Nghiên cứu tạo rễ tơ ở cây sâm dây (Đảng Sâm Codonopsis sp) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
…………………….
KHOA HOÁ
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên : Trần Thị Lệ
Lớp : 08SH
Ngành : Công nghệ sinh học
Khoá : 2008 – 2013
1. TÊN ĐỀ TÀI
Nghiên cứu tạo rễ tơ cây sâm dây (Đảng sâm- Condonopsis sp) thông qua vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes.
2. NỘI DUNG CÁC PHẦN CỦA ĐỒ ÁN
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình
Lời mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
3. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Họ và tên cán bộ hướng dẫn: TS.Phạm Bích Ngọc
4. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 12/12/2013
5. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 28/05/2013
Thông qua bộ môn:
Ngày … tháng … năm 2013
TỔ TRƯỞNG BỘ MÔN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)
TS. Đặng Đức Long TS. Phạm Bích Ngọc
CÁN BỘ PHẢN BIỆN SINH VIÊN THỰC HIỆN
(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)
Trần Thị Lệ
KẾT QUẢ ĐIỂM ĐÁNH GIÁ:……………
Ngày…….tháng… . 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(Ký và ghi rõ họ tên)
Đồ án tốt nghiệp CBHD: TS.Phạm Bích Ngọc
LỜI CẢM ƠN
Sau 6 tháng thực tập tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
được sự giúp đỡ và chỉ dạy tận tình của các thấy cô giáo, các cán bộ của Viện cùng
sự nỗ lực và cố gắng của bản thân, em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình.
Trước tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu nhà trường
và các thầy cô trong khoa Hóa, trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng trong suốt năm
năm qua đã nhiệt tình giảng dạy và trang bị cho em rất nhiều kiến thức.
Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới TS.Phạm Bích Ngọc và TS.Nguyễn
Thị Thúy Hường đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo em để em có thể hoàn thành đề tài
tốt nghiệp của mình.
Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà, TS.Lê Văn
Sơn cùng toàn thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công Nghệ Sinh
học _ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ, truyền
đạt những kinh nghiệm quý báu cho em suốt thời gian thực tập.
Cuối cùng em xin cảm ơn sự quan tâm, động viên của gia đình, toàn thể bạn
bè luôn khuyến khích giúp đỡ em.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013
Sinh viên

Trần Thị Lệ

SVTH: Trần Thị Lệ 3 08SH
Đồ án tốt nghiệp CBHD: TS.Phạm Bích Ngọc
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC HÌNH
Trang
DANH MỤC BẢNG
Trang
SVTH: Trần Thị Lệ 4 08SH
Đồ án tốt nghiệp CBHD: TS.Phạm Bích Ngọc
SVTH: Trần Thị Lệ 5 08SH
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
SVTH: Trần Thị Lệ 6 08SH
2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid
A.rizogenes : Agrobacterium rhizogenes
BAP : 6-Benzylaminopurine
IBA : Indole-3-butyric
MS : Murashige và Skoog, 1962
NAA : Naphthalence acid
Ri plasmid : Root induction plasmid
Rol : Root locus
Sp : Species
Ss T-DNA : Single strain T-DNA
TDZ : Thidiazuron
UV : Ultra violet (tia cực tím)
YMB : Yeast Manitol Broth
SVTH: Trần Thị Lệ 7 08SH
LỜI MỞ ĐẦU
Sâm dây hay còn gọi là Đảng Sâm, là loài dây leo thảo, sống nhiều năm. Theo
sách đỏ Việt Nam thì đẳng sâm là nguồn gen quý và là cây thuốc quý, được sử dụng

phổ biến trong y học dân tộc. Sâm dây có tác dụng bổ ngũ tạng, nâng cao thể lực,
tăng sức dẻo dai, tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể; có tác dụng ích huyết,
sinh tân dịch, chống mệt mỏi, giảm stress. Bộ phận dùng làm thuốc duy nhất của
Đảng sâm là rễ. Rễ cây Đảng sâm chứa saponins, triterpenes và steroid. Các hoạt
chất có trong Đảng Sâm giúp cho các hoạt động trao đổi chất của cơ thể tốt hơn. Về
công dụng, Đảng sâm được dùng thay thế cho nhân sâm trong các bệnh thiếu máu,
da vàng, bệnh bạch huyết, viêm thượng thận, nước tiểu có anbumin, hợp chân phù
đau; dùng làm thuốc bổ dạ dày, chữa ho, tiêu đờm, lợi tiểu. Do có giá trị dược lý và
kinh tế nên hiện nay người dân đang tập trung khai thác rễ cây sâm dây trong rừng
một cách triệt để; làm cạn kiệt và giảm khả năng tái sinh nguồn cây trong tự nhiên.
Vì vậy để bảo vệ nguồn cây dược liệu mang tính đặc hữu của các vùng cần có các
hướng nghiên cứu bảo tồn, nhân giống, phát triển nguồn cây dược liệu này.
Rễ tơ là một bệnh ở thực vật được gây ra bởi quá trình tương tác giữa vi khuẩn
A.rhizogenes và tế bào vật chủ. Đặc biệt rễ tơ là có thể sinh trưởng, phát triển tốt
trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng vì thế loại bỏ
được dư lượng của các chất này trong sản phẩm tạo ra. Hơn nữa các rễ tơ có khả
năng sinh trưởng nhanh, phân nhánh cao, kỹ thuật nuôi cấy và chuyển gen dễ dàng
và có thể được nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền
sản xuất các chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Vì vậy, việc
chuyển từ trồng cả cây sang chỉ nuôi cấy rễ tơ để thu các hợp chất thứ cấp quan
trọng được nghiên cứu phát triển rất nhanh do tiềm năng to lớn trong ngành công
nghiệp dược. Ứng dụng công nghệ nuôi rễ tơ sẽ góp phần tạo nguồn dược liệu quý
phục vụ sức khỏe cộng đồng và đóng góp cho công tác bảo tồn các cây dược liệu
quý của Việt Nam.
SVTH: Trần Thị Lệ 8 08SH
Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu thực tiễn trên chúng tôi thực hiện đề
tài “Nghiên cứu tạo rễ tơ ở cây sâm dây (Đảng Sâm - Codonopsis sp.) thông qua
vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes” với nội dung bao gồm:
1) Xây dựng qui trình nhân nhanh in vitro cây sâm dây
2) Xây dựng qui trình chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium

rhizogenes
3) Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen.

SVTH: Trần Thị Lệ 9 08SH
Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây sâm dây
Cây sâm dây hay còn gọi là cây Đảng Sâm. Cây Đảng Sâm là một loài dây
leo, củ dùng làm thuốc bổ. Tại Kontum, dân địa phương thường gọi là cây “ Hồng
đảng sâm”. Cây còn có nhiều tên khác như “cây đùi gà”, “mằn ráy cáy” (dân tộc
Tày), “co nha đòi” (Thái), “ canh ho” (H’Mông).
Trong Đông y, vị thuốc đảng sâm được khai thác từ nhiều loài khác nhau,
cùng thuộc chi Codonopsis- thuộc họ hoa chuông (Campanulaceae).
Tại Việt Nam thường gặp loài có tên khoa học là Codonopsis javanica
(Blume) Hook. Loài này phân bố ở độ cao 900-2200m, có ở hầu hết các tỉnh miền
núi. Tập trung nhất ở Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang…ở phía Nam, có ở núi Ngọc
Linh và vùng Đà Lạt. Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng, thường mọc
tương đối tập trung ở các vùng nương rẫy cũ, ven rừng, nhất là loại hình rừng núi đá
vôi sau khi đã bị khai phá để lấy đất canh tác [ 25].
1.1.1. Phân loại
Giới : Plantae
Phân giới : Tracheobionta
Nhóm lớn : Spermatophyta
Nhóm : Magnoliophyta
Lớp : Magnoliopsida
Phân lớp : Asteridae
Bộ : Campanulales
Họ : Campanulaceae
Giống :Codonopsis Wall.
Loài : Codonopsis sp
Hình 1.1. Cây sâm dây

1.1.2. Đặc điểm hình thái
Sâm dây là một loại cây thảo sống lâu năm. Mọc bò hay leo bằng thân quấn,
phân nhánh nhiều, phía dưới hơi có lông, phía ngọn nhẵn. Toàn cây có nhựa mủ
SVTH: Trần Thị Lệ 10 08SH
trắng. Lá mọc đối, ít khi mọc so le, gốc lá hình tim, đầu lá nhọn, phiến lá mỏng hình
trứng rộng, dài 3 - 8cm, rộng 2 - 4cm; mép nguyên lượn sóng hoặc hơi khía cưa;
mặt trên màu lục nhạt; mặt dưới màu trắng xám, nhẵn hoặc có lông rải rác. Hoa
mọc riêng ở kẻ lá. Có cuống dài 2 - 6cm. Đài có 5 phiến hẹp; tràng hình chuông,
màu trắng hoặc hơi vàng, có vân tím ở cọng; chia 5 thùy, nhị 5, chỉ nhị hơi dẹt; bao
phấn đính gốc; bầu hình cầu có 5 ô. Quả nang hình cầu, có 5 cạnh mờ, đầu bẹt, phía
trên có một núm nhỏ hình nón, đường kính 1 - 2cm, có đài tồn tại; khi chín màu tím
hoặc đỏ; hạt nhiều, màu vàng nhạt, bóng. Rễ hình trụ dài, đường kính có thể đạt 1-
1,7cm. Đầu rễ phình to, trên có vết sẹo lồi của thân cũ, phía dưới thường phân
nhánh, mặt ngoài màu vàng nhạt, khi khô màu xám [ 26 ].
1.1.3. Giá trị dược liệu
1.1.3.1. Các hoạt chất sinh học trong cây sâm dây
Từ xa xưa, trong y học cổ truyền, lang y đã biết dùng củ sâm phơi khô để
dùng trong các bài thuốc chữa bệnh, bồi bổ sức khỏe. Ngày nay, với sự phát triển
của khoa học, con người đã biết tách chiết riêng những thành phần có tính chất
dược trong củ sâm tạo thành thuốc. Công nghệ tách chiết hoạt chất đã giúp cho việc
không phải sử dụng nguyên củ sâm cùng những thành phần không có công dụng
chữa bệnh cũng như bồi bổ sức khoẻ.
Các loài sâm nói chung cũng như sâm dây nói riêng chứa rất nhiều hoạt chất
sinh học. Các hoạt chất này có nhiều tính chất dược và được sử dụng nhiều để làm
thuốc. Trong các loài sâm thường chứa các hoạt chất như: terpen, acid amin, hợp
chất glycosid, vitamin, các nguyên tố khoáng, alkaloid và hợp chất saponin. Thành
phần saponin, được hiểu như là hoạt chất chính tạo nên những công dụng của nhân
sâm. Sâm càng có nhiều thành phần này thì càng tốt.
Trong rễ cây sâm dây chứa thành phần chủ yếu là saponin, ngoài ra còn có:
stigmasterol, α-spinasterol, inulin, fructose, choline, caproic acid, enanthic acid,

pinen và các alkanloid . Trong rễ cây sâm dây chứa nhiều loại acid amin (khoảng
17 loại), tuy liều lượng không cao nhưng mang đầy đủ các loại acid amin cần thiết
cho cơ thể.
Bảng 0.1. Hoạt chất có trong đảng sâm việt nam
Stt Nhóm chất Kết quả stt Nhóm chất Kết quả
1 Đường khử + 6 Glycosid -
SVTH: Trần Thị Lệ 11 08SH
2 Chất béo + 7 Flavonoid -
3 Acid amin + 8 Tanin -
4 Saponin + 9 Coumarin -
5 Alkaloid -
Tác giả Hoàng Minh Giám đã thực hiện thu thập mẫu cây sâm dây – đảng sâm
tại Lào Cai. Trải qua các thí nghiệm, tác giả đã xác định được thành phần hợp chất
chủ yếu có trong rễ đảng sâm. trong rễ sâm gồm các thành phần như: đường khử,
chất béo, acid amin và đặc biệt là saponin.
1.1.3.2. Tác dụng dược lý
Theo lương y Vũ Quốc Trung, củ sâm đất có tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng,
làm long đờm , nhưng với liều cao có thể gây nôn mửa và ra nhiều mồ hôi. Dân
gian thường lấy củ sâm đất ngâm rượu uống; lá nấu canh ăn giúp giải nhiệt cơ thể,
làm mát gan. Canh rau sâm đất ăn có vị ngọt, hơi chua giống như rau mồng tơi,
nhưng không có nhớt. Sâm đất có các tác dụng trị liệu, như trong chứng viêm khớp
nó giúp giảm viêm sưng và giảm đau.
Sâm đất còn giúp giảm táo bón. Dùng sâm đất giúp giảm cơn ho và suyễn;
dùng cho một số trường hợp nam giới bất lực. Sâm đất được dùng nhiều trong
những bệnh về da như ghẻ; dùng làm bài thuốc trị giun sán; dùng trong bệnh sỏi
thận, viêm thận; giải độc cho gan.
Còn theo lương y Như Tá, bộ phận dùng toàn cây (phần thân trên mặt đất) và rễ. Lá
có vị hơi đắng, cay; tính lạnh, có ít độc (gây nôn nếu dùng liều cao). Rễ có vị ngọt,
cay, tính mát. Công dụng: thanh nhiệt (hạ sốt), lợi niệu, giải độc. Chủ trị, toàn cây
chữa tiểu đường dạng 2. Rễ dùng chữa đau răng, đau bụng, cảm mạo, bệnh gan, cao

huyết áp, tiểu đường, nhiễm trùng đường tiểu [27].
1.1.4. Tình hình nghiên cứu về sâm dây
Các nghiên cứu trong nước
SVTH: Trần Thị Lệ 12 08SH
Trong nước, các nghiên cứu trên cây sâm dây chủ yếu là về phân tích thành
phần hóa học và các tác dụng dược lý của vị thuốc quý này. Năm 2002, công trình
“Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của vị thuốc đảng sâm Việt Nam” của
Hoàng Minh Chung, Phạm Xuân Sinh và Nguyễn Mạnh Tuyển; được đăng trên tạp
chí dược liệu, tập 7 số 1/2002. Đây là nghiên cứu lần đầu tiên công bố các thành
phần hóa học của cây đảng sâm Việt Nam. Bằng một số phương pháp định tính và
định lượng trên các mẫu củ sâm sống và cao sâm, nhóm tác giả đã nhận thấy đặc
điểm thực vật của cây sâm dây mọc ở sapa; các thành phần có trong rễ sâm dây khô
và tươi: đường khử, acid amin, chất béo và saponin; thành phần và hàm lượng của
các loại acid amin có trong rễ sâm dây.
Cũng chính hai tác giả Hoàng Minh Chung và Phạm Xuân Sinh cũng đã công
bố kết quả những nghiên cứu về hợp chất saponin có trong sâm dây. Loại saponin
chủ yếu là saponin tritecpenoid, hàm lượng saponin vào khoảng 3.12 ± 0.08 %.
Ngoài ra, nhóm tác giả cũng đã công bố về hàm lượng đường khử khoảng 14.6 ±
11.2 % đối với các mẫu cây sống, và 29.5 ± 0.9 % đối với các mẫu đã qua chế biến.
Các nghiên cứu ngoài nước
Các nghiên cứu ngoài nước chủ yếu được thực hiện trên các loài họ hàng của
cây đảng sâm Việt Nam Codonopsis sp. Do điều kiện khoa học tiến bộ nên các khía
cạnh nghiên cứu cũng rất đa dạng.
Slupki và đtg (2011) đã công bố về quá trình vi nhân giống cây Codonopsis
pilosula. Nhóm nghiên cứu đã tìm ra môi trường tối ưu cho sự phát sinh chồi từ
chồi nách là 0,1 mg/l BAP kết hợp với 0,1 mg/l NAA số lượng chồi có thể thu được
lên tới 69 chồi/ nách. Tỉ lệ cây tạo rễ in vitro là 98% trong môi trường MS bổ sung
0,5 mg/l IAA.
Peng Jin Huan và đtg (2010) đã công bố qui trình tạo mô sẹo từ lá là tốt nhất
trong các nguồn nguyên liệu đoạn thân, hạt ở Codonopsis lanceolata.

SVTH: Trần Thị Lệ 13 08SH
Bên cạnh đó còn rất nhiều nghiên cứu về xác định thành phần hóa học và công
dụng của chúng, các phương pháp chiết xuất hợp chất trong các loài Codonopsis sp
ứng dụng trong lĩnh vực y dược.
1.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1.1. Tính toàn năng của tế bào
Gottlieb Haberlandt lần đầu tiên đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế
bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách rời”. Theo ông, mỗi
tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ thông tin di truyền của
cơ thể đó và có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận
lợi. Ðó chính là tính toàn thể của tế bào.
Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của
phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến nay, người ta đã hoàn toàn
chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào riêng lẻ.
1.2.1.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào
Cơ thể sinh vật trưởng thành gồm nhiều cơ quan có chức năng khác nhau
được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó
đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu. Ở giai đoạn đầu, tế bào phân chia thành nhiều
tế bào phân sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hoá). Sau đó, từ các tế
bào phân sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hoá đặc
hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau.
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phân sinh thành các tế bào mô
chuyên hoá, đảm nhiệm các chức năng khác nhau. Tuy nhiên khi tế bào đã phân hoá
thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng
biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể
trở về dạng tế bào phân sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là quá trình
phản phân hoá tế bào, ngược lại với quá trình phân hoá tế bào.
SVTH: Trần Thị Lệ 14 08SH
Như vậy, quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là

kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào dựa trên tính toàn thể của tế
bào thực vật.
Do đó, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật xét cho đến cùng là kỹ thuật
điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong
điều kiện nhân tạo vô trùng) một cách có định hướng dựa vào sự phân hoá và phản
phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn thể của tế bào thực vật.
1.2.2. Sự phát sinh hình thái thực vật
Phát sinh hình thái là sự phát triển của tế bào, mô, cơ quan thực vật theo thời
gian, từ lúc khởi đầu cho đến lúc trưởng thành, để hoàn tất chu trình phát triển. Bao
gồm các quá trình:
- Phát sinh mô (histogenesis)
- Phát sinh cơ quan (organogensis)
- Phát sinh phôi (embryogenesis)
Quá trình phát sinh hình thái đã bắt đầu được nghiên cứu vào đầu những năm
1900 với lý thuyết của Haberlandt là có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ tế bào
sinh dưỡng. Những nghiên cứu đầu tiên trên mô sẹo Thuốc lá của Miller và Skoog
cho thấy auxin và cytokinin có thể dùng trong nuôi cấy phát sinh hình thái.
Với những bước tiến về vi nhân giống và kỹ thuật di truyền, đã có hàng trăm
loài thực vật được nuôi cấy thành công trên nhiều loại mô khác nhau với nhiều phát
sinh hình thái khác nhau. Có nhiều loài thực vật khó nuôi, không hình thành rễ, chồi
trong nhiều điều kiện nuôi cấy không giống nhau. Việc phát triển mô hình nuôi cấy
tái sinh thành công ở những loài thực vật khó tái sinh sẽ hữu ích trong việc nâng cao
tầm hiểu biết của chúng ta về những cơ chế cơ bản điều khiển phát sinh hình thái.
Hầu hết những tế bào thực vật đều có tính toàn thể, hay khả năng tái sinh
thành cây hoàn chỉnh. Tuy nhiên, sự thể hiện đặc tính này có giới hạn một cách
tương đối ở những tế bào, được xác định bởi Torrey (1966) như là những vùng mô
SVTH: Trần Thị Lệ 15 08SH
phân sinh. Đây là những vùng tế bào có đầy đủ khả năng phát sinh hình thái: có khả
năng thích ứng với môi trường nuôi cấy trong biệt hóa chồi, rễ hay phôi. Như vậy,
để tái sinh cây, mô nuôi cấy cần phải có những vùng mô phân sinh hay có những tế

bào có khả năng chuyển hóa thành những vùng mô phân sinh.
Vùng mô phân sinh được phát hiện trong khối mô sẹo khi nó được phát sinh
trực tiếp bằng cách phân bào là những cụm nhỏ có cấu trúc chặt, có hai cực, tế bào
có màng mỏng với nhân điển hình, tế bào chất đậm đặc và có không bào nhỏ.
Nhu mô đỉnh sinh trưởng và phôi chưa chín thuần thục có chứa nhiều tế bào
với hình dạng tương tự và những loài này có khả năng phản ứng với môi trường
nuôi cấy có hormone.
Sự phát sinh cơ quan
Phát sinh cơ quan là quá trình các tế bào và mô tạo ra cấu trúc một cực, cực
chồi hoặc cực rễ. Đây là một quá trình liên quan đến sự tăng sinh và sự phân hóa tế
bào, phụ thuộc vào thành phần và hàm lượng của các chất điều hòa tăng trưởng thực
vật khác nhau. Phát sinh cơ quan có thể xảy ra theo hai con đường: phát sinh trực
tiếp hoặc gián tiếp.
1.2.2.1. Phát sinh cơ quan trực tiếp
Phát sinh cơ quan trực tiếp bao gồm sự hình thành chồi và rễ trực tiếp từ mẫu
cấy mà không thông qua giai đoạn tạo mô sẹo.
a. Sự hình thành chồi bất định
Chồi bất định xuất hiện không chỉ từ mô phân sinh chóp mà còn xuất hiện
gần vết thương, gần vết cắt, gần vùng phát sinh libe-mộc hoặc ngoài biểu bì, vì vậy
chồi có thể có nguồn gốc nội sinh hoặc ngoại sinh do một sự phản biệt hóa các tế
bào trưởng thành. Chúng cũng khởi sự bằng những phân chia tế bào và sắp xếp tế
bào giống như mô phân sinh chóp và có mạch gắn liền với mạch của thân.
Mô phân sinh ngọn chồi có thể hình thành từ tế bào biểu bì, mô giậu, mô
khuyết hay mô bao quanh mạch của mô cấy. Trước khi biệt hóa để hình thành tầng
phát sinh mới của chồi, tế bào đã biệt hóa phải trải qua quá trình phản biệt hóa. Sự
SVTH: Trần Thị Lệ 16 08SH
phản biệt hóa này có thể được cảm ứng trên cây bằng cách kìm hãm các hiệu ứng
cản tương quan (gỡ ưu tính ngọn bằng cách cắt bỏ chồi ngọn) hay trên mô cấy nhờ
các môi trường nuôi cấy có bổ sung các chất điều hòa thích hợp. Có hai giai đoạn
xảy ra trong quá trình tái sinh: giai đoạn phản biệt hóa và giai đoạn tái biệt hóa.

Trong giai đoạn phản biệt hóa, tế bào đã biệt hóa bắt đầu phân chia, các bào
quan bên trong tế bào biến đổi để trở về trạng thái của các tế bào mô phân sinh thứ
cấp (hạch nhân, không bào lớn dần và ti thể, lạp thể phân chia thành các bong nhỏ).
Một vài biến đổi khác có thể xảy ra trước khi bắt đầu giai đoạn khử phân hóa: mất
dần tinh bột dự trữ trong các lạp thể hoặc tích lũy tinh bột dữ trữ và một số chất
khác, nhưng sự tích lũy như vậy có thể làm chậm sự tạo mô phân sinh.
Sau đó là bước chuyển tiếp từ tế bào ở trạng thái mô phân sinh thứ cấp sang
trạng thái mô phân sinh sơ cấp có khả năng sinh cơ quan. Có sự phân chia không
bào thành những không bào nhỏ. Tế bào có thể tích nhỏ dần, vách mỏng, tế bào chất
đậm đặc, nhân và hạch nhân rất to.
Tiếp theo là giai đoạn tái phân hóa của mô phân sinh sơ cấp. Tế bào trở lại
trạng thái mô phân sinh thứ cấp. Sự tái phân hóa cũng qua hai bước: bước một, tế
bào trở về trạng thái mô phân sinh hoạt động, các không bào trương nước và hợp
thành không bào trung tâm, kích thước tế bào gia tăng, ti thể dần trở về hình dạng
đặc trưng; bước hai, các lạp thể phân hóa, các chất sống căn bản (hạch nhân, tế bào
chất…), chất dự trữ, các chất tiết (tanin, tinh dầu…) được tổng hợp. Sau đó, các tế
bào này có thể trở lại giai đoạn phân chia tế bào mới hay trực tiếp phân hóa mà
không qua sự phân chia tế bào.
Trong tự nhiên, sự tạo mới chồi trực tiếp có thể xảy ra ở các chỗ khuyết trên
lá một số loại Sống đời, từ mô phân sinh trong gân lá Dương xỉ.
b. Sự hình thành rễ bất định
Rễ bất định có thể có ở trụ hạ diệp của một cây con, ở các mấu và lóng của
thân và ở rễ. Hầu hết rễ bất định phát sinh kiểu nội sinh, mặc dù vẫn có những
trường hợp phát sinh ngoại sinh. Các rễ bất định có thể nảy sinh từ các mầm nằm
SVTH: Trần Thị Lệ 17 08SH
yên và vẫn ngủ cho đến khi được kích thích để sinh trưởng hoặc chúng có thể là hệ
thống tổ chức mới.
Sự hình thành rễ bất định gồm ít nhất là hai giai đoạn có thể phân biệt được
dưới kính hiển vi: giai đoạn tạo sơ khởi rễ từ vài tế bào của tầng phát sinh libe-mộc
hay chu luân và giai đoạn kéo dài sơ khởi rễ này.

Rễ bất định thường được khởi sinh ở vùng lân cận của các mô mạch dẫn
đang phân hóa của cơ quan đã tạo ra chúng. Nếu cơ quan này còn non, sơ khởi rễ
bất định được khởi sinh bằng một nhóm tế bào gần ngoại vi của hệ thống mạch dẫn.
Nếu cơ quan đó già hơn, vị trí khởi sinh nằm sâu hơn, gần với tầng sinh mạch. Ở
các thân non, các tế bào tạo ra sơ khởi rễ thường được hình thành từ mô mềm giữa
các bó mạch dẫn.
Ở những thân già hơn, chúng hình thành từ một tia mạch. Đôi khi rễ bất
định được khởi sinh bằng cách phân chia trong vùng tầng phát sinh. Rễ bất định
xuất phát từ vùng giữa các tia mạch hoặc ở tầng phát sinh làm cho rễ gần với libe-
mộc của cơ quan mẹ. Điều này thuận lợi cho việc thiết lập đường nối mạch giữa hai
cơ quan này.
1.2.2.2. Phát sinh cơ quan gián tiếp
Phát sinh cơ quan gián tiếp bao gồm sự hình thành mô sẹo, mô sẹo tăng sinh
và sau đó hình thành chồi hoặc rễ từ mô sẹo này.
a. Sự tạo mô sẹo
Mô sẹo là khối tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường
được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ.
Do đó, cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành dễ cho mô
sẹo trong điều kiện nuôi cấy in vitro dưới tác động của một auxin mạnh được áp
dụng riêng lẻ hay phối hợp với cytokinin.
Sự tạo mô sẹo, nhờ auxin, thuộc một trong ba quá trình:
- Sự phản phân hóa của các tế bào nhu mô.
SVTH: Trần Thị Lệ 18 08SH
- Sự phân chia của các tế bào tượng tầng.
- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ). Quá trình này
được ưu tiên áp dụng ở cây một lá mầm, vì các cây này không có các tượng tầng
điển hình, và các tế bào nhu mô khó phản phân hóa (so với cây hai lá mầm).
Tuy nhiên, mô sẹo cũng có thể được hình thành từ sự phân chia của các tế
bào biểu bì như ở cây Trạng nguyên Euphorbia pulcherrima Willd.
Sự tạo mô sẹo cần phải chú ý đến tình trạng sinh lý của mô cấy, sử dụng

auxin riêng lẻ hay phối hợp với cytokinin, bản chất và nồng độ của auxin.
b. Sự hình thành chồi và rễ gián tiếp
Nhìn chung sự hình thành chồi và rễ gián tiếp theo 2 cách:
- Trên mô sẹo được tạo ra từ mẫu cấy ban đầu. Sự tạo cơ quan xuất hiện
trong suốt quá trình hình thành mô sẹo ban đầu. Có thể khó phân biệt với quá trình
phát sinh cơ quan trực tiếp.
- Trên mô sẹo có khả năng phát sinh hình thái đã được cảm ứng nhưng chưa
hình thành cơ quan cho đến khi được chuyển sang môi trường khác.
Những nghiên cứu trước đây cho rằng môi trường nuôi cấy với chất điều hòa
sinh trưởng thực vật ngoại sinh cảm ứng sự tạo mô sẹo sẽ thúc đẩy sự hình thành
một khối mô không xác định chứa những sơ khởi cơ quan. Những sơ khởi này sẽ
phát triển thành cơ quan xác định khi được chuyển vào môi trường thứ hai (môi
trường có tỷ lệ chất điều hòa sinh trưởng thực vật phù hợp cho sự phát sinh cơ quan
chồi hoặc rễ).
Một điều được các tác giả lưu ý trong sự tái sinh cây từ mô sẹo là nguy cơ
biến dị thế hệ. Những biến đổi về di truyền sẽ xảy ra khi cây được tái sinh từ mô sẹo
được cấy chuyền qua nhiều lần và duy trì trong thời gian dài.
1.3. Phương pháp chuyển gen tạo rễ tơ vào tế bào thực vật thông qua
Agrobacterium rhizogenes
SVTH: Trần Thị Lệ 19 08SH
Các phương pháp chuyển gen vào thực vật có thể chia là hai phương thức:
(1) Chuyển gen trực tiếp: bằng súng bắn gen, vi tiêm, xung điện siêu âm, hút chân
không hay bằng hóa chất. (2) Chuyển gen gián tiếp thông qua vi sinh vật trung gian
(virus hoặc vi khuẩn). Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A.tumefaciens và
A.rhizogenes được sử dụng rộng rãi hơn cả, vì phương pháp này dễ sử dụng, ít tốn
kém nhưng mang lại hiệu quả cao (lượng bản sao gen biến nạp ít tạo thuận lợi cho
việc phân tích cây chuyển gen và không gây tổn thương tế bào). Hầu hết các nghiên
cứu chuyển gen vào cây lâm nghiệp đã công bố đều sử dụng vector trung gian là vi
khuẩn Agrobacterium.
1.3.1. Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và cơ chế chuyển gen

1.3.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

Hình 0.2. Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Agrobacterium rhizogenes (tên cũ Phytomonas rhizogenes) được định danh
lần đầu tiên cách đây hơn 70 năm. Vi khuẩn A.rhizogenes là tác nhân gây bệnh ở
thực vật: hội chứng tạo rễ tơ hay bệnh rễ nhày. A.rhizogenes là vi khuẩn đất hình
que, gram âm, thuộc chi Agrobacterium.
Vi khuẩn đất gram âm A.rhizogenes, gây bệnh rễ tơ ở thực vật hai lá mầm.
Giống như vi khuẩn A.tumefaciens mang Ti-Plasmid, A.rhizogenes mang Ri (root-
inducing) plasmid và plasmid này đã được xác định là tác nhân gây bệnh rễ tơ ở các
mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm. Khi tế bào thực vật bị thương tiết ra polyphenol
hấp dẫn các vi khuẩn, tại đây nó chuyển một đoạn T-DNA (tranfer DNA) từ Ri-
plasmid vào hệ gen của tế bào vật chủ. Nhìn chung cơ chế quá trình xâm nhiễm và
SVTH: Trần Thị Lệ 20 08SH
cơ chế phân tử của quá trình vận chuyển T-DNA vào tế bào vật chủ của hai vi
khuẩn này được chứng minh là tương tự nhau. Tuy nhiên sự hình thành khối u ở vi
khuẩn A.tumefaciens do gen mã hóa sinh tổng hợp auxin quy định. Trong khi đó,
các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin ở vi khuẩn A.rhizogenes có vai trò rất nhỏ trong
quá trình hình thành rễ tơ ở thực vật.
1.3.1.2. Cấu trúc của Ri-plasmid và T-DNA
Hình 1.3.Cấu trúc Ri-plasmid
Giống như T-plasmid, Ri-plamid là phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có
trọng lượng phân tử lớn từ 200-800kb gồm hai vùng chính là T-DNA và vir
(virulence). Dựa vào khả năng sinh tổng hợp các opine ở rễ tơ, Ri-Plasmid được
chia làm hai nhóm chính: agropine và manopine, và một số nhóm phụ được tìm
thấy và phân loại này như cucumopine và mikimopine. Trong đó các chủng thuộc
nhóm agropine ( A
4
, 15834, LBA9042) được chứng minh là độc hơn so với chủng
thuộc nhóm mannopine (8196, TR

7
, TR
101
) và các chủng này được sử dụng chủ yếu
trong nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật.
T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine bao gồm hai vùng chính là vùng
biên trái T
L
-DNA và vùng bên phải T
R
-DNA. Hai vùng này đều có kích thước
khoảng 15-20kb và được xen kẽ bới một đoạn DNA, đoạn DNA này sẽ không được
chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ. Vùng T
R
-DNA mang gen mã hóa sinh tổng
hợp auxin (tms1 và tms2), vùng T
L
-DNA bao gồm 18 khung đọc mở (ORFs), trong
đó có 4 loci 10, 11, 12 và 15 mã hóa cho rolA, B, C và D (root locus). Các Ri-
plasmid của chủng A.rhizogenes thuộc hóm manopine, cucumopine và mikmopine
SVTH: Trần Thị Lệ 21 08SH
chứa vùng T-DNA đơn, có cấu trúc giống như vùng T
L
-DNA của chủng thuộc
nhóm agropine nhưng khuyết gen rolD. Các gen rolA, rolB, rolC đóng vai trò quan
trọng trong quá trình cảm ứng tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật. Sự biểu hiện đồng thời
của 3 gen này gây nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm. Các rễ
này có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh hơn rất nhiều so với rễ bình
thường. Trong 3 gen rol trên, gen rolB đóng vai trò quan trọng hơn cả. Khi rolB
được biểu hiện, mô tế bào thực vật đã cảm ứng tạo kiểu hình rễ tơ, trong khi đó bất

hoạt gen rolB không tạo được kiểu hình rễ tơ.
1.3.1.3. Cơ chế của quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật
Hình 1.4. Mô hình chuyển gen nhờ Agrobacterium
(1)_ Agrobacterium nhận dạng và tấn công tế bào chủ; (2)_ Tổ hợp tín hiệu
VirA/VirG của Agrobacterium cảm nhận những tín hiệu thực vật đặc trưng; (3)_ Sự
hoạt hóa vùng gen Vir; (4)_ T-DNA được tách ra khỏi Ri-plasmid nhờ phức hợp
protein VirD
1
/D
2
; (5)_ Sự tạo thành phức hợp VirD
2
-DNA ( phức hợp -T chưa
thành thục), cùng một vài protein Vir khác đi vào nguyên sinh chất tế bào chủ;
(6)_Sự kết hợp của VirE
2
với sợi -T tạo thành phức hợp -T thành thục xuyên qua
nguyên sinh chất tế bào chủ; (7)_Phức hợp -T thành thục chủ động đi vào nhân tế
SVTH: Trần Thị Lệ 22 08SH
bào chủ; (8)_T-DNA bị hấp dẫn tới vị trí hợp nhất; (9)_T-DNA tách khỏi các
protein bảo vệ; (10)_T-DNA hợp nhất vào bộ gen chủ.
Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A.rhizogenes sang tế bào cây chủ
được thực hiện bởi hoạt động của các gen vir A, B, C, D, E, G, F, trong đó virC và
virE có tác dụng làm tăng tần số biến nạp. Các gen này có vai trò quan trọng trong
việc nhận diện ra vết thương của cây thông qua tín hiệu hoá học
acetosyringone(AS). Tín hiệu hoá học được nhận biết đầu tiên bởi virA. Gen virA
sẽ tổng hợp nên một loại protein nằm trong màng tế bào để đáp ứng sự trao đổi chất
của vết thương trên cây. Protein virA tự photphoryl hoá đồng thời làm cho protein
virG được photphoryl hoá và kích hoạt sao mã của các gen virB, C, E, F, G. Tiếp
đó các protein được mã hoá bởi virD, virE thực hiện chức năng giải phóng sợi T-

DNA. Protein D2 cắt T-DNA tại vị trí 5’ của bờ phải và 3’ của bờ trái và giải phóng
sợi T-DNA. Protein E2 bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của enzym nuclease trong
cây. Đồng thời thực hiện chức năng này có các protein virC1, virC2 có tác dụng
tăng cường việc giải phóng T-DNA. Sự chuyển phức hợp T-DNA do operon virB
đảm nhiệm. VirB có chức năng tạo kênh xuyên qua màng tế bào giúp chuyển sợi
đơn T-DNA vào nhân tế bào. Đồng thời protein virB4, virB11 có hoạt tính ATPase
cung cấp năng lượng cho vận chuyển T-DNA. Như vậy, thực chất đã có một hệ
thống chuyển gen của vi khuẩn đất vào cây trồng tồn tại trong tự nhiên.
Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào,
chúng gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối
loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u (trường hợp A.tumefaciens) hoặc rễ
tơ (trường hợp A.rhizogenes). Khả năng chuyển gen này đã được khai thác để
chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn.
1.3.1.4. Tương tác giữa T-DNA và genome tế bào thực vật
Trong tế bào thực vật, phức ssT-DNA được đưa qua màng nhân vào nhân.
Hai protein đóng vai trò quan trọng trong bước này là VirD
2
và VirE
2
. Tín hiệu định
vị trong nhân của VirD
2
và VirE
2
đóng vai trò chủ yếu. Protein VirD
2
có chức năng
xác định vị trí cho T-DNA trong nhân. Phức ssT-DNA là nucleoprotein lên đến
20Kb chứa một đầu 5’ gắn với protein VirD
2

. Nhưng phức hợp được bao bởi số
SVTH: Trần Thị Lệ 23 08SH
lượng lớn phân tử VirE
2
và mỗi phức này có hai tín hiệu định vị trong nhân. Hai tín
hiệu này của VirE
2
đóng vai trò quan trọng đối với việc nhận liên tục phức T-DNA
của nhân, có khả năng kích thích mở lỗ màng nhân. Khả năng nhận phức của nhân
được điều khiển bởi protein kết hợp tín hiệu định vị trong nhân, protein này được
tìm thấy trong tế bào chất của tế bào thực vật.
Bước cuối cùng trong quá trình vận chuyển T-DNA là sự tương tác trong
genome tế bào thực vật. Các phản ứng trong sự tương tác T-DNA không có tính
điển hình. Sự tương tác này tìm thấy bởi sự tái tổ hợp không theo quy luật. Theo
cách nhìn nhận này việc cắt bỏ bớt base, như microhomologies, được cần đến đối
với bước lặp lại giữa cặp vận chuyển T-DNA với VirD
2
và DNA thực vật. Sự tương
đồng này rất thấp và cung cấp đặc trưng nhỏ nhất đối với quá trình tái tổ hợp bởi sự
xác định vị trí của VirD
2
để gắn kết. Ở trình tự gần kề hay đầu 3’ của T-DNA tìm
thấy một vài sự tương đồng nhỏ với DNA thực vật, kết quả ở sự tương tác đầu tiên
giữa sợi T-DNA và DNA thực vật là tạo lỗ hổng ở sợi 3’-5’ của DNA thực vật. Sau
đó DNA thực vật được cắt ở vị trí đầu 3’của lỗ hổng bởi sợi endonuclease và
nucleotide của đầu 5’ bắt cặp với VirD
2
bới một nucleotide trong đầu sợi (5’-3’)
DNA thực vật. Phần 3’ nhô ra của T-DNA cũng như DNA thực vật thay thế bị phân
hủy bởi endonuclease hay 3’-5’ exonuclease. Đầu 5’ của T-DNA gắn với VirD

2
còn
đầu 3’ kia cặp đôi với DNA dưới của thực vật kéo dài từ bước đầu của quá trình
tương tác, nối liền với vết cắt trong sợi DNA dưới của thực vật. Sự đưa vào của sợi
T-DNA trong sợi 3’-5’ của DNA thực vật được bổ sung, tình trạng xoắn sinh ra bởi
vết cắt trong sợi đối ngược được sản sinh.
Tình trạng này hoạt hóa phản ứng sửa chữa của tế bào thực vật và sợi bổ
sung được tổng hợp sử dụng để chèn dễ dàng sợi T-DNA như là sợi khuôn. VirD
2
có vai trò hoạt hóa trong sự hòa hợp chính xác sợi T-DNA vào nhiễm sắc thể thực
vật. Phóng thích protein VirD
2
có thể cung cấp năng lượng chứa đựng trong các liên
kết phosphodieste, như Tyr29 với nucleotit đầu tiên của sợi T-DNA, quy định đầu
5’ của sợi T-DNA để nối vào DNA thực vật. Khi protein VirD
2
bị đột biến được vận
chuyển gắn vào sợi T-DNA, quá trình tương tác với vị trí phù hợp với nucleotit của
đầu 5’ của sợi T-DNA không còn.
SVTH: Trần Thị Lệ 24 08SH
1.3.2. Rễ tơ
1.3.2.1. Giới thiệu về rễ tơ
Rễ tơ được tạo ra do sự chuyển gen sử dụng hệ thống vector tự nhiên từ tác
nhân bệnh – Agrobacterium rhizogenes, vi khuẩn đất gram âm vào tế bào thực vật.
Trong quá trình xâm nhiễm vào mô thực vật bị thương, vi khuẩn này chuyển T-
DNA, một phần của Ri-plasmid vào bộ gen tế bào chủ. Những chủng vi khuẩn
thuộc nhóm agropine có hoạt lực mạnh, T-DNA chứa 2 phần riêng rẻ được gọi là
TL-DNA, mang những gen rol cảm ứng cho sự hình thành kiểu hình rễ tơ, và TR-
DNA mang một số gen mã hóa ra enzyme điều hòa sự sinh tổng hợp và xác định sự
cân bằng hormone trong những rễ đã chuyển gen. Sau khi A.rhizogens xâm nhiễm

vào mô, rễ hình thành và phát triển từ vị trí bị thương, được cắt ra, và sau đó chuyển
sang môi trường lỏng lắc để tăng sinh khối. Rễ tơ có thể sinh trưởng và phát triển
tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng, vì thế loại bỏ
được dư lượng các hợp chất này trong sản phẩm tạo ra. Hơn nữa rễ tơ có khả năng
sinh trưởng nhanh, phân nhánh cao, kỹ thuật nuôi cấy và chuyển gen dễ dàng và có
thể được nuôi cấy và tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền
sản xuất các hợp chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Rễ tơ có thể
sản xuất một lượng lớn các hợp chất thứ cấp và rễ tơ là cơ quan biệt hóa nên có sự
di truyền ổn định hơn nuôi cấy tế bào huyền phù và mô sẹo.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo rễ tơ: độ tuổi cây, loại mô, loại cây,
chủng vi sinh vật, nồng độ khuẩn gây lây nhiễm, thời gian đồng nuôi cấy, thời gian
ngâm mẫu.
1.3.2.2. Ứng dụng của nuôi cấy rễ tơ
Từ những ngày đầu được phát hiện cho đến nay, công nghệ nuôi cấy rễ tơ đã
và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhờ vào những ưu điểm của
mình. Rễ chuyển gen có đặc tính là tốc độ sinh trưởng nhanh và tính di truyền ổn
định. Rễ tơ có thể sản xuất một lượng lớn hoạt chất thứ cấp hay hàng loạt hợp chất
có liên quan tới thực vật.
a) Sản xuất hợp chất thứ cấp.
SVTH: Trần Thị Lệ 25 08SH