Phát hiện nhân tố gây bệnh (gene fima) của vi khuẩn p gingivalis bằng phương pháp real time PCR

i

LỜI CẢM ƠN
Với tất cả lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô nghành
Công nghệ sinh học Trƣờng Đại Học Nha Trang đã giảng dạy và truyền đạt cho em
các kiến thức quý báu trong 4 năm qua.
Em xin gửi lời cảm ơn tới ban giám đốc Công Ty Cổ Phần Công Nghệ Việt
Á đã tạo điều kiện cho em thực hiện và hoàn thành khóa luận này.
Em xin cảm ơn cô Nguyễn Thị Hiệp, chị Hồ Thị Thanh Thủy đã tận tình
giúp đỡ, giảng dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành tốt khóa
luận này.
Em xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Duy Khánh, anh Nguyễn Văn Hƣng
đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Xin gởi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị trong Công Ty Cổ Phần Công
Nghệ Việt Á đã luôn giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Tôi xin cảm ơn các bạn lớp 48CNSH trƣờng Đại Học Nha Trang, đặc biệt là
nhóm bạn thân và các bạn cùng làm khoá luận tại Công Ty Cổ Phần Công Nghệ
Việt Á đã luôn giúp đỡ, chia sẽ những kiến thức quý báu trong suốt thời gian làm
khoá luận cũng nhƣ trong 4 năm vừa qua
Và trên cả, con xin cảm ơn Ba mẹ, anh chị đã luôn động viên, chia sẽ, ủng hộ
và tạo mọi điều kiện tốt nhất để con có thể hoàn thành tốt khóa luận này.



Sinh viên
Đoàn Thị Trang

ii

MỤC LỤC

Trang
Phần 1. ĐẶT VẤN ĐỀ i
PHẦN 2. TỔNG QUAN 2
1. GIỚI THIỆU BỆNH VIÊM NHA CHU 2
1.1 Bệnh viêm nha chu 2
Thành phần chính trong mảng bám gồm có: 2
1.2 Các triệu chứng của bệnh nhƣ sau 3
1.3 Tác nhân gây bệnh 4
1.4 Ảnh hƣởng của bệnh trên ngƣời 5
2. Tình hình bệnh viêm nha chu trên thế giới và tại Việt Nam 6
2.1 Trên thế giới 6
2.2 Tại Việt Nam 7
3. Vi khuẩn porphyromonas gingivalis 7
3.1 Vi khuẩn Porphyromonas gingivalis 7
3.2 Phân loại khoa học [9] 8
Giới: Eubacteria 8
3.3 Cấu trúc bộ gene 8
3.4. Giới thiệu Gene fimA 9
3.5. Giới thiệu gene 16s rRNA 9
4. Cơ chế gây bệnh viêm nha chu: 10
5. Các phƣơng pháp phát hiện bệnh viêm nha chu 12
5.1. Phƣơng pháp nuôi cấy 13
5.2 Phƣơng pháp lai DNA-DNA (checkboard DNA-DNA hybridisation) 13

5.3 Phƣơng pháp PCR và realtime PCR 13
6. Phƣơng pháp realtime PCR và ứng dụng 14
6.1 Định nghĩa 14
6.2 Nguyên tắc 14


iii

6.3 Các bƣớc cơ bản của một chu kỳ nhân gene 14
6.4. Các thành phần và ảnh hƣởng của chúng tới hiệu quả các phản ứng real time
PCR: 16
6.4.1. DNA mẫu (DNA template) 16
6.4.2 Primer và nhiệt độ lai 16
6.4.3 Enzyme 16
6.4.4. Các thành phần khác 16
a. Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphat) 16
b. Nồng độ MgCl
2
17
c. Dung dịch đệm 17
6.5 Ƣu điểm của Real-time PCR 17
6.6 Vấn đề hạn chế đối với Real-time PCR 17
PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 18
1. Vật liệu 18
1.1 Mẫu 18
1.2 Primer và probe 18
1.3 Hóa chất xử lý và tách chiết mẫu 19
1.4 Hóa chất phản ứng real time PCR 19
1.5 Thiết bị và dụng cụ 19
2. Phƣơng pháp 20

2.1 Phƣơng pháp thiết kế, đánh giá primer và probe 20
2.1.1 Tiêu chuẩn primer và probe 20
2.1.2 Phƣơng pháp thiết kế primer và probe 21
2.1.3 Phƣơng pháp đánh giá primer và probe 21
1.2. Phƣơng pháp đánh giá độ đặc hiệu của primer trên lý thuyết 21
2.3 Phƣơng pháp tách chiết DNA 22
2.4 Phƣơng pháp real time PCR 23
2.5 Phƣơng pháp khảo sát nhiệt độ lai của hệ primer-probe 24
2.6 Phƣơng pháp khảo sát độ đặc hiệu của hệ primer-probe 25


iv

2.7 Phƣơng pháp khảo sát độ nhạy của quy trình 25
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27
1. Kết quả thiết kế primer/probe 27
2. Kết quả khảo sát các đặc tính của mồi 32
3. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu và khả năng nhân bản chọn lọc của mồi trên lý
thuyết 34
4. Kết quả xây dựng quy trình realtime PCR 38
4.1. Kết quả khảo sát khả năng hoạt động của primer/probe. 38
4.2. Kết quả chạy multiplex realtime PCR với tỷ lệ mỗi primer/probe là 1:1:1:1:1 . 40
4.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ƣu 42
4.4. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của qui trình 44
4.5. Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình 46
4.6. Kết quả ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm 49
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 588
1. KẾT LUẬN 58
2. ĐỀ NGHỊ 58

v

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA: Deoxynucleotide acid
PCR: Polymerase chain reaction
FimAF: primer (F) gene fimA
FimAP: probe gene fimA
FimAR1: primer (R1) gene fimA
FimAR2: primer (R2) gene fimA
16SF: primer (F) gene 16S rRNA
16SP: probe gene 16S rRNA
16SR: primer (R) gene 16S rRNA
MTB: Mycobacterium tuberculosis
CMV: Cytomegalovirus
HPV: Human papiloma virus
HCV: Hepatitis C virus
HBV: Hepatitis B virus
IDT: Internetionar DNA Technologies
NST: Nhiễm sắc thể

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang


Bảng 1: Một số thành phần của mảng bám 2
Bảng 2:Hệ primer và probe gene fimA 18
Bảng 3: Hệ mồi và probe gene 16S rRNA 18
Bảng 4: Các thông số của bộ primer-probe của gen fimA 32
Bảng 5: Các thông số của bộ primer-probe của gen 16S rRNA 32
Bảng 6: Hệ số hetero dimer ΔG giữa hai bộ primer-probe của gene fimA và gene
16S rRNA. 34
Bảng 7: Kết quả chạy multiplex realtime PCR với tỷ lệ mỗi primer/probe là
1:1:1:1:1 42
Bảng 8: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của hệ primer và probe. 43
Bảng 9: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của quy trình. 46
Hình 30: Kết quả real time PCR khảo sát độ nhạy với primer và probe fimA. 47
Bảng 10: Kết quả real time PCR khảo sát độ nhạy của hệ primer và probe của
fimA. 47
Hình 31: Kết quả real time PCR khảo sát độ nhạy với primer và probe 16S rRNA.48
Bảng 11: Kết quả real time PCR khảo sát độ nhạy của hệ primer và probe của gene
16S rRNA. 48
Bảng 12: Kết quả khảo sát quy trình trên mẫu bệnh viêm nha chu dương tính. 49
Bảng13: Kết quả phát hiện gene fimA và 16S rRNA các mẫu bệnh phẩm viêm nha

chu của Porphyromonas gingivalis. 51





vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1: Bệnh viêm nha chu 4
Hình 2. Vi khuẩn Porphyromonas gingivalis 7
Hình 3: Diễn biến của bệnh 10
Hình 4: Nguyên tắc phản ứng PCR (nguồn Andy Vierstraete, 1999) 15
Hình 5: Sơ đồ bắt cặp của fimAF/ fimAR trên gene fimA. 24
Hình 6: Sơ đồ bắt cặp của 16SF/16SR trên gene 16S rRNA. 24
Hình 7: Kết quả sắp gióng trình tự gene fimA. 27
Hình 8: Vị trí của mồi fimAF trên gene fimA 28
Hình 9: Vị trí của probe fimAP trên gene fimA. 28
Hình 10: Vị trí của mồi fimAR1 trên gene fimA 29
Hình 11: Vị trí của mồi fimAR2 trên gene fimA. 29
Hình 12: Vị trí của mồi 16SF đối với gene 16S rRNA. 30
Hình 13: Vị trí của probe 16SP đối với gene 16S rRNA 31
Hình 14: Vị trí của primer 16SR đối với gene 16S rRNA. 31
Hình 15: Cấu trúc hetero-dimer của probe với 16SR của gene 16S rRNA có giá trị
∆G nhỏ nhất. 33
Hình 16: Cấu trúc hetero-dimer của fimAR1 với fimAR2 của gene fimA có giá trị ∆G
nhỏ nhất. 33

Hình 17: Cấu trúc hetero-dimer của 16SP và fimAR1 gene fimA có giá trị ∆G nhỏ
nhất. 34
Hình 18: Khả năng đặc hiệu của fimAF đối với gene fimA của loài P.gingivalis. 35
Hình 19: Khả năng đặc hiệu của fimAP đối với gene fimA của loài P.gingivalis. 35
Hình 20: Khả năng đặc hiệu của fimAR1 đối với gene fimA của loài P.gingivalis. 36
Hình 21: Khả năng đặc hiệu của fimAR2 đối với gene fimA của loài P.gingivalis. 36


viii

Hình 22: Kết quả sự bắt cặp của primer, probe của gene fimA sau khi chạy trên
Annhyb. 37
Hình 23: Sự bắt cặp của primer, probe gene 16S rRNA sau khi chạy trên Annhyb. . 38
Hình 24 : Kết quả khảo sát khả năng hoạt động của primer và probe fimA 39
Hình 25 : Kết quả thử khả năng bắt cặp của primer và probe của 16S rRNA 40
Hình 26 : Kết quả chạy multiplex realtime PCR với tỷ lệ mỗi primer/probe là
1:1:1:1:1 41
Hình 27: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của hệ primer và probe. 43
Hình 28: Kết quả chạy real time PCR với các mẫu HBV, HCV, HPV, MTB, CMV với
primer và probe đặc hiệu của chúng. 45
Hình 29: Các mẫu khảo sát HBV, HCV, MTB, CMV,HPV với primer và probe của
16S rRNA và fimA. 45
Hình 30: Kết quả real time PCR khảo sát độ nhạy với primer và probe fimA 47
Hình 31: Kết quả real time PCR khảo sát độ nhạy với primer và probe 16S rRNA. . 48
Hình 32: Kết quả real time PCR mẫu 1-6, với primer/probe của 16S rRNA. 53
Hình 33: Kết quả real time PCR mẫu 1-6, với primer/probe của fimA. 53
Hình 34: Kết quả real time PCR mẫu 7-12, với primer/probe của 16S rRNA 54
Hình 35: Kết quả real time PCR mẫu 7-12, với primer/probe của fimA 54
Hình 36: Kết quả real time PCR mẫu 13-18, với primer/probe của 16S rRNA. 55
Hình 37: Kết quả real time PCR mẫu 13-18, với primer/probe của fimA. 55

Hình 38: Kết quả real time PCR mẫu 19-24, với primer/probe của 16S rRNA. 56
Hình 39: Kết quả real time PCR mẫu 19-24, với primer/probe của fimA. 56
Hình 40: Kết quả real time PCR mẫu 25-30, với primer/probe của 16S rRNA. 57
Hình 41: Kết quả real time PCR mẫu 25-30, với primer/probe của fimA. 57






1

Phần 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh viêm nha chu là bệnh răng miệng, nó ảnh hƣởng rất lớn tới dân số thế
giới (hơn 90%). Bệnh này gây ra bởi sự tƣơng tác của các vi sinh vật gây hại tồn tại
trong miệng, chúng xâm nhập và gây bệnh qua sự tổn thƣơng vùng miệng và sự
phòng vệ của cơ thể không thể ngăn chặn đƣợc. Các vi khuẩn này gây hủy hoại răng
và làm tổn thƣơng nƣớu gây đau đớn, ảnh hƣởng rất lớn đến cuộc sống hàng ngày.
Ngoài ra, bệnh còn gây các bệnh lý khác nhƣ: Bệnh tim mạch và chứng xơ vữa
mạch máu, sinh non, bệnh đƣờng hô hấp, đái tháo đƣờng, nhiễm khuẩn huyết, viêm
nội tâm mạc nhiễm trùng.
Có nhiều tác nhân gây bệnh viêm nha chu. Trong đó, một số tác nhân gây
bệnh thƣờng gặp là Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetem-
comitans, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, T. socranskii, and
Prevotella intermedia. Những vi khuẩn này cùng với P. Gingivalis thƣờng hiện diện
ở cùng vị trí, trong các túi nha chu.
Vi khuẩn P. gingivalis có nhiều nhân tố gây bệnh nhƣ là fimbriae, collage-
nase, hemagglutinins, haemolysin, LPS, proteases, kháng nguyên vỏ. Trong đó theo
nghiên cứu thì gene fimA đƣợc xem là tác nhân gây độc quan trọng nhất liên quan đến
sự hủy hoại nƣớu trong bệnh răng miệng và là tác nhân chủ yếu gây bệnh viêm nha

chu của vi khuẩn P. gingivalis do các hoạt động sinh lý và miễn dịch của chúng. Việc
phát hiện bệnh có vai trò quan trọng trong việc theo dõi sự phát triển viêm nha chu ở
ngƣời trƣởng thành cũng nhƣ ƣớc định mức độ rủi ro và hỗ trợ điều trị bệnh này.
Gần đây, trên thế giới có nhiều báo cáo về việc sử dụng phƣơng pháp khác
nhau trong phát hiện P.gingivalis, trong đó có phƣơng pháp real-time PCR để phát
hiện P. gingivalis đã cho kết quả chính xác cao nhƣng tại Việt Nam thì chƣa đƣợc
nghiên cứu cụ thể.Vì vậy mà chúng tôi thực hiện đề tài “Phát hiện nhân tố gây bệnh
(gene fimA) của vi khuẩn P.gingivalis bằng phƣơng pháp real time PCR” nhằm
kiểm tra vi khuẩn này bằng phƣơng pháp mới và ứng dụng trong thực tế.


2

PHẦN 2. TỔNG QUAN
1. GIỚI THIỆU BỆNH VIÊM NHA CHU
1.1 Bệnh viêm nha chu
Bệnh viêm nha chu là bệnh viêm nƣớu gây chảy máu và để lộ ra nền răng.
Nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn có trong miệng cùng với lớp nhờn và các hạt
khác liên tục tạo thành một nếp không màu (mảng bám) trên răng, khi nƣớu bị tổn
thƣơng, các vi khuẩn này xâm nhiễm vào vùng chân răng và phá hủy răng, sau đó
chúng chuyển qua tồn tại trong các túi nha chu xung quanh răng, tăng cƣờng tiết
enzyme làm đứt dây chằng của nƣớu và làm mục xƣơng răng và cuối cùng là gây
gãy răng.
Lúc đầu, trên răng sẽ hình thành một màng (mảng bám) trong suốt bám vào.
Thành phần chính trong mảng bám gồm có:
Vi khuẩn: chiếm khoảng 90 - 95% trọng lƣợng ƣớt của mảng bám (1g
mảng bám răng (ẩm) có 2x10
11
vi khuẩn). Có khoảng 500 loại vi khuẩn đƣợc tìm
thấy ở đây, hiện tại ngƣời ta không thể nuôi cấy hay xác định tất cả chúng.

Còn lại 5 - 10% là một số tế bào của vật chủ (tế bào biểu mô, đại thực
bào, leukocytes), khuôn hữu cơ và ion vô cơ (gồm chất vô cơ và chất hữu cơ, có
nguồn gốc từ nƣớc bọt, dịch nƣớu, thức ăn, sản phẩm của vi khuẩn).

Bảng 1: Một số thành phần của mảng bám
Thành phần hữu cơ
- Glucid :Có nguồn gốc từ vi khuẩn và là chất keo để vi khuẩn bám vào. Chủ yếu
Glucid
30 - 40%
Lipid
6 – 7%
Protein
25 - 30%
Nƣớc và các ion khác
Còn lại


3

là levan và dextran (là những polymer của glucose và fructose ).
Những polysaccharid khác: glycogen, amylopectin.
Những đƣờng khác: galactose, fructose, ribose.
- Lipid: Có nguồn gốc từ vi khuẩn, dịch nƣớu và nƣớc bọt, mảnh vụn của tế bào vi
khuẩn, tế bào ký chủ và mảnh vụn thức ăn dƣới dạng glycerid, sterid, cholesterol tự
do và glycolipid, photpholipid kết hợp với protein tạo thành lipoprotein.
- Protein: Có nguồn gốc từ nƣớc bọt, thức ăn, dịch nƣớu răng và vi khuẩn. Gồm
glycoprotein và glycosaminoglycan và albumin. Các protein này có vai trò quan
trọng trong giai đoạn sớm của quá trình thành lập mảng bám răng.
Thành phần vô cơ khác: Ca2+, PO3- dƣới dạng ion hay tinh thể có nguồn gốc
từ nƣớc bọt hay men răng. Nguyên tố vi lƣợng: Mg, Ag, Co, Fe, Cu, Pb, Sn góp

phần vào chuyển hoá của vi khuẩn. Fluor: đa số có nguồn gốc từ bên ngoài nhƣ Fluor
trong kem đánh răng, nƣớc súc miệng nƣớc uống. Thành phần vô cơ mảng bám dƣới
nƣớu có nguồn gốc từ dịch nƣớu răng (là chất tiết của huyết thanh) và nƣớc.
Nếu không đánh răng đều để loại trừ màng này, nó sẽ tích tụ, dần dần bị
khoáng hóa trở thành vôi răng và chính bề mặt khô nhám của vôi răng là nơi lý tƣởng
cho sự tích tụ vi khuẩn và nếu không đƣợc loại bỏ, vi khuẩn sẽ tích tụ với lƣợng ngày
càng tăng. Các độc tố do vi khuẩn tạo ra xâm nhập mô nƣớu, gây viêm. Chúng cũng
phá hủy các mô nâng đỡ răng khiến nƣớu dần tách ra khỏi mặt răng. [ 5]
Khi đánh răng và dùng chỉ nha khoa sẽ loại bỏ mảng bám trên răng nhƣng
không thể loại bỏ thể cứng và các vi khuẩn chứa trong cao răng. Vì vậy khả năng
gây bệnh viêm nha chu vẫn tăng.
1.2 Các triệu chứng của bệnh nhƣ sau
- Chảy máu khi đánh răng
- Nƣớu sƣng đỏ khi đánh răng và lớn hơn so với bình thƣờng
- Hơi thở hôi dai dẳng


4

- Có ổ mủ hoặc có mủ chảy ra giữa răng và nƣớu
- Răng lung lay khi nhai
- Cảm giác hơi khó chịu.
Biểu hiện đầu tiên là viêm nƣớu kéo dài, nếu không điều trị sẽ gây bệnh
viêm nha chu. Ngoài ra, bệnh viêm nha chu còn có những biểu hiện ban đầu khác
nhau nhƣng biểu hiện chung thƣờng qua các dấu hiệu nhƣ mất bám dính, thành lập
túi nha chu, sƣng đau, chảy mủ, tiêu xƣơng ổ răng, răng lệch lạc, lung lay và cuối
cùng là mất răng. Thông thƣờng ở giai đoạn này ngƣời ta nghĩ đây là hiện tƣợng lão
hóa gây rụng răng nên không đi chữa trị, chính vì vậy, bệnh này cũng là một trong
những nguyên nhân gậy rụng răng sớm của ngƣời lớn tuổi. Hơn nữa, sau khi đã có
những biểu hiện nêu trên thì việc điều trị trở nên khó khăn hơn do khả năng hồi

phục của mô nha chu và xƣơng nâng đỡ quanh răng kém. [6]

Hình 1: Bệnh viêm nha chu
1.3 Tác nhân gây bệnh
Theo các nghiên cứu, nguyên nhân chủ yếu của bệnh viêm nha chu là do các
vi khuẩn tồn tại trong miệng, trong đó, có 2 loại vi khuẩn chủ yếu và đƣợc tìm hiểu
nhiều nhất là Actinobacillus actinomycetemcomitans và Porphyromonas gingivalis.
Hai vi khuẩn này đều gây bệnh viêm nha chu và đều tìm đƣợc trong các túi nha chu


5

trong nƣớu. Trong đó mức độ nguy hiểm của P. gingivalis gấp hai lần A.
actinomycetemcomitans và là vi khuẩn chính gây bệnh viêm nha chu trên ngƣời. Nó
đƣợc tìm thấy ở các bệnh nhân viêm nha chu ở những mức độ khác nhau. Vi khuẩn
này có khả năng sản xuất enzyme nhƣ fimbrilin, collagenase, arginine-specific
cysteine proteinase v.v…có thể phá hủy hệ thống miễn dịch và dẫn đến sự phá hủy
mô liên kết của nƣớu [ 7].
Ngoài ra còn có các vi khuẩn khác là Bacteroides forsythus, Treponema
denticola, T. socranskii, và P. intermedia [7 ].

1.4 Ảnh hƣởng của bệnh trên ngƣời
Theo nghiên cứu của hội y học quốc tế, bệnh viêm nha chu có thể gây các
bệnh lý khác trên ngƣời nhƣ:
- Bệnh tim mạch và chứng xơ vữa mạch máu
Các nghiên cứu cho thấy viêm nha chu là nhân tố nguy hiểm cho bệnh tim mạch
nhƣ nhồi máu cơ tim và đột quỵ (Mattila et al., 1989; 1993; 1995; Beck, 1991;
DeStefano et al., 1993; Beck et al., 1996). Bệnh này có mức độ nguy hiểm ảnh
hƣởng tới bệnh tim mạch tƣơng đƣơng hút thuốc, tuổi tác và tiểu đƣờng.
- Sinh non

Nhiều nghiên cứu chỉ ra bệnh viêm nha chu có thể làm tăng nguy cơ trẻ em có
trọng lƣợng thấp sau khi sinh ở những ngƣời mẹ bị bệnh (Collins et al., 1994). Điều
này có thể do ảnh hƣởng của các chất trung gian sinh học trong phản ứng viêm nhƣ
prostaglandins E2 và TNF-α (Offenbacher et al 1996).
- Bệnh đƣờng hô hấp
Hiện nay, sự kết hợp giữa vi khuẩn gây bệnh viêm nƣớu và vi khuẩn gây
bệnh đƣờng hô hấp có thể gây các bệnh nhƣ viêm phế quản kinh niên, tắc nghẽn hô
hấp kinh niên. Tuy nhiên vấn đề này vẫn còn là giả thuyết và đang đƣợc nghiên cứu.
- Viêm nội tâm mạc nhiễm trùng


6

Khi vi khuẩn vào trong dòng máu và bám đƣợc vào nội mạc các van tim bị
tổn thƣơng sẽ hình thành nên những mảnh sùi. Bản chất các mảnh sùi này là do vi
khuẩn đƣợc bao bọc bởi một mạng lƣới fibrin và các tế bào máu và gây bệnh.
- Đái tháo đƣờng
- Nhiễm khuẩn huyết
Nguyên nhân dẫn đến các bệnh này do vi khuẩn gây bệnh kết hợp với các vi
khuẩn tạm thời ở miệng có thể vào máu sau các hoạt động chuyên biệt liên quan đến
răng nhƣ nhai, chải răng hoặc làm sạch kẽ răng (các hoạt động này có thể gây tổn
thƣơng mô răng) và gây bệnh. [ 4]
Ngoài ra tính độc của các vi khuẩn gây viêm nha chu có thể biến đổi các
chức năng của tế bào chủ, bao gồm sự biểu hiện của nhiều nhân tố gây viêm kinh
niên và cản trở sự điều hòa của phản ứng viêm tại chỗ.
2. Tình hình bệnh viêm nha chu trên thế giới và tại Việt Nam
2.1 Trên thế giới
Vấn đề răng miệng đã và đang đƣợc quan tâm trên toàn thế giới và nó là một
vấn đề khó khăn đối với y tế răng miệng do ảnh hƣởng của phong tục tập quán khác
nhau bên cạnh đó nó còn ảnh hƣởng do mức sống của ngƣời dân (ngƣời dân có mức

sống trung bình và dƣới trung bình).[3]
Trên thế giới có khoảng 90% dân số bị ảnh hƣởng bởi bệnh viêm nha chu
không phụ thuộc vào vị trí địa lý, dân tộc, chủng tộc cũng nhƣ các nhóm tuổi khác
nhau. Riêng tại Mỹ, bệnh nha chu ảnh hƣởng tới 75% số dân với khoảng 20-30% bị
ảnh hƣởng nghiêm trọng [9]. Khoảng 15% học sinh ở một vài nƣớc châu Mỹ La
Tinh bị hƣ răng và bệnh này lan rộng 5-12% trẻ em từ 6-12 tuổi ở Trung Đông. Tuy
nhiên, các nghiên cứu gần đây từ các nƣớc công nghiệp phát triển cho thấy sự phát
triển của bệnh viêm nha chu gia tăng ảnh hƣởng 16-40% trẻ em 6 tuổi và 4-33% trẻ
em 12-14 tuổi.


7

2.2 Tại Việt Nam
Tại Việt Nam thực tế vấn đề răng miệng chƣa đƣợc chú trọng một cách hợp
lý, vì vậy tỷ lệ mắc bệnh răng miệng của ngƣời dân chiếm tỷ lệ rất cao. Nguyên
nhân chủ yếu do ý thức của ngƣời dân về vấn đề vệ sinh răng miệng chƣa cao, bên
cạnh đó thì một số nơi dân tộc của nƣớc ta có những phong tục gây ảnh hƣởng xấu
tới răng miệng nhƣ nhuộm răng, hút thuốc…
Bệnh viêm nha chu là một trong những bệnh chiếm tỷ lệ khá lớn trong các
bệnh răng của ngƣời Việt Nam. Theo khảo sát thì tại Việt Nam tỷ lệ ngƣời mắc
bệnh viêm nƣớu chiếm tới trên 95% và bệnh viêm nha chu chiếm tỷ lệ gần 32%.
Theo điều tra của hội răng hàm mặt Việt Nam thì cứ 10 trẻ em lại có 8 trẻ bị sâu
răng chỉ 24% học sinh hiểu biết rõ về sâu răng nhƣng 59,6% học sinh có nhận thức
đúng về chăm sóc răng miệng.[9]

3. Vi khuẩn porphyromonas gingivalis

Hình 2. Vi khuẩn Porphyromonas gingivalis
3.1 Vi khuẩn Porphyromonas gingivalis

Vi khuẩn Porphyromonas gingivalis đƣợc tìm thấy trong miệng, phía trên
đƣờng hô hấp, tiêu hóa và trong ruột già. Các vi khuẩn này là vi khuẩn gram âm, kỵ
khí, hình que, màu đen, không có khả năng di động, xung quanh tế bào P. gingivalis


8

đƣợc bao bọc bởi lớp polysaccharide gọi là vỏ capsules và lớp nhày dày đặc không
cố định giúp nó bám dính vào tế bào chủ. Vỏ capsule này làm cho bề mặt tế bào của
nó có tính kỵ nƣớc giúp bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại hệ thống miễn dịch của tế
bào chủ và góp phần làm cho vi khuẩn bám vào tế bào biểu mô dễ dàng hơn. Lớp
vỏ capsule và lớp nhày mặc dù không cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn
nhƣng rất quan trọng cho việc tồn tại và xâm nhiễm của nó trong tế bào chủ.[12] Vi
khuẩn tấn công nƣớu khi nƣớu bị tổn thƣơng, sau khi đã xâm nhiễm tế bào chủ, nhờ
lớp vỏ capsule bám dính và tránh đƣợc hệ thống miễn dịch, chúng tồn tại trong đó
và tiết ra các enzyme phá hủy mô nƣớu và mô chân răng làm tổn thƣơng răng, đầu
tiên là gây bong tróc nƣớu khỏi răng sau đó phá hủy lớp collagene và xƣơng quanh
răng, làm răng lung lay và gây rụng răng. P.gingivalis đi theo thành phần nƣớc bọt
đi vào tế bào chủ và tạo điều kiện cho fimbriae gây bệnh vì fimbriae đƣợc bố chí
trên bề mặt tế bào.
3.2 Phân loại khoa học [9]
Giới: Eubacteria
Ngành: Bacteroidetes
Lớp: Bacterioides
Giống: Porphyromonas
Loài: gingivalis
3.3 Cấu trúc bộ gene
Bộ gen của P. gingivalis dạng vòng gồm 2015 gen với tổng số 2343479
nucleotide, nhân lên ở vị trí oriC. Trong đó số lƣợng guanine và cytosine xấp xỉ
49% [12]. Một số nghiên cứu lâm sàng gần đây chỉ ra rằng, các nucleotide đột biến

trong gene liên quan tới tính độc hại của chủng đó. Một số điều tra ở các bệnh nhân
viêm nha chu mãn tính cho thấy gene đột biến fimA type II là phổ biến nhất và có
khả năng sản xuất độc tố hơn các gene khác sau đó là kiểu gene fimA tip V đang
đƣợc quan tâm trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh viêm nha chu. Hiện nay ngƣời


9

ta đã và đang điều tra sự đa dạng gene fimA của P.gingivalis và các trình tự khác
trong bệnh viêm nha chu của ngƣời. Ngoài độc tố fimbriae trên vi khuẩn này còn
sản xuất ra một số enzyme độc tố khác nhƣ: lipopolysacharide, collagenase,
cysteine proteinase. [9]
3.4. Giới thiệu Gene fimA
Porphyromonas gingivalis có nhiều tác nhân gây độc: fimbriae, collagenase,
hemagglutinins, haemolysin, LPS, proteases, kháng nguyên vỏ. Tất cả các tác nhân
này đều quan trọng trong hấp thu dinh dƣỡng và phát triển của P. gingivalis. Tính
độc của nó cũng là sự phối hợp của các tác nhân này.
Qua các nghiên cứu cho thấy gen fimA của P. gingivalis mã hóa fimbiae là
cấu trúc lông rung dạng sợi trên bề mặt vi khuẩn. Chúng đƣợc xem là tác nhân gây
độc quan trọng nhất liên quan đến sự hủy hoại nƣớu trong bệnh răng miệng, cũng là
nguyên nhân chủ yếu gây bệnh viêm nha chu của vi khuẩn P. gingivalis do các hoạt
động sinh lý và miễn dịch của chúng. Fimbriae (fimA) đƣợc xây dựng từ tiểu đơn
vị monomer fimbrillin và có khối lƣợng phân tử vào khoảng 43kD, đặc trƣng cho
tính chất keo dính của tế bào và sự tƣơng tác với phân tử nƣớc bọt, các tế bào biểu
mô miệng và vi khuẩn vùng miệng. Vì vậy nó có thể tạo nên một lớp mảng bám
xung quanh răng, khởi đầu sự tiết cytokines của các tế bào bị xâm nhiễm và là một
gene độc quan trọng của vi khuẩn P.gingivalis.[10] Gene fimA chia làm 6 type:(
genetype I, Ib, II, III, IV, và V) với kiểu type II và IV đƣợc cô lập chủ yếu ở bệnh
nhân viêm nha chu, các type này đƣợc mô tả dựa trên sự khác biệt các trình tự
nucleotide.(13,9)

3.5. Giới thiệu gene 16s rRNA
Ở vi khuẩn, ribosome đƣợc cấu tạo từ hai tiểu đơn vị ribonucleoprotein với
hệ số lắng (Svedberg) lần lƣợt là 50S và 30S. Tiểu đơn vị lớn chứa hai loại rRNA là
23S rRNA và 5S rRNA trong đó tiểu đơn vị nhỏ chỉ gồm một loại 16S rRNA.
Gene 16S rRNA có kích thƣớc khoảng 1540 bp, mã hóa cho phân tử 16S
rRNA, một thành phần quan trọng cấu thành nên tiểu đơn vị nhỏ của ribosome.


10

Ở tất cả các loài vi khuẩn thực (eubacteria) gene 16S rRNA có một đặc điểm
rất đặc biệt đó là chúng mang những vùng bảo tồn cao ở cấp độ nhóm xen kẽ với
những vùng biến động nhƣng lại bảo tồn ở cấp độ loài. Sự bảo tồn và biến động ở
cấp độ khác nhau đã làm cho gene này trở thành “một thƣớc đo tiến hóa”, là sự lựa
chọn hàng đầu của các nhà khoa học trong việc định danh và phân loại các vi
khuẩn. Không chỉ đƣợc ứng dụng trong lĩnh vực phân loại học, tiến hóa học, hiện
nay gene 16S rRNA còn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y học (chuẩn đoán
bệnh).
Vì vậy trong bài chúng tôi sử dụng gene 16s r RNA để xác định vi khuẩn
P.gingivalis có trong mẫu lấy đƣợc.
4. Cơ chế gây bệnh viêm nha chu:

Hình 3: Diễn biến của bệnh
Trong miệng chúng ta luôn tồn tại rất nhiều loại vi khuẩn và trong số đó có
một số vi khuẩn gây bệnh. Trong quá trình vệ sinh răng miệng, chúng ta có thể làm
tổn thƣơng nƣớu, tại đó vi khuẩn bắt đầu xâm nhập và gây bệnh với triệu chứng ban
đầu là viêm nƣớu, nếu chúng ta không điều trị sẽ gây viêm nha chu.
Các vi khuẩn trong miệng có khả năng tạo lớp nhớt dày có thành phần là

polysaccharide, tạo thành lớp màng bao phủ xung quanh răng. Tính chất điện hóa


11

của lớp màng này là nguyên nhân giúp nó bám vào răng một cách chắc chắn, đồng
thời giúp duy trì môi trƣờng hoàn hảo cho vi khuẩn nhân lên cho đến khi chúng đạt
gần 100% khối lƣợng của mảng bám. Ở đây chức năng của fimbriae rất quan trọng,
chúng chính là nhân tố bám dính giúp tế bào P.gingivalis bám vào mô xung quanh
răng và bắt đầu tiết enzyme làm tổn thƣơng các dòng tế bào khác nhau nhƣ các tế
bào biểu mô, tế bào thuộc màng trong và nguyên sợi bào. Ngoài ra nó còn là nhân tố
chính trong quá trình tƣơng tác của vi khuẩn tại chỗ và vi khuẩn xâm nhiễm gây
bệnh. Các vi khuẩn này khi kết hợp với nhau có thể vƣợt qua hệ thống hàng rào bảo
vệ và ảnh hƣởng trực tiếp lên các tế bào chủ nhạy cảm bằng cách tiết các enzyme
(proteases, collagenase, fibrinolysin, phospholipase A) có thể làm thoái hóa các lớp
mô xung quanh của nƣớu gây nên tình trạng phá hủy mô.
Khi có vi khuẩn xâm nhập, hệ thống miễn dịch của tế bào chủ đƣợc
hoạt hóa, kích thích sản xuất cytokine và chất trung gian của phản ứng viêm nhƣ
prostaglandins E2 (PGE2), chúng lần lƣợt giải phóng enzyme phá hủy chất nền
ngoại bào và xƣơng (Offenbacher, 1996). Ngoài ra trong quá trình thực bào, chính
polymorphonuclear neutrophils (PMNs) có thể giải phóng vài enzyme gây nên sự
hƣ hại collagen và đóng góp vào tiêu hủy mô.
Vài cytokine chính và chất trung gian phản ứng viêm đƣợc tìm thấy nhƣ sau:
Interleukin (IL-1): một tiền chất của phản ứng viêm, cytokine đa chức
năng kích thích tái hấp thu xƣơng và sản xuất PGE2, matrix metallo-proteinases
(MMP) gây thoái hóa chất nền ngoại bào.
Nhân tố gây hoại tử khối u alpha (TNF-α): là một chất trung gian
tƣơng tự trong nhiều hoạt động sinh học nhƣ IL-1. Nó đƣợc sản xuất bởi bạch cầu
và nguyên sợi bào đƣợc kích thích bởi lypopolysaccharide.
Prostaglandin E2 (PGE2) đƣợc giải phóng bởi bạch cầu, có vai trò

trong sự tái hấp thu xƣơng và sản xuất metalloproteinases (Offenbacher, Heasman
& Collins, 1993).


12

Ngoài ra, các vi khuẩn P.gingivalis tạo mảng xung quanh răng sau đó sử
dụng sản phẩm trao đổi chất của cơ thể, tiếp tục trao đổi chất và tạo ra sản phẩm dƣ
thừa vào màng nƣớu. Những sản phẩm dƣ thừa này là endotoxin, nguyên nhân làm
cho nƣớu đỏ và sƣng. Cơ thể tạo ra rất nhiều mạch máu nhỏ mới trong vùng tế bào
bị tấn công và xâm nhiễm bởi các vi khuẩn và những mạch máu nhỏ này lại bị tấn
công bởi vi khuẩn trở nên mỏng manh và dễ chảy máu.
Tình trạng khởi phát của viêm nha chu gọi là viêm nƣớu, gây đau đớn và dễ
chảy máu nhƣng ngƣời ta không chú ý tới hiện tƣợng này nên thƣờng để tiếp diễn
cho đến giai đoạn thứ hai là mất xƣơng. Sự mất xƣơng là tiến trình thích nghi để
bảo vệ cơ thể khỏi sự xâm nhiễm của vi khuẩn vào xƣơng gọi là viêm tủy sống. Khi
vi khuẩn xâm nhập, nếu cơ thể xảy ra hiện tƣợng viêm tủy sống để bảo vệ cơ thể tốt
thì vi khuẩn sẽ chết. Tuy nhiên, ở ngƣời già, hiện tƣợng viêm tủy sống để bảo vệ
không tốt chính vì vậy tỷ lệ bệnh viêm nha chu ở ngƣời cao tuổi thƣờng cao hơn
ngƣời trẻ (nƣớu xung quanh răng dƣờng nhƣ bị kéo xuống và để lộ chân răng, vì
vậy răng trông dài hơn so với lúc trẻ biểu hiện của bệnh viêm nha chu). Ngày nay
chúng ta biết rằng có thể ngăn chặn bệnh này bằng việc đánh răng thƣờng xuyên.
5. Các phƣơng pháp phát hiện bệnh viêm nha chu
Trong nghiên cứu bệnh viêm nha chu, ngƣời ta đã sử dụng một số phƣơng
pháp nhƣ: nuôi cấy vi sinh vật, lai phân tử (DNA- DNA) và phƣơng pháp sinh học
phân tử. Trong đó, kỹ thuật chuẩn đoán PCR đã trở thành một công cụ nhanh
chóng, nhạy, đặc trƣng, chính xác và đã trở thành một công cụ phổ biến hiện nay.
Tuy nhiên, các phƣơng pháp trên có những nhƣợc điểm nhƣ việc chuẩn đoán mất
nhiều thời gian, kết quả không chính xác. Ngoài ra, sử dụng phƣơng pháp PCR khó
khăn trong quá trình đọc kết quả.[14]

Gần đây, phƣơng pháp Realtime-PCR sử dụng Taqman probe đƣợc phát triển
để phân tích định lƣợng DNA. So với các phƣơng pháp khác để định lƣợng tác nhân
gây bệnh răng miệng, bao gồm cả lai phân tử, TaqMan realtime-PCR có lợi thế vì
nó có độ nhạy cao, nhanh chóng và chính xác. Mặt khác, primer và mẫu dò có sự


13

chuyên biệt cao với các trình tự nucleotide mục tiêu nên có thể phân biệt với các tác
nhân gây bệnh khác trong miệng, cho kết quả chính xác mà tổng số vi sinh vật mục
tiêu trong mẫu vẫn đƣợc tính toán. Vì vậy, phƣơng pháp này rất cần thiết để giám
sát hiệu quả điều trị và chuẩn đoán các bệnh, ở đây ta ứng dụng trong xác định vi
khuẩn P.gingivalis. [14]
5.1. Phƣơng pháp nuôi cấy
Nuôi cấy kỵ khí là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến nhất để phát hiện và
định lƣợng thành phần của mảng nƣớu, và để xác định tính nhạy cảm của vi khuẩn
đối với thuốc kháng sinh trong invitro. Tuy nhiên, phƣơng pháp này có nhiều trở
ngại là tốn thời gian, công sức và độ nhạy thấp. Điều này là do vi khuẩn gây bệnh
trong răng miệng phát triển chậm hoặc đòi hỏi môi trƣờng phát triển chuyên biệt.
(theo Khalil Boutaga và ctv, 2003)
5.2 Phƣơng pháp lai DNA-DNA (checkboard DNA-DNA hybridisation)
Phƣơng pháp lai DNA-DNA là phƣơng pháp lai số lƣợng lớn DNA mẫu với
số lƣợng lớn mẫu dò DNA trên màng lai. Nó cho phép phát hiện đồng thời sự hiện
diện của vô số các loài vi khuẩn trong một hoặc nhiều mẫu và đặc biệt ứng dụng
trong nghiên cứu dịch tễ học. Nhƣng trong việc phát hiện các vi khuẩn nhƣ
Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, P. endodontalis
,Bacteroides forsythus,

Peptostreptococcus micros và Treponema denticola thì
phƣơng pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu thấp, khả năng phát hiện gene fimA

thấp. ( theo Jose F. Siqueira và ctv, 2002).
5.3 Phƣơng pháp PCR và realtime PCR
Ngày nay các phƣơng pháp sinh học phân tử đặc biệt là kỹ thuật PCR, real-
time PCR đƣợc ứng dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh vì có các ƣu điểm nhƣ cho
kết quả nhanh chóng, nhạy, độ đặc hiệu cao, sử dụng lƣợng mẫu ít, kết quả chẩn
đoán không bị ảnh hƣởng bởi chất kháng sinh.


14

6. Phƣơng pháp realtime PCR và ứng dụng
6.1 Định nghĩa
Real time PCR là PCR tại thời điểm thực, nghĩa là quá trình khuếch đại DNA
đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt đƣợc theo dõi trực tiếp và diễn ra theo 2 bƣớc
đồng thời:
- Khuếch đại DNA bằng PCR
- Đo độ phát quang tỷ lệ thuận với số lƣợng bản sao DNA tạo thành.[2]
6.2 Nguyên tắc
Nguyên tắc của realtime PCR tƣơng tự PCR truyền thống. Tuy nhiên phƣơng
pháp này cho phép phát hiện và định lƣợng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay cả khi
phản ứng đang xảy ra. Khả năng này đƣợc thực hiện nhờ bổ xung vào phản ứng
những phân tử phát huỳnh quang liên kết với một đoạn nucleotide đặc hiệu có vị trí
ở giữa 2 primer gọi là probe, sự gia tăng lƣợng DNA tỷ lệ với sự gia tăng tín hiệu
huỳnh quang trong quá trình phản ứng. Máy luân nhiệt đặc biệt trang bị bộ phận đọc
tín hiệu huỳnh quang trong quá trình khuếch đại và hiển thị trên máy tính.[2]
Real time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng
phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lƣợng bản sao DNA
tạo thành.
6.3 Các bƣớc cơ bản của một chu kỳ nhân gene
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi

chu kỳ gồm 3 bƣớc:
Bƣớc 1 (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation) Giai đoạn này
đƣợc thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94 – 95
0
C)
trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch
đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ
sung mới.


15

Bƣớc 2 (giai đoạn bắt cặp- annealing): Trong bƣớc này ở nhiệt độ đƣợc
hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với
mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 65
0
C. Tùy
thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.
Bƣớc 3 (kéo dài, elongation – extension) Nhiệt độ đƣợc tăng lên 72
0
C
giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Dƣới tác động của DNA polymerase,
các nucleotide lần lƣợt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn.
Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại,
thƣờng kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Sự khuếch đại này có thể đƣợc tính nhƣ sau:
Tổng lƣợng DNA khuếch đại = m x 2
n

m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa.

n: Là số chu kỳ.
Nhƣ vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã đƣợc nhân bản thành hai
bản sao; và nếu chu kỳ này đƣợc lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA
đích đã nhân bản đƣợc thành 2
30
đến 2
40
bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao.[1]

Hình 4: Nguyên tắc phản ứng PCR (nguồn Andy Vierstraete, 1999)


16

6.4. Các thành phần và ảnh hƣởng của chúng tới hiệu quả các phản ứng
real time PCR:
6.4.1. DNA mẫu (DNA template)
Phản ứng khuếch đại tối ƣu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Nhiều kỹ
thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận đƣợc trực tiếp
từ dịch chiết tế bào. Lƣợng DNA mẫu sử dụng cũng có xu hƣớng giảm (1µg
xuống còn 100ng) với việc sử dụng các DNA polymerase có hiệu quả cao. (trích
dẫn bởi Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2003)
6.4.2 Primer và nhiệt độ lai
Primer là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thí
nghiệm PCR. Để đạt đƣợc một sự khuếch đại đặc trƣng và có hiệu quả cao thì mồi
sử dụng phải có tính đặc hiệu cho đoạn DNA khuếch đại và phải tuân thủ theo
những nguyên tắc về sự bắt cặp giữa các mồi, cấu trúc kẹp tóc, nhiệt độ biến tính…
6.4.3 Enzyme
Taq polymerase là enzyme chịu nhiệt, hoạt động tối ƣu 72
0

C, gồm một
chuỗi polypeptide trọng lƣợng 94KD, có hoạt tính tổng hợp theo chiều 5’-3’ khi
có sự hiện diện của ion Mg
2+
và hoạt tính 5’- 3’ exonuclease. Trong thời gian 1
phút, enzyme này có thể tổng hợp đoạn sản phẩm PCR từ 1-2kb. Đối với những
đoạn DNA lớn hơn cần khuếch đại thì cứ tăng 1000bp, thời gian kéo dài sẽ tăng
thêm 1 phút. Ngƣời ta sử dụng từ 0,5- 2 đơn vị/ 50 μl hỗn hợp phản ứng .[1]
6.4.4. Các thành phần khác
a. Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphat)
Nồng độ dNTP thƣờng đƣợc sử dụng là 20 – 200 μM. Nồng độ cao hơn dễ
dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh". Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các
dNTP cũng ảnh hƣởng đến phản ứng PCR (mất cân bằng trong thành phần các
dNTP làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase).


17

b. Nồng độ MgCl
2

Nồng độ MgCl
2
cũng là một nhân tố ảnh hƣởng mạnh đến phản
ứng PCR. Mg
2+
rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq
polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Nếu nồng độ Mg
2+
quá thấp thì

Taq polymerase sẽ hoạt động kém và hạn chế quá trình kéo dài (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 1999). Ngƣợc lại nồng độ Mg
2+
cao làm tăng hiện tƣợng bắt
cặp giả và cho ra những sản phẩm không đặc hiệu. Chính vì vậy phải có nồng độ
tối ƣu cho từng phản ứng. Thông thƣờng, MgCl
2
đƣợc sử dụng ở nồng độ từ 1.5
mM – 4 mM.
c. Dung dịch đệm
Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion (inonic strength) cần thiết
cho phản ứng xảy ra, tăng cƣờng hiệu quả cho phản ứng PCR. Nồng độ, pH của
dung dịch đệm cũng nhƣ nồng độ KCl tối ƣu thƣờng tùy thuộc vào nguồn DNA
polymerase sử dụng, không có một quy luật chung cho vấn đề này.
6.5 Ƣu điểm của Real-time PCR
Ƣu điểm chính của realtime PCR so với PCR truyền thống là nó cho
phép xác định số lƣợng bản sao khuôn mẫu ban đầu với độ chính xác và độ nhạy
cao. Kết quả realtime-PCR có thể là kết quả định tính (hiện diện hay vắng mặt
một trình tự DNA) hay định lƣợng (số lƣợng bản sao DNA). Thêm vào đó, dữ
liệu PCR có thể đƣợc đánh giá mà không cần điện di trên gel, giúp tiết kiệm thời
gian và gia tăng số lƣợng thí nghiệm thực hiện. Cuối cùng, việc tiến hành phản
ứng và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại
nhiễm và loại bỏ những thao tác sau phản ứng khuếch đại.[2]
6.6 Vấn đề hạn chế đối với Real-time PCR
- Không phân biệt đƣợc tác nhân gây bệnh còn sống hay chết
- Đòi hỏi kỹ năng về thao tác và kỹ năng sử dụng máy.
- Thiết bị: Yêu cầu về thiết bị đọc tín hiệu huỳnh quang và máy tính đi kèm.
Tuy nhiên ở những phƣơng pháp trƣớc thì vấn đề hạn chế này cũng tƣơng tự,
chính vì vậy phƣơng pháp realtime- PCR là phƣơng pháp tối ƣu nhất hiện nay.