Nghiên cứu chuyển gen bar kháng thuốc trừ cỏ vào cây hoa lily thông qua vi khuẩn agrobecterium tumefaciens

Phần I
Mở đầu
I. Đặt vấn đề
Trong khi sự an toàn của con ngời đối với thực phẩm biến đổi gen vẫn còn
cha đợc khẳng định chắc chắn thì việc nghiên cứu hệ thống chuyển gen hiệu quả
cho các loài hoa cây cảnh từ đó chuyển đợc các gen mong muốn tạo ra các đặc
tính mới lạ (mầu sắc, cấu trúc hoa, hơng thơm, tuổi thọ của hoa cắm, các đặc
tính kháng sâu và bệnh hại, chống chịu với điều kiện bất thuận) luôn là mong
muốn của các nhà chọn tạo giống.
Lilium thuộc họ liliaceae, có khoảng 85 loài phân bố chủ yếu ở các vùng
ôn đới và cận nhiệt đới thuộc phía bắc bán cầu lily là một trong các loài hoa đẹp
đang rất đợc a chuộng trên thị trờng hoa hiện nay. Với kiểu dáng đẹp sang trọng,
một số chủng loại có hơng thơm quyến rũ và độ bền hoa rất cao (9-15 ngày), dễ
thu hoạch, bảo quản trên thế giới lilium cùng với tulip, freesia là ba loại hoa
dang thân củ chủ yếu, quan trọng trong ngành hoa thơng mại, chiếm 24% giá trị
sản phẩm hoa thơng mại (Robinson và Pizarobady, 1993) ở Việt Nam hiện nay,
hoa lily đã đợc trồng thành công ở nhiều tỉnh ở nớc ta nh Lâm Đồng, Hà Nội và
hầu hết các tỉnh miền Bắc và hiệu quả kinh tế rất cao, có thể xuất khẩu quy mô
lớn. Tuy nhiên điều kiện khí hậu nóng ẩm, ma nhiều của nơc ta đã tạo điều kiện
rất thuận lợi cho các loài cỏ dại phát triển đây là một trong những yếu tố hạn chế
chủ yếu đến sản xuất hoa lily. Chính cỏ dại làm cho giảm năng xuất, phẩm chất,
đặc biệt nó cạnh tranh dinh dỡng với cây. để có thể trừ bỏ cỏ thì cần tốn nhiều
công lao động, để giảm bớt công lao động con ngời đã phải dùng đến các loại
thuốc trừ cỏ nhng chính điều này đã gây ảnh hởng không nhỏ đến cây hoa lily.
Để có thể vừa trừ đợc cỏ mà lại không gây ảnh hởng đến cây thì việc nghiên cứu
chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ PPT vào cây hoa lily là đòi hỏi của sản xuất ,
xuất
Hoa lily thuộc Liliaceae là một trong những loài hoa đẹp và có giá trị trên
thị trờng hiện nay. Các nỗ lực chính trong nghiên cứu chuyển gem vào cây lily
đã đợc thực hiện bởi các phơng pháp chuyển gen trực tiếp nh bắn gen (Nishihara
và cộng sự, 1993; Sanford và cộng sự ; 1993 ; Wilmink và cộng sự, 1995 ;

Tsuchiya và cộng sự, 1996), xung điện (Miyoshi và cộng sự, 1995) và gần đây đã
tạo đợc cây Lilium longiflorum chuyển gen nhờ phơng pháp bắn gen. Trong một
số năm gần đây, sự thành công trong nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn
1
Agrobacterium đã đợc công bố trên một số loài thuộc họ Liliace bao gồm:
Asparagus officinalis (Kiasaka và Kameya, 1998), Allium sativum (Kondo và
cộng sự, 2000), Allium cepa (Eady và cộng sự, 2000), Agapanthus praecox
(Suzuki và cộng sự, 2001) và Muscari armeniacum (Suzuki và Nakano,2002).
Gần đây nhất, Y. Hoshi và cộng sự đã nghiên cứu thành công quy trình tạo cây
chuyển gen cho cây Oriental hybrid lily, Lilium ev. Acapulco bằng vi khuẩn
Agrobacterium.
Các kết quả nghiên cứu đã chứng tỏ chúng ta hoàn toàn có thể tạo đợc cây
hoa lily.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy, các đối tợng thực vật có bộ gen lớn hoặc
là mức tối đa bội lớn nh cây hoa cúc, hoa đồng tìên sẽ khó tạo đợc cây chuyển
gen hơn là các loài có bộ gen hay mức tối đa bội thấp hơn (Elomaa et al, 1993;
Robinson & Froozabady 1993). Hiện cha có lý giải cho hiện tợng trên tuy nhiên,
có thể do các bộ gen nhỏ hơn thì khả năng các gen lạ có thể đợc cài vào vùng
hoạt động cao hơn. (Elomaa et al 1993; Robinson & Froozabady 1993). Sự
không thành công trong biểu hiện các gen đợc chuyển có thể là kết quả của sự
đông đặc của DNA (Eady et al. 1995a) hoặc sự metyl hoá (Torres et al 1993) đã
không cho phép các gen đợc cài biểu hiện, chính vì vậy việc nghiên cứu chuyển
các gen chọn lọc hoặc gen chỉ thị trớc khi nghiên cứu chuyển các gen có tình
trạng mong muốn cho cây hoa lily là cấn thiết và có tính gợi mở cho các nghiên
cứu tiếp theo.
Mục tiêu của đề tài là xây dựng đợc những khâu cơ bản trong hệ thống kỹ
thuật chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ cho cây hoa Lily nhờ vi khuẩn
Agrobecterium tumefaciens.
Để đạt đợc mục tiêu đề ra ở trên chúng tôi cần hòan thành các yêu cầu
sau:

1. Xây dựng hệ thống tái sinh hoàn chỉnh cho cây lily
2. Xác định ngỡng gây chết của PPT đối với mẫu vảy củ, lát cắt thân và
đỉnh sinh trởng của cây hoa lily.
3. Bớc đầu thử nghiệm chuyển gen bar - kháng thuốc trừ cỏ vào cây hoa
lily thông qua vi khuẩn Agrobecterium tumefaciens.
2
Phần II
Tổng quan tài liệu
2.1 Giới thiệu chung về cây hoa lily
2.1.1 Nguồn gốc
Cây hoa lily có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Nam Triều Tiên,
California (Mỹ) và một số nơi khác.
2.1.2 Vị trí phân loại thực vật
Trong hệ thống phân loại thực vật cây hoa lily đợc xếp vào nhóm cây một
lá mầm (Monocotyledones), phân lớp hành (Lilidae), bộ hành (Liliales), họ hành
(liliaceae), chi lilium (theo Dơng Đức Tiến, Võ Văn Chi, 1978).
Cây hoa lily là cây thân thảo, thân dạng hành có vảy. Thân thờng mọc đơn
có lá. Lá luôn có hình mũi mác hay hình vạch ít khi rộng, hình tim và mọc xung
quanh thân. Hoa lỡng tính, kích thớc lớn mọc ở nách lá hay ở ngọn, có rất nhiêu
màu sắc khác nhau. Hoa có thể mọc riêng lẻ hay thành cụm gồm nhiều hoa, bao
hoa 6 mảnh dạng cánh, nhị 6, bầu hình trụ, đầu nhụy hình đầu, chia 5 thùy. Quả
nang có 3 góc và 3 nang, quả nang có nhiều hạt.
2.1.3. Giống .
2.1.3.1 - Các nhóm giống trồng trọt
Công tác tạo giống, cải tiến giống hoa lyli đợc thực hiện trên 100 năm nay
do đó nên giống rất phong phú. Trên thị trờng và trong trồng trọt thờng thấy 3
nhóm: dòng lyli thơm, dòng á châu lai, dòng lyli phơng đông lai.
a. Dòng lyli thơm lai (the longi florum hybrids)
Gồm các giống đợc sinh ra từ lyli thơm và lyli Đài Loanvà các giống tạp
giao của chúng, cây cao tứ 120 - 140cm, một số có thể đến 200cm, lá hẹp dài

hoặc hình kim sẻ ra, gắn vào thân, không có cuống lá. Nụ rất to dài từ 12 - 18cm,
khi vơn ra thì hơi trúc xuống, nằm ngang ra, chếch lên hoặc đứng thẳng. Hoa có
hình loa kèn, hoa trắng tinh khiết và có vị thơm nồng. Lyli thơm từ khi bứng
trồng đến khi ra hoa khoảng 12 - 14 tuần, tuỳ theo giống và nhiệt độ không khí
có biến động nhất định. Thời gian xử lý lạnh để phá ngủ với lyli thơm nói chung
từ 4 - 6 tuần nhng có thay đổi ít nhiều tuỳ theo giống và thời tiết lúc thu hoạch
củ. Các giống trong nớc thờng thấy là: Hoàng hậu tuyết(Snow Queen), White
3
Fox, Avita, Lilium formolongi. Vụ đông xuân ở Quảng Đông trồng rất nhiều
dòng lai của giống này.
b. Dòng á châu lai(the asistic hybrids)
Là nhóm giống đợc chọn ra từ một số bố mẹ của lyli Châu á hoặc từ các
dòng lai của chúng .
các bố mẹ đó là: quyển đau xuyên bách hợp, quyển đau đại toả, hoa kèn triều
tiên, sơn đan cây cao từ 80- 160(cm) lá hẹp dài hình kim sẻ ra, gắn vào thân.
nụ hoa thuộc loại nhỏ nhất dài 5,5-12,5(cm)
nụ hoa vờn ra theo các hớng lến, vơn ra ngoài và rũ xuống, hình dáng hoa cong
cuộn lại, hình cái bát rất ít có hình hoa kèn, màu sắc rất phong phú chủ yếu là
màu vàng, màu cam, hoa không thơm, từ khi trồng đến khi ra hoa từ 8-16 tuần,
giống và nhiệt độ không khí ảnh hởng đến thời gian sinh trởng , thời gian xử lý
lạnh phải ủ với củ giống từ 6-8 tuần, giống và thời gian vụ thu hoạch ủ giống ảnh
hởng rất lớn đến thời gian xử lý lạnh phá ngủ.
các giống thờng trồng ở Trung Quốc là: trung tâm nớc(novar center) màu vàng,
giống sa mạc(cordclia) màu vàng, pollyauma màu vàng, Elite màu cam, Brunello
màu đỏ cam
c- Dòng lai phơng đông(the oriental hybrids)
gồm các giống thiên hơng, lộc tử(con hơu) các giống có nguồn gốc từ hoa kèn
Nhật Bản và các giống thuộc dòng lai giữa các giống trên với hoa kèn Hồ báo
cây cao 60-240cm, lá tơng đối to, hình trứng hoặc hình kim sẻ rộng, lá có cuống
rõ và khác với dòng loài hoa kèn thơm và lai á châu. Độ lớn của nụ thuộc loại

hoa lớn nhất đờng kính từ 15-20 cm, nụ đa số mọc thẳng rất ít nằm ngang. Hoa
có hình cái bát hoặc hình sao, màu sắc hoa rất phong phú mầu đỏ, phấn hồng, và
màu sắc trắng là chính, hoa có mùi thơm nồng. từ khi trồng đến khi ra hoa 12-20
tuần thay đổi tuỳ theo giống và thời vụ. tính khác nhau và thời tính vụ thu hoạch
cũng ảnh hởng lớn tới thời gian sử lý lạnh phải ngủ nói chung khoảng 4-8 tuần.
các giống trong nớc thờng thấy là: stargazer(sao hoàng tộc), giống nguyên
soái(Acafulco), Sorbonne, Merostar, Siberiamaqssa, starfighter, và tiber
hiện nay trên thế giới đang mở rộng diện trong các giống dòng lai thơm và lai á
châu (L/A)và dòng lai thơm với phơng đông (L/O) để dung hoà u điểm của hai
giống
4
2.1.3.2- Các giống trồng trọt chủ yếu
a-Dòng lai loa kèn thơm
Avito: trồng vào vụ đông xuân cây có thể cao 120cm, thân cứng, lá dài hẹp, màu
xanh đậm, lá phía trên ngắn, thẳng lên trên hình dáng đẹp. Nụ to vừa dài 13-15
cm đẫy, mập nằm ngang hoặc chếch lêu trên.
Hoa hình loa kèn, mở to, đẹp mắt, cánh hoa xếp chặt, đầu cánh hơi cong ra
ngoài, màu trắng trang nhã, là loại hoa cắt tốt, tính chống chịu kém, nhiệt độ hơi
cao nụ teo lại, tỷ lệ bài dục cao, thời gian sinh trởng ngắn lại, cuống hoa ngắn.
SnowQueen cây cao 60-115 cm cây tơng đối cứng, lá dài hẹp, màu xanh đậm, lá
phía trên cuộn lại, nụ hoa dài 13-15 cm, nằm ngang hoặc hơi cong xuống, ngoại
hình đẹp, hoa nở miệng to, dáng đẹp, cánh hoa xếp tơng đối tha,cánh ngoài cuộn
ngợc lại cánh phía trong hơi cong, màu trắng là loại hoa cắt tơn đối đẹp. tính
chống chịu tơng đối yếu
White fox cây cao, trồng vào vụ đông thân cao tới 130 cm thân rất cứng lá dài
hẹp, màu xanh đậm hơi trúc xuống nụ tovừa 13-15 cm, nằm ngang hơi rủ xuống,
nụ to đẫy mập, ngoại hình đẹp,hoa hình loa kèn, miệng to, hình dáng đẹp, cánh
hoa xếp tớng đối khít cánh ngoài cánh trong đều cong ra ngoài màu trắng, đẹp, là
giống làm hoa cắt rất tốt, là giống rất đợc a chuộng , tính chịu nóng kém, nhiệt
độ caonụ hoa nhiều, tỷ lệ bài dục cao, phẩm chất hoa kém, giôngs này tơng đối

mẫn cảm với ánh sáng yếu.
Lilium formolougi là giống mới nhập vào nớc năm nay và phát triển rất mạnh có
đặc sắc là giống cắt cành trồng bằng cây con. cây cao to 100-180 cm trồng vào
vụ đông có thể cao tới trên 2m , thân rất cứng, lá có nhiều dạng, từ hình kim sẻ
dọc đến hình trứng, màu lá từ màu xanh xám đến xanh đậm, nụ tơng đối to từ
13-16 cm, đa số thẳng đứng, rất ít nằm ngang nụ to mập, dáng đẹp, hoa hình loa
kèn, miệng không to cánh hoa xếp đầy, cánh nghiêng ra ngoài rất ít gặp cong
cuộn, có khả năng chịu nắng là giống cắt cành tốt.
giống này là giống lai giữa hoa kèn thơm với hoa kèn Đài loan, qua chọn lọc bồi
dỡng đến nay đã hình thành một nhóm nhiều giống, chia ra loại hình trồng bằng
cây con, loại hình trồng bằng củ và loại hình kiêm dụng, các giống thờng thấy
là : Ngân hà , Bạch phong, bạch mã, tuyết sơn
Dòng loa kèn chịu nhiệt là dòng do trung tâm nghiên cứu khoa học viện nông
nghiệp trọng khải tạo ra mới đây có thể trồng vào vụ hè thu ở khu vực hoa nam,
tỷ lệ ra hoa và phẩm chất hoa cắt đều cao.
5
b-Dòng lai loa kèn châu á
Nove cento: là giống trồng trong nớc nhiều năm, sinh trởng khoẻ chống bệnh
mạnh không mẫn cảm với ánh sáng khả năng thích ứng rộng cây không cao
khoảng 110 cm nhiệt độ, ánh sáng ảnh hớng lớn đến chiều cao cây, nhiệt độ quá
cao, quá thấp, ánh sáng mạnh đều ức chế phát triển chiều cao. Là giống tốt trồng
trong chậu và cắt cành, thân cành rất cứng, lá dài hẹp, lá phía trên ngắn, nằm
ngang, màu xanh đâm. Nụ to và ngắn dài 7,5-8,4 cm nhiều nụ có một số nhánh
thứ hai củ nhỏ dễ ra hoa, hoa hình sao, tơng đối nhỏ, cánh hoa ngẵn và dầy hơi
cong ngợc lại, xếp khít nhau. Hoa màu vàng kim đều hoa đẹp, thời gian sinh tr-
ởng ngắn. Ơ vùng đồng bằng Chu Giang trồng vào vụ xuân 7-10 tuần ra hoa.
-Cordelia: trồng vào vụ đông xuân cây cao 110 cm, thân cành cứng, có góc cạnh,
lá hình kim xẻ, nằm ngang hơi rủ xuống, lá xanh bóng, hơi bị cháy. nụ dài 8,5-
10 cm tơng đối nhiều nụ có cành cấp hai tơng đối rõ. hoa hình sao, miệng rộng,
cánh dầy,phía giữa và dới rộng , phía trên tơng đối dài hơi cong ngợc lại. Gốc

cành có một ít đốm nhỏ màu nâu, từ gốc cành kéo dài đến giữa cành có vết đốm
màu vàng cam . cánh hoa xếp tha, tách rời nhau, thời gian sinh trởng ngắn. ở
đồng bằng Chu Giang trồng vào vụ đông xuân từ 10-14 tuần ra hoa không mẫn
cảm với ánh sáng yếu .
Pollyanna: quảng đông thờng gọi là ly ly vàng. dáng cây dáng hoa màu sắc hoa
rất giống Cordelia nhng có rất nhiều tính trạng hơn cordelia là một giống trong
dòng lai châu á màu vàng đợc a chuộng nhất, có diện tích trồng lớn nhát. giống
này sinh trởng khoẻ cây cao đến 120 cm lá xanh tơi hơi hớng lên trên. nụ tơng
đối to , ít nhánh thứ hai chống bệnh cháy lá và bệnh muội tro mạnh. thời gian
sinh trởng tơng đối ngắn. ở vùng đồng bằng Chu Giang trồng vào vụ đông xuân.
sau 10-12 tuần ra hoa có sức chịu nóng nhất định.
Elite: cây có thế sinh trởng khoẻ, cao 110-120 cm , thân cành cứng, lá dài, hình
kim, màu xanh tối, mọc ngang, nụ màu cam, dài 8-10 cm, không có cuống cấp
hai. hoa hình cốc nông, hình sao, tơng đối to, cánh hoa tơng đối dày, xếp khít
nhau, cánh hoa màu đỏ cam, ở gốc có một ít đốm đen nhỏ thời gian sinh trởng
ngắn. ở đồng bằng chu Giang trồng vào vụ đông xuân sau 10-13 tuần ra hoa.
giống này ở vùng ấm và nnơi không khí bị ô nhiễm bệnh mụi tro rất nặng, có thể
dẫn đến huỷ diệt. rất mẫn cảm với ánh sáng yếu.
Brunello: cây sinh trởng khoẻ, cao 110 cm thân to cứng, lá dài hình kím sẻ màu
xanh đậm, bóng. nụ dài và to màu cam, dài 8,5-11 cm có nhánh cấp hai. hoa hình
sao to, cánh dày phía ngọn hơi cong, xếp khít nhau, cánh màu đỏ quýt sáng, đều,
6
không có đốm, vệt. thời gian sính trởng ngắn, ở vùng đồng bằng Chu Giang gieo
trồng vào vụ đông xuân sau 9-11 tuần ra hoa, dòng màu cam của giống này có
tính chống chịu mạnh không mẫn cảm với ánh sáng yếu là giống tốt. cảm nhiễm
bệnh muội tro nhẹ.
dòng lai á châu, ngoài các giống màu vàng, màu camcòn có màu đỏ, màu phấn
hồng, màu trắng và nhiều màu nh giống: Amarono, Phanro nhng ở trung quốc ít
thấy .
c- Dòng lai phơng đông.

Stargazer(loa kèn lửa, hoàng tộc)
cây cao 60-100 cm , thân to, cứng, lá hình kim sẻ, hình trứng dài 9-10 cm, rộng 3
cm lá chếch lên trên, nụ hoa to, dài từ 11-13 cm, mập, thẳng, dáng đẹp. hoa hình
sao, đẹp, cánh hoa xếp tơng đối khít, cánh trong cánh ngoài cong ra phía ngoài,
mép lá lợn sóng từ giữa cánh trở lên có giọt nh giọt sữa nổi lên , ,màu cánh đỏ,
có viền trắng hẹp. đây là giống cắt cành và trồng trong chậu tốt, đợc trồng rộng
rãi ở phía nam trung quốc, là m,ột trong những giống chủ lực ở trung quốc. tính
chống chịu khá, không mẫn cảm với ánh sáng yếu.Cần lu ý hiện tợng khô đầu lá.
ở Hoa nam thời gian sinh trởng từ 90-110 ngày.
Akapulco: cây cao to, 100-120 cm thân cành cứng lá dài hình kim, ngọn lá kéo
dài,mọc ngang. Thân vơn dài nhanh, khoảng cách các lá tha. nụ hoa to mập dài
13-15 cm. Hoa hình sao hoặc hình cốc nông, đẹp, đầu ngọn cánh hơi cong ra
ngoài, mép lợn sóng. Từ giữa cánh trở lên có giọt lmàu đỏ nổi lên cánh hoa màu
đỏ sáng đều đặn. Đây là giống hoa cắt tốt , nụ và hoa có dáng đẹp, màu sắc đẹp,
đợc trồng nhiều ở phía bắc Trung Quốc nhiệt độ thấp dễ làm nụ biến hình. ở Hoa
nam trồng vào vụ thu đông thời gian sinh trởng 80-90 ngày.
Siberia: cây cao 100-110 cm, thân cành cứng lá hình kim sẻ, mọc ngang hoặc
trúc xuống, nụ hoa to mập, đẹp mắt dài 12-14 cm. Hoa hình sao cánh cong lật ra
ngoài, mép cánh lợn sóng cánh hoa đẹp màu trắng. Giống này tính chống chịu
mạnh là loại giống hoa cắt cành rất quý, giá cao.
Sorbone: cây cao 80-100 cm, thân cành cứng, lá dài hẹp hình kim dài 12-13 cm,
rộng 3,3-3,5 cm, hớng lên phía trên, nụ hoa to dài12-13 cm, mập đẹp. Hoa hình
chén nông, miệng rộng, cánh trong, ngoài mọc ngang hoặc hơi cong ra ngoài, từ
giữa cánh trở xuống có giọt sữa màu đỏ, cánh hoa màu phấn hồng, mép cánh có
vệt trắng hẹp.(bản dịch hoa lily)
7
2.1.4 Đặc tính sinh vật học hoa ly ly
Đặc trng hình thái.
Ly ly là cây thân thảo lâu năm, thân cao từ 50-200 cm. Phần dới đất là
thân vẩy, màu trắng hoặc màu hồng nhạt, phía ngoài không có màng bao bọc,

nên gọi là thân vẩy trần (không vỏ, thân vẩy là củ giống để trồng.)
Bộ phận trên mặt đất là thân, lá ,và hoa,quả, là phần thơng phẩm của lyli. Rễ lyli
có hai tầng, rễ mọc ở gốc của thân vẩy gọi là rễ gốc, to, mềm, có ngay trên củ
giống hoặc mọc ra ngay sau khi trồng. Rễ mọc ở nơi tiếp giáp giữa củ và thân
trên mặt đất gọi là rễ thân. Đa số giống sản xuất những thân vẩy( củ) mọc ra từ
rễ này làm thực liệu để nhân giống.
Lá lyli thờng mọc chéo nhau , hình dài, hình trứngkhông có cuống hoặc
cuống rất ngắn, một số ít giống ở nách lá có mầm, có thể dùng nhân giống.
Hoa lyli to mọc riêng rẽ mọc thành chùm hoặc thành cụm trên đỉnh ngọn
thân.Mỗi củ chỉ có một cành hoa, mầm thân của lyli bị rụng đi, hoặc sau khi
ngắt ngọn không thể mọc ra thân mới, cũngkhông thể hình thành cành hoa khác.
Nếu muốn cắt hoa thì không đợc bấm ngọn, hoa có hình loa kèn, hình phễu, hình
sao, hình cái chén nông. Màu sắc hoa rất phong phú, đẹp có màu trắng, màu
vàng lục, màu phấn hồng, màu cam, màu đỏ, màu tím và nhiều màu. Màu cánh
thờng là đơn sắc, hoặc có đốm màu nâu, màu tím một số ít có hơng thơm.
Cánh hoa sáu cái, hai vòng, mỗi vòng ba cái, nhị đực sáu cái, vòi nhỏ dài, túi
phấn to có màu tím, ,màu vàng ở giữa có trục hoa nhỏ đầu phình to.
lạnh càng dài thì ra hoa càng sớm.(bản dịch hoa lily)
2.1.5 Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng.
Loa kèn có hoa to màu sắc phong phú, hơng thơm - là loại hoa đợc thế giới
a thích, lả loại hoa có lợng lu thông lớn trên thị trờng thế giới, sản lợng đứng
hàng thứ 4 thứ 5 của hoa cắt.
Loa kèn tợng trng cho sự tốt lành, đoàn kết, mỹ mãn nên càng đợc ngời
Trung Quốc a chuộng và trở thành loại hoa phát triển mạnh, sản lợng và giá trị
ngày càng cao.(bản dịch hoa lily)
Hoa tơi là một sản phẩm hàng hóa đặc biệt của ngành Nông Nghiệp. Hiện
nay trồng hoa đã trở thành một ngành sản xuất phát triển khắp thế giới. Trong đó
8
hoa loa kèn đóng góp một phần không nhỏ. Với u thế rất phong phú về hình
dạng, màu sắc, hơng thơm. Hoa loa ken có giá trị kinh tế cao trong sản xuất lẫn

mặt tinh thần.
Bên cạnh giá trị phong phú về tinh thần thì hoa loa kèn còn đợc sử dụng để
tách chiết và tinh chế dầu thơm phục vụ cho một số ngành công nghiệp, mỹ
phẩm, bánh kẹo. Đối với y học, loài này cũng có một giá trị nhất định. Loài hoa
bách hợp L.browniFEbrown có tác dụng chữa bệnh, có thể sử dụng làm thuốc.
Với giá trị nh vậy hoa loa kèn hứa hẹn mang lại một nguồn doanh thu lớn
cho ngành sẩn xuất, kinh doanh mặt hàng này. Hiện nay, trên thị trờng Việt Nam,
các loại hoa loa kèn đang đợc bán phổ biến từ 10.000 đến 15.000 đồng/cành
(theo điều tra của thời báo kinh tế). Nh vậy đầu t vốn vào phát triển kinh doanh
mặt hàng này sẽ đem lại cho sản xuất lợi nhuận rất cao.
2.1.6 Bệnh và cách phòng trừ:
a, Phòng trừ sâu bệnh
ở trung Quốc các bệnh thờng thấy là: bệnh muội tro, sâu thờng thấy là rệp
b, Phòng trừ bệnh
Trọng điểm là bệnh khô lá và muội tro
Với bệnh khô lá: sau khi trồng 30 ngày đã bắt đầu có bệnh, bệnh tập trung
ở phần giữa lá và đỉnh ngọn làm cho lá biến nâu, sau khi khô thì cuộn lại biến
thành màu nâu đen. Nụ bị hại thời kỳ đầu biến thành màu nâu vàng đến màu nâu
đen rồi bị rụng, có thể áp dụng các biện pháp để phòng hoặc giảm bệnh.
Trong thời gian ra nụ dùng lới cản quang che bớt ánh sáng, hạ bớt nhiệt độ
và khống chế độ ẩm, dùng tay tách các lá bị bệnh cho nụ lộ ra để giảm bệnh lây
sang nụ.
Với bệnh muội tro thì phun thuốc phòng: bách khuẩn thanh, Dithan đồng
thời quạt thông gió .
2.2. CHUYểN GEN ở THựC VậT
2.2.1. Chuyển gen ở thực vật và những lợi ích đối với cải tạo giống cây trồng
Vào những năm đầu của thập kỉ 80, các nhà khoa học khám phá ra việc chuyển
gen hay còn gọi là biến nạp gen vào thực vật để tạo ra đặc tính di truyền mới nh kháng
bệnh hay vật gây hại. Nhiều kỹ thuật chuyển gen ra đời, đợc hoàn thiện và áp dụng
rộng rãi nh: bắn gen trực tiếp, thông qua Agrobacterium, nhờ vào xung điện hoặc hoá

9
học. Trong đó, 2 phơng pháp đầu tỏ ra hữu hiệu hơn cả. Vào năm 1983, cây biến nạp
gen đầu tiên ra đời đó là cây thuốc lá kháng kháng sinh. Năm 1985, một số cây chuyển
gen kháng sâu, bệnh virus và bệnh nấm lần lầu tiên đợc đa ra thử nghiệm ngoài đồng
ruộng.
Đến nay, sự biến nạp gen vào cây trồng không còn là vấn đề phải tranh cãi nữa
mà đã trở thành kỹ thuật thông dụng trong tạo giống cây trồng. Đã có hơn 50 loại gen
đợc chuyển vào cây trồng và ít nhất khoảng 400 loài đã đợc kiểm tra ngoài đồng
ruộng. Đối với các loài cây rau, chuyển gen đã thành công ở cà chua, cà rốt, khoai tây,
rau diếp, cần tây, súp lơ, da chuột, dâu tây, cải xanh, cải bắp, măng tây, ở các cây
trồng ngũ cốc nh lúa nớc, lúa mạch, lúa mỳ, ngô và cả những cây công nghiệp nh cây
bông việc nghiên cứu chuyển gen cũng đã thu đợc nhiều kết quả khả quan [1].
Những cây trồng đợc chuyển gen vẫn giống cây trồng truyền thống nhng chúng
có thêm một số đặc điểm đợc cải thiện. Vì vậy ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật
nhằm cải tạo giống cây trồng đã đem lại nhiều lợi ích rõ rệt trong phát triển sản xuất
nông nghiệp và phục vụ đời sống con ngời. Có thể điểm những lợi ích đó nh:
- Tăng sản lợng
- Giảm chi phí sản xuất
- Tăng lợi nhuận nông nghiệp
- Cải thiện môi trờng
Ngày nay, các nhà khoa học đang hớng tới tạo những cây chuyển gen thế hệ thứ
2 có đặc điểm tăng giá trị dinh dỡng hoặc có những tính trạng thích hợp cho công
nghiệp chế biến. Những lợi ích này hớng trực tiếp hơn vào ngời tiêu dùng nh:
- Lúa gạo giàu vitamin A và sắt
- Khoai tây tăng hàm lợng tinh bột
- Vacxin ăn đợc ở ngô và khoai tây
- Những giống ngô trồng đợc trong điều kiện nghèo dinh dỡng
- Dầu ăn có lợi cho sức khoẻ từ đậu nành và cải dầu [no1]
2.2.2. Những thành tựu chuyển gen ở thực vật trên thế giới và trong nớc
Trên thế giới, diện tích trồng cây chuyển gen tăng từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên 11

triệu năm 1997, 27,8 triệu năm 1998, 39,9 triệu năm 1999 và tới hơn 44 triệu năm 2000.
Các quốc gia trồng cây chuyển gen gồm có Achentina, úc, Bungary, Canada, Trung
Quốc, Pháp, Đức, Mexico, Rumani, Tây Ban Nha, Nam Phi, Urgoay và Mỹ [9]. Hiện
10
nay, những sản phẩm lơng thực, thực phẩm do công nghệ sinh học tạo ra đã có mặt trên
thị trờng.
Các thành tựu của biến nạp gen ở thực vật tập trung vào một số hớng nh:
- Chịu chất diệt cỏ
Ngời ta dùng gen tổng hợp hợp EPSP chuyển vào cây trồng để chịu đợc
Glyphosphat. Nhiều loài thực vật đã biến nạp và đang đợc thử nghiệm nh củ cải đờng,
đậu tơng, nho. cải hạt dầu, bông, cà chua và thuốc lá.
Cây đậu tơng chuyển gen chịu thuốc diệt cỏ khống chế cỏ dại tốt hơn, góp phần
nâng cao hiệu quả của các trang trại nhờ tối u hoá năng suất và sử dụng hiệu quả đất
trồng trọt, tiết kiệm thời gian cho nông dân. Giống mới này hoàn toàn giống các giống
đậu tơng khác về dinh dỡng, cấu tạo và phơng thức chế biến thành thực phẩm và thức
ăn gia súc. Đợc trồng nhiều ở Achentina, úc, Braxin, Canada, EU, Nhật bản, Hàn
Quốc, Mexico, Nga, Thụy Điển, Mỹ và Uruguay.
Cải dầu chịu thuốc diệt cỏ đợc trồng tại úc, Canada và Mỹ.
- Kháng bệnh virus
Đang nghiên cứu các gen kháng bệnh virus của thực vật. Ngoài ra đang nghiên
cứu khả năng kháng virus bằng biến nạp gen từ động vật.
Đu đủ đợc chuyển gen của virus mã hoá cho protein vỏ của virus đốm vòng.
Protein này tạo cho cây khả năng tự bảo vệ chống lại bệnh đốm vòng. Một gen từ
nguồn bệnh đã đợc sử dụng để kháng lại chính nó.
Cây khoai tây đã đợc chuyển gen giúp kháng virus gây xoăn lá, cây bí chuyển
gen giúp kháng virus gây bệnh.
- Kháng các loài gây hại
Chuyển gen độc tố từ Bacillus thuringiensis (BT) để tạo giống chịu côn trùng có
hại. Cây bông chuyển gen Bt kháng sâu đục quả và ăn lá, đợc trồng phổ biến ở nhiều n-
ớc nh Trung quốc, Nam phi, Achentina, Các cây bông, lúa mang gen chuyển này có

khả năng chống chịu sâu đục thân rất tốt.
- Chống chịu các bệnh nấm
Đang phân lập gen 1,3-glucanase (mã hóa enzym phân hủy thành tế bào của các
mầm bệnh nấm) từ thực vật kháng bệnh để chuyển vào các loài mẫn cảm.
- Thay đổi thành các axit béo
11
Ngời ta làm tăng hàm lợng axit béo đơn không bão hòa và các thành phần dầu
thực vật. Cây đậu tơng chuyển gen axit oleic có hàm lợng axit oleic cao, một axit béo
có một liên kết không no. Theo các nhà dinh dỡng thì chất béo không no đợc xem là tốt
hơn so với chất béo no, đợc tìm thấy ở thịt bò, lợn, phomat và một số thức ăn thờng
ngày khác.
Cải dầu chuyển gen có hàm lợng Laurate cao, đợc dùng trong công nghiệp thực
phẩm để làm lớp phủ ngoài kẹo chocolate, bánh ngọt, lớp kem, bơ. Đợc trồng ở Canada
và Mỹ. Cải dầu có hàm lợng axit oleic cao đợc trồng ở Canada.
- Làm chậm chín quả ở cà chua
Cây cà chua mang một gen chuyển làm chậm quá trình làm mềm quả tự nhiên
khi quả chín. Đây là loại thực phẩm chuyển gen đầu tiê n đợc sản xuất ở các nớc phát
triển. Giống cà chua này có thời gian lu trên giá bán hàng dài hơn.
Ngoài ra giống chuyển gen có các đặc tính nh:
- Điều chỉnh sinh tổng hợp tinh bột để làm chủ mức tinh bột trong sản phẩm.
- Cải thiện chất lợng đạm tích lũy trong hạt.
- Tăng hàm lợng vitamin A trong hạt gạo.
ở nớc ta, một số phòng thí nghiệm lớn đã và đang đi sâu vào công tác cải thiện
giống cây trồng bằng kỹ thuật chuyển gen. Tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện
Công nghệ Sinh học, các bớc cơ bản trong giai đoạn chuẩn bị đã đợc thực hiện. Đó là:
(1) Thu thập và cất giữ các nguồn gen có giá trị nh gen CryIA(b), CryIA(c), gen ức chế
tryspin để trừ sâu, gen Xa21 chống bạc lá vi khuẩn, gen chịu lạnh, gen protein giàu
tryptopha; (2) Thiết kế các vector mang gen chuyển và thử nghiệm thành công các kỹ
thuật chuyển gen: gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, trực tiếp
bằng súng bắn gen. Đến nay, nhiều dòng lúa chuyển gen Xa21, CryIA(c), đu đủ

chuyển gen chín chậm và kháng virus đốm vòng đã đợc tạo ra. Các dòng cây chuyển
gen này sẽ đợc đa vào phân tích phân tử; (3) Chuẩn bị thiết bị để tiến hành các kỹ thuật
sinh học phân tử phục vụ việc đánh giá theo dõi cây chuyển gen nh PCR, lai Southern,
RFLP, AFPD. Nh vậy, có thể tiến hành chuyển gen và đa kỹ thuật này vào công việc tạo
giống cây trồng ở Việt Nam [1].
2.3 Nghiên cứu tái sinh và chuyển gen trên cây hoa lily
2.3.1 Byung Joon Ahn, Young Hee Joung, Kathryn K. Kamo, 2004. J
Transgenic Plants of Eastr lily (Lilium longiflorum) with Phosphinothricin
Resitance. J Plant Biotechnology (2004) Vol. 6 (1).pp.9-13.
12
Tóm tắt
Qúa trình chuyển gen và biểu hiện của gen uidA đợc sử dụng trong nghiên
cứu tối u hoá các thông số khi chuyển gen bằng súng bắn gen cho huyền phù tế
bào của hoa Easter lily, Lilium longiflorum. Sử dụng hạt vàng cho sự biểu hiện
của gen uidA cao hơn so với hạt đạn bằng tungsten. Tiền xử lý dung dịch huyền
phù tế bào trớc 3 giờ bằng osmoticum (0.125M) cho hiệu quả biểu hiện của uidA
tăng 1.5 lần. Sử dụng áp lực 1550psi, khoảng cách 6cm có kết quả tốt nhất so với
các áp lực 1100,1200,1800 psi. Sự biểu hiện tạm của uidA xuất hiện ở 493 tế
bào/đĩa petri. Để chuyển gen bền vững, huyền phù tế bào của Lilium longiflorum
đợc bắn với plasmid bao gồm cucumber mosaic virus (CMV) replicase đợc điều
khiển bởi Act/ promoter và gen bar đợc điều khiển bởi CaMV promoter, 10 cây
tái sinh đã đợc phân tích bởi PCR, 2 trong 10 cây đã đợc khẳng định chuyển gen
nhờ lai Southern, 2 cây chuyển gen đợc chuyển độc lập trong đó có 1 cây mang
gen bar một cây mang cả hai gen bao gồm CMV replicase và bar gen. Các cây
này đã đợc xác định là có khả năng kháng PPT ở nồng độ 1000 mg/l ở giai đoạn
nở hoa chứng tỏ gen bar đã đợc biểu hiện ở toàn bộ lá khi đợc điều khiển bởi
CaMV 35 S promoter.
2.3.2 Y.Hoshi, M. Kondo, S.Mori, Y.Adachi, M.Nakano,
H.Kobayashi, 2004. Production of transgenic lily plants by Agrobacterium-
mediated transformation, Plant Cell Rep (2004) 22:359-364

Tóm tắt
Hệ thống tạo cây chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium cho cây
Oriental hybrid lily Lilium cv. Acapulco đã đợc nghiên cứu. Callus xuất phát từ
ống phấn đợc đồng nuôi cấy với vi khuẩn Agrobacterium dòng EHA101/plG 121
Hm, chứa véc tơ mang các gen nptH,
hyg
r+
, uidA trong vùng T-DNA. Đã thu
đợc 6 dòng kháng hyg từ hơn 200 callus bằng cách làm tổn thơng callus với giấy
ráp (sandpaper) trớc khi đồng nuôi cấy, callus đợc đồng nuôi cấy trên môi trờng
MS không có NH
4
NO
3
, sử dụng Hyg trong môi trờng chọn lọc. Các dòng tái sinh
kháng hyg tạo chồi sau đó phát triển thành cây khi chuyển sang môi trờng MS
không bổ sung chất điều tiết sinh trởng. Tất cả các cây đợc kết luận chuyển gen
nhờ GUS histochemical assay và phân tích inverse PCR.
2.3.3 Sakae SUZUKI anh Masaru NAKANO, 2002, Agrobacterium-
Mediated transformation in Liliaceous ornamental plant. JARQ 36(3), 119-
127(2002)
13
Tóm tắt
Đã nghiên cứu chuyển gen cho 3 giống cây thuộc họ Liliace, Lilium
formosanum, Agrobacterium đã đợc sử dụng, cả ba dòng đuểu cha binary vector
mang gen nptII, hpt và gus trong vùng T-DNA. Với Lilium formosanum, không
thu đợc mô hoặc cây chuyển gen sau khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn
Agrobacterium mặc dù có sự biểu hiện tạm của gen gus trong callus trong quá
trình đồng nuôi cấy. Tuy nhiên, đã thu đợc một số cụm tế bào có khả năng kháng
hygromycin của giống Agapanthus praecox ssp. Orientalis và Muscarri

armeniacum trên môi trờng có bổ sung hygromycin, Callus kháng hygromycin
đã tái sinh tạo cây hoàn chỉnh qua phôi soma, hầu hết trong số chúng đợc xác
định là cây chuyển gen dựa trên phép thử GUS histochemical assay và phân tích
PCR. Bằng lai Southern đã phát hiện đợc 1-5 copy của gen trong bộ gen của cây
chuyển gen của 2 giống trong đó hầu hết là có 1 hoặc 2 copy. Hệ thống chuyển
gen vào Muscarri armeniacum và Agapanthus praecox ssp. Orientalis có thể là
một công cụ để phát triển trong các nghiên cứu về sinh học phân tử.
2.3.4 A.Mercuri, L. De Benedetti, S. Bruna, R. Begliano, C. Bianchini,
G.Foglia, T.Schiva. Agrobacterium- Mediated transformation with rol
genes of Lilium longìlirum Thunb. ISHS Acta Horticluturae 612
Tóm tắt
Đã nghiên cứu thành công hệ thống chuyển gen cho Lilium longiflorum
Thunb giống " Snow Queen". Callus phát sinh phôi xuất phát từ vòi nhuỵ và
cuống đã đợc cấy và đồng nuôi cấy trong 7 ngày với huyền phù của vi khuẩn
Agrobacterium LBA 4404 mang binary vectơ pBin 19 bao gồm nptH gen đợc
điều khiển bởi nos promoter và các đoạn giới hạn T-DNA EcoRI 15, bao gồm
ORFs 10,11 và 12 tơng ứng với rol A, B và C đợc cắt từ Agrobacterium
rhizogenes pRi 1855. Các chồi chuyển gen đã đợc tái sinh trên môi trờng chọn
lọc và dễ dàng nhân nhanh, ra rễ và chuyển ra đất. Có sự đa dạng về kiểu hình
của các dòng chuyển gen.
2.3.5 A. Lipsky, A. Cohen, R. Barg, S. Shabtai, Y. Salts, V. Gaba, K.
Kamo, A. Gera và A. Watad Development of Lilium longiflorum cell
cultures of high competence for transformation by particle bombarment
and of high embryogenic capacity
Tóm tắt
14
Để có thể tạo đợc cây chuyển gen bền vững cho Lilium longiflorum
Thumb.vn. Snow Queen cần thiết lập hệ thống tái sinh để có đợc callus (xuất
phát từ các đoạn vảy củ) có độ đồng đều về hình thái cao trong môi trờng lỏng.
Callus xuất phát từ vảy củ có độ đồng đều thấp sau 6 tháng cấy chuyển . Nghiên

cứu chuyển gen đã đợc thực hiện bằng sử dụng thiết bị bắn gen Finertype
bombardment trên callus có 3 hoặc 10 tháng đợc duy trì trong môi trờng lỏng ở
điều kiện bóng tối. Các hạt vàng đợc bọc bới plasmid pUBQ3 gen GUS bao gồm
gen uidA đợc điều khiển bởi UBQ3 promoter. Thí nghiệm đợc lặp lại 3 lần mỗi
lần một đĩa, 10000 đến 15000 điểm biểu hiện của gen gus. Callus nuôi cấy trên
môi trờng lỏng cho phép thu đợc cây chuyển gen bền vững cao hơn từ 50-70 lần
so với môi trờng đăc. Đã tái sinh đợc 81.6+3.7 cây/ 1g callus tơi từ callus nuôi
cấy trong môi trờng lỏng lắc có chiếu sáng. ở đầu giai đoạn tái sinh có sự hình
thành phôi soma ở mức độ cao. Kanamycin có hiệu quả chọn lọc tốt hơn so với
bialaphos. Đã thu đợc 10 cây chuyển gen bền vững của Lilium longiflorum
Thumb. cn. Snow Queen. Gần đây nhất, các tác giả đã sản xuất đợc hàng trăm
cây chuyển gen khác nhau sử dụng pCAMBIA2301 bao gồm gen rol B dới sự
điều khiển của Lat 52 promoter để chống lại sự phát triển của phấn hoa. Gen gus
đã đợc biểu hiện rất mạnh trong các cây chuyển gen. Các phân tích về gen của
những cây này đang đợc tiến hành.
2.4 kỹ thuật chuyển gen vào thực vật.
2.4.1 khái niệm về chuyển gen
kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đa một hay nhiều gen lạ đã đợc thiết kế ở
dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ ở cây trồng nói riêng và ở các vi sinh vật nói
chung (vi sinh vật, động vật) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng Plasmid tái tổ
hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ các gen này hoạt động
tổng hợp nên các protein đặc trng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ
thể chuyển gen.
2.4.2 Sự tái sinh cơ thể thực vật cơ sở thành công của chuyển gen
2.4.2.1 Cơ sở khoa học về khả năng tái sinh của thực vật
a, Tính toàn năng của tế bào.
Haberlandt (1902), lần đầu tên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của
một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiêm tàng để phát triển thành một cơ
thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã
phân hóa đều mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó.

15
Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể
hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào. tính toàn năng của tế bào mà
Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực
vật. Cho đến nay con ngời đã hoàn toàn chứng minh đợc khả năng tái sinh của
một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. [0.1. G.C.Philips, 1997].
b, Sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào.
Cơ thể thực vật trởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan chức năng khác nhau, đợc hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy
nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp
tử). ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào
phôi sinh cha mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó từ tế bào phôi
sinh này chúng đợc tiếp tục biến đổi thành tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các
mô, cơ quan có chức năng khác nhau.
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hóa, đảm nhệm các chức năng khác nhau. Ví dụ: mô dậu làm nhiệm vụ
quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn
làm chức năng dẫn nớc và dinh dỡng.
Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị:
Quá trình phân hóa
Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hóa
Quá trình phản phân hóa
Tuy nhiên khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên,
chúng không là hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trờng hợp cần
thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân
chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là quá trình phản phân hóa tế bào, ngợc lại với
sự phân hóa tế bào. về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá
trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát
triển cá thể, có một số gen đợc hoạt hóa (mà vốn trớc nay bị ức chế) để cho ta
tính trạng mới, còn một số gen lại bị đình chỉ hoạt động, điều này sảy ra theo

một chơng trình đã đợc mã hóa trong cấu trúc của một tế bào khiến quá trình
sinh trởng phát triển của cơ thể thực vật luôn đợc hài hòa.
16
Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối cơ thể thờng bị ức chế bở các tế
bào xung quanh khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thớc của khối mô sẽ
tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất
là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. kỹ thuật nuôi cấy
mô tế bào cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào
thực vật (khi nuôi cấy tác rời trong điều kiện vô trùng) một cách định hớng dựa
vào sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào
thực vật. Điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, ngời ta thờng bổ
xung vào môi trờng nuôi cấy cả hai nhóm chất điều tiết sinh trởng thực vật là
auxin và cytokinin.
Tùy theo mục đích nghiên cứu đặt ra nh tạo mô sẹo, tạo chồi phụ, tạo rễ,
tạo phôi vô tính hay cho mọc chồi trực tiếp từ mô nuôi cấy mà môi trờng thích
hợp là cần thiết nhất (Bajaj và cộng sự, 1975).
2.4.2.2 Vai trò của việc xây dựng hệ thống tái sinh.
Trong kỹ thuật chuyển gen vào cơ thể thực vật, thì những đối tợng thờng
đợc sử dụng để chuyển gen là: Mô lá, mô thân, mô callus hay những tế bào tách
rời những vật liệu này sau khi đã đợc biến nạp thành công, các tế bào đã dung
nạp những gen ngoại lai, ta phải tìm cách làm cho các tế bào này tái sinh đợc
thành cây hoàn chỉnh bằng cách đặt nó vào môi trờng tái sinh phù hợp. Nếu nh,
sự tái sinh này thành cây hoàn chỉnh không thành công thì tất cả những vật liệu
đã đợc biến nạp đó sẽ trở nên vô nghĩa. Chính vì vậy sự thành công của kỹ thuật
chuyển gen phụ thuộc vào sự tái sinh của tế bào. do vây, việc lựa chọn và điều
chỉnh môi trờng nuôi cấy mô và tế bào thực vật đóng vai trò hết sức quan trọng,
mang tính quyết định đến sự thành công hay thất bại của thí nghiên biến nạp,
bên cạnh đó, vấn đề sử dụng mô hay tế bào thích hợp để biến nạp cũng là mục
tiêu nghiên cứu không kém phần quan trọng (potrykus, 1991).

JamesF.thutchinson, Daniel Isenegger, Savitri Nadesan, Neil Smith and
Piter Waterhouse, (2000) nhận thấy: Để có thể tạo đợc giống mới nhờ cải biến di
truyền một cách có hiệu quả thì phải đảm bảo 4 yêu cầu sau:
*Hệ thống tái sinh thích hợp để tái sinh đợc cây đã chuyển gen:
*Hệ thống vecter thích hợp để có thể đa đợc các gen vào DNA:
*Các gen thích hợp đã đợc nhân rộng và xác đinh các đặc tính:
17
*Các phơng pháp để đánh giá các cây chuyển gen trong phòng thí nghiệm,
nhà kính và đồng rộng (JamesF.thutchinson, Daniel Isenegger, Savitri Nadesan,
Neil Smith and peter Waterhouse,2000)
2.4.3 Đại cơng về các phơng pháp chuyển gen:
Ta có thể phân chia thành hai nhóm phơng pháp chuyển gen chính là:
* Các phơng pháp chuyển gen trực tiếp:
- Dùng PEG (Polyetylen glycol).
- Dùng súng bắn gen (gen gun).
- Dùng điện xung (electropration).
- Dùng vi tiêm (microinjection).
- Dùng siêu âm (microwaves).
- Dùng silicon carbide.
- Dùng điện di.
- Sử dụng ống phấn (pollentube pathways)
* Các phơng pháp chuyển gen gián tiếp: đây là phơng pháp chuyển gen mà các
đoạn DNA không đợc đa trực tiếp vào tế bào hoặc mô mà phải thông qua các
vector mang, các vector này thờng là các plasmid tái tổ hợp hoặc có thể là DNA
của virus. Hiện nay đợc sử dụng nhiều nhất là hai phơng pháp sau:
- Chuyển gen nhờ vi khuẩn: thờng sử dụng hai loại vi khuẩn đất là
Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogens.
- Chuyển gen nhờ virus: có hai loại thờng sử dụng là: Gemini virus và
caulimosaic virus.
Sau đây chúng ta sẽ tìm hiểu về một số các phơng pháp đợc sử dụng phổ biến:

2.4.1 Chuyển gen bằng PEG (pholyethylene glycol).
PEG là chất có ái lực lớn với nớc. Ơ nồng độ cao, PEG là cho DNA không còn ở
trạng thái hòa tan mà kết dính vào màng nguyên sinh của tế bào sau đó bị tế bào
nuốt theo cơ chế của Amip. Có nhiều chất có ái lực lớn nh PEG nhng PEG là
chất ít gây độc cho tế bào nhất nên đợc sử dụng phổ biến.
Chyển gen qua PEG là một phơng pháp thực hiện khá đơn giản mà lại hiệu quả
cao. Trong cùng một thí nghiệm ta có thể xử lý một lợng khá lớn tế bào, có thể
thu đợc hàng nghìn cá thể chuyển gen riêng biệt. Hơn nữa lại không có những
18
hạn chế về dãy vật chủ nên đợc sử dụng phổ biến để nghiên cứu các cơ chế điều
hòa sự biểu hiện gen.
Nồng độ ion Mg++ hoặc Ca++ trong hỗn hợp ủ, trọng lợng phân tử và nồng độ
PEG là những thông số quan trọng nhất tác động đến hiệu quả của phơng pháp
này.
2.4.2 Chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm (Micro injection).
Qua kính hiển vi, DNA plasmid có thể đợc tiêm vào tế bào vi sinh vật và
protoplast đối với tế bào thực vật dới áp lực cao để tiến hành chuyển gen. Ngời ta
đã thực hiện chuyển gen thành công ở khá nhiều đối tợng thực vật, vi sinh vật
cũng nh động vật bằng phơng pháp này.
Tuy nhiên, phơng pháp này ít đợc sử dụng ở phòng thí nghiệm vì thao tác
vi tiêm dới kính hiển vi đòi hỏi thiết bị vi thao tác cực nhạy, rất đắt tiền. Sự thành
công phụ thuộc nhiều vào sự khéo tay và kiên nhẫn của ngời thao tác.
2.4.3 Chuyển gen bàng xung điện:
Phơng pháp này sử dụng những xung điện ngắn trong một điện trờng cực
mạnh để tạo một lỗ thủng tạm thời trên màng tế bào làm tăng khả năng xâm
nhập của DNA vào tế bào.
Protoplast hoặc các tế nguyên vẹn đợc đặt giữa hai tấm kim loại cách nhau
1-4 mm trong một cuvette bằng nhựa. ơ điện thế cao, xung điện tạo các lỗ tạm
thờ (cỡ 30 nm) trên màng protoplast và DNA bên ngoài có thể xâm nhập vào bên
trong tế bào.

Xung điện từ lâu đã đợc dùng để biến nạp và hợp nhất các tế bào trần. So
với phơng pháp bắn hạt, phơng pháp này hiệu quả có phần hạn chế hơn, nhng đối
với những mô dễ hấp thu DNA nhờ xung điện thì sử dụng phơng pháp này
nhanh, đơn giản và rẻ tiền hơn.
2.4.4 Chuyển gen bằng phơng pháp bắn gen (Biolistic hoặc
Bombardement).
Phơng pháp sử dụng súng bắn gen do John Stanford ở đại học Comell phát
minh (Klein và ctv, 1987). Đây là phơng pháp trong đó các vi đạn có tốc độ cao
đợc sử dụng để chuyển các axit nucleic vào các tế bào sống. Phơng pháp này rất
có hiệu quả trong việc chuyển DNA lạ vào tế bào thực vật.
19
Phơng pháp này có khả năng xử lý đối với các mô đã biệt hóa và có thể
biến nạp vào các loài khó chuyển gen nh: đậu tơng, bông, ngô, lúa Sự biểu hiện
gen tạm thời đã đợc chứng minh ở nhiều loài khác nhau.
Hiệu quả của phơng pháp phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
- Bản chất của mô đích: Phải có khả năng biến nạp và dễ tái sinh.
- Bản chất, các tính chất hóa học và vật lý của các hạt kim loại dùng để
mang DNA lạ, việc chuẩn bị và gắn DNA vào các hạt mang.
- Các yếu tố về môi trờng nh: nhiệt độ, độ ẩm, chu kỳ sáng.
Ưu điểm của phơng pháp:
- Dễ sử dụng.
- Bắn một lần có thể chuyển nạp vào rất nhiều tế bào.
- Gen đợc bọc ngoài hạt kim loại vẫn có hoạt tính sinh học cần thiết.
- Các tế bào, mô cần chuyển rất phong phú.
- Điểm tới của hạt kim loại có thể là trên bề mặt hoặc sâu bên trong của mô.
Nhợc điểm của phơng pháp:
- Nhiều tế bào bị phá hủy.
- Tạo ra nhiều bản sao của DNA, khi kết gắn dễ làm xáo trộn hệ thống di
truyền của mô đích.
- Việc kết gắn bền vững thấp.

- Công việc chuẩn bị vật liệu tốn nhiều thờ gian.
- Thiết bị đăt tiền.
2.4.5 Chuyển gen qua trung gian là các virus vector:
Do virus có kích thớc nhỏ, cấu trúc đơn giản chỉ gồm vỏ protein và lõi
DNA hoặc RNA lại có khả năng xâm nhiễm tự nhiên vào các vật chủ nên ngời ta
đã nghĩ đến việc sử dụng chúng làm vector chuyển gen.
Có hai loại virus thờng đợc sử dụng làm vector chuyển gen là:
- Gemini virus: có phổ ký chủ động (có cả cây hòa thảo)
- Caulimosaic virus: virus hại cây họ cải, có khả năng tải và chuyển gen tốt,
có promotor mạnh.
20
Tuy nhiên phơng pháp này vẫn còn ít đợc sử dụng do những gen đợc chuyển
nhờ virus không di truyền qua hạt nên không di truyền cho các thế hệ sau đ-
ợc. Muốn di truyền đợc cho các thế hệ sau phải tiến hành nhân vô tính nên
không phải loại cây nào cũng thực hiện đợc. Mặt khác việc lựa chọn các
chủng virus phải thỏa mãn một số yêu cầu sau:
- Cấu trúc di truyền phải là DNA.
- Không có tính độc hoặc tính độc thấp.
- Khả năng tải lớn.
- Có phổ ký chủ rộng.
2.4.6 Phơng pháp chuyển gen qua trung gian Agrobacterium.
Vi khuẩn Agrobacterium là một tác nhân chuyển gen rất hiệu quả trên đối
tợng thực vật. Có hai chủng đợc sử dụng phổ biến là:
- Agrobacterium tumefaciens: vectơ mang là Ti-plasmid.
- Agrobacterium rhizogens: vectơ mang là Ri-plasmid.
Trớc đây ngời ta cho rằng phơng pháp chuyển lạp gián tiếp này chỉ thực hiện
có hiệu quả đối với cây hai lá mầm vì trong tự nhiên các vi khuẩn này không
có khả năng gây bệnh ở cây một lá mầm. Tuy nhiên, gần đây nhiều nhà khoa
học đã tiến hành chuyển gen thành công trên đối tợng cây một lá mầm nh:
lúa, ngô nhờ Agrobacterium. Chính vì vậy phơng pháp này đợc sử dụng khá

phổ biến hiện nay. Đặc biệt ở nớc ta đây có thể coi là phơng pháp chuyển gen
phổ biến nhất do nó không đòi hỏi các thiết bị đắt tiền mà lại có hiệu quả cao.
2.5 Các hớng tạo cây chuyển gen.
2.5.1 Tình hình chung về cây chuyển gen.
Ngời ta bắt đầu tiến hành chuyển gen vào đối tựơng thực vật từ năm 1982,
tiếp theo đó nhiều giống cây trồng mới đợc tạo ra bằng phơng pháp chuyển gen
và phổ biến vào sản xuất từ năm 1996. Diện tích gieo trồng cây chuyển gen tăng
nên không ngừng: 2,8 triệu ha năm 1996, 12,8 triệu ha năm 1997, 27, 8 triệu ha
năm 1998, riêng ở Mỹ năm 1999 đạt 28,7 triệu ha (15 triệu ha là đậu tơng, 10,3
triệu ha là ngô, 3,5 triệu ha là bông chiếm 72% diện tích trồng cây chuyển gen
trên toàn cẫu). Tập trung ở một số nớc nh: Mỹ, Canađa, Trung Quôc theo tổng
kết của công ty công nghệ sinh học Mũ, Monsanto thì vấn đề cây chuyển gen đã
có 18 năm kinh nghiệm, sử dụng đối với 56 loại cây ở 45 nớc. Tốc độ phát triển
21
các giống cây trồng chuyển gen rất nhanh, lợi nhuận đa lại từ các sản phẩm này
rất lớn: ớc tính đến năm 2010 thị trờng thực phẩm biến đổi gen sẽ tăng gấp tám
lần so với hiện nay, tức khoảng 25 tỷ USD. Trong số các cây trồng chuyển gen,
cây đợc chuyển gen kháng sâu bệnh đợc sử dụng khá phổ biến đặc biệt là với các
cây công nghiệp nh: bông, thuốc lá cây lơng thực nh: ngô, lúa Từ năm 1986
đến 1993 đã có tới 96 thử nghiệm đối với việc chuyển gen kháng sâu cho cây
trồng (34 thử nghiêm ở khoai tây, 19 thử nghiệm đối với thuốc lá, 24 thử nghiệm
đối với ngô, 16 thử nghiệm đối với cà chua, 3 thử nghiệm đối với hạt chứa dầu)
(Plant Molecular Genetics Monica A. Hughes). Những giống cây kháng sâu
này thự sự có hiệu quả nên đã đem lại nhiều lợi nhuận do không phải sử dụng
thuốc trừ sâu năng suất chất lợng lại tăng: năm 1996 lợi nhuận nớc My do bông
Bt đem lại là 60 triệu USD, do ngô Bt đem lại là 200 triệu USD. Do những lợi ích
to lớn nh vậy nên công nghệ chuyển gen cho thực vật ngày càng đợc hoàn thiện,
các phơng pháp chuyển gen ngày càng phong phú. Hàng loạt các phơng pháp
chuyển nạp gen vào thực vật đã đợc thông báo thành công. Có những phơng pháp
rất phức tạp, phải sử dụng đến những kỹ thuật cao nhng cũng có những phơng

pháp khá đơn giản.
2.5.2 Các hớng chính tạo cây chuyển gen:
Tạo cây chống chịu bệnh virus nhờ chuyển gen:
Bệnh virus là bệnh không chữa đợc và gây tổn hại lớn đến năng suất cũng nh
chất lợng của cây trồng. Do đó hớng nghiên cứu này rất quan trọng.
Đa số virus hại cây có cấu trúc gồm một vỏ bọc protêin và phần lõi là axit
nucleic (AND, ARN). Gen mã hóa cho protein vỏ đợc gọi là các gen CP (Coat
protein genes). Giáo s Beachy ở viện nghiên cứu SCRIPP tại Sandiego (My)
là ngời đầu tiên nhận thấy nếu chuyển gen CP vào bộ gen của cây thì cây trở
lên kháng hoàn toàn với loại virus tơng ứng. Cơ chế của hiện tợng này còn
cha đợc sáng tỏ tuy nhiên ngời ta đã giả định sự d thừa protein vỏ virus nh tín
hiệu ngừng tổng hợp phần tổng hợp axit nucleic của virus. Chính vì thế khi có
mặt sẵn protein vỏ do gen CP sản sinh, virus mới xâm nhiễm sẽ không thể
nhân lên đợc. Lợi dụng tính chất này ngời ta đã tiến hành chuyển gen mã hóa
quá trình tổng hợp protein vỏ virus vào cây để giúp cây chống chịu bệnh
virus. Hớng chuyển gen này rất thành công đối với cây họ cà: thuốc lá. khoai
tây, cà chua, đu đủ.
Tạo cây kháng sâu:
22
Sâu là một tác nhân gây hại rất lớn cho ngành nông nghiệp. Hàng năm một l-
ợng lớn thuốc trừ sâu hóa học đã đợc sử dụng để hạn chế các dịch hại cây
trồng. Nhng biện pháp này có hại cho sức khỏe con ngời và ô nhiễm môi tr-
ờng nên cần thay thế bằng một phơng pháp khác an toàn hơn.
Từ đầu thế kỷ 20 đã phát hiện vi khuẩn đất Bacillus thuringens có khả
năng tổng hợp độc tố có bản chất protein gọi là Bt toxin, chất này có khả
năng diệt sâu non của côn trùng mà không ảnh hởng đến động vật có xơng
sống (Nguyễn văn Uyển, 1997) [10]. Các protein độc tố thờng ở dạng tinh thể
protein hình quả trám gọi tắt là Cry. Hiện nay đã phát hiện đợc trên 50 loại từ
CryI đến CryIX. Các Cry khác nhau có cơ chế gây hại khác nhau. Theo thống
kê cho thấy 525 loài sâu thuộc 13 bộ côn trùng có thể bị nhiễm bệnh do B.

thuringiensis gây ra: Bộ cánh vảy (318 loài), Bộ hai cánh (59 loài), Bộ cánh
màng (57 loài), Bộ cánh cứng (34 loài).
Năm 1985 trình tự những gen mã hóa cho việc tạo protein tinh thể độc lần
đầu tiên đã xác định (Adang và cs, 1985) [13]. Những thí nghiệm đầu tiên về
chuyển gen mã hóa protein tinh thể đợc thực hiện nhờ trung gian
Agrobacterium tumefaciens đợc thực hiện trên cây thuốc lá và cây khoai tây
(Adang và cs, 1987) [14]. Tiếp đó Vector mang trình tự mã hóa cho tiền độc
tố CryIA(a), CryIA(b), CryIA(c) đã đợc chuyển vào cây thuốc lá (Barton và
cs 1987) [15]. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng việc chuyển gen Cry đã có sửa
chữa so với nguyên bản cho hoạt tính kháng sâu cao hơn nhiều. Cây bông
chuyển gen Cry đã cải tiến thể hiện tính kháng cao với loại sâu xanh nguy
hiểm (Perlak và cs, 1993) [19]. Trên cánh đồng cây củ cải chuyển gen
CryIA(b) cải tiến đã kháng lại hoàn toàn sâu hại củ và sâu hại lá (Wilson và
cs, 1992) [20]. Nh vậy có thể thấy hớng nghiên cứu này có rất nhiều tiềm
năng ứng dụng vào thực tiễn sản xuất là rất lớn.
Tạo cây kháng thuốc trừ cỏ:
Thuốc diệt cỏ tác động lên cây trồng bằng nhiều con đừng: Qua con đờng
quang hợp, qua con đờng tổng hợp axit amin, chất béo hoặc tổng hợp các
hoóc môn sinh trởng thực vật.
Basta là một loại thuốc trừ cỏ sinh học có dợc chất chính là
phosphinothricin (PPT0 tác dụng lên cơ chế tổng hợp axit amin cụ thể là
enzim Glutamin synthase (GS), (Monica A.Huges, 1995[19]. Loại thuốc trừ
cỏ này có tác dụng tiêu diệt không chọn lọc nên khi sử dụng để tiêu diệt thì
đồng thời cũng ảnh hởng đến cây trồng. Gen bar không có trong thực vật, đợc
23
phân lập từ xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus mã hóa cho việc hình
thành enzim phosphinothricin acetyltransferase (PAT) có tác dụng làm mất
độc tính của PPT (Nguyễn văn Uyển, 1998)[8], đã đợc nghiên cứu chuyển
vào cây tạo cho cây tạo cho cây có khả năng kháng đợc PPT. Gen bar thờng
đợc chuyển kèm cùng với các gen hữu dụng khác nh gen kháng sâu với vai

trò vừa nh một gen chọn lọc vừa nh một gen hữu dụng tạo đồng thời tính
kháng thuốc trừ cỏ cho cây.
Thuốc trừ cỏ tác động lên sự quang hợp của cây bằng cách ức chế enzim
quang hợp, làm ngừng trệ quá trình quang hợp làm cho cây bị chết. Hiện nay
thuốc trừ cỏ phổ biến, có hiệu có hiệu quả cao, không độc với môi trờng là
chất Glyphosat: chất này tác động lên enzim biến đổi sản phẩm thứ cấp của
quang hợp Enolpyruvat sikimat phosphat synthetaza (EPSPS). Nếu enzim này
bị hỏng sẽ ảnh hởng đến sự tổng hợpc các hợp chất mạch vòng nh: axit
sikimic tiền chất để tạo axít amin mạch vòng, các chất kích thích sinh trởng
làm cho cây bị chết. Loại thuốc diệt cỏ này cũng có tác dụng tiêu diệt không
chọn lọc cho nên khi sử dụng các loại cây trồng cũng bị ảnh hởng. Hiện nay
đã phân lập gen mã hóa gen tổng hợp enzim EPSPS từ vi khuẩn Salmonella
typhimurium và Escherichia coli có hoạt tính tổng hợp rất cao chuyển vào cây
làm tăng hoạt tính của enzim lên trên 20 lần và cây chiệu đợc nồng độ thuốc
diệt cỏ cao hơn 4 lần (Monica A.Huges, 1995)[19].
Đây là hớng nghiên cứu hiện đang đợc nghiên cứu rộng rãi. theo thống kê
từ năm 1986 đến 1993 tổng cộng đã có 214 thử nghiệm chuyển gen kháng
thuốc trừ cỏ cho 5 loại cây điển hính sau: 16 thử nghiệm với khoai tây, 94 thử
nghiêm với cây có hạt chứa dầu, 29 với thuốc lá, 54 với ngô, 21 với cà chua
(Monica A.Huges, 1995)[19].
Chuyn gen to mu sc cho hoa: hoa l mt sn phm rt cú giỏ tr kinh
t v xut khu. Hoa c dựng trang trớ nờn rt cn cú s phong phỳ
a dng v mu sc. Tuy nhiờn hng nghiờn cu ny khỏ phc tp v
hin nay cũn cha tỡm hiu ht. Mt vi vớ d: chuyn gen tng hp sc t
xanh Delphinidium Daniella vo hoa hng to ra hoa hng cú mu xanh
da tri; chuyn gen tng hp sc t antocyan ca ngụ cho rt nhiu loi
hoa to ra nhiu mu sc khỏc nhau.
Chuyn gen tng hp cỏc protein ng vt vo thc vt: to protein ng
vt phi thụng qua chn nuụi tn kộm hn so vi chm súc cõy trng nờn
ngi ta ó chuyn gen mó húa cho vic tng hp cỏc protein ng vt

24
vào thực vật để bắt cây trồng tổng hợp lên chúng. Hiện người ta đã
chuyển gen tổng hợp hai loại Protein là enkeplain (một loại protein thần
kinh) và albumin huyết thanh.
• Chuyển gen làm thay đổi phẩm chất nông sản: người ta tiến hành chuyển
các gen như: gen tạo mùi thơm, gen mã hóa cho việc tổng hợp β- caroten,
vào lúa để tạo ra các giống lúa giàu β- caroten, chuyển gen tổng hợp các
protein chứa nhiều axit amin có lưu huỳnh vào cỏ chăn nuôi cừu để tăng
lượng lông thu được. chuyển gen tổng hợp các protein có vị ngọt cao vào
cây ăn quả…
2.6 Phương pháp chuyển gen cho đối tượng thực vật.
2.6.1 Chuyển gen trực tiếp vào tế bào thực vật:
• Tế bào thực vật có một đặc điểm là có một lớp thành tế bào rất vững chắc
nên rất khó tác động trực tiếp, thường các phương pháp chuyển gen trực
tiếp trên (trừ phương pháp sử dụng súng bắn gen) đều được áp dụng phổ
biến với protoplats đây là thuật ngữ để chỉ tế bào thực vật đã được tách bỏ
lớp thành tế bào bên ngoài chỉ còn lại màng nguyên sinh và phần trong
của tế bào. Màng nguyên sinh cho phép protoplat có thể hấp thu vào tế
bào các đại phân tử theo cơ chế của amip, khi đứng cạnh nhau chúng có
thể hòa làm một gọi là dung hợp. Lợi dụng đặc tính này của protoplast
người ta tiến hành chuyển trực tiếp các đoạn DNA vào để tạo ra các cá thể
mới (Nguyễn văn Uyển, 1996)[8].
• 2.6.2 Chuyển gen vào tế bào thực vật qua trung gian là vi khuẩn
Agrobacterium tumefacients.
• Trong khi các phương pháp chuyển gen trên khá phức tạp, đòi hỏi các
thiết bị đắt tiền thì chuyển gen vào tế bào thực vật qua trung gian
Agrobacterium lại tỏ ra rất có hiệu quả mà không cần tới các thiết bị phức
tạp (Nguyễn văn Uyển, 1996)[8].
Agrobacterium là một loại vi khuẩn có dạng hình que, gram âm và thuộc họ vi
khuẩn Rhizobraeae. Chúng được phân loại theo đặc tính gây bệnh thực vật như

sau: A.tumefacients gây bệnh sần cây, A.rhizogenes gây bệnh rễ lông và
A.radiobacter không độc. Chúng có khả năng sâm nhập vào cây qua vết thương
và gắn một đoạn DNA của chúng vào bộ gen của tế bào thực vật, đây là những
gen mã hóa cho việc hình thành khối u và tổng hợp ra những chất dinh dưỡng
đặc biệt giúp cho vi khuẩn phát triển. Người ta đã tìm thấy những axit amin lạ
25