nghiên cứu khảo sát điều kiện chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn agrobacterium rhizogenes ở sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM



ðINH THỊ LAN


NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT ðIỀU KIỆN
CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ THÔNG QUA VI KHUẨN
AGROBACTERIUM RHIZOGENES Ở SÂM NGỌC LINH
(PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV)




CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 06.472.0201

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. CHU HOÀNG HÀ
GS. TS. NGUYỄN QUANG THẠCH




HÀ NỘI - 2014

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page i

LỜI CAM ðOAN

- Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung
thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào.
- Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã
được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ
nguồn gốc.
Tác giả luận văn



ðinh Thị Lan












Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng
Hà, GS. TS. Nguyễn Quang Thạch, TS. Phạm Bích Ngọc ñã tận tình hướng dẫn,
giúp ñỡ và tạo ñiều kiện cho tôi hoàn thành chương trình học tập, thực hiện ñề tài và
hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Tôi cũng xin ñược trân trọng cảm ơn KS. Nguyễn Khắc Hưng, KS. Nguyễn
ðình Trọng và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi
trong quá trình thực hiện nghiên cứu ñề tài.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học
Học viện Nông nghiệp Việt Nam ñã hướng dẫn, truyền ñạt kiến thức cho tôi trong
suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng chân thành cảm ơn những người thân trong gia ñình và bạn bè ñã
tạo ñiều kiện giúp ñỡ, ñộng viên tôi thực hiện ñề tài và hoàn thành bản luận văn tốt
nghiệp.
Hà nội, tháng 07 năm 2014
Tác giả luận văn


ðinh Thị Lan


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN I
LỜI CẢM ƠN II
MỤC LỤC III

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VI
DANH MỤC BẢNG VII
DANH MỤC HÌNH VIII
MỞ ðẦU 1
1.1. Tính cấp thiết 1
1.2. Mục đích 4
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1. Cây sâm Ngọc Linh 5
1.1.1. Phân loài 5
1.1.2. Hình thái 5
1.1.3. Đặc điểm sinh thái 7
1.1.4. Sinh trưởng 7
1.1.5. Phân bố 7
1.1.6. Giá trị dược liệu 7
1.1.7. Tình hình nghiên cứu về cây sâm Ngọc Linh 10
1.2. Tình hình nghiên cứu về cây chuyển gen 13
1.2.1. Khái niệm cây chuyển gen 13
1.2.2. Lịch sử chuyển gen vào thực vật 13
1.2.3. Các phương pháp chuyển gen 15
1.3. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 15
1.3.1. Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 16
1.3.2. Cơ chế chuyển gen 20
1.4. Nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật và sinh khối rễ tơ 23

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iv

1.4.1. Nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật 23
1.4.2. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ 27

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.1. Vật liệu 30
2.2. Địa điểm, thời gian 30
2.3. Hóa chất thiết bị 30
2.4. Nội dung 30
2.5. Phương pháp thực hiện 30
2.5.1. Tiến hành với chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
ATCC
15834
chứa gen gusA 31
2.5.2. Tiến hành chuyển gen vào sâm Ngọc Linh với chủng Agrobacterium
rhizogenes
ATCC
15834 để kiểm tra lại quy trình và cảm ứng ra rễ. 33
2.5.3. Chuẩn bị vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 37
2.5.4. Quy trình lây nhiễm 37
2.5.5. Phương pháp kiểm tra sự có mặt của gen gus 38
2.5.6. Phương pháp kiểm tra dòng chuyển gen 39
2.5.7. Phương pháp tách chiết DNA tổng số 39
2.5.8. Phương pháp PCR – Polymerase Chain Reaction 41
2.5.9. Các chỉ tiêu theo dõi 43
2.5.10. Xử lý kết quả 43
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44
3.1. Khảo sát khả năng chuyển gen vào sâm Ngọc Linh nhờ vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 có chứa gen gusA 44
3.1.1. Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes 44
3.1.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen nhờ vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes 48
3.1.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen nhờ

vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 50

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page v

3.1.5. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes đến hiệu
quả chuyển gen 52
3.1.6. Kết quả chuyển gen ở sâm Ngọc Linh thông qua vi khuẩn A.Rhizogenes 53
3.2. Chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834 54
3.2.1. Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến khả năng tạo rễ tơ 55
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng acetonsyringone (AS) đến khả
năng tạo rễ tơ 57
3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ 59
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng tạo rễ tơ 61
3.2.5. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A. rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ 63
3.2.6. Ảnh hưởng của tổ hợp các điều kiện đến khả năng tạo rễ tơ 64
3.3. Chọn lọc và kiểm tra sự có mặt của các gen rol ở các dòng rễ tơ 65
3.3.1. Chọn lọc các dòng rễ tơ 65
3.3.2. Kiểm tra sự có mặt của các gen rol ở các dòng rễ tơ 66
3.4. Xác định môi trường nuôi cấy các dòng rễ tơ 68
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72
Kết luận 72
Kiến nghị 72
TÀI LIỆU THAM KHẢO 73
PHỤ LỤC 82




Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

A. rhizogenes

:

Agobacterium rhizogenes

AS

:

Acetosyringone

bp

:

Base pair

DNA

:

Desoxyribonucleic acid

GusA

:

β-glucuronidase

kp

:

Kilobase pair

LB

:

Left border

PCR :

Polymerase Chain Reaction
RB
:

Right border

Ri-plasmid
:

Root induction plasmid

Rol

:

Root locus

SH
:

Schenk và Hildebrandt, 1972

ss T-DNA
:

Single strain T-DNA

Vir

:

Virulence genes

WPM

:

Woody Plant Medium
YMB

:

Yeast Malnitol Broth







Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page vii

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

1.1 Hàm lượng saponin của sâm Việt Nam và các loài Panax trồng trọt. 8
3.1 Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen nhờ vi khuẩn
A. rhizogenes qua biểu hiện của gen gus 45
3.2 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng acetonsyringone đến hiệu quả
chuyển gen nhờ vi khuẩn A. rhizogenes qua biểu hiện của gen gus 47
3.3 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm vi khuẩn A. rhizogenes đến hiệu
quả chuyển gen qua biểu hiện của gen gus 49
3.4 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen nhờ
vi khuẩn A. rhizogenes qua biểu hiện của gen gus 51
3.5 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A.rhizogenes đến hiệu quả chuyển
gen qua biểu hiện của gen gus 52
3.6 Ảnh hưởng của tổ hợp các điều kiện tối ưu đến hiệu quả chuyển gen
nhờ vi khuẩn A. rhizogenes qua biểu hiện của gen gus 54
3.7 Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến khả năng tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn
A. rhizogenes 56

3.8 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng acetonsyringone (As) đến khả
năng tạo rễ tơ 58
3.9 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm vi khuẩn A. rhizogenes đến khả
năng tạo rễ tơ 60
3.10 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng tạo rễ tơ 62
3.11 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A. rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ 63
3.12 Ảnh hưởng của tổ hợp các điều kiện tới đến khả năng tạo rễ tơ 65
3.13 Ảnh hưởng của nước dừa và casamino acid tới sinh trưởng của rễ tơ 69


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page viii

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

1.1 Cây sâm Ngọc Linh 5
1.2 Một số đặc điểm hình thái cây sâm Ngọc Linh 6
1.3 Vi khuẩn Agrobacterium sp, rễ tơ 16
1.4 Cấu trúc Ri- plasmid 17
1.5 Cơ chế chuyển T-DNA của Ti-plasmid sang genome thực vật 21
1.6 Nuôi cấy rễ tơ 28
3.1 Kết quả thử vật liệu chuyển gen 46
3.2 Kết quả kiểm tra nồng độ AS 48
3.3 Kết quả kiểm tra thời gian lây nhiễm 50
3.4 Kết quả kiểm tra ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy 52
3.5 Kết quả kiểm tra OD
600
53

3.6 Khả năng ra rễ trên các loại mô khác nhau 56
3.7 Mẫu rễ tơ ở nồng độ AS 100 µM 59
3.8 Kết quả kiểm tra thời gian lây nhiễm 61
3.9 Kết quả kiểm tra thời gian đồng nuôi cấy 63
3.10 Kết quả kiểm tra nồng độ vi khuẩn 64
3.11 Các dạng hình thái rễ tơ 66
3.12 Kết quả phản ứng PCR kiểm tra các gen rolA và rolB 67
3.13 Kết quả phản ứng PCR kiểm tra các gen rolC 67
3.14 Ảnh hưởng của nước dừa 70
3.15 Ảnh hưởng của casamino acid 71

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 1


MỞ ðẦU

1.1.Tính cấp thiết
Sâm Ngọc Linh có tên khoa học là
Panax
vietnamensis Ha et Grushv, thuộc
họ Nhân
sâm
(Araliaceae). Panax xuất phát từ
chữ
Panacea trong tiếng Hy Lạp,
có nghĩa là
thuốc
trị bách bệnh, thần dược.
Tác dụng dược lý

của
sâm Ngọc Linh đã được nhiều nhà khoa học ở Việt
Nam
cũng như trên thế giới nghiên cứu và
chứng
minh là cây thuốc quý dùng để
chữa nhiều bệnh và tăng cường sức khỏe như tăng lực, tăng trí nhớ, bảo vệ cơ
thể
chống stress, tác động lên hệ miễn dịch,
tăng
sức đề kháng cho cơ thể, giúp
chống viêm,
ngăn
cản sự lão hóa, v.v (Duc N.M et al., 1996).
Theo các nhà khoa học sâm Ngọc Linh có tác dụng kích thích hệ miễn dịch,
chống ôxi hóa, lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan, tăng thị lực, hoạt
động trí tuệ và cải thiện thể lực, nâng cao huyết áp ở người bị huyết áp thấp, có tính
kháng khuẩn, chống trầm cảm, giảm lo âu.
Chính vì vậy mà
sâm
được xem là vị thuốc quý, đứng đầu các
vị
thuốc bổ
theo thứ tự Sâm, Nhung, Quế,
Phụ
trong y học cổ truyền, đã được sử dụng từ
rất
lâu đời ở các nước trên thế giới cũng như ở
Việt
Nam (Đỗ Tất Lợi,

2006).

Những kết quả nghiên cứu mới nhất thân rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh (2007) đã
thu nhận được tới 50 saponin trong đó 26 sanopin thường thấy ở sâm Triều Tiên,
sâm Mỹ, sâm Nhật và 24 saponin damaran có cấu trúc mới. Trong lá và cọng đã
phân lập được 19 saponin, trong đó có 8 saponin có cấu trúc mới. Đã xác định được
trong sâm Ngọc Linh 17 axít amin trong đó có 8 axít amin không thay thế, 17 axít
béo, 20 nguyên tố đa lượng, vi lượng và hàm lượng tinh dầu là 0,1%. Sâm Ngọc
Linh chứa chủ yếu các saponin triterpen, là loại sâm có hàm lượng saponin và số
lượng saponin nhiều nhất so với các loài khác của chi Panax.
Sâm Ngọc Linh chứa các hợp chất đa dạng được xem là thần dược với sức
khỏe con người khiến giá sâm Ngọc Linh trên thị trường rất cao, có những thời
điểm 1 kg sâm Ngọc Linh tươi ở Quảng Nam có giá 25 - 30 triệu đồng, lúc khan

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 2

hiếm có thể lên tới 80 - 90 triệu đồng. Vì lợi ích lớn nên việc khai thác, mua bán và
sử dụng tràn lan chưa có quy định quản lý, bảo vệ cùng các chính sách, giải pháp
đầu tư, quy hoạch phát triển khiến vùng sâm mọc tự nhiên giữa Quảng Nam và Kon
Tum dần cạn kiệt. Năm 2007 sâm Ngọc Linh được xếp nhóm nguy cấp (EN) trong
sách đỏ Việt Nam có nguy cơ tuyệt chủng, loài phân bố hẹp, đang bị khai thác mạnh
(Phạm Quốc Hùng và cs., 2010).
Do giá trị kinh tế và giá trị y dược cao, ngày nay nhiều nhà khoa học đã và
đang tiến hành các công trình nghiên cứu về sâm Ngọc Linh. Các nghiên cứu về
thành phần hóa học của các hợp chất có giá trị làm thuốc, bảo tồn phát triển sâm
Ngọc Linh. Tuy nhiên thời gian nuôi trồng sâm Ngọc Linh kéo dài đã xảy ra tình
trạng sâm bị khai thác trộm trước thời gian thu hoạch.
Nhiều chương trình di thực Sâm Ngọc Linh được tiến hành từ nhiều năm nay
nhưng vẫn còn những hạn chế nhất định. Do vậy, các chế phẩm từ sâm Ngọc Linh

cũng được sản xuất rất ít, thậm chí ngưng sản xuất vì thiếu nguồn nguyên liệu.
Vấn đề đặt ra là cần triển khai, phát triển sinh khối tế bào thực vật, tạo nguồn
nguyên liệu ổn định, đáp ứng nhu cầu làm thuốc. Nhân sinh khối tế bào thực vật đã
được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: dược phẩm, sản phẩm chức năng, chất
phụ gia thực phẩm, nông nghiệp, lâm nghiệp… vừa tạo ra nguyên liệu, vừa bảo tồn
nguồn gen quý hiếm. Nhiều hoạt chất nguồn gốc từ thực vật có giá trị kinh tế cao là
sản phẩm từ sinh khối tế bào thực vật như caffein thu được từ nuôi cấy tế bào
Coffea arabica, betalain từ mô sẹo củ cải đường, berberin từ cây Coptis japonica.
Hiện nay trên thế giới đã có một số nghiên cứu về nuôi cấy sinh khối các loài
sâm ứng dụng trong các lĩnh vực y dược. Một số nước tiêu thụ và xuất khẩu sâm lớn
như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc đã ứng dụng nuôi cấy sinh khối tế bào từ
nhân sâm trong sản xuất các sản phẩm chức năng làm thuốc bổ, thuốc phòng chống
bệnh tim mạch, chống gốc tự do, tăng cường chức năng hệ thần kinh trung ương,
các loại mỹ phẩm.
So với nuôi trồng tự nhiên, công nghệ sinh khối tế bào thực vật có nhiều ưu
điểm như không chịu tác động của các yếu tố tự nhiên như địa lý, khí hậu, thổ
nhưỡng, bệnh dịch, thiên tai, yếu tố thời vụ…. nên có thể chủ động được nguồn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 3

nguyên liệu phục vụ sản xất, thời gian sản xuất nguyên liệu theo công nghệ sinh
khối tế bào rút ngắn hơn nhiều so với gieo trồng tự nhiên, chất lượng sản phẩm ổn
định do các điều kiện nuôi cấy được kiểm soát chặt chẽ, có thể điều khiển quá trình
sinh tổng hợp tạo ra các hoạt chất cao hơn so với nuôi trồng tự nhiên bằng cách bổ
sung các chất kích thích tăng tích lũy các hoạt chất chính. Có thể sản xuất các hợp
chất thứ cấp theo yêu cầu với số lượng khác nhau.
Thách thức lớn nhất đối với công nghệ tế bào thực vật là sự ổn định, khả
năng nuôi cấy tế bào thực vật trên quy mô lớn và đạt hiệu suất tối đa cho sự tích
lũy và sản xuất các chất thứ cấp. Điều này có thể thực hiện bằng cách chọn lọc các

kiểu gen thích hợp và các dòng tế bào có sản lượng cao, xây dựng các công thức
môi trường dinh dưỡng hợp lý để nuôi cấy tế bào, thiết kế và vận hành các hệ thống
nuôi cấy tế bào (bioreactor) hiệu quả (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006).
Trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm làm giảm hoặc
mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy người ta cần thiết phải bổ sung các chất
điều hòa sinh trưởng vào trong môi trường nuôi cấy, vấn đề này là một trong những
khó khăn khi đưa sản phẩm ra ngoài thị trường do tồn dư của các chất điều hòa sinh
trưởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức
khỏe người sử dụng.
Có thể khắc phục nhược điểm trên bằng nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ. Rễ tơ ở
thực vật được gây ra bởi quá trình tương tác giữa vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes và tế bào vật chủ. Rễ tơ có thể sinh trưởng tốt trên môi trường không bổ
sung các chất điều hòa sinh trưởng. Rễ tơ có khả năng sinh trưởng nhanh, phân
nhánh cao, kỹ thuật nuôi cấy không phức tạp, chuyển gen dễ dàng và có thể được
nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các
chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học.
Nuôi cấy rễ tơ có khả năng rút ngắn thời gian nuôi cấy, rễ tơ là cơ quan biệt
hóa nên ổn định về mặt di truyền và sinh hóa hơn nuôi cấy tế bào huyền phù và mô
sẹo, nuôi cấy trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng thực vật tạo ra
các nguyên liệu sạch cho công nghiệp dược, thực phẩm, mỹ phẩm.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 4

Yêu cầu đối với công nghệ sinh khối tế bào thực vật là nuôi cấy đạt hiệu suất
tối đa cho sự tích lũy và sản xuất các hợp chất thứ cấp. Do đó cần chọn lọc các
dòng rễ tơ sinh trưởng nhanh, môi trường dinh dưỡng hợp lý, tối ưu quy trình kỹ
thuật nuôi cấy, thiết kế và vận hành các hệ thống nuôi cấy tế bào (bioreactor) hiệu
quả. Tế bào thực vật có sự trao đổi chất chậm hơn vi sinh vật vì thế đòi hỏi phải
duy trì một điều kiện nuôi cấy vô trùng trong thời gian lâu hơn. Các thông số hóa

học, vật lý như thành phần môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi
cấy, sự thông khí, lắc khuấy, ánh sáng, … đều ảnh hưởng lớn tới hàm lượng và chất
lượng các hợp chất thứ cấp.
Xuất phát từ thực tế trên tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu khảo
sát ñiều kiện chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes ở sâm Ngọc linh (Panax Vietnamensis Ha et Grushv)”.
1.2. Mục ñích
Xác định khả năng chuyển gen vào sâm Ngọc Linh và điều kiện chuyển gen
thích hợp cho tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ở sâm Ngọc
Linh (Panax Vietnamensis Ha et Grushv).
Bước đầu xác định môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng của rễ tơ sâm
Ngọc Linh.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy khả năng chuyển được gen vào cây sâm
Ngọc Linh tạo rễ tơ thu sinh khối. Đồng thời, các thông số kĩ thuật đã xác định được sẽ
làm cơ sở cho việc chuyển các gen mong muốn vào cây sâm Ngọc Linh.
• Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở thúc đẩy ứng dụng công nghệ mới nuôi
cấy rễ tơ thu các hợp chất thứ cấp phục vụ cho công nghiệp, dược phẩm,


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 5

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cây sâm Ngọc Linh
1.1.1. Phân loài
Sâm Ngọc Linh (danh pháp hai phần: Panax Vietnamensis) là một loài cây

thuộc họ Cam tùng (Araliaceae), còn gọi là sâm Việt Nam, sâm Khu Năm (sâm
K5), sâm trúc (sâm đốt trúc, trúc tiết nhân sâm), sâm cung, sâm đắng, sâm rừng,
củ ngải rọm con hay cây thuốc giấu.
Phân loại khoa học của cây sâm Ngọc Linh như sau:


Họ: Araliaceae
Phân họ: Aralioideae
Chi: Panax
Phân chi: Panax
Loài: P. Vietnamensis
Tên khoa học: Panax Vietnamensis Ha et Grushv
Hình 1.1. Cây sâm Ngọc Linh

1.1.2. Hình thái
Cây thảo, sống nhiều năm, cao 0,4 - 0,8 m. Thân khí sinh cao khoảng 30 -
60 cm, mảnh mai, thẳng, nhẵn, ruột xốp. Thân khí sinh tàn lụi hàng năm sau mùa
sinh trưởng và để lại trên thân rễ một vết sẹo (là căn cứ để tính tuổi của cây). Mỗi
cây thường có một thân khí sinh, có khi có 2 - 3 thân.
Thân rễ (củ) nạc gồm nhiều đốt, phân nhánh, nằm ngang, đường kính 1,5 - 2,5
cm, phần đầu có nhiều vết sẹo do thân khí sinh tàn lụi. Sâm ngoài tự nhiên thân
rễ dài 5 - 25 cm hoặc hơn, màu vàng nhạt hoặc vàng nâu, thân rễ mang nhiều
rễ phụ nạc dễ đứt. Trên sâm trồng thường có 2 - 3 rễ củ hoặc hơn hình con quay,
bám dọc theo thân. Thân rễ có mùi thơm mát, vị đắng ngọt dễ chịu. Thân rễ sâm
hoang dại có thể nặng tới 700g và mang đến 70 vết sẹo (Nguyễn Như Chính, 2003).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 6

Lá kép chân vịt, mỗi cây thường có 3 - 6 lá kép, mỗi lá kép có từ 5 - 7 lá

chét, lá mọc vòng, lá chét thuôn, dài 10 - 14 cm, rộng 3 - 5 cm, gốc nhọn, đầu
vuốt nhọn, mép khía răng cưa, cuống lá chét ngắn dưới 1 cm, có lông ở cả hai
mặt, gân phụ 10 cặp hình lông chim, gân nhỏ hình mạng.
Cụm hoa tán, mọc ở ngọn, thường tán đơn, cá biệt có tán phụ, cuống cụm hoa
dài 15 - 30 cm. Hoa nhỏ, màu trắng ngà, cuống hoa 1 - 1,5 cm, đài 5, hợp ở gốc,
hình tam giác, 5 cánh hoa hình tam giác rộng, nhị 5, chỉ nhị mảnh, bầu 2 ô, cá biệt 1
ô, đầu nhụy chẻ đôi. Mùa hoa thường từ tháng tư đến tháng bảy, cây trồng từ hạt
thường sau 3 năm ra hoa.
Quả mọng, hình cầu hoặc hình cầu hơi dẹt, đường kính 0,6 - 1 cm, khi non
màu xanh nhạt, lớn dần có màu xanh đậm, khi chín màu đỏ, có chấm đen. Hạt hình
thận gần tròn, đường kính 2 - 3 mm, dài 3 - 4 mm, màu trắng xám. Số quả trên cây
dao động từ 5 - 40 quả, bình quân 6 - 7 quả trên cây. Mùa quả vào khoảng tháng
chín đến tháng mười (Nguyễn Tập, 2006).

Hình 1.2. Một số ñặc ñiểm hình thái cây sâm Ngọc Linh

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 7

1.1.3. ðặc ñiểm sinh thái
Cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác hoặc thành đám nhỏ
dưới tán rừng kín thường xanh ở độ cao từ 1,200 - 2,300 m. Nhiệt độ trung bình từ
15 - 18
o
C, độ ẩm 90%, lượng mưa hàng năm khoảng 3000 mm, đất nhiều mùn,
giàu chất dinh dưỡng.
1.1.4. Sinh trưởng
Hạt nảy mầm vào giữa tháng 12 đến tháng 2 năm sau. Cây ra hoa kết quả vào
tháng 4 - 6. Từ tháng 7 - 9 là thời kỳ quả chín có thể kéo dài đến tháng 10. Sau đó là
giai đoạn thân khí sinh tàn lụi, gọi là thời kỳ ngủ đông vào tháng 11, đến tháng 3

năm sau mọc lên thân mới lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành có 1 tán hoa.
Cá biệt có một số thân khí sinh tồn tại sang năm sau. Tái sinh tự nhiên từ hạt hoặc
từ phần đầu mầm thân rễ. Căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ, người ta có thể nhận biết
độ tuổi của cây sâm. Sau 3 năm đầu, cây sâm mới rụng lá và để lại vết sẹo đầu tiên.
Củ từ 3 tuổi trở lên bắt đầu được thu hoạch, tốt nhất là trên 5 tuổi. Mùa đông cũng là
mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm (Nguyễn Như Chính, 2003).
1.1.5. Phân bố
Sâm Ngọc Linh là loài đặc hữu của Việt Nam, phân bố ở vùng núi Ngọc Linh
thuộc 2 tỉnh Kon Tum và Quảng Nam, ngoài ra còn có ở núi Langbiang – Lâm
Đồng, nhưng hiện nay không còn. Việt Nam là nơi phân bố duy nhất của sâm Ngọc
Linh trên toàn thế giới.
Năm 1968 Vũ Minh Đức đã phát hiện sâm này ở Bắc Bền (Trà Linh) và đặt
tên là Sâm khu 5. Năm 1973 dược sỹ Đào Kim Long, dược sỹ Trần Thanh Dân,
dược sỹ Nguyễn Châu Giang, kỹ sư Nguyễn Bá Hoạt tìm thấy ở Đăk Tô, Kon tum
và đặt tên là sâm đốt trúc với tên khoa học là Panax Articulatus (Nguyễn Như
Chính, 2003).
1.1.6. Giá trị dược liệu
Theo đánh giá của Nguyễn Minh Đức, thì từ sâm Ngọc Linh đã chiết được 50
hợp chất, xác định cấu trúc hóa học cho thấy 26 hợp chất có cấu trúc đã biết
(thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật) và 24 saponin damaran có cấu
trúc mới không bắt gặp tại các loại sâm khác trên thế giới được đặt tên là vina-
ginsenosid-R1-R24. Sâm Ngọc Linh chứa chủ yếu các saponin triterpen, nhưng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 8

cũng là một trong những cây sâm có hàm lượng saponin khung pammaran cao nhất
(khoảng 12 - 15%) và số lượng saponin nhiều nhất so với các loài khác của chi.
Trong lá và cọng đã phân lập được 19 saponin damaran, đã được phân lập, gồm 11
saponin đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới đặt tên là vinaginsenosid-L1-L8

(Nguyen MD et al., 1993, 1994).
Sâm Ngọc Linh chứa chủ yếu saponin thuộc nhóm damaran và có rất ít
saponin nhóm olean. Thành phần saponin của sâm Ngọc Linh rất giống với thành
phần của các loài sâm trồng khác (Bảng 1.1). Nó chứa hầu như đầy đủ các saponin
chủ yếu có trong các loài sâm trồng như ginsenosid-Rb
1
, -Rd, - Re, -Rg
1
, và
notoginsenosid-R1, nhưng hàm lượng saponin toàn phần của sâm Ngọc Linh lại cao
hơn, ngoài ra sâm Ngọc Linh chứa một hàm lượng saponin có cấu trúc mạch nhánh
ocotillol rất cao, nhất là chất majonosid-R2 (khoảng 5% và chiếm nửa lượng
saponin toàn phần). Thành phần đặc biệt này đã giúp sâm Ngọc Linh trở thành một
loài Panax độc đáo không những về mặt hoá phân loại mà còn về mặt dược lý
(Nguyen MD et al., 1993, 1994).
Bảng 1.1. Hàm lượng saponin (%) của sâm Việt Nam và các loài Panax trồng
trọt. (ppd: protopanaxadiol; ppt: protopanaxatriol)
Loại aglycon P. ginseng

P. notoginseng

P. uinquefolium

P. Vietnamensis
20(S)-ppd 2.9 2.1 2.7 3.1
20(S)-ppt 0.6 2.4 1.2 2.0
Ocotillol 0.04 5.6
Oleanolic acid 0.02 0.07 0.09
Tổng số(%) 3.5 4.5 4.0 10.8
Trong sâm Ngọc Linh còn có 17 axít béo có từ 8 - 20 cacbon, trong đó chiếm

tỷ lệ lớn nhất là acid linoleic (40%), acid palmitic (29,6%), acid oleic (13,3%), acid
stearic (4,5%) và acid linolenic (2,6%). 18 axít amin trong đó có 8 axít amin không
thay thế, một số acid amin có tỷ lệ rất cao như arginine 46,6%, lysine 17,9% và
tryptophan 10,2% đã được xác định có tính chống lão hoá tế bào và 18 nguyên tố đa
lượng, vi lượng trong đó bao gồm một số các nguyên tố có tác dụng sinh học như
K, Na, Mg, Mn, Cu, Fe, Co, Zn, Se và hàm lượng tinh dầu là 0,1% (Nguyen MD et
al., 1993, 1994).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 9

Theo Nguyễn Bá Hoạt những kết quả nghiên cứu dược lý thực nghiệm sâm
Ngọc Linh có tác dụng chống stress vật lý, stress tâm lý và trầm cảm, kích thích
hệ miễn dịch, chống ôxi hóa, lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan.
Nghiên cứu dược lý lâm sàng của sâm Ngọc Linh cũng cho kết quả tốt: bệnh nhân ăn
ngon, ngủ tốt, lên cân, tăng thị lực, hoạt động trí tuệ và thể lực cải thiện, gia tăng sức
đề kháng, cải thiện các trường hợp suy nhược thần kinh và suy nhược sinh dục, nâng
cao huyết áp ở người bị huyết áp thấp. Ngoài ra, nó còn có tác động kháng khuẩn
đáng kể đối với các loài Streptococci và có tác dụng tốt với chứng viêm họng.
Ngoài những tác dụng như trên, theo dược sĩ Đào Kim Long, sâm Ngọc Linh
có những tính năng như tăng lực, phục hồi sự suy giảm chức năng giúp cho tình
trạng của cơ thể trở lại bình thường, kháng các độc tố gây hại tế bào, giúp kéo dài
sự sống của tế bào và tăng các tế bào mới. Đặc biệt, sâm Ngọc Linh có những tính
năng mà sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc không có là tính kháng khuẩn, chống
trầm cảm, giảm lo âu, chống ôxi hóa, và hiệp lực tốt với thuốc kháng sinh, thuốc
trị bệnh tiểu đường.
Theo nghiên cứu của Trần Mỹ Tiên và
Nguyễn Thị Thu Hương
(2005) thì
không chỉ thân rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh mới cho tác dụng tốt mà cả phần lá cũng

có tác dụng đối với hệ thần kinh trung ương, có tác dụng chống stress, tăng lực,
chống oxy hóa, phụ hồi sức khỏe. Khi thử nghiệm trên thần kinh trung ương ở liều
thấp 60 mg/kg và 120 mg/kg cao lá sâm Ngọc Linh có tác động rút ngắn thời gian
ngủ của pentobarbital và ở liều cao là 1800 mg/kg có tác dụng ức chế thần kinh
trung ương, kéo dài thời gian ngủ của pentobarbital. Cao lá sâm Ngọc Linh ở liều
600 - 1200 mg/kg đều thể hiện tác dụng phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi
stress, đưa trở về trạng thái bình thường. Saponin toàn phần lá sâm Ngọc Linh có
tác động chống stress thể hiện rõ ở liều 2000 mg/kg. Hợp chất notoginsenoside-Fc,
một saponin có hàm lượng cao trong lá sâm Ngọc Linh, là hợp chất quyết định tác
dụng chống trầm cảm của cao lá sâm Ngọc Linh. Cao lá sâm Ngọc Linh có tác dụng
chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA. Ở thử nghiệm dùng cao lá sâm Ngọc
Linh cho thấy có tác dụng phục hồi sinh lực, giữ nguyên thời gian vận động của
động vật thí nghiệm.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 10

1.1.7. Tình hình nghiên cứu về cây sâm Ngọc Linh
Cây sâm Ngọc Linh được biết đến khá muộn so với các loài sâm khác trên thế
giới, ngay khi loài sâm này được các nhà khoa học phát hiện thì việc nghiên cứu về
thành phần hóa học và giá trị dược liệu của sâm Ngọc Linh đã được tiến hành.
Năm 1974, Nguyễn Thới Nhâm tiến hành nghiên cứu bước đầu về thành phần
hóa học sâm Ngọc Linh, khi so sánh với sâm Hàn Quốc và tam thất Trung Quốc qua
sắc ký đồ cho thấy sâm Ngọc Linh có thành phần hóa học rất giống sâm Hàn Quốc.
Năm 1978, bộ y tế thành lập đơn vị nghiên cứu chuyên đề sâm K5 để điều tra nguồn
gốc sinh thái, trữ lượng và khoanh vùng bảo vệ. Đến năm 1980 đã tìm thấy được 108
vùng sâm mọc tập trung với trữ lượng lớn và độ tuổi rất cao (10 - 70 tuổi chiếm 70%).
Năm 1985, Hà Thị Dụng đã mang tiêu bản sâm Ngọc Linh sang Liên Xô để
phân loại và chính thức công bố trên toàn thế giới sâm Ngọc Linh là một loài mới
và đặc hữu với tên khoa học Panax vietnamensis Ha et Grushv.

Khi nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy sâm Ngọc Linh là loài dược
liệu quý, nó chứa đầy đủ các saponin chủ yếu có trong các loài sâm trồng như
ginsenosid-Rb
1
, -Rd, - Re, -Rg
1
, và notoginsenosid-R1, nhưng hàm lượng saponin
toàn phần của lại cao hơn, ngoài ra sâm Ngọc Linh chứa một hàm lượng saponin có
cấu trúc mạch nhánh ocotillol rất cao, nhất là chất majonosid-R2 (Nguyen MD et al.
1993, 1994).
Hiện nay có nhiều nghiên cứu về cây sâm Ngọc Linh, nghiên cứu về ứng dụng
công nghệ sinh học trong nhân sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh, nghiên cứu môi
trường nuôi cấy tế bào, hệ thống nuôi cấy, hệ thống chiếu sáng đến cây sâm Ngọc
Linh, Trong nghiên cứu của Nhut et al. (2009) về xác định một số yếu tố ảnh
hưởng đến sinh khối của cây sâm Ngọc Linh thì mô sẹo được cảm ứng thành công
trên môi trường MS bổ sung 1mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ trong điều kiện chiếu
sáng 16 giờ/ngày và mô sẹo có khả năng tăng sinh nhanh trên môi trường MS có bổ
sung 1mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ. Số chồi tái sinh từ mô sẹo đạt cao nhất trên môi
trường MS bổ sung 1mg/l BA, 1mg/l NAA và 50 g/l sucrose. Môi trường
1
/
2
MS có
bổ sung 5 mg/l NAA kích thích sự phân rễ tốt nhất, cho tỷ lệ ra rễ cao nhất và rễ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 11

phân nhánh nhiều nhất. Kết quả phân tích định tính saponin bằng phương pháp TLC
cho thấy trong sinh khối mô sẹo, sinh khối chồi và sinh khối rễ đều có ginsenoside-

Rg1 và majonoside-R2, riêng sinh khối rễ còn có ginsenoside-Rb1.
Khi xác định hàm lượng saponin và dư lượng chất điều hòa sinh trưởng trong
callus, chồi và rễ sâm Ngọc Linh qua kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng và
định lượng bằng HPLC, dựa trên sự đối chiếu 3 chất chuẩn có được và so sánh với
sâm Ngọc Linh tự nhiên cho thấy đều có sự hiện diện của ginsenoside và
majonoside R2 với tỷ lệ và hàm lượng khác nhau. Ở mô sẹo hàm lượng MR
2
, G-
Rb
1
và GRg
1
thấp nhất, tiếp đến là mô sẹo biệt hóa rễ, mô sẹo biệt hóa chồi có hàm
lượng 3 chất trên cao nhất. Cũng sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng và HPLC
đã xác định được dư lượng NAA và BA trong sinh khối sâm Ngọc Linh nuôi cấy in
vitro kết quả không thấy xuất hiện vạch của NAA và BA trong các mẫu phân tích
(Dương Tấn Nhựt và cs., 2010).
Theo nghiên cứu của tác giả Hoàng Xuân Chiến và cs. (2011) khi tạo củ sâm
Ngọc Linh in vitro và xác định hàm lượng saponin trong cây tạo từ củ trồng thử
nghiệm ở núi Ngọc Linh thì môi trường thích hợp nhất để tạo củ sâm Ngọc Linh in
vitro là SH có bổ sung 1 mg/l NAA, 2 mg/l BA trong điều kiện chiếu sáng 16
giờ/ngày, nồng độ ABA thích hợp cho quá trình tạo củ là 3 mg/l, nồng độ sucrose
tốt nhất cho quá trình tạo củ là 50 g/l, qua hệ thống HPLC cho thấy trong sâm Ngọc
Linh nuôi cấy mô trồng thử nghiệm 17 tháng tại núi Ngọc Linh có chứa 3 loại
saponin quan trọng của sâm Ngọc Linh là MR
2
(0,77%)
,
G-Rg
1

(0,17%), G-
Rb
1
(0,21%).
Khi khảo sát một số yếu tố đa lượng trong môi trường nuôi cấy tế bào cây sâm
Ngọc Linh. Khi bổ sung NH
4
NO
3
với nồng độ 0,5 mg/l thu được sinh khối cao
nhất, nồng độ KNO
3
tối ưu cho sự sinh trưởng của tế bào là 1,0 mg/l, còn sản
phẩm ginsenoside thu được lớn nhất (6,1 mg/g DW) ở nồng độ 2,0 mg/l. Sinh
khối tế bào và thành phần ginsenoside tăng trưởng đáng kể khi bổ sung CaCl
2
vào
môi trường ở nồng độ 1,5mg/l (Thanh et al., 2011).
Nghiên cứu tạo rễ bất định của sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro mẫu cấy

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 12

trên môi trường MS có bổ sung 50 g/l sucrose, 8 g agar, 1 mg/l 2,4D cho kết quả
hình thành mô sẹo và rễ bất định tốt nhất sau 2 tháng nuôi cấy. Đoạn rễ bất định
trên môi trường Gamborg bổ sung 50 g/l sucrose, 8 g agar, 5 mg/l IBA cho kết quả
hình thành rễ và tăng sinh khối khả quan.Từ kết quả này mở ra hướng đi mới để tạo
sinh khối rễ sâm Ngọc Linh trong thời gian ngắn, số lượng nhiều, chủ động nguồn
nguyên liệu (Nguyễn Thị Liễu và cs., 2011).
Nghiên cứu về ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sinh trưởng và khả năng

tích lũy saponin của cây sâm Ngọc Linh in vitro của tác giả Hoàng Văn Cương và
cs. (2012) cho thấy kết hợp ánh sáng xanh và đỏ với tỷ lệ 50:50 thích hợp cho sinh
trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh in vitro. Các cây nuôi dưới ánh sáng
huỳnh quang cho sự tích lũy saponin cao nhất.
Dương Tấn Nhựt và cs. (2012) đã bước đầu đánh giá ảnh hưởng của methyl
jasmonate acid lên khả năng tích lũy saponin trong mô sẹo sâm Ngọc Linh và khảo
sát một số hệ thống nuôi cấy trong nuôi cấy rễ bất định và rễ thứ cấp sâm Ngọc
Linh có nguồn gốc từ mô sẹo lên khả năng tạo saponin. Kết quả cho thấy rễ bất
định hình thành tốt nhất trong hệ thống bioreactor Hàn Quốc chứa 2 lít môi trường
SH có bổ sung 3 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, trong đó rễ hình thành chứa được cả 3
loại saponin quan trọng MR
2
, G-Rb
1
, G-Rg
1
.
Trần Quang Trung và cs. (2013) đã xác định hàm lượng của 3 ginsenoside
Rb
1
, Re, Rg
1
trong sâm Ngọc Linh tự nhiên lần lượt là 1,0916%, 0,1226%,
1,4215%, trong sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh lần lượt là 0,3281%, 0,0817% và
0,3646%.
Gần đây nhất là nghiên cứu của tác giả Vũ Thị Hiền và cs. (2014) đã tạo được
phôi trực tiếp từ lá, cuống lá, thân rễ cây sâm Ngọc Linh trên môi trường MS bổ
sung 2mg/l NAA cho hiệu quả phát sinh phôi cao nhất.
Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu về cây sâm Ngọc Linh, nghiên cứu về tác
dụng dược lý của sâm Ngọc Linh, thành phần môi trường, thành phần hóa học trong

sâm nuôi cấy in vitro tuy nhiên các nghiên cứu về chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm Ngọc
Linh để thu hợp chất thứ cấp vẫn còn hạn chế.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 13

1.2. Tình hình nghiên cứu về cây chuyển gen
1.2.1. Khái niệm cây chuyển gen
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở
dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói
chung (vi sinh vật, động vật, ) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ
hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng
hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của vật chủ
tiếp nhận gen (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).
1.2.2. Lịch sử chuyển gen vào thực vật
Năm 1980 vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens được sử dụng làm
phương tiện vận chuyển DNA. Ở điều kiện bình thường vi khuẩn này gây bệnh ở
thực vật, tạo nên khối u. Một phần nhỏ của Ti-plasmid có trong vi khuẩn này, được
gọi là T-DNA, được vận chuyển từ Agrobacterium vào cây hai lá mầm. Năm 1980,
lần đầu tiên thành công trong việc chuyển đoạn DNA ngoại lai đã được xác định
(transposon Tn7) vào thực vật nhờ A. Tumefaciens, đoạn Tn7 trở thành một phần
của DNA trong tế bào tạo nên khối u, tuy nhiên T-DNA vẫn chứa các đoạn gen
gây độc với tế bào thực vật (Hernalsteens et al., 1980).
Năm 1981, xác định được tác nhân gây ra bệnh rễ tơ ở thực vật, do plasmid của
vi khuẩn chuyển vào trong DNA của tế bào thực vật (Chilton and Tepfer, 1982).
Năm 1983, nhiều nghiên cứu cải tiến T-DNA và đưa DNA ngoại lai vào tế
bào thực vật. Ngoài ra, các gen tạo khối u được cắt ra. DNA ngoại lai cùng với
phần còn lại được chuyển vào thực vật. Thành công này nhờ nghiên cứu chính
xác con đường lây nhiễm của A. tumefaciens trước đó và khả năng của hệ thống
chọn lọc đối với thực vật. Hoekema đã tiến hành cải tiến plasmid ở vi khuẩn, Ti-

plasmid này chứa vùng T-DNA và vùng vir. Plasmid này có thể chuyển được vào
trong tế bào vi khuẩn A. Tumefaciens và cho phép chuyển đoạn T-DNA vào thực
vật (Hoekema et al., 1983).
Cây chuyển gen đầu tiên thu được vào năm 1983, điều này cho thấy rằng mới
chỉ hơn hai thập niên các công cụ của công nghệ DNA tái tổ hợp và sinh học tế bào
đã giúp ích rất nhiều cho các nhà chọn giống thực vật (Trần Quốc Dung, 2006).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 14

Năm 1984, thành công trong chuyển gen vào tế bào cây một lá mầm, mở ra
một tiềm năng mới trong chuyển gen vào tế bào thực vật một lá mầm nhờ
Agrobacterium ( Hooykaas et al., 1984).
Kể từ năm 1984, bắt đầu tạo được cây trồng chuyển gen và đến nay đã có
những bước tiến lớn. Nhiều cây trồng quan trọng chuyển gen ra đời như lúa, ngô,
lúa mì, đậu tương, bông, khoai tây, cà chua, cải dầu, đậu Hà Lan, bắp cải Các
gen được chuyển là gen kháng vi sinh vật, virus gây bệnh, kháng côn trùng phá
hại, gen cải tiến protein hạt, gen có khả năng sản xuất những loại protein mới,
gen chịu hạn, gen bất thụ đực, gen kháng thuốc diệt cỏ (Trần Quốc Dung, 2006).
Năm 1985, Nicola đã phát hiện ra yếu tố trung gian trong việc truyền DNA từ
A. tumefaciens vào trong tế bào thực vật là các plasmid dạng vòng, đoạn DNA
được chuyển vào trong tế bào thực vật là đoạn T-DNA có kích thước 25kb (Nicola
et al., 1985). Cùng năm này Stachel đã phát hiện ra sự có mặt của acetosyringone
(AS) và alpha-hydrocyacetosyringone (OH-AS) tại vùng tổn thương của tế bào
thực vật giúp các vi khuẩn Agrobacterium nhận biết được các tế bào thực vật trong
tự nhiên (Stachel et al., 1985).
Từ đó đến nay các nhà khoa học đã đạt được nhiều thành tựu trong lĩnh vực
chuyển gen tạo ra thực vật kháng virus, cây có gen kháng thuốc diệt cỏ, kháng côn
trùng Một số cây trồng chuyển gen thành công nhờ vi khuẩn Agrobacterium như cà
chua có chứa gen Bt chống được nhiều loài côn trùng cánh vảy Lepidoptera, cà chua

chứa gen CP-TMV kháng virus, bông chuyển gen Bt chống sâu đục quả, thuốc lá
chống sâu, côn trùng cánh vảy, kháng nấm khô vằn, chống mặn, chống lạnh
Từ năm 1996 đến năm 2007 diện tích đất canh tác cây chuyển gen lên tới
114,3 triệu héc-ta. Năm 2007, đã có 23 quốc gia canh tác cây trồng chuyển gen,
bao gồm 12 nước đang phát triển và 11 nước công nghiệp. Các loại cây được trồng
nhiều như bông Bt, ngô, đậu tương, cà chua, cải canola (James Clive, 2007).
Năm 2008, số nước trồng cây chuyển gen đã lên tới 25 nước, tổng diện tích đất
trồng cây chuyển gen trên toàn thế giới từ trước tới nay đã đạt mức 2 tỉ mẫu. Ngô,
đậu tương, bông, cải canola, đu đủ kháng virus, hoa cẩm chướng, cây dương, cỏ
alfalfa và bí là những cây trồng chuyển gen được trồng nhiều (James Clive, 2008).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 15

Năm 2013 diện tích trồng cây chuyển gen tăng lên tới 175 triệu ha đưa cây
trồng công nghệ sinh học trở thành công nghệ cây trồng được ứng dụng nhanh nhất
trong thời gian gần đây. Trong số 27 nước trồng cây trồng công nghệ sinh học vào
năm 2013, có 19 nước đang phát triển và 8 nước công nghiệp. Giống ngô chịu
hạn được đưa vào sản xuất (James Clive, 2013).
1.2.3. Các phương pháp chuyển gen
Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại thành
hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và chuyển gen
trực tiếp.
* Phương pháp chuyển gen trực tiếp
- Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện.
- Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm.
- Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn.
- Chuyển gen nhờ súng bắn gen.
- Chuyển gen nhờ silicon carbide.
* Phương pháp chuyển gen gián tiếp

- Chuyển gen nhờ virus.
- Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium.
1.3. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium được nghiên cứu từ những năm
1960 - 1970. Việc phát hiện ra Agobacterium tumefaciens (A.tumefaciens) có khả
năng chuyển gen vào thực vật vào đầu những năm 1980 đã biến loài này trở thành
một trong những công cụ quan trọng nhất của công nghệ sinh học thực vật với
những ưu điểm nổi trội: số bản sao của gen biến nạp được chuyển vào tế bào thực
vật thấp (khoảng 1 - 2 bản sao, trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn), do
vậy giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen được chuyển, tăng khả năng chuyển
gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao, tránh được sự hình thành của các cây
chuyển gen khảm, kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền
(Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 16

Phương pháp chuyển gen này đã được áp dụng thành công trên nhiều đối tượng
cây trồng đặc biệt là trên cây hai lá mầm (khoai tây, cà chua, thuốc lá, đu đủ, ). Sự
chuyển gen vào cây một lá mầm khó thành công. Gần đây đã chuyển gen nhờ
Agrobacterium ở một số cây hòa thảo: lúa, ngô thành công. Trong trường hợp này
người ta thường dùng tế bào phôi ở dạng huyền phù làm đối tượng chuyển nạp, môi
trường nuôi cấy có bổ sung acetosyringone (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).
1.3.1. Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Agrobacterium là các loài vi khuẩn đất, thuộc nhóm Gram (-), yếm khí, xâm
nhập qua vết thương, các loài vi khuẩn nay gây bệnh u rễ hay bệnh rễ tơ.
Agrobacterium thuộc: Giới Bacteria
Nghành: Proteobacteria
Lớp: Alpha Proteobacteria
Bộ: Rhizobiales

Họ: Rhizobiaceae
Chi: Agrobacterium
Có 4 loài chính Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes,
Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rubi. Trong đó hai loài Agrobacterium
tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes được nghiên cứu nhiều nhất.

Hình 1.3. Vi khuẩn Agrobacterium sp, rễ tơ do vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes gây ra
Vi khuẩn đất gram âm A.rhizogenes, gây bệnh rễ tơ ở thực vật hai lá mầm.
Giống như vi khuẩn A.tumefaciens mang Ti-plasmid, A.rhizogenes mang Ri (root-
inducing) plasmid, là tác nhân gây bệnh rễ tơ ở các mô tế bào thực vật bị xâm