áp dụng phương pháp elisa phát hiện độc tố lt của các chủng escherichia coli phân lập trong thực phẩm

Bộ y tế
Viện dinh dỡng




Báo cáo đề tài



áp dụng phơng pháp Elisa phát hiện độc tố
LT của các chủng Escherichia coli phân lâp
trong thực phẩm








Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dinh Dỡng

Chủ nhiệm đề tài: BS. Phạm Thị Thanh Yến



5751
05/4/2006

Hà Nội - 2005


1
Bộ y tế
Viện dinh dỡng




Báo cáo đề tài



áp dụng phơng pháp Elisa phát hiện độc tố
LT của các chủng Escherichia coli phân lâp
trong thực phẩm




Chủ nhiệm đề tài: BS. Phạm Thị Thanh Yến

Cán bộ thực hiện: Phạm Thị Thanh Yến
Nguyễn Lan Phơng
Nguyễn ánh Tuyết

Hà Thị Anh Đào









Hà Nội - 2005


2

I. Đặt vấn đề:
Tiêu chảy là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở trẻ em
đặc biệt là ở các nớc vùng nhiệt đới, trong đó Escherichia coli (E.coli) là một
trong những nguyên nhân gây tiêu chảy cấp ở trẻ em . E.coli gây tiêu chảy
đợc chia làm 5 loại, bao gồm (1):
E.coli gây bệnh (Enteropathogenic E. coli, viết tắt là EPEC)
E.coli sinh độc tố ruột (Enterotoxigenic E. coli, viết tắt là ETEC)
E.coli xâm nhập (Enteroinvasive E.coli, viết tắt là EIEC)
E.coli gây chảy máu (Enterohemorrhage E.coli, viết tắt là EHEC)
E.coli bám dính (Enteroaggregative E.coli, viết tắt là EAggEC)
E.coli sinh độc tố ruột (ETEC) là chủng vi khuẩn sinh độc tố ruột trong
ruột non của ngời và súc vật gây ỉa chảy mất nớc giống tả. Có 2 loại độc tố
ruột: độc tố chịu nhiệt ST (Stable Toxin) bị phá hủy ở 100
0
C trong 15 phút và

độc tố không chịu nhiệt LT (Labile Toxin) dễ bị phá hủy ở 60
0
C trong 15
phút. Có chủng E.coli có cả 2 loại độc tố LT và ST, nhng cũng có chủng chỉ
có LT hoặc ST(2).
LT là phân tử lớn oligomer, có cấu trúc và chức năng giống độc tố tả (CT
cholera toxin), vì vậy cơ chếgây bệnh của ETEC tơng tự nh bệnh tả. LT gồm
2 nhóm chính : LT1 và LT2. Độc tố LT1 gây bệnh ở ngời và động vật. LT2
chỉ gây bệnh ở động vật, hiếm khi gây bệnh ở ngời.LT có tính kháng nguyên
(là kháng nguyên lông)
nên có vai trò quan trọng trong nghiên cứu văcxin phòng bệnh.ST có cấu trúc
phân tử nhỏ, không có tính kháng nguyên nên ít đợc nghiên cứu hơn. Độc tố
ST gồm 2 loại: Sta và STb.
E.coli sinh độc tố là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy ở trẻ em
các nớc đang phát triển. Một số nghiên cứu cho thấy khoảng 10 - 30% các

3
trờng hợp tiêu chảy ở trẻ em là do E.coli sinh độc tố. Các điều tra dịch tễ cho
thấy: thực phẩm và nớc ở vùng có dịch tiêu chảy tỷ lệ nhiễm ETEC rất cao,
hầu hết trẻ em nuôi bộ ( sau khi cai sữa ) ở những vùng này bị nhiễm ETEC
qua thức ăn. Điều kiện khí hậu nóng ẩm, đặc biệt vào mùa hè là một trong
những điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của ETEC trong thực phẩm và
nớc. Trong những năm gần đây để phát hiện độc tố của E.coli có nhiều kỹ
thuật đợc áp dụng nh: kỹ thuật ELISA, ngng kết (latex aglutination) và
phản ứng chuỗi men (PCR) (3, 4).
E.coli là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá mức độ ô nhiễm
của các loại thực phẩm. Theo số liệu nghiên cứu, khảo sát của Phòng thí
nghiệm Vi sinh - Viện Dinh dỡng cho thấy: tỷ lệ nhiễm E.coli chiếm khoảng
15 - 25% trong tổng số các mẫu thực phẩm có nguy cơ (5). Do vậy, việc xác
định E.coli trong các mẫu thực phẩm có khả năng sinh độc tố gây tiêu chảy

đóng vai trò quan trọng trong công tác giám sát VSATTP một cách có hiệu
quả. Trong nghiên cứu này chúng tôi áp dụng kỹ thuật ELISA để xác định độc
tố LT của các chủng E.coli phân lập đợc trong thực phẩm năm, 2004 do
phơng pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
II. Mục tiêu đề tài
Triển khai kỹ thuật ELISA phát hiện độc tố LT của các chủng E.coli
phân lập trong thực phẩm.
III. Đối tợng, thời gian và kỹ thuật áp dụng
1. Đối tợng:
- Mẫu thực phẩm: tổng số 80 mẫu, trong đó:
+ 60 mẫu lòng lợn cha qua chế biến
+ 10 mẫu lòng lợn đã qua chế biến
+ 10 mẫu tiết canh
- Địa điểm lấy mẫu: chợ Ngọc Hà (quận Ba Đình), chợ Cầu Giấy (quận
Cầu Giấy), chợ Thanh Xuân (quận Thanh Xuân).

4
- Cách lấy mẫu: các mẫu lòng lợn ( lòng già, non) và tiết canh đợc mua
vào buổi sáng từ 10 đến 11 giờ. Mỗi mẫu lấy tối thiểu là 250g, đựng vào túi
polyetylen vô trùng, rồi đa ngay về phòng thí nghiệm để kiểm tra trong
vòng không quá 3 giờ.
2. Thời gian tiến hành đề tài:
- Phân lập các chủng E.coli từ thực phẩm: 7 27 tháng 12 năm 2004
- Triển khai kỹ thuật ELISA : 3 27 tháng 5 năm 2005
3. Kỹ thuật áp dụng:
- Kỹ thuật xác định E.coli trong thực phẩm theo TCVN5159 1990 để
phân lập các chủng E.coli.
- Kỹ thuật ELISA xác định độc tố LT của các chủng E.coli (1).
IV. Nội dung và kết quả triển khai
A. Kết quả phân lập E.coli trong thực phẩm:

Tên chợ Thực phẩm Số mẫu kiểm tra Số mẫu nhiễm
Lòng non 1 1
Lòng già 1 1
Chợ Ngọc Hà
Tiết canh 4 2
Lòng non 2 1
Lòng già 3 3
Chợ Cầu Giấy
Tiết canh 2 1
Lòng non 3 3 Chợ Thanh Xuân
Lòng già 4 4
Cộng 20 16

Qua kiểm tra 20 mẫu lòng lợn sống, tiết canh tại 3 chợ: Ngọc Hà, Cầu
Giấy, Thanh Xuân chúng tôi đã thu thập đợc 16 chủng E.coli.


5


B. Tiển khai kỹ thuật ELISA
1. Nguyên lý

+
GM1 LT KT1 KT2 Enzym Cơ chất
ELISA ( Enzyme- Linked Immunosorbent assay ) là phản ứng miễn dịch giữa
kháng nguyên và kháng thể có gắn men.
- GM1 có vai trò thụ thể bám diính độc tố LT.
KT1 (kháng thể 1) : là huyết thanh thỏ kháng độc tố LT.
- KT2 (kháng thể 2) : Là huyết thanh dê ( Ig G dê kháng thỏ ) có gắn enzym

( thờng gọi là cộng hợp men ).
- Khi xảy ra sự kết hợp giữa LT và KT1, thì cơ chất giúp đo đợc hoạt động
của enzym, từ đó xác định đợc số lợng KT1 gắn vào LT, qua đó xác định
đợc LT.
2. Vật liệu, hoá chất, môi trờng
- Canh thang BRILA ( Merck )
- Thạch ENDO ( Merck )
- Thạch Citrat Simmons ( Merck )
- Pastone ( Sanofi )
- Môi trờng canh thang trypticase soy (Merck)
- GM1 (Monosialoganglioside - Sigma )
- Huyết thanh thỏ kháng độc tố LT ( Sigma )

6
- Cộng hợp men: Huyết thanh dê gắn với men phophatase kiềm (Goat
Antihuman IgG - Alkaline phosphatase conjugate - Sigma)
- Cơ chất : OPD (O-Phenylenediamine dihydrochloride tablet-Sigma)
- Phosphate Buffered Saline (PBS, pH 7,4)
- BSA (Bovine Serum Albumine - Sigma Fine Chemical)
- Khay nhựa 96 giếng đáy bằng (Nunc - 439454); pi pet và đầu típ
- Máy đọc ELISA (Biorad)
- Eppendorf
- ống Falcol
- Máy lắc Voltex
- Máy ly tâm
3. Chủng thử nghiệm
- Chứng dơng: ETEC EBa-35 (Nhật Bản)
- Chứng âm:
STEC O111-19 (Nhật Bản)
- Các chủng E.coli phân lập từ các mẫu thực phẩm

4. Chuẩn bị dịch nổi chủng E.coli đ phân lập đợc và các chủng chứng
dơng, chứng âm:
16 chủng E.coli đã phân lập và chủng ETEC EBa-35 (chứng dơng) và
chủng STEC O111-19 (chứng âm) đợc nuôi cấy trong canh thang Trypcase
soy (9ml canh thang/ống), ủ ấm 37
o
C/18 giờ. Sau đó cho vào ống ly tâm ( 4 ml
canh trùng/ống), rồi ly tâm 2000 vòng/phút trong 5 phút, lấy dịch nổi.
5. Chuẩn bị các dung dịch đệm:
+ Dung dịch mẹ
Na
2
HPO
4
5,48g
Na
2
H
2
PO
4
.H
2
O

1,575g
Nớc cất 100ml
pH = 7,2
+ R1-Đệm phủ đĩa

7
Dung dịch mẹ 20ml
NaCl 9g
Nớc cất 1000ml
pH = 7,2
+ R2-Đệm rửa

NaCl 8,5g
Tween 20

1ml
NaN
3
0,2g
Nớc cất 1000ml
+ R3-Đệm khoá
R1 10ml
BSA 0,1g
+ R4-Đệm pha kháng thể:
R1 10ml
BSA 0,1g
Tween 20 10àl
+ R5-Đệm pha cơ chất
Tris base 1,21g
MgCl
2
30àl
Nớc cất 8ml
Chỉnh pH = 9,8 bằng HCl sau đó thêm nớc cất cho đủ 10ml
+ Dung dịch dừng phản ứng (NaOH 3M)

NaOH 12g
Nớc cất 100ml
6. Pha các sinh phẩm
- Pha GM1 (nồng độ 5àg/ml): 20 àl GM1 + 3980 àl R1
- Pha huyết thanh thỏ kháng độc tố LT tỷ lệ 1/1000 (Kháng thể 1 - KT1)
4àl KT1 + 4000 àl R4

8
- Pha IgG dê kháng thỏ có gắn enzyme tỷ lệ 1/1000 ( Kháng thể 2 hay còn gọi
là cộng hợp men KT 2) 4àl KT2 + 4000 àl R4
- Pha Subtrate: 1 viên OPD + 20 ml R5
7. Tiến hành ELISA
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với mẫu chứng dơng, chứng âm và16
chủng E.coli phân lập đợc. Thí nghiệm bố trí theo sơ đồ sau:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
M1 M1 M9 M9
B
M2 M2 M10 M10
C
M3 M3 M11 M11
D
M4 M4
M12 M12

E
PC
M5 M5 M13 M13
F

PC M6 M6
M14 M14
G
NC M7 M7 M15 M15
H
NC M8 M8 M16 M16

Trong đó:
PC: đối chứng dơng (Positive control)
NC: đối chứng âm (Negative control)
* Các bớc tiến hành:
- Bớc 1: Gắn bản GM
1
: 100àl/giếng, rồi để qua đêm ở nhiệt độ phòng.
- Bứơc 2: Rửa bản 3 lần với R2: 200 àl/giếng trong 3 phút.
- Bớc 3: Cho R3: 100àl/giếng, ủ 1 giờ ở 37
o
C.
- Bớc 4: Rửa bản 3 lần với R2: 200 àl/giếng trong 3 phút.
- Bớc 5: Cho dịch nổi chủng chứng dơng, chủng chứng âm và E.coli cần
kiểm tra độc tố, mỗi mẫu 2 giếng : 100àl /giếng ủ 2 giờ ở 37
0
C.
- Bớc 6:Rửa bản 3 lần với R2: 200 àl/giếng trong 3 phút.
- Bớc 7: Cho kháng thể1: 100àl/giếng ủ 1 giờ ở 37
0
C.

9
- Bớc 8: Rửa bản 3 lần với R2: 200 àl/giếng trong 3 phút

- Bớc 9: Cho kháng thể 2: 100àl/giếng ủ 1 giờ ở 37
o
C.
- Bớc 10: Rửa bản 3 lần với PBS -Tween 20: 200 àl/giếng trong 3 phút.
- Bớc 11: Cho cơ chất: 100àl /giếng ủ 50 phút ở 37
o
C
- Bớc 12: Làm ngừng phản ứng bằng NaOH3M: 50àl/giếng, để ở nhiệt độ
phòng thí nghiệm cho tới khi chứng dơng có màu vàng rõ, (thời gian chờ
không quá 15 phút).
IV. Kết quả ELISA
Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở bớc sóng 405nm. Hiệu giá mẫu
thử nghiệm cao hơn chứng âm gấp 2 lần trở lên thì đợc coi là dơng tính.
Khi quan sát bằng mắt xác định phản ứng dơng tính nhờ sự xuất hiện
màu vàng trong giếng thí nghiệm, thể hiện sự tơng tác giữa độc tố trong dịch
nổi của vi khuẩn E.coli (LT) và kháng thể kháng độc tố của thỏ. Kết quả
ELISA cho thấy, màu vàng xuất hiện ở vị trí mẫu số 6 (F2, F3) và mẫu số 14
(F4, F5) tơng tự nh màu ở giếng đối chứng dơng (E1, F1), còn mẫu chứng
âm và các mẫu còn lại đều không có màu, chứng tỏ phản ứng không xảy ra,
hay nói cách khác là trong dịch nổi không có độc tố LT (xem hình 1).

Hình 1: Phản ứng màu ELISA

10
Đĩa ELISA sau khi đã dừng phản ứng đợc cho vào máy đọc ở bớc sóng
405 nm và có kết quả nh bảng sau (xem bảng 2:
Bảng 2: Kết qủa Elisa

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A

0.052 0.045 0.153 0.157
B
0.056 0.052 0.166 0.161
C
0.158 0.171 0.172 0.170
D
0.053 0.056 0.170 0.167
E
1.825
0.052 0.049 0.160 0.165
F
1.877 1.540 1.566 1.61 1.70

G
0.164 0.058 0.135 0.008 0.005
H
0.158 0.155 0.179 0.006 0.007

Nhìn vào bảng kết quả chúng tôi thấy giá trị OD trung bình của mẫu số
6 và số 14 lần lợt là 1.553 và 1.655 là tơng đối cao, gần bằng giá trị trung
bình của mẫu dơng chuẩn (1.851), cao hơn chứng âm gấp 9,6 lần (mẫu số 6)
và 10,3 lần (mẫu số 14), tức là giá trị OD của mẫu số 6 và số 14 cao hơn chứng
âm >2 lần đợc coi là dơng tính (có độc tố LT). Vậy trong tổng số 16 chủng
E.coli phân lập đợc từ các mẫu lòng lợn sống và tiết canh, thì chỉ có 2 chủng
có độc tố là mẫu số 6 và mẫu số 14.
Kết quả Elisa đợc thể hiện thông qua biểu đồ 1

11
Biểu đồ 1: Kết quả Elisa của các chủng E.coli
0

0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
P
C
M
1
M
3
M
5
M
7
M
9
M
1
1
M
1
3
M
1

5
Số thứ tự mẫu
Giá trị OD


V. Kết luận:
Qua kết quả triển khai đề tài, chúng tôi đã triển khai thành công kỹ
thuật ELISA phát hiện đọc tố LT của các chủng Escheria coli phân lập trong
thực phẩm.





12
Tài liệu tham khảo

1. Hoàng Thu Thuỷ. Phơng pháp kỹ thuật phát hiện độc tố ruột của
Escherichia coli. Kỹ thuật xétnghiệm Vi sinh vật Y học-Nhà xuất bản
văn hoá Hà nội 1991: tr: 91-94.
2. Những nghiệm pháp chuẩn đoán E. coli sinh độc tố ruột. Sổ tay xét
nghiệm về nhiễm khuẩn đờng ruột cấp tính.Tài liệu dịch từ CDD/83.3
của OMS: tr: 40-60.
3. Black,R.E.M.H. Brown, S. Becker, and M.H.Merson. Contamination of
weaning foods and transmission of Enterotoxigenic Eschirichia
diarrhoer in children in rural Bangladesh. 1982;
Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg. 76: 259-64.
4. Black,R.E,M.H. Merrson, B. Rowe, P. R, Taylor, and D .A Sack.
Enterotoxigenic Escherichia coli diarrhoer: acquired imnunity and
transmission in an endemic area. Bull. WHO1981; 59: 263-68.

5 Hà Thị Anh Đào, Phạm Thanh Yến, Nguyễn Lan Phơng. Thực trạng
ATTP thức ăn chế biến sẵn trên địa bàn Hà Nội năm 2002; Hội nghị
khoa học ATVSTP 2003 tr: 99-104.
6 Yolken RH, greenberg HB, Merson MH, Sack RB, Kapikian AZ.
Enzyme linked immunosorbent assay for detection of Escherichia coli
heat-labile enterotoxin. . J Clin Microbiol 1977; 6: 439-44.







13