từ 1959 ñến trước 2003; (ii) nhóm các chủng phân lập từ
gia cầm và người ở Hồng Kông năm 1997; và (iii) nhóm các chủng phân
lập giai ñoạn 2003-2009 từ các vật chủ khác nhau, trong ñó có chủng
CkHG4 do chúng tôi phân lập.
Kết quả phân tích cho thấy, ñã có ñột biến xoá gen xảy ra trong các
chủng thuộc nhóm (ii) và (iii), nhưng bản chất của ñột biến có khác nhau.
Biến ñộng ñột biến xoá nucleotide xảy ra ở vùng nucleotide có vị trí 145-
213. Cụ thể:
- Các chủng cúm A/H5N1 thuộc nhóm (i) có gen N1 có ñộ dài 1410
nucleotide.
- Các chủng thuộc nhóm (ii) (phân lập ở Hồng Kông năm 1997) ñã có
ñột biến xoá ñi 57 nucleotide vị trí 157-213 từ các chủng nhóm (i).
- Các chủng thuộc nhóm (iii) có chuỗi gen N1 ngắn nhất, chỉ còn 1350
14
nucleotide do ñã có ñột biến xoá ñi 60 nucleotide ở các vị trí 145-204.
3.2.2.3 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid
Kết quả phân tích về thành phần nucleotide và tương ñồng
(homology) về amino acid cho thấy:
- Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng rất cao so với các
chủng phân lập từ vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2005, 99% về
thành phần nucleotide và amino acid.
- So sánh giữa chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam, tỷ lệ ñồng
nhất và tương ñồng có biến ñộng lớn hơn. Tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide
là 95-99% và tương ñồng về amino acid là 94-99%.
3.2.2.4 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ
Gen N1 của chủng CkHG4 do chúng tôi phân lập ñược ñưa vào phân
tích phả hệ cùng với 47 chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới.
Kết quả phân tích cho thấy, chủng CkHG4 tập hợp trong cùng một nhóm
với các chủng cúm A/H5N1 phân lập ở miền nam Việt Nam: Ck-VN-DT-
171-04 (DQ099759), Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758), VN-HG-178-04

(DQ094286), VN-HG-207-05 (DQ094292), Ck-VN-CT-018-04
(DQ094280). ðiều này cho thấy, các chủng cúm A/H5N1 từ người và gia
cầm Hậu Giang và các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu Long là có cùng
nguồn gốc, hoàn toàn giống như kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ sử
dụng gen H5.
3.2.3 Phân tích gen PB2
3.2.3.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid
Gen PB2 thu nhận từ chủng CkHG4 có ñộ dài 2280 bp, mã hóa cho 759
amino acid, khởi ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TAG. Trình
tự nucleotide và amino acid của gen PB2 ñược so sánh với 26 chủng cúm
A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 2004-2009.
Kết quả phân tích cho thấy, chủng CkHG4 có tổng cộng 455
nucleotide sai khác với các chủng so sánh. Chủng CkHG4 có 3 nucleotide
sai khác với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí: 365, 580, 2080; và cả
3 vị trí sai khác này ñều dẫn ñến thay ñổi amino acid.
Sai khác về nucleotide giữa chủng CkHG4 với các chủng so sánh dẫn
ñến thay ñổi thành phần amino acid tổng cộng ở 82 vị trí. Trong số ñó,
mười ba vị trí sai khác lớn ñược liệt kê ở
Bảng 3.3. Chủng CkHG4 có 3
amino acid sai khác với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí A122V,
K194Q và L694F (Bảng 3.3), tương ứng với 3 vị trí ñột biến nucleotide
15
như ñã phân tích ở trên.
Vị trí amino acid 627 ở protein PB2 ñược cho là có liên quan ñến tính
thích nghi nhiệt ñộ cơ thể loài vật chủ và ñộc lực của virus. Ở virus cúm
gia cầm vị trí này là glutamic acid (E), còn ở virus thích nghi trên người
là lysin (
Wasilenko và cs, 2008) [155]. Các chủng virus H5N1 ñộc lực cao
ñối với ñộng vật có vú, thành phần amino acid của PB2 có chứa lysin (K) ở
vị trí 627 hoặc tổ hợp 627E/701N (

Li và cs, 2010) [100]. Vị trí 627 ở
protein PB2 của chủng CkHG4 do chúng tôi phân lập là glutamic acid (E)
và amino acid ở vị trí 701 là asparatic acid (D).
Bảng 3.3: So sánh vị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide
PB2 giữa 27 chủng virus cúm
Vị trí có thay ñổi amino acid

Chủng
105 108 122 147 194 338 339 357 368 390 430 494 694
1
A A A I K V K H R D T V L
2
A A V V Q I K Y R D T I F
3
A A V V Q I K Y R D T I F
4
A A V I Q I K Y R D T I F
5
A A V I Q V K H R D T V L
6
A A V I Q V K H R D T V F
7
A A V I Q I K Y R D T I F
8
A A V I Q V K H R D T V F
9
A A V I Q V K H R D P V F
10
T T V T Q V T H Q N P V F
11

T T V T Q V T H Q N P V F
12
A A V I Q V K H R D T I F
13
A A V I Q I K Y R D T I F
14
T T V T Q V T H Q N P V F
15
T T V I Q V K H R D P V F
16
A A V I Q I K Y R D T I F
17
A A V I Q I K Y R D T I F
18
T T V T Q V A H Q N P V F
19
T T V V Q V K H R D P V F
20
T A V I Q V T H R D P V F
21
T T V T Q V T H Q N P V F
22
T T V T Q V T H Q N P V F
23
T A V I Q V T H R D P V F
24
T T V T Q V T H Q N P V F
25
T T V T Q V T H Q N P V F
26

T A V I Q V T H Q D P V F
27
T T V V Q V K H R D P V F
Ghi chú: Các chủng ñược ñánh số thứ tự từ 1 ñến 18 là các chủng phân lập
tại Việt Nam, 19-27 là các chủng của thế giới; 1-5 là các chủng phân lập ở vùng
Hậu Giang; 10, 11, 14, 15, 18 là các chủng phân lập ở miền Bắc.
16
3.2.3.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid
Kết quả phân tích sự ñồng nhất về thành phần nucleotide và tương
ñồng về amino acid cho thấy:
- Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng cao so với các
chủng phân lập từ vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2007, 97-99% cả 2
thành phần nucleotide và amino acid.
- Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide là 90-99% và tương
ñồng về amino acid là 96-99% so với các chủng của Việt Nam; 93-97%
về thành phần nucleotide và 97-98% về thành phần amino acid khi so với
các chủng của thế giới.
3.2.3.3 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ
Kết quả phân tích phả hệ sử dụng gen PB2 cho thấy, chủng CkHG4 với
các chủng cúm A/H5N1 phân lập ở miền Nam: Ck-VN-CT-018-04
(DQ094280), Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758) tập hợp trong cùng một
nhóm, chứng tỏ các chủng cúm A/H5N1 từ gia cầm Hậu Giang và các
tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu Long có thể cùng nguồn gốc, tương tự như
kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ sử dụng gen H5 và N1 trình bày ở
phần trước.
3.2.4 Phân tích gen PB1 và PB1-F2
3.2.4.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid
Toàn bộ gen PB1 thu nhận từ chủng CkHG4 có ñộ dài 2274 bp, mã
hoá cho chuỗi polypeptide PB1 gồm 757 amino acid, bộ mã khởi ñầu là
ATG và kết thúc bằng bộ mã TAG. Lồng vào trong chuỗi

nucleotide của
PB1, từ vị trí 95 ñến 367 là PB1-F2, có ñộ dài 273 bp bao gồm 90 amino
acid, khởi ñầu bằng bộ ba ATG và kết thúc bằng bộ ba TGA. Trình tự
nucleotide và amino acid gen PB1 và PB1-F2 ñược so sánh với 26 chủng
A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 2003-2009.
Kết quả phân tích cho thấy, gen PB1 của chủng CkHG4 có tổng cộng
428 vị trí sai khác về nucleotide với các chủng so sánh. Những thay ñổi
về nucleotide dẫn ñến sai khác về amino acid ở 62 vị trí, trong ñó có 8 vị
trí sai khác lớn. Chủng CkHG4 có sai khác hoàn toàn 4 amino acid trên
protein PB1 so với tất cả các chủng, cụ thể ở các vị trí
R206G, S306N,
M323T, L631F.
Gen PB1-F2 của chủng CkHG4 có tổng cộng 52 nucleotide (trong ñó
có 1 nucleotide sai khác với hầu hết các chủng của Việt Nam và thế giới ở
vị trí 131) và 41 amino acid sai khác với các chủng so sánh.
17
Chuỗi polypeptide PB1-F2 của chủng CkHG4 chỉ có một amino acid
sai khác so với hầu hết các chủng ở vị trí
K44R.
3.2.4.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino acid
Kết quả phân tích ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino
acid gen PB1 và PB1-F2 của chủng CkHG4 cho thấy:
ðối với gen PB1: Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng
cao so với các chủng Việt Nam giai ñoạn 2004-2007, 97-99% về
nucleotide và 98-99% về amino acid. ðối với các chủng của thế giới, mức
ñộ ñồng nhất và tương ñồng dao ñộng lớn hơn, tỷ lệ tương ứng là 91-98%
và 97-99%.
ðối với gen PB1-F2: Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide
và tương ñồng về amino acid với các chủng vùng Hậu Giang theo thứ tự
tương ứng là 99-100% và 97-100%, với các chủng Việt Nam khác là 97-

99% và 93-98%. Mức ñộ ñồng nhất và tương ñồng với các chủng thế giới
qua các năm 2003-2009 biến ñộng rất lớn: 90-99% về nucleotide và 75-
97% về amino acid.
Như vậy, chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide và tương
ñồng về amino acid cao so với một số chủng vùng Hậu Giang phân lập
qua các năm 2004-2007. Với các chủng phân lập càng về sau, mức ñộ
ñồng nhất và tương ñồng càng giảm.
3.2.4.3 Phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc
Kết quả phân tích phả hệ cho thấy, chủng CkHG4 với các chủng A/H5N1
phân lập ở miền Nam trong các năm 2004-2005: VN-HG-207-05
(DQ138165), Ck-VN-DT-171-04 (DQ138156), VN-HG-178-04
(DQ138160), Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758) tập hợp trong cùng một nhóm,
chứng tỏ các chủng virus cúm A/H5N1 từ người và gia cầm Hậu Giang và
các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu Long có thể cùng nguồn gốc.
3.2.5 Phân tích gen PA
3.2.5.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid
Toàn bộ gen PA của chủng CkHG4 có ñộ dài 2151 bp, mã hóa cho
716 amino acid, có bộ mã khởi ñầu là ATG, bộ mã kết thúc là TAG.
Trình tự nucleotide của gen PA này ñược so sánh với gen PA tương ứng
của 26 chủng A/H5N1 phân lập tại Việt Nam và thế giới trong các năm
2003-2009. Kết quả phân tích cho thấy, gen PA của chủng CkHG4 có:
- Tổng cộng 425 nucleotide sai khác với các chủng so sánh, trong ñó
có 10 nucleotide sai khác hoàn toàn so với hầu hết các chủng so sánh ở
18
các vị trí: 203, 205, 324, 444, 693, 1059, 1105, 1332, 2053, 2060; 11
nucleotide sai khác với 5 chủng miền Bắc và các chủng của thế giới ở các
vị trí: 51, 102, 342, 645, 808, 957, 1281, 1296, 1521, 1695, 1878.
Những thay ñổi về nucleotide trên ñây dẫn ñến sai khác amino acid ở
76 vị trí, trong ñó có 5 amino acid sai khác hoàn toàn so với hầu hết các
chủng so sánh ở các vị trí: L68P, Y69N, T369A, R685G, F687Y

. Mặc dù
chủng CkHG4 có ñến 11 nucleotide sai khác với các chủng miền Bắc và
thế giới, nhưng những sai khác này chỉ làm thay ñổi thành phần amino
acid ở một số chủng.

Nghiên cứu gần ñây cho thấy, các ñột biến T515A trong PA và Y436H
trong PB1 ñã làm mất tính gây bệnh của virus H5N1 (
Hulse-Post và cs,
2007
) [82], nhưng chỉ ñột biến riêng lẻ ở các amino acid này thì không ảnh
hưởng ñến ñộc lực của virus. Trong thành phần amino acid của chủng
CkHG4 và tất cả các chủng A/H5N1 lựa chọn so sánh, threonin (T) ở vị trí
515 phát hiện không biến ñổi qua các năm 2003-2009.
3.2.5.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino
acid
Kết quả phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino
acid cho thấy:
- Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng rất cao so với các
chủng phân lập từ vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2007, 98-99% về
thành phần nucleotide và 99% về thành phần amino acid.
- Chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng biến ñộng lớn hơn
khi so với các chủng của Việt Nam. Tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide là 92-
99% và tương ñồng amino acid là 96-99%; trong ñó với các chủng miền
Bắc là 92-97% và 96-98% (theo thứ tự tương ứng), với các chủng miền
Nam là 98-99% (cả 2 thành phần).
- ðối với các chủng thế giới, chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về
nucleotide là 90-97%, tương ñồng về amino acid là 96-98%.
3.2.5.3 Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ
Kết quả phân tích cho thấy, gen PA của chủng CkHG4 tập hợp trong
cùng một nhóm với các chủng A/H5N1 phân lập ở miền nam Việt Nam:

VN-HG-207-05 (DQ138186), VN-HG-178-04 (DQ099792), Ck-VN-DT-
171-04 (DQ099788), Ck-VN-CT-018-04 (DQ094280), Ck-VN-TG-023-
04 (DQ099758), chứng tỏ các chủng A/H5N1 phân lập từ người và gia
cầm vùng ñồng bằng sông Cửu Long có thể có cùng nguồn gốc, tương tự
như kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ trình bày ở phần trước.
19
3.2.6 Phân tích gen NP
3.2.6.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid
Toàn bộ gen NP thu nhận từ chủng CkHG4 có kích thước 1497 bp,
mã hóa cho 498 amino acid, có bộ mã khởi ñầu là ATG và bộ mã kết thúc
là TAA. Trình tự nucleotide và amino acid gen NP ñược so sánh, phân
tích với 26 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các
năm 2003-2009.
Kết quả phân tích cho thấy, gen NP của chủng CkHG4 có 7
nucleotide sai khác hoàn toàn so với hầu hết các chủng so sánh ở các vị
trí: 36, 105, 138, 606, 795, 816, 1269; 14 nucleotide sai khác với hầu hết
các chủng miền Bắc ở các vị trí: 51, 204, 231, 258, 273, 318, 324, 483,
507, 537, 549, 915, 1116, 1149; 1 nucleotide sai khác với các chủng
A/H5N1 vùng Hậu Giang và các chủng miền Nam khác ở vị trí 306.
Chuỗi polypeptide NP chủng CkHG4 chỉ sai khác hoàn toàn 1 amino
acid với tất cả các chủng so sánh ở vị trí M265I.
Như vậy, NP là gen ổn ñịnh nhất về thành phần nucleotide và amino
acid. Mặc dù có những biến ñổi nucleotide, nhưng hầu hết các ñột biến
này không làm thay ñổi thành phần amino acid của chuỗi polypeptide.
3.2.6.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino
acid
Kết quả phân tích sự ñồng nhất về thành phần nucleotide và tương
ñồng về amino acid cho thấy, chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương
ñồng với các chủng vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2007 là 96-99%;
96-99% cũng là tỷ lệ ñồng nhất và tỷ lệ tương ñồng của chủng CkHG4

với các chủng khác của Việt Nam. Nếu so với các chủng của thế giới thì
các tỷ lệ tương ứng sẽ là 92-97% và 98-99%.
Xét một cách tổng thể, mức ñộ ñồng nhất về thành phần nucleotide và
tương ñồng về thành phần amino acid của gen NP chủng CkHG4 với các
chủng Việt Nam và thế giới là tương ñối cao, ñặc biệt là thành phần amino
acid.
3.2.6.3 Phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc
Gen NP thu nhận từ chủng CkHG4 ñược ñưa vào phân tích phả hệ
cùng với 26 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới. Kết quả phân tích
cho thấy, chủng CkHG4 cùng với các chủng A/H5N1 phân lập ở miền
Nam: VN-HG-207-05 (DQ138186), VN-HG-178-04 (DQ099792), Ck-
VN-TG-023-04 (DQ099758) tập hợp trong cùng một nhóm, chứng tỏ các
chủng A/H5N1 từ người và gia cầm các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu
20
Long có cùng nguồn gốc.
3.2.7 Phân tích gen M
3.2.7.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid
Toàn bộ gen M thu nhận từ chủng CkHG4 có kích thước 982 bp, mã
hóa cho 2 chuỗi polypeptide M1 và M2. Gen M1 có ñộ dài 759 bp (từ
nucleotide ñầu tiên ñến nucleotide 759), mã hóa cho 252 amino acid, khởi
ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TGA. Gen M2 có kích
thước 294 bp bao gồm 97 amino acid, bắt ñầu bằng bộ mã ATG và kết
thúc bằng bộ mã TAA. Gen M1 và M2 có chung 27 nucleotide ñầu 5’ của
vùng mã hóa và gen M2 ñược tạo ra do nối 27 nucleotide này với 267
nucleotide từ vị trí 716 trở về sau cho ñến nucleotide 982.
Trình tự nucleotide gen M1 và M2 ñược so sánh, phân tích với 26
chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới phân lập qua các năm 2003-
2009. Kết quả phân tích cho thấy:
- Gen M1 của chủng CkHG4 có tổng cộng 87 nucleotide sai khác với
các chủng so sánh dẫn ñến thay ñổi tổng cộng 12 amino acid trong chuỗi

polypeptide M1. Gen M1 của chủng CkHG4 có 3 nucleotide sai khác
hoàn toàn so với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí: 132, 502 và 615,
nhưng chỉ có thay ñổi ở vị trí 502 là dẫn ñến sai khác về amino acid ở vị
trí 168 (V168I) trong protein M1. Bên cạnh ñó, chủng CkHG4 còn có 3
nucleotide (246, 522, 613) sai khác với phần lớn các chủng miền Bắc và
thế giới, nhưng chỉ có sai khác ở vị trí 613 là làm thay ñổi amino acid ở vị
trí 205 (I205V).
- Gen M2 có tổng cộng 31 nucleotide sai khác so với các chủng so
sánh dẫn ñến thay ñổi thành phần amino acid tổng cộng ở 18 vị trí trong
chuỗi polypeptide M2. Trong số các sai khác về nucleotide, chỉ có 1
nucleotide là có sai khác hoàn toàn với tất cả các chủng so sánh (vị trí
127), và sai khác này ñã làm thay ñổi thành phần amino acid của protein
M2 tại vị trí 43 (F43L). Ngoài ra, gen M2 của chủng CkHG4 còn có 4
nucleotide (76, 92, 190, 197) sai khác với hầu hết các chủng miền Bắc và
thế giới. Tất cả 4 vị trí sai khác này ñều dẫn ñến thay ñổi thành phần
amino acid ở các vị trí 26 (I26L), 31 (N31S), 64 (A64S), 66 (A66E).
Protein M1 có liên quan ñến yếu tố ñộc lực của virus A/H5N1 ở ñộng
vật có vú. Nghiên cứu gần ñây cho thấy, amino acid asparatic acid (D) ở
vị trí 30 và alanin (A) ở vị trí 215 trong protein M1 là cần thiết ñể virus
H5N1 gây chết chuột. Hai loại amino acid này (D30 và A125) cũng ñã
21
ñược phát hiện có trong thành phần protein M1 của chủng CkHG4 và tất
cả các chủng so sánh, và không có biến ñổi qua các năm 2003-2009.
M2 là một protein có liên quan ñến tính kháng amantadine của virus.
Chỉ cần thay thế một amino acid ở các vị trí 26 (L→F), 27 (V→A hoặc T),
30 (A→T hoặc V) và 31 (S→N hoặc R) trong vùng xuyên màng của
protein M2 có thể làm cho virus có khả năng kháng thuốc
(Suzuki và cs,
2003) [142].
Các vị trí này trong protein M2 của chủng CkHG4 lần lượt

là I26, V27, A30 và N31. Như vậy là ñã có ñột biến ở vị trí 31 (S→N)
trong protein M2 của chủng CkHG4, và ñột biến này có thể làm cho virus
ñề kháng với amantadine.
3.2.7.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino
acid
Kết quả phân tích sự ñồng nhất về thành phần nucleotide và tương
ñồng về amino acid cho thấy:
- Gen M1 của chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng với
các chủng vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2007 là rất cao, 98-99% về
thành phần nucleotide và 99% về thành phần amino acid; so với các
chủng khác của Việt Nam thì tỷ lệ này là 96-99% và 98-99%; so với các
chủng của thế giới thì các tỷ lệ tương ứng là 96-98% và 96-99%.
- Gen M2 chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về thành phần nucleotide
và tương ñồng về amino acid với các chủng vùng Hậu Giang tương ứng là
99% và 97-98%, với các chủng khác của Việt Nam là 97-99% và 89-98%,
với các chủng của thế giới là 94-98% và 90-97%.
3.2.7.3 Phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc
Gen M thu nhận từ chủng CkHG4 ñược ñưa vào phân tích phả hệ
cùng với 26 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới.
Kết quả phân tích
cho thấy, chủng CkHG4 cùng với các chủng A/H5N1 phân lập ở miền
nam Việt Nam: VN-HG-207-05 (DQ138186), VN-HG-178-04
(DQ099792), Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758), Ck-VN-CT-018-04
(DQ094258) tạo thành một nhóm, chứng tỏ gen M của các chủng
A/H5N1 từ người và gia cầm các tỉnh vùng ñồng bằng sông Cửu Long có
thể có cùng nguồn gốc.

3.2.8 Phân tích gen NS
3.2.8.1 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid
Gen NS thu nhận từ chủng CkHG4 mã hoá cho 2 chuỗi polypeptide

NS1 và NS2. Gen NS1 có ñộ dài 678 bp, mã hóa cho 225 amino acid,
22
khởi ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TGA. Gen NS2 có ñộ
dài 366 bp bao gồm 121 amino acid, bắt ñầu bằng bộ mã ATG và kết thúc
bằng bộ mã TAA. Gen NS2 và NS1 có chung 30 nucleotide ñầu 5’ của
vùng mã hóa và gen NS2 ñược tạo ra do nối 30 nucleotide này với 336
nucleotide từ vị trí 488 trở về sau cho ñến nucleotide 823.
Trình tự nucleotide của gen NS1 và NS2 của chủng CkHG4 sau ñó
ñược so sánh với các chuỗi gen tương ứng của 26 chủng A/H5N1 phân
lập tại Việt Nam và thế giới qua các năm 2001-2009. Kết quả phân tích
cho thấy:
Gen NS1 chủng CkHG4 có:
- 4 nucleotide sai khác hoàn toàn so với tất cả các chủng so sánh ở các
vị trí: 166, 195, 394 và 512; trong ñó sai khác ở 3 vị trí 166, 394, 512 dẫn
ñến thay ñổi các amino acid tương ứng A56T, A131T, I171N.
- 7 nucleotide (273, 423, 444, 523, 563, 595, 642) sai khác với một số
chủng vùng Hậu Giang. Trong ñó, sai khác ở các vị trí 413, 523, 563, 595
và 642 ñã làm biến ñổi các amino acid T138N, V175I, R188Q, R199G,
K214N (theo thứ tự tương ứng).
- 8 nucleotide (177, 180, 223, 242, 395, 408, 443, 568) sai khác với
hầu hết các chủng miền Bắc và thế giới, nhưng chỉ 4 vị trí 223, 242, 443
và 568 là làm biến ñổi amino acid, tương ứng ở các vị trí K75E, V81A/T,
G148E và T190S.
Gen NS2 chủng CkHG4 có:
- 1 nucleotide (vị trí 55) sai khác với tất cả các chủng so sánh dẫn ñến
thay ñổi amino acid ở vị trí 19 (L19M).
- 5 vị trí (66, 106, 138, 179, 185) sai khác về nucleotide so với một số
chủng vùng Hậu Giang; trong ñó sai khác ở 3 vị trí 106, 179, 185 ñã làm
biến ñổi amino acid ở các vị trí tương ứng E36K, I60T, và N62T.
- 2 nucleotide (vị trí 112 và 250) sai khác với ña số các chủng so sánh

phân lập ở miền Bắc và thế giới, tuy nhiên các sai khác này không làm
biến ñổi thành phần amino acid.
Nhằm tìm hiểu kỹ hơn sự biến ñộng thành phần nucleotide và amino
acid của gen NS, chúng tôi tiến hành so sánh chủng CkHG4 với một số
chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới qua các năm 1996-2009. Gen NS
của chủng CkHG4 và một số chủng virus cúm A/H5N1 phân lập sau năm
2000 (giai ñoạn 2001-2009) bị xóa 15 nucleotide. Sự thay ñổi này dẫn ñến
xóa ñi 5 amino acid “(A/T)IAS(V/S)” ở các vị trí 80 - 84 trong protein NS1.

Theo Long và cộng sự (2008) [102] protein NS1 bị xóa 5 amino acid ở các
23
vị trí 80 - 84 dẫn ñến ñột biến D92E làm tăng ñộc lực của virus cúm
A/H5N1 ở gà và chuột. ðồng thời, glutamic acid
(E) ở vị trí 92 trong
protein NS1 còn liên quan ñến khả năng của virus A/H5N1 ñiều chỉnh ñáp
ứng với cytokine và tính ñộc lực cao của virus trên lợn
(Seo và cs, 2002)
[132]
. E92 cũng ñược phát hiện trong thành phần protein NS1 của chủng
CkHG4. Theo
Jackson và cộng sự (2008) [84], bốn amino acid ở ñầu C
của protein NS1 là vùng liên quan ñến ñộc lực của virus. Các chủng virus
cúm A/H5N1 gây dịch cúm gia cầm với tỷ lệ chết cao gần ñây ñều có các
amino acid ở ñầu C trong NS1 là ESEV hoặc EPEV. Bốn amino acid ở
ñầu C của protein NS1 chủng CkHG4 cũng có motif là 222ESEV225.
Các amino acid R38, K41 (Wang và cs, 1999) [153] và A149 (Li và
cs, 2006
) [99] trong protein NS1 ñược cho là liên quan ñến khả năng của
virus ức chế tế bào sản xuất interferon và kháng lại ñáp ứng của chúng.
Arginin (R) ở vị trí 38 và lysin (K) ở vị trí 41 cũng ñã ñược phát hiện

trong thành phần amino acid của protein NS1 chủng CkHG4.
3.2.8.2 Phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về amino
acid
Kết quả phân tích sự ñồng nhất về nucleotide và tương ñồng về
amino acid cho thấy:
- Gen NS1 của chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất và tương ñồng với
các chủng vùng Hậu Giang qua các năm 2004-2007 là 97-99% về thành
phần nucleotide và 95-98% về thành phần amino acid; so với các chủng
khác của Việt Nam tỷ lệ này là 94-99% và 92-98%; so với các chủng của
thế giới các tỷ lệ tương ứng là 94-97% và 93-97%.
- Gen NS2 của chủng CkHG4 có tỷ lệ ñồng nhất về nucleotide và
tương ñồng về amino acid với các chủng vùng Hậu Giang theo thứ tự tương
ứng là 98-99% và 95-99%, với các chủng Việt Nam khác là 93-99% và 91-
99%, với các chủng thế giới là 95-98% và 94-97%.
3.2.8.3 Phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc
Gen NS thu nhận từ chủng CkHG4 ñược phân tích phả hệ cùng với
36 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới. Kết quả phân tích cho thấy,
chủng CkHG4 cùng với các chủng A/H5N1 phân lập ở miền nam Việt
Nam: Ck-VN-TG-023-04 (DQ099758), Ck-VN-CT-018-04 (DQ094258),
VN-CL2009-05 (DQ493254) tạo thành một nhóm, chứng tỏ gen NS của
chủng A/Ck/VN/HG4/2005(H5N1) do chúng tôi phân lập có cùng nguồn
gốc với các chủng cúm A/H5N1 từ người và gia cầm vùng ñồng bằng
sông Cửu Long.
24
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
(1) Toàn bộ 8 phân ñoạn gen của virus cúm A/H5N1 chủng CkHG4,
bao gồm PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS ñã ñược thu nhận và giải
trình tự,
- Hệ gen mã hóa cho 11 chuỗi polypeptide, trong ñó có kích thước

ngắn nhất là PB1-F2 (90 amino acid), dài nhất là PB2 (759 amino acid).
- Tất cả 11 gen ñều khởi ñầu bằng bộ mã ATG. Các gen PB2, PB1,
PA và N1 kết thúc bằng bộ mã TAG. Bộ mã kết thúc của các gen H5, NP,
M2 và NS2 là TAA. Riêng các gen PB1-F2, M1 và NS1 có bộ mã kết
thúc là TGA.
- Kết quả phân tích thành phần gen cho thấy chuỗi polypeptide H5 có
7 vị trí glycosyl hóa, chuỗi nối giữa HA
1
và HA
2
có ñầy ñủ các amino
acid RRRKK; chuỗi polypeptide N1 có 3 vị trí glycosyl hóa; chuỗi
polypeptide NS1 bị xóa 5 amino acid ở các vị trí 80 - 84; chuỗi
polypeptide PB2 chứa glutamic acid (E) ở vị trí 627 và asparatic acid (D)
ở vị trí 701, thích ứng gây bệnh ở gia cầm và ñặc trưng của virus cúm
A/H5N1 ñộc lực cao.
(2) Hệ gen của chủng CkHG4 phù hợp với các chủng virus cúm
A/H5N1 phân dòng Quảng ðông, thuộc nhóm kháng nguyên clade 1,
nhóm di truyền genotype Z.
(3) Chủng CkHG4 có mức ñộ ñồng nhất (về nucleotide) và tương
ñồng (về amino acid) cao ở tất cả 8 phân ñoạn gen với các chủng cúm
A/H5N1 phân lập ở miền nam Việt Nam trong các năm 2004-2005.
(4) Phân tích mối quan hệ phả hệ từng gen riêng biệt của toàn bộ hệ
gen cho thấy chủng CkHG4 tập hợp trong cùng nhóm với các chủng virus
cúm A/H5N1 phân lập từ người và gia cầm vùng ñồng bằng sông Cửu
Long giai ñoạn 2004-2007.

KIẾN NGHỊ
Tiếp tục giải trình tự hệ gen của các chủng virus cúm A/H5N1 mới
xuất hiện trong những năm gần ñây tại Việt Nam, phân tích ñặc tính sinh

học phân tử ñể ñánh giá mức ñộ tiến hóa cũng như mối quan hệ về kháng
nguyên-miễn dịch của các biến chủng A/H5N1 cập nhật với các chủng
virus vaccine nhằm giúp cho việc phòng chống dịch cúm gia cầm có hiệu
quả.