nghiên cứu hệ gen của virus cúm ah5n1 phân lập từ gà nuôi tại hậu giang

B
Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯ
ỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
TR
ẦN QUANG VUI
LU
ẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP
Ng êi
Hà N
ội
- 2012
B
Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯ
ỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
TR
ẦN QUANG VUI
Chuyên ngành: Vi sinh v
ật học thú y
Mã s
ố: 62 62 50 10
LU
ẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP
Ngư
ời hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. LÊ THANH HOÀ
2. TS. NGUYỄN BÁ HI
ÊN
Hà N
ội

- 2012
I
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công tr
ình nghiên c
ứu của bản thân do chính tôi
thực hiện. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng
được ai công bố trong bất kỳ công trình luận án nào trước đây. Mọi sự giúp đỡ đã
được cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trích trong luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Nghiên cứu sinh
Trần Quang Vui
II
LỜI CẢM ƠN
Hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
- PGS.TS. Lê Thanh Hòa và TS. Nguyễn Bá Hiên - những người thầy đ
ã
dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và tận tình giúp đỡ tôi
hoàn thành luận án này.
- Bộ Khoa học và Công nghệ về Nhiệm vụ Nghị định thư Việt Nam - Thái
Lan và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen (Viện Công nghệ sinh học) đ
ã
hỗ trợ kinh phí và trang thiết bị để chúng tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
- Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam) đ
ã t
ạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình
thực hiện đề tài.
- Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú Y, Viện Đào tạo Sau Đại học,
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đ

ã t
ạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình
nghiên cứu.
- Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế đã cho
phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có đủ thời gian thực hiện luận án.
- Th.S. Nguyễn Thị Bích Nga, các anh chị Phòng Miễn dịch học thuộc Viện
Công nghệ Sinh học và các bạn đồng nghiệp đ
ã t
ận tình giúp
đ
ỡ, hỗ trợ về kỹ thuật
trong quá trình nghiên cứu.
Góp công sức không nhỏ trong việc hoàn thành luận án là người vợ thân yêu
- đ
ã
đ
ộng viên giúp đỡ, gánh vác mọi công việc gia đ
ình
đ
ể tôi dành thời gian cho
nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Nghiên cứu sinh
Trần Quang Vui
III
MỤC LỤC
Trang
DANH M
ỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA
.
VI

DANH M
ỤC CÁC BẢNG

VIII
DANH M
ỤC CÁC HÌNH

XI
M
Ở ĐẦU

1
CHƯƠNG 1: T
ỔNG QUAN TÀI LIỆU

4
1.1.
Đ
ại c
ương về bệnh cúm gia cầm

4
1.1.1. L
ịch sử bệnh cúm gia cầm

4
1.1.2. Tình hình d
ịch cúm gia cầm A/H5N1 trên thế giới

5

1.1.3. Tình hình d
ịch cúm gia cầm
A/H5N1 ở Việt Nam
7
1.1.4. Nguyên nhân gây b
ệnh

9
1.1.5. Cơ chế sinh bệnh
13
1.1.6. Tri
ệu chứng lâm sàng

15
1.1.7. B
ệnh tích

16
1.1.8. Chẩn đoán bệnh
18
1.1.9. Phòng ch
ống bệnh cúm gia cầm

20
1.2.
Sinh h
ọc phân tử virus cúm A

24
1.2.1. H

ệ gen của virus cúm A

24
1.2.2. Protein của virus - cấu trúc và chức năng
26
1.2.3. Cơ ch
ế phân tử quá tr
ình xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A
36
1.2.4. Các phương th
ức biến đổi kháng nguyên của virus cúm A

38
1.3.
Ti
ến hóa hệ gen virus cúm A/H5N1

42
1.3.1. S
ự tiến hóa của virus cúm A/H5N1

42
1.3.2. S
ự xâm nhập các genotype của virus cúm A/H5N1
vào Vi
ệt
Nam
44
1.3.3. Sự biến đổi thành phần hemagglutinin (HA) tạo nên các nhóm
kháng nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam

47
IV
1.4.
Ph
ản ứng RT
-PCR trong nghiên c
ứu virus cúm A

49
1.5.
M
ột số
nghiên c
ứu
v
ề
sinh h
ọc phân tử virus cúm A/H5N1
t
ại
Vi
ệt
Nam
50
1.6.
T
ầm quan
tr
ọng của việc giải m
ã hệ gen virus cúm A/H5N1

54
CHƯƠNG 2: N
ỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN C
ỨU

56
2.1.
Đ
ối tượng nghiên cứu

56
2.2.
Đ
ịa điểm v
à thời gian nghiên cứu

56
2.3.
N
ội dung nghiên cứu

56
2.3.1. Gi
ải trình tự toàn b
ộ hệ gen chủng virus cúm A/H5N1 (CkHG4)
phân l
ập từ gà Hậu Giang

56
2.3.2. Phân tích so sánh thành ph
ần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả
hệ chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới
56
2.4.
V
ật liệu nghiên cứu

56
2.4.1. Nguyên li
ệu

56
2.4.2. D
ụng cụ và thiết bị

57
2.4.3. Hóa ch
ất

57
2.4.4. Các dung d
ịch và môi trường

57
2.5.
Phương pháp nghiên cứu
58
2.5.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số

58
2.5.2. Phương pháp RT-PCR
59
2.5.3. Phương pháp ki
ểm tra sản phẩm RT
-PCR
63
2.5.4. Phương pháp tinh s
ạch sản phẩm RT
-PCR
63
2.5.5. Phương pháp dòng hóa
64
2.5.6. Phương pháp gi
ải tr
ình tự

67
2.5.7. Phương pháp x
ử lý số liệu

69
CHƯƠNG 3: K
ẾT QUẢ V
À THẢO LUẬN

70
3.1.
K
ết quả giải mã hệ gen virus cúm A/H5

N1 ch
ủng CkHG4

70
3.1.1. K
ết quả tách RNA tổng số

70
V
3.1.2. Kết quả giải trình tự các gen kháng nguyên HA (H5)
và NA (N1)
71
3.1.2.1. Gi
ải trình tự gen H5 (HA)

71
3.1.2.2. Gi
ải tr
ình tự gen N1 (NA)

73
3.1.3. K
ết quả giải trình tự cá
c gen polymerase
75
3.1.3.1. Gi
ải tr
ình tự gen PB2

75

3.1.3.2. Gi
ải trình tự gen PB1

76
3.1.3.3. Gi
ải trình tự gen PA

77
3.1.4. K
ết quả giải trình tự các gen NP, M và NS

79
3.1.4.1. Gi
ải trình tự gen NP

79
3.1.4.2. Gi
ải t
rình t
ự gen M

79
3.1.4.3. Gi
ải trình tự gen NS

80
3.2.
Phân tích so sánh thành ph
ần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của
ch

ủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới

83
3.2.1. Phân tích gen H5
84
3.2.2. Phân tích gen N1
93
3.2.3. Phân tích gen PB2
102
3.2.4. Phân tích gen PB1 và PB1-F2
106
3.2.5. Phân tích gen PA
112
3.2.6. Phân tích gen NP
117
3.2.7. Phân tích gen M
120
3.2.8. Phân tích gen NS
124
3.3.
Th
ảo luận chung

131
K
ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

136
CÁC CÔNG TRÌNH
Đ

à CÔNG B
Ố LIÊN QUAN ĐẾN
LUẬN ÁN
138
TÀI LI
ỆU THAM KHẢO

139
PH
Ụ LỤC
VI
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGH
ĨA
Ký hiệu
Tiếng Anh
Thuật từ/Cách dùng hoặc ngh
ĩa
tiếng Việt
Aa
Amino acid
Axit amin
Bp
Base pair
Cặp bazơ
Ck
Chicken
Gà
CkHG4
A/Chicken/Vietnam/HG4/05(H5N1)
Chủng virus cúm A/H5N1 phân

lập từ gà Hậu Giang năm 2005
Da
Dalton
Đơn vị tính trọng lượng phân tử
protein
Dk
Duck
Vịt
DNA
Deoxyribonucleic Acid
Axit deoxyribonucleic
dNTP
deoxy Nucleotide Triphosphate
Tiền chất dNTP cho phản ứng PCR
ddNTP
dideoxy Nucleotide Triphosphate
Tiền chất dNTP cho phản ứng giải
trình tự
ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay
Phản ứng miễn dịch đánh dấu
enzym
FAO
Food and Agricultural Organization
Tổ chức nông lương thế giới
Gs
Goose
Ngỗng
HA

Haemagglutinin
Ngưng kết hồng cầu
HI
Hemagglutination Inhibition
Ngăn trở ngưng kết hồng cầu
HPAI
Highly Pathogenic Avian Influenza
Cúm gia cầm thể độc lực cao
Kb
Kilo base
Kilo bazơ
LB
Luria-Bertani
Môi trường Luria-Bertani nuôi cấy
vi khuẩn
LPAI
Low Pathogenic Avian Influenza
Cúm gia cầm thể độc lực thấp
M
Matrix
Protein đệm
MDk
Muscovy duck
Ngan
MEGA
Molecular Evolutionary Genetics
Chương tr
ình p
hân tích tiến hóa
VII

Analysis
gen
NA
Neuraminidase
Enzym phân giải sialic
NEP
Nuclear Export Protein
Protein vận chuyển
NP
Nucleoprotein
Protein nhân
NS
Non structural protein
Protein không cấu trúc
OIE
Office International des Epizooties
Tổ chức Thú y thế giới
PA
Polymerase acidic protein
Enzym polymerase có tính axit
PB1
Polymerase basic protein 1
Enzym polymerase có tính bazơ 1
PB2
Polymerase basic protein 2
Enzym polymerase có tính bazơ 2
PCR
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng PCR
RNA

Ribonucleic Acid
Axit ribonucleic
RNP
Ribonucleoprotein
Tổ hợp protein liên kết ribonucleic
RT-PCR
Reverse Transcription-Polymerase
Chain Reaction
Phản ứng PCR ngược
SPF
Specific Pathogen Free
Không chứa mầm bệnh (siêu sạch)
(-)ssRNA
Negative single-strand Ribonucleic
Acid
ARN sợi đơn âm
TAE
Tris-Acetate-EDTA
Tris-Acetate-EDTA
TNF-α
Tumor Necrosis Factor-α
Yếu tố α g
ây ho
ại tử khối u
WHO
World Health Organization
Tổ chức Y tế thế giới
VIII
DANH MỤC CÁC BẢNG
TT

Tên b
ảng
Trang
1.1
T
ổng số trường hợp nhiễm cúm
gia c
ầm A/H5N1 ở người báo
cáo cho WHO t
ừ tháng 12/2003 đến
6/7/2012
6
2.1
Thành ph
ần phản ứng RT
-PCR
59
2.2
Chu trình nhi
ệt sử dụng trong nghi
ên cứu sinh học phân tử virus
cúm A/H5N1
60
2.3
Danh sách m
ồi sử dụng để thu nhận hệ gen virus cúm gia cầm
61
2.4
Thành ph
ần phản ứng và chu trình nhiệt giải trình tự

68
3.1
Danh sách các ch
ủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
gi
ới sử dụng gen H5 trong phân tích so sánh thành phần gen và
m
ối quan hệ nguồn gốc phả hệ
85
3.2
So sánh v
ị trí sai khác nucle
otide c
ủa gen H5 chủng CkHG4 với
26 ch
ủng virus cúm khác
86
3.3
So sánh v
ị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide H5
gi
ữa 27 chủng virus cúm
87
3.4
T
ỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương
đ
ồng về amino acid (d
ưới đường chéo)
gen H5 gi

ữa các chủng
cúm A/H5N1 c
ủa Việt Nam v
à thế giới
90
3.5
Danh sách các ch
ủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
gi
ới được sử dụng gen N1 trong phân tích so sánh thành phần gen
và m
ối quan hệ nguồn gốc phả hệ
94
3.6
So sánh v
ị trí sai khác
nucleotide c
ủa gen N1 chủng CkHG4 với
26 ch
ủng virus cúm khác
95
3.7
So sánh v
ị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide N1
gi
ữa 27 chủng virus cúm
96
3.8
T
ỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương

đ
ồng về amino acid (dưới đường
chéo) c
ủa gen N1 giữa các
ch
ủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới
100
IX
3.9
Danh sách các ch
ủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
gi
ới được sử dụng gen PB2 trong phân tích so sánh thành phần
gen và m
ối quan hệ nguồn gốc phả hệ
102
3.10
So sánh v
ị
trí sai khác nucleotide c
ủa gen PB2 chủng CkHG4
v
ới 26 chủng virus cúm khác
103
3.11
So sánh v
ị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide PB2
gi
ữa 27 chủng virus cúm
104

3.12
Danh sách các ch
ủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
gi
ới đ
ược sử dụn
g gen PB1 và PB1-F2 trong phân tích so sánh
thành ph
ần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ
107
3.13
So sánh v
ị trí sai khác nucleotide của gen PB1 chủng CkHG4
v
ới 26 chủng virus cúm khác
109
3.14
So sánh v
ị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptid
e PB1
gi
ữa 27 chủng virus cúm
110
3.15
So sánh v
ị trí sai khác nucleotide v
à amino acid của gen PB1
-F2
ch
ủng CkHG4 với 26 chủng virus cúm khác

111
3.16
Danh sách các ch
ủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
gi
ới đ
ược sử dụng gen PA trong phân tích so
sánh thành ph
ần
gen và m
ối quan hệ nguồn gốc phả hệ
113
3.17
So sánh v
ị trí sai khác nucleotide của gen PA chủng CkHG4 với
26 ch
ủng virus cúm khác
115
3.18
So sánh v
ị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide PA
gi
ữa 27 chủng virus cúm
116
3.19
Danh sách các ch
ủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam v
à thế
gi
ới được sử dụng gen NP trong phân tích so sánh thành phần

gen và m
ối quan hệ nguồn gốc phả hệ
117
3.20
V
ị trí sai khác nucleotide v
à amino acid của gen NP chủng
CkHG4 so v
ới 26 chủng virus cúm
khác
119
X
3.21
Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
gi
ới đ
ược sử dụng gen M trong phân tích so sánh thành phần gen
và m
ối quan hệ nguồn gốc phả hệ
121
3.22
V
ị trí sai khác nucleotide v
à amino acid của gen M1 và M2
ch
ủng CkHG4 so với
26 ch
ủng virus cúm khác
122
3.23

Danh sách các ch
ủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam v
à thế
gi
ới được sử dụng gen NS trong phân tích so sánh thành phần
gen và m
ối quan hệ nguồn gốc phả hệ
125
3.24
V
ị trí sai khác nucleotide của gen NS1 chủng CkHG4 so v
ới 26
ch
ủng virus cúm khác
126
3.25
V
ị trí sai khác amino acid của chuỗi polypeptide NS1 giữa 27
ch
ủng so sánh
127
3.26
Vị trí sai khác nucleotide và amino acid gen NS2 chủng
CkHG4 so v
ới 26 chủng virus cúm khác
128
XI
DANH MỤC CÁC HÌNH
TT
Tên hình

Trang
1.1
Sơ đ
ồ danh pháp quốc tế các chủng virus cúm A
10
1.2
Ảnh chụp kính hiển vi điện tử, mô h
ình và ph
ức hợp
ribonucleoprotein RNP c
ủa virus cúm A
11
1.3
Sinh b
ệnh học của virus cúm A/H5N1 ở người
14
1.4
Tri
ệu chứng lâm s
àng ở gà m
ắc bệnh cúm gia cầm
15
1.5
B
ệnh tích ở gà mắc bệnh cúm gia cầm
17
1.6
Mô hình c
ấu trúc Hemagglutinin
27

1.7
S
ự biến đổi amino acid chuỗi nối HA
1
và HA
2
(đi
ểm cắt của
protease) quy đ
ịnh độc lực của virus cúm A
29
1.8
Mô hình c
ơ chế xâm nhiễm và nhân
lên c
ủa virus cúm A ở tế
bào ch
ủ
37
1.9
Sơ đ
ồ minh họa đột biến điểm của hiện tượng “lệch kháng
nguyên”
39
1.10
Sơ đ
ồ minh họa đột biến tái tổ hợp của hiện t
ượng “trộn kháng
nguyên” (antigenic shift)
ở virus cúm A

40
1.11
S
ự xâm nhập của virus cúm
A/H5N1 đ
ộc lực cao vào Việt Nam
giai đo
ạn 2001
-2007
45
2.1
Sơ đ
ồ nghiên cứu tổng quát để thu nhận các chuỗi gen
58
2.2
Sơ đ
ồ bố trí các mồi để thu nhận các phân đoạn gen của virus
cúm A/H5N1
62
2.3
C
ấu trúc vector pCR
®
2.1TOPO (Invitrogen)
64
3.1
K
ết
qu
ả điện di

ki
ểm tra
RNA t
ổng số,
s
ản phẩm RT
-PCR và
DNA plasmid tái t
ổ hợp gen H5 tr
ên thạch agarose 1%
70
3.2
Phân tích di
ễn giải thành phần nucleotide và amino acid của gen
H5 (HA) ch
ủng CkHG4
72
3.3
K
ết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT
-PCR và DNA plasmid
tái t
ổ hợp
73
XII
3.4
Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của gen
N1 (NA) ch
ủng CkHG4
74

3.5
K
ết quả điện di sản phẩm RT
-PCR và DNA plasmid tái t
ổ hợp
phân đo
ạn 1 (gen PB2)
76
3.6
K
ết quả điện di sản phẩm RT
-PCR và DNA plasmid tái t
ổ hợp
phân đo
ạn 2 (gen PB1)
77
3.7
K
ết quả điện di sản phẩm RT
-PCR và DNA plasmid tái t
ổ hợp
phân đo
ạn 3 (gen PA)
78
3.8
K
ết quả điện di sản phẩm RT
-PCR và DNA plasmid tái t
ổ hợp
phân đo

ạn 5 (gen NP)
79
3.9
K
ết quả điện di sản phẩm RT
-PCR và DNA plasmid tái t
ổ hợp
phân đo
ạn 7 (gen M)
80
3.10
Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của gen M
81
3.11
K
ết quả điện di sản phẩm RT
-PCR và DNA plasmid tái t
ổ hợp
phân đo
ạn 8 (gen NS)
82
3.12
Phân tích di
ễn giải thành phần nucleoti
de và amino acid c
ủa gen
NS
82
3.13
M

ối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa chủng CkHG4 với các
ch
ủng cúm A/H5N1 của Việt Nam v
à thế giới trên cơ sở gen
kháng nguyên H5 về thành phần nucleotide và amino acid bằng
chương tr
ình MEGA4.0
92
3.14
M
ối quan hệ ng
u
ồn gốc phả hệ giữa chủng CkHG4 với các
ch
ủng cúm A/H5N1 của Việt Nam v
à thế giới trên cơ sở gen
N1 v
ề thành phần nucleotide và amino acid bằng chương trình
MEGA4.0
101

1
M
Ở ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
B
ệnh cúm gia cầm
là m
ột bệnh truyền nhiễm cấp tính
có t

ốc độ lây lan
nhanh, v
ới
t
ỷ lệ chết cao trong đàn gia cầm nhiễm bệnh
do các phân týp (subtype)
c
ủa nhóm virus cúm A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae
gây ra. B
ệnh
gây thi
ệt hại kinh tế rất lớn cho ngành chăn nuôi của nhiều nước trên thế giới, và có
kh
ả năng lây nhiễm từ động vật sang người.
Bệnh cúm gia cầm do phân týp H5N1 xuất hiện lần đầu tiên tại Việt Nam
năm 2003
(Trương Văn Dung và Nguy
ễn Viết Không, 20
04) [3]. Trong m
ột thời
gian r
ất ngắn,
b
ệnh
cúm gia c
ầm đ
ã lây lan trên toàn bộ đất nước, hàng triệu gia
c
ầm bị chết và tiêu hủy, gây thiệt hại rất lớn cho nền kinh tế quốc dân
; và t

ừ đó
đ
ến
nay b
ệnh xảy ra li
ên tục trở thành một vấn đề dịch tễ phức tạp cầ
n gi
ải quyết tại
nư
ớc ta.
Virus cúm A là lo
ại virus
có h
ệ gen
RNA s
ợi đ
ơn âm, bao gồm 8 phân đoạn
gen riêng biệt mang tên từ 1 -8 (hay được gọi theo tên protein mà chúng mã hoá
t
ổng hợp
), mã hoá cho 11 protein khác nhau c
ủa virus gồm: PB2,
PB1, PB1-F2, PA,
HA, NP, NA, M1, M2, NS1 và NS2
(Murphy và Webster, 1996) [113], (Rabadan
và cs, 2006) [126],
đư
ợc phân chia th
ành nhiều phân týp khác nhau dựa trên kháng
nguyên HA và NA có trên b

ề mặt capsid của hạt virus
(de Wit và Fouchier, 2008)
[55]
.
H5N1 là m
ột phâ
n týp thu
ộc nhóm virus cúm A, loại hình phân týp kháng
nguyên b
ề mặt HA là H5 và NA là N1, có độc lực cao gây nhiễm và gây bệnh nặng
n
ề ở gia cầm và cả trên người
(Murphy và Webster, 1996) [113].
Virus cúm A/H5N1 có h
ệ gen
luôn bi
ến đổi
, tái t
ổ hợp biến c
h
ủng và
thay
đ
ổi cấu trúc kháng nguyên để thích ứng gây bệnh
(Lê Thanh Hòa và cs, 2004) [7].
Trình t
ự nucleotide hệ gen là cơ sở để xác lập mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa của
các bi
ến chủng virus cúm A/H5N1.
K

ết quả giải mã hệ gen là nguồn dữ liệu cung
c
ấp
thông tin v
ề nguồn gốc xuất xứ, sự tiến hóa của virus, giúp phát hiện những
2
bi
ến chủng mới trong quần thể virus cúm gia cầm.
Thông qua vi
ệc giải m
ã hệ gen, so sánh, phân tích trình tự nucleotide và
amino acid có thể xác định những vùng gen thường biến đổi, vùng gen ổn định làm
cơ s
ở dữ liệu gen học v
à protein học của các chủng H5N1 xuất hiện từ những năm
đ
ầu tiên tại nước ta
làm cơ s
ở
l
ựa chọn loại vaccine thích hợp trong
công tác phòng
ch
ống dịch cúm gia cầm
.
Đ
ể có thêm nguồn gen của virus cúm A/H5N1 lưu
hành t
ại Việt Nam, từ đó
làm cơ s

ở dữ liệu cho
nh
ững
nghiên c
ứu về
gen/h
ệ gen của virus cúm A/H5N1
và
nghiên c
ứu sản xuất
các ch
ế phẩm
sinh h
ọc
th
ế hệ mới
ứng d
ụng trong chẩn đoán và
phòng b
ệnh,
chúng tôi ti
ến hành
đ
ề tài:
Nghiên c
ứu hệ gen của virus cúm
A/H5N1
phân l
ập từ gà nuôi tại
H

ậu Giang
.
M
ục t
iêu c
ủa
đ
ề t
ài
(1) Gi
ải mã
đư
ợc
toàn b
ộ
h
ệ gen gồm
8 phân đo
ạn
c
ủa một chủng virus cúm
A/H5N1 t
ừ g
à nuôi tại
H
ậu Giang
.
(2) Phân tích được một số đặc điểm sinh học phân tử của hệ gen nhằm thu
đư
ợc

thêm d
ữ li
ệu l
àm
cơ s
ở cho nghi
ên cứu vaccine phòng bệnh
hi
ệu quả
.
Ý ngh
ĩa khoa học của đề t
ài
- Đây là lu
ận án
nghiên c
ứu khá đầy đủ
, có h
ệ thống
v
ề
sinh h
ọc phân tử
h
ệ
gen virus cúm A/H5N1 ở gà nuôi t
ại
H
ậu Giang
.

- Lu
ận án
là tài li
ệu tham khảo tốt
ph
ục vụ
cho gi
ảng dạy và nghiên cứu
khoa
h
ọc
v
ề virus cúm A/H5N1.
Ý ngh
ĩa thực tiễn của đề t
ài
- K
ết quả nghiên cứu của đề tài
giúp hi
ểu biết thêm về tính đa dạng của virus
cúm. Trên cơ s
ở đó góp phần
xây d
ựng ph
ương pháp chẩn đoán
và l
ựa chọn vaccine
phòng b
ệnh phù
h

ợp
.
- K
ết quả nghi
ên cứu của đề tài góp phần làm sáng tỏ thêm mối quan hệ
ngu
ồn gốc
ph
ả hệ của virus cúm A/H5N1
phân l
ập
trong nh
ững năm đầu tiên dịch
xu
ất hiện
ở vùng đ
ồng bằng sông Cửu Long
.
3
Nh
ững đ
óng góp m
ới của đề tài
(1) Gi
ải tr
ình tự và n
ghiên c
ứ
u hoàn ch
ỉnh

, có h
ệ thống hệ gen
c
ủa một chủng
virus cúm A/H5N1 thuộc thể độc lực cao (HPAI) phân lập từ gà tại Hậu Giang năm
2005 (ký hi
ệu chủng l
à CkHG4)
trong đ
ợt dịch cúm gia cầm lần đầu ti
ên xuất hiện ồ
ạt ở Việt Nam.
(2) Đã phân tích
đ
ặc điểm gen học h
ệ gen/gen của chủng CkHG4, bao gồm
trình t
ự nucleotide/amino acid, cấu trúc, đồng nhất/tương đồng
; so sánh v
ới các
chủng trong vùng và thế giới.
(3) Đ
ã làm sáng t
ỏ m
ối quan hệ phả hệ, nguồn gốc v
à tương quan gen/h
ệ gen
c
ủa
virus cúm A/H5N1 cư

ờng độc dòn
g Qu
ảng Đông (chủng CkHG4), góp phần
hi
ểu biết th
êm về virus cúm A/H5N1 gây bệnh và đóng góp dữ liệu cho đối chiếu
v
ới các vaccine sử dụng tại Việt Nam.
(4) Đ
ã
kh
ảo sát và
xác đ
ịnh được các cặp mồi sử dụng
có hi
ệu quả để thu
nh
ận và
gi
ải trình tự hệ gen củ
a virus cúm A/H5N1 thu
ộc những phân dòng lần đầu
tiên xuất hiện và hiện còn lưu hành tại Việt Nam .
4
CHƯƠNG 1
T
ỔNG QUAN T
ÀI LIỆU
1.1 Đ
ẠI CƯƠNG VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM

Cúm gia c
ầm (avian influenza) đúng hơn là cúm loài chim, là bệnh truyền
nhi
ễm cấp t
ính c
ủa loài chim, do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae
gây ra. Đây là nhóm virus có biên đ
ộ chủ rộng, được phân chia thành nhiều phân
týp khác nhau d
ựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus
(de Wit và Fouchier, 2008) [55]. Nhóm virus cúm A có 16 phân týp HA (từ H1 đến
H16) và 9 phân type NA (t
ừ N1 đến N9)
(Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11],
(Horimoto và Kawaoka, 2005) [78]
. S
ự tái tổ hợp (reassortment) giữa các phân týp
HA và NA, v
ề mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều phân týp k
hác nhau v
ề độc tính và khả
năng gây b
ệnh
.
D
ịch cúm gia cầm do virus cúm A phân týp H5N1 thể độc lực cao xuất hiện
ở v
ùng Qu
ảng Đông, Trung Quốc năm 1996 và đã lan ra hơn 60 nước trên thế giới
ở châu Á, châu Âu và châu Phi

(Duan và cs, 2008) [59], gây nhiều thiệt hại kinh tế
do gia c
ầm bị chết hoặc ti
êu huỷ nhằm kiểm soát dịch, được chứng minh là có khả
năng lây nhi
ễm từ động vật sang người, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng
(Lê
Thanh Hòa và cs, 2004) [7]
. B
ệnh cúm gia cầm A/H5N1 lần đầu ti
ên xuất hiện tại
Vi
ệt Nam vào cuối năm 2003, từ đó đến nay bệnh xảy ra liên tục, đang là vấn đề
d
ịch tễ phức tạp do xuất hiện nhiều phân d
òng virus mới và là dịch bệnh cần phải
gi
ải quyết tại nước ta
(Nguyen và cs, 2008) [116], (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11].
Virus cúm A/H5N1 đang lưu hành
ở nhiều nước, thường xuyên gây bệnh cho gia
c
ầm và người, là nguy cơ gây đại dịch trên toàn thế giới.
1.1.1 L
ịch sử bệnh cúm gia cầm
B
ệnh cúm g
à (avian influenza) còn có tên là dịch hạch gà (Fowl Plague) lần
đ
ầu tiên được phát hiện ở Ita

lia vào năm 1878. Nhưng m
ãi tới năm 1901 mới xác
đ
ịnh đ
ược yếu tố gây bệnh là căn nguyên siêu nhỏ có khả năng qua màng lọc và tới
năm 1955 m
ới xác định được chính xác nguyên nhân gây bệnh cúm gia cầm là virus
5
cúm týp A thông qua kháng nguyên b
ề mặt H7N1 và
H7N7 (Lê Văn Năm, 2004)
[18]
.
Đại dịch giống như cúm được xác nhận lần đầu tiên vào năm 1580. Từ đó
tr
ở đi, tr
ên toàn thế giới đã có 31 đại dịch được ghi nhận
(Nguy
ễn Văn Thanh v
à cs,
2007) [24], (Bùi Quý Huy, 2007) [12]
. Trong th
ế kỷ XX đã xảy ra các đạ
i d
ịch cúm
trên ngư
ời nh
ư
d
ịch cúm Tây Ban Nha

năm 1918 – 1919 do virus cúm A/H1N1,
d
ịch cúm châu Á
năm 1957 – 1958 do virus cúm A/H2N2, d
ịch cúm Hồng Kông
năm 1968 – 1969 do virus cúm A/H3N2, và d
ịch cúm Nga
năm 1977 do virus cúm
A/H1N1
(Lê Thanh Hòa và cs, 2006) [9].
Ở Việt Nam bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 đ
ược phát hiện năm
2003
(Trương Văn Dung và Nguy
ễn Viết Không, 2004) [3]
.
1.1.2 Tình hình d
ịch cúm gia cầm A/H5N1 trên thế giới
Cúm A/H5N1 là m
ột loại virus có độc lực cao v
à gây bệnh trên n
gư
ời trong
các đ
ợt dịch cúm gia cầm những năm 1996
- 2008, đ
ặc biệt ác liệt là do virus cúm
A/H5N1 th
ể độc lực cao (HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây ra kể từ
năm 2003 cho đ

ến nay
(Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11]. Ch
ủng virus cúm A/H5N1
đư
ợc phát
hi
ện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959 và có
th
ể gọi chủng virus này là virus cúm A/H5N1 cổ điển. Từ đó đến nay, cấu trúc
thành ph
ần gen và kháng nguyên miễn dịch của H5 và N1 đã có nhiều thay đổi
(Horimoto và Kawaoka, 2006) [79]. Sau g
ần 40 năm không phát hiện, cúm A/H5N1
xu
ất hiện tại Quảng Đông (1996), Hồng Kông (1997) với những biến đổi sâu sắc,
không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng và gây chết người bệnh. Có thể coi
dòng virus cúm A/H5N1 t
ừ 1996 đến nay là cúm A/H5N1
hi
ện đại mới xuất hiện
(de Jong và Hien, 2006) [54]. Đ
ặc biệt từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1
gây ra d
ịch cúm gia cầm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục
qu
ốc gia tr
ên thế giới ở châu Á, châu Âu và châu Phi
(Lê Thanh Hòa và cs, 2008)
[11], (Duan và cs, 2008) [59]
. Virus cúm A/H5N1 giai đo

ạn 2003
-2008, cơ b
ản về
c
ấu trúc vẫn nh
ư trước đó, nhưng tính gây bệnh, loài vật chủ nhiễm bệnh, tính
kháng nguyên-miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác
6
v
ới nhiều biến chủn
g H5N1 trư
ớc đây
(Subbarao và Luke, 2007) [140], (Zhao và cs,
2008) [164]
. T
ừ
đ
ầu năm 1997 đến tháng 5 năm 2005, virus cúm A/H5N1 chỉ giới
hạn ở vùng Đông Nam Á
(Chen và cs, 2005) [45]. Từ cuối 2005, cúm A/H5N1 sau
khi lây nhi
ễm cho chim hoang d
ã ở vùng hồ
Thanh H
ải (Qinghai Lake), Trung
Qu
ốc bắt đầu lan truyền sang phía Tây, lan sang một số nước vùng Trung Á, trong
đó có Nga, r
ồi tr
àn ngập Đông Âu và xâm nhập vào các nước vùng Tiểu Á, bao

g
ồm Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc
- Trung Phi, đ
ặc biệt Ai Cập và Nigiêria
là các nư
ớc
ch
ịu thiệt hại nhiều nhất
(Salzberg và cs, 2007) [129].
Tính đ
ến 2008, tổng số
có trên 60 nư
ớc và vùng lãnh thổ bùng phát dịch cúm
gia c
ầm, hàng trăm triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề cho
ngành chăn nuôi và kinh t
ế
(Duan và cs, 2008) [59], (Lê Thanh Hòa và cs, 2008)
[11].
B
ảng 1.1
: T
ổng số tr
ường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo cáo
cho WHO t
ừ tháng 12/2003 đến
6/7/2012
2003
2004
2005

2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
T
ổng
Qu
ốc gia
N
C
N
C
N
C
N
C
N
C
N
C
N
C
N
C
N
C
N

C
N
C
Azerbaizan
0
0
0
0
0
0
8
5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
8
5
Bangladesh
0
0
0

0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
2
0
3
0
6
0
Cambodia
0
0
0
0
4
4
2
2
1
1

1
0
1
0
1
1
8
8
3
3
21
19
Trung Qu
ốc
1
1
0
0
8
5
13
8
5
3
4
4
7
4
2
1

1
1
2
1
43
28
Djibouti
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
Ai C

ập
0
0
0
0
0
0
18
10
25
9
8
4
39
4
29
113
39
15
10
5
168
60
Indonesia
0
0
0
0
20
13

55
45
42
37
24
20
21
19
9
7
12
10
7
7
190
158
Iraq
0
0
0
0
0
0
3
2
0
0
0
0
0

0
0
0
0
0
0
0
3
2
Lào
0
0
0
0
0
0
0
0
2
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

2
2
Myanmar
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
Nigeria
0
0
0
0

0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
Pakistan
0
0
0
0
0
0
0
0
3
1
0

0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
1
Thái Lan
0
0
17
12
5
2
3
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

0
0
25
17
Th
ổ Nhĩ
K
ỳ
0
0
0
0
0
0
12
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
12
4

Vi
ệt Nam
3
3
29
20
61
19
0
0
8
5
6
5
5
5
7
2
0
0
4
2
123
61
T
ổng số
4
4
46
32

98
43
115
79
88
59
44
33
73
32
48
24
62
34
29
18
607
358
Ghi chú: N: s
ố người nhiễm; C: số người chết; Số ca mắc bệnh bao gồm
c
ả các ca tử vong.
WHO ch
ỉ ghi nhận những ca được xác nhận bằng xét nghiệm và được báo cáo chính thức.
Ngu
ồn: Tổ chức Y tế thế giới
– WHO (tính đ
ến tháng
7/2012)
/>chives/en/index.html.

7
S
ố người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 mỗi năm một cao hơn,
theo th
ống k
ê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) số người nhiễm cúm gia c
ầm H5N1
giai đoạn 2003-7/2012 là 607 trường hợp, trong đó, 358 trường hợp đã tử vong
chi
ếm tới 5
8,97%. Indonesia, Ai C
ập
và Vi
ệt Nam l
à
3 qu
ốc gia có số ng
ười nhiễm
và t
ử vong do virus cúm A/H5N1 cao nhất thế giới (
B
ảng 1.1
). Trong s
ố 15 nước có
ngư
ời nhiễ
m cúm gia c
ầm, Indonesia v
à Việt Nam được WHO xác định là quốc gia
“đi

ểm nóng
”, có th
ể có các điều kiện thuận lợi để virus cúm A/H5N1 tiến hoá thích
nghi lây nhi
ễm v
à trở thành virus của người
(Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11].
1.1.3 Tình hình d
ịch cúm gia c
ầm A/H5N1 ở Việt Nam
D
ịch cúm gia cầm A/H5N1 lần đầu tiên bùng phát tại Việt Nam vào cuối
tháng 12/2003
ở các tỉnh phía Bắc, chỉ trong một thời gian ngắn dịch đ
ã nhanh
chóng lây lan t
ới hầu hết các tỉnh/thành trong cả nước, hàng chục triệu gia cầm bị
tiêu hu
ỷ, gây thiệt hại nặng nề tới nền kinh tế quốc dân
(Lê Thanh Hòa và cs, 2008)
[11]
. Hàng năm, d
ịch cúm gia cầm liên tục tái bùng phát
t
ại nhiều địa phương trong
c
ả n
ước. Có thể phân chia dịch cúm gia cầm ở Việt Nam thành các đợt dịch lớn như sau:
- Đ
ợt d

ịch thứ nhất từ tháng 12/2003 đến 30/03/2004, dịch cúm xảy ra ở các
t
ỉnh Hà Tây, Long An và Tiền Giang. Dịch lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng hai
tháng đ
ã xuất hiện ở 57/64 tỉnh thành trong cả nước. Tổng số gà và thuỷ cầm mắc
b
ệnh, chết và thiêu huỷ hơn 4
3,9 tri
ệu con, chiếm 17% tổng đàn gia cầm. Đặc biệt,
có 3 ngư
ời được xác định nhiễm virus cúm A/H5N1 và cả 3 đã tử vong trong đợt
d
ịch này
(Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11].
- Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4 đến tháng 11/2004: dịch bệnh tái phát tại 17 tỉnh,
th
ời
gian cao đi
ểm nhất là trong tháng 7, sau đó giảm dần đến tháng 11/2004 chỉ
còn m
ột điểm phát dịch. Tổng số gia cầm ti
êu hủy được thống kê trong vụ dịch này
là 84.078 con. S
ố người mắc bệnh do virus cúm A/H5N1 trong đợt dịch này là 27
ngư
ời, trong đó có 9 t
rư
ờng hợp tử vong
(Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11].
- Đ

ợt dịch thứ 3 từ tháng 12/2004 cho đến tháng 15/12/2005: dịch cúm gia
c
ầm xảy ra tr
ên 36 tỉnh thành trong cả nước. Số gia cầm bị tiêu hủy được Cục Thú y
thống kê là 1,846 triệu con. Vào những tháng cuối năm 2005, dịch cúm gia cầm xảy
8
ra trong tháng 10/2005 lan nhanh trong g
ần 40 tỉnh thành và giảm dần trong tháng
12/2005
(Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11].
- Sau một năm (2006), do áp dụng chương trình tiêm chủng rộng rãi cho các
đàn gia c
ầm trong cả n
ước, c
ùng v
ới các biện pháp ph
òng chống dịch quyết liệt,
d
ịch cúm A/H5N1 không xảy ra ở Việt Nam. Mặc dù vậy, đến 06/12/2006 dịch cúm
gia c
ầm A/H5N1 đ
ã tái bùng phát ở Cà Mau, sau đó lan sang các tỉnh Bạc Liêu,
H
ậu Giang, Vĩnh Long và Cần Thơ
(Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11].
- Trong năm 2007, d
ịch bệnh tái phát tại Hải D
ương vào ngày 17/02/2007 và
đư
ợc khống chế sau 1 tháng. Tuy nhiên, đến ngày 01/05/2007 dịch bệnh tiếp tục tái

phát t
ại Nghệ An, sau đó lan sang nhiều tỉnh, thành phố trong cả nước. Theo Báo
cáo của Cục Thú y (Bộ Nông nghiệp v
à Phát triển Nông thôn) đến ngày 10/06/2007
d
ịch đã xảy ra trên 16 tỉnh, thành phố và chỉ được khống chế hoàn toàn vào 8/2007.
- Trong năm 2008, d
ịch bệnh lại tiếp tục tái bùng phát ở một số tỉnh phía Bắc
vào tháng 3/2008, sau đó lan sang 21 t
ỉnh thành phố trong cả nước
(Lê Thanh Hòa
và cs, 2008) [11]
. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 60.090 con, trong
đó có 23.498 gà và 36.592 con th
ủy cầm
(Văn Đăng K
ỳ, 2008) [14]
. Các
ổ dịch
thư
ờng xuất hiện ở cả 3 miền Bắc, Trun
g, Nam và trên c
ả 3 v
ùng: Vùng núi, trung
du và đ
ồng bằng, chủ yếu xảy ra trên đàn gia cầm không tiêm phòng vaccine và ở
lo
ại h
ình trang trại gia đình hoặc hộ chăn nuôi nhỏ lẻ. Ở loại hình chăn nuôi hỗn
h

ợp, các ổ dịch thường phát ra trên đàn thủy cầm trướ
c, sau đó lây nhi
ễm cho gà
.
- T
ừ năm 2009 đến nay, dịch bệnh cúm
gia c
ầm
H5N1 v
ẫn th
ường xuyên tái
phát tại nước ta. Năm 2011, dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở các tỉnh: Bắc Kạn, Thái
Nguyên, L
ạng S
ơn, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Hà Nam, Nam Định, Hải Phòng, Bắc
Ninh, Phú Th
ọ, Nghệ An, Quảng Trị,
Đ
ắk Lắk, Quảng Ngãi,
Bình
Định, Tiền
Giang, Sóc Trăng, V
ĩnh Long, Long An,
Cà Mau và m
ột số địa ph
ương khác.
K
ết
qu
ả

phân tích m
ẫu virus từ các ổ dịch cúm gia cầm và số liệu giám sát virus cúm
cho th
ấy
clade virus m
ới (cla
de 2.3.2) lưu hành
ở hầu khắp các tỉnh miền Bắc,
duyên h
ải miền Trung và Tây Nguyên. Riêng
clade virus c
ũ (clade 1) vẫn lưu hành
ở một số tỉnh phía Nam (từ th
ành phố Hồ Chí Minh đến Cà Mau)
(Nguy
ễn Ngọc
9
Ti
ến và cs, 2011) [29]
.
- T
ừ đầu năm đến hết tháng 5
năm 2012, d
ịch cúm gia cầm đ
ã xảy ra ở 61
xã/phường của 42 quận/huyện thuộc 14 tỉnh/thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh,
ch
ết v
à tiêu hủy là 74.811 con
(Văn Đăng K

ỳ, 2012) [15]
.
Như v
ậy, dịch cúm gia cầm H5N1 ở Việt Nam hiện nay đã có sự xuất hiện
c
ủa nhi
ều clade virus m
ới l
àm cho tình hình dịch tễ và định hướng phòng chống
d
ịch trở nên phức tạp hơn.
1.1.4 Nguyên nhân gây b
ệnh
1.1.4.1 Phân lo
ại và danh pháp của virus cúm
1.1.4.1.1 Phân lo
ại
Virus cúm đư
ợc phân loại chủ yếu dựa theo đặc tính kháng nguy
ên
c
ủa virus.
Virus cúm A gây b
ệnh cúm gia cầm thuộc họ Orthomyxoviridae trong hệ thống
phân lo
ại (Basic Taxomomy)
(Murphy và Webster, 1996) [113]. H
ọ
Orthomyxoviridae đư
ợc phân thành các nhóm virus cúm A (influenza A virus),

virus cúm B (influenza B virus), virus cúm C (influenza C virus) và nhóm
Thogotovirus d
ựa vào sự khác nhau về đặc tính kháng nguyên trong nucleoprotein
(NP) và matrix (M1) protein c
ủa chúng. Virus cúm B và C không phân loại thành
các phân týp (subtype). T
ất cả virus cúm gia cầm (avian inf
luenza virus) đư
ợc xếp
vào týp A. Virus týp A
được chia ra các phân týp dựa vào tính kháng nguyên của
glycoprotein b
ề mặt ở hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Cho đến nay,
t
ổng số phân týp chia theo cấu trúc chuỗi nucleotide (HA) là 16 (HA1
-16) và theo
protein NA là 9 (N1-9). Trong tự nhiên, virus cúm A tồn tại trong các phân týp là
k
ết quả tái tổ hợp của 16 HA và 9 NA. Vì vậy, virus cúm A được đặt tên là HxNy
(x có giá tr
ị từ 1 đến 16 v
à y có giá trị từ 1 đến 9)
(Murphy và Webster, 1996)
[113], (Nguy
ễn Tiến Dũng, 2008) [5]
.
1.1.4.1.1 Danh pháp
T
ổ chức Y tế thế giới quy định thống nhất danh pháp lưu trữ hệ gen của các
ch

ủng virus cúm trong Ngân hàng gen (GenBank), cũng như trong Trung tâm dữ
10
li
ệu các gen virus cúm ISD (Influenza Sequence Database), t
heo th
ứ tự ký hiệu: Tên
týp virus (serotype)/Loài
đ
ộng vật bị nhiễm/Vùng địa lý phân lập/Số hiệu đăng ký
chủng virus/Thời gian phân lập/Loại hình phân týp (HA(H) và NA(N)). Ví dụ:
A/Chicken/Vietnam/HG4/05(H5N1) (
Hình 1.1A). Đ
ối với các virus đ
ược phân lập
trên ngư
ời bệnh, thì bỏ qua phần động vật bị nhiễm trong danh pháp
(WHO, 2008)
[159]
. Ví d
ụ: A/Vietnam/1203/04(H5N1) (
Hình 1.1B).
Tên
Serotype
Vùng địa
lí phân lập
Số hiệu
chủng
Năm
phân lập
Phân type

HA và NA
A/Ck/VN/HG4/05(H5N1)
Loài
nhiễm
A
Hình 1.1: Sơ đ
ồ danh pháp quốc tế các chủng virus cúm
(WHO, 2008) [159]
(A: Phân l
ập ở các loài động vật;
B: Phân l
ập trên người)
1.1.4.2 Hình thái và c
ấu trúc của virus cúm A
H
ạt virus cúm A (virion) có hình cầu, đường kính 80
-120 nanomet (nm), đôi
khi có d
ạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da
lton (Da). H
ạt virus có
c
ấu tạo đơn giản gồm: màng bao ngoài (envelope), vỏ (capsid) và lõi là RNA sợi
đơn âm (negative single strand)
(Murphy và Webster, 1996) [113] (Hình 1.2).
V
ỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus,
b
ả
n ch

ất cấu tạo l
à màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng nguyên sinh chất của tế
bào nhi
ễm được đặc hiệu hoá gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có
kho
ảng 500 “gai mấu” nhô ra v
à phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10
-14
nm có đư
ờng kính 4
-6 nm, đó là nh
ững kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu
t
ạo l
à glycoprotein gồm: HA, NA, MA (
matrix antigen) và các d
ấu ấn khác của
virus
(Lê Thanh Hoà và cs, 2004) [7], (Zhou và cs, 2007) [165]. Có sự phân bố
không đ
ồng đều giữa các phân tử HA v
à NA (tỷ lệ
kho
ảng 4HA/1NA), đây l
à hai
protein kháng nguyên v
ỏ có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm và lây
nhi
ễm của virus ở tế b
ào cảm nhiễm

(Murphy và Webster, 1996) [113], (Wagner và