phân lập, giám định đặc tính sinh vật hóa học và định type độc tố của vi khuẩn yếm khí clostridium perfringens trên thịt gà tại một số chợ bằng kỹ thuật multiplex - pcr

- 1 -
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm đã và
đang trở thành mối quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới. Nhiều nghiên
cứu của các nhà khoa học đã đưa ra những cảnh báo về tình trạng mất an toàn
trong thực phẩm tiêu dùng.
Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có khoảng chừng 250-500 vụ ngộ
độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân, trong đó 100 - 200 ca tử vong. Có
rất nhiều nguyên nhân dẫn đến ngộ độc thực phẩm, chẳng hạn do: thực phẩm
bị nhiễm vi sinh vật, thực phẩm bị ô nhiễm hóa chất, thực phẩm bị biến chất,
thực phẩm vốn hàm chứa các chất độc tự nhiên…Xét về nguyên nhân do vi
sinh vật, trong số các vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm thì vi khuẩn C.
pefringens đã được nhiều tác giả nghiên cứu và xác định chúng là một trong
những tác nhân phổ biến gây ngộc độc thực phẩm [25].
Vi khuẩn Clostridium perfringens (C. perfringens) là loại trực khuẩn,
bắt màu Gram dương, chúng có thể đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hoặc
đứng song song. Vi khuẩn có khả năng hình thành nha bào, không di động, chỉ
hình thành giáp mô trong cơ thể động vật. Căn cứ vào sự sản sinh các loại độc
tố chính (alpha, beta, epsilon, iota) người ta phân chia vi khuẩn này ra làm 5
type là A, B, C, D, E. Mỗi type sản sinh ra những độc tố khác nhau và gây
bệnh cho từng loại đối tượng khác nhau. Type A sản sinh độc tố Alpha, type B
sản sinh các độc tố Alpha, Beta và Epsilon, type C sản sinh Alpha và Beta,
type D sản sinh Alpha và Epsilon, type E sản sinh Alpha và Iota. Ngoài ra C.
perfringens còn sản sinh một số độc tố khác như: gama, delta, eta, theta, kapa,
lambda, mu, nu, neuraminidase, enterotoxin,…[11].
Vi khuẩn C. perfringens tồn tại rất phổ biến trong tự nhiên: trong đất,
nước, đặc biệt là trong đường ruột của động vật và con người [3]. Do đó chúng
rất dễ dàng lây nhiễm vào trong thực phẩm và gây ngộ độc cho con người.
Bệnh ngộ độc thực phẩm thường do các vi khuẩn type A và C đôi khi D gây
ra. Các type này có thể sản sinh độc tố enterotoxin nguồn gốc nha bào kết hợp
- 2 -

với các tế bào thượng bì niêm mạc của phần cuối ruột non gây tổn hại cấu trúc
màng tế bào gây đau bụng và tiêu chảy [11].
Thịt gà là một loại thực phẩm có hàm lượng dinh dưỡng cao và được
sử dụng khá phổ biến trong bữa ăn hàng ngày của mỗi gia đình. Tuy nhiên
cũng như các loại thực phẩm khác chúng rất dễ bị nhiễm các loại vi sinh vật
trong đó có vi khuẩn C. pefringens. Vì vậy, việc nghiên cứu tình trạng ô nhiễm
vi sinh vật trên thực phẩm nói chung và trên thịt gà nói riêng là rất cần thiết.
Từ đó có thể kịp thời phản ánh tình trạng ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm
và có những biện pháp giảm thiểu vấn đề ngộ độc thực phẩm. Xuất phát từ
thực tế trên, được sự đồng ý của Lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung và
Ban giám đốc Viện công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha
Trang, chúng tôi thực hiện đề tài: “PHÂN LẬP, GIÁM ĐỊNH ĐẶC
TÍNH SINH VẬT HÓA HỌC VÀ ĐỊNH TYPE ĐỘC TỐ CỦA VI
KHUẨN YẾM KHÍ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRÊN THỊT
GÀ TẠI MỘT SỐ CHỢ TRONG ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ NHA
TRANG BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX - PCR”. Với mục tiêu là
xác định tình trạng ô nhiễm vi khuẩn C. perfringens trên thịt gà mà chúng tôi
thu thập từ một số chợ bán lẻ trong địa bàn thành phố Nha Trang, từ đó đề ra
những khuyến cáo về tình trạng nhiễm C. perfringens trên thịt gà.
- 3 -
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.Tình hình ngộ độc thực phẩm trong nước và nước ngoài
1.1. Tình hình ngộ độc trong nước
Ngộ độc thực phẩm là do ăn phải thức ăn có chất độc, thường xảy ra một
cách đột ngột và kết thúc nhanh chóng, khác với dịch bệnh là có thời gian tiến
triển tăng dần và trước khi kết thúc có thời gian giảm dần xuống. Ngộ độc có
những triệu chứng của một bệnh cấp tính, biểu hiện bằng nôn mửa, tiêu
chảy…và kèm theo các triệu chứng khác tùy theo đặc điểm của từng loại ngộ
độc (trừ ngộ độc do C. botulinum lại gây táo bón do bị tê liệt thần kinh) [4].

Theo thống kê của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm cho thấy trong 3
năm trở lại đây số người ngộ độc trong mỗi năm là rất lớn. Trong đó ngộ độc
do nguyên nhân thực phẩm nhiễm vi sinh vật chiếm tỷ lệ khá cao. Ngộ độc
thực phẩm không chỉ gây tổn thất lớn về sức khỏe mà còn thiệt hại rất lớn về
kinh tế của mỗi quốc gia. Vì vậy, vấn đề kiểm soát ngộ độc thực phẩm của
mỗi quốc gia là rất cần thiết, đặc biệt là vấn đề ngộ độc thực phẩm do vi sinh
vật.
Bảng 1.1 Thống kê ngộ độc thực phẩm trong 3 năm [24]:
Chỉ tiêu
Năm 2006
Năm 2007
Năm 2008
Số vụ ngộ độc
170
234
69
Số người mắc
7250
6896
4270
Số tử vong
63
123
15
Ngộ độc do vi sinh vật
29
87
26
Ngộ độc do độc tố
39

65
22
Ngộ độc do thực phẩm biến chất
8
19
4
Ngộ độc do thực phẩm hoá chất
22
18
1
- 4 -
Qua bảng thống kê ở trên cho thấy tình hình ngộ độc thực phẩm ở nước
ta xảy ra nhiều và do nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong đó đáng chú ý là số
người tử vong do ngộ độc thực phẩm còn cao. Ngộ độc thực phẩm không chỉ
ảnh hưởng đến sự an toàn và sức khỏe của cộng đồng mà còn ảnh hưởng đến
sự tăng trưởng của nền kinh tế quốc dân. Đòi hỏi các đoàn thể xã hội phải hợp
tác chặt chẽ để hạn chế đến mức tối đa tình trạng ngộ độc thực phẩm như hiện
nay.
1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm ở một số nơi trên thế giới
Trong 3 thập niên trở lại đây, tình hình ngộ độc thực phẩm đã và đang là
vấn đề nóng bỏng trên toàn thế giới. Ngộ độc thực phẩm không chỉ diễn ra ở
những nước đang phát triển mà cả ở những nước phát triển và gây ra nhiều tổn
thất đáng lo ngại.
Theo thống kê của Trung tâm phòng chống dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC)
[12] có khoảng 76 triệu người bị các bệnh lây truyền qua thực phẩm hàng năm
ở Mỹ và gây thiệt hại khoảng 5 – 6 tỷ đô la, riêng chi phí cho bệnh lây truyền
qua thực phẩm do Salmonella chiếm khoảng 1 tỷ đô la hàng năm về những chi
phí y tế trực tiếp và gián tiếp.
Tại Nhật Bản, theo thống kê của Trung tâm phòng chống dịch bệnh công
bố năm 2004 [12], số người bị ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi sinh vật lên tới

277 vụ, chiếm 45% trong số các vụ ngộ độc thực phẩm trong cả nước. Thiệt
hại mỗi năm gần chục tỷ USD cho việc giải quyết những hậu quả của các vụ
ngộ độc thực phẩm.
Ở các nước phương tây, nhiễm C. perfringens là nguyên nhân thứ ba về
ngộ độc thực phẩm phần lớn là do thực phẩm chưa được nấu chín.
Trên đây là những con số sơ bộ về tình hình ngộ độc thực phẩm ở một số nước
phát triển. Còn tại các nước đang phát triển, tình hình ngộ độc thực phẩm cũng
đang diễn biến khá phức tạp và cũng gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng, trong
đó có Việt Nam.
- 5 -
2. Nguyên nhân và một số loại ngộ độc thực phẩm
Ngộ độc thực phẩm thường do các nguyên nhân sau [4]:
- Thức ăn bị ôi hỏng.
- Bản thân thức ăn có chất độc.
- Thức ăn bị nhiễm vi sinh vật.
- Ngộ độc do hóa chất thêm hoặc lẫn vào thức ăn.
2.1. Ngộ độc thực phẩm do thức ăn bị ôi hỏng
Trong quá trình bảo quản, nếu không đảm bảo vệ sinh hoặc không theo
đúng yêu cầu kĩ thuật, các cất dinh dưỡng trong thức ăn sẽ bị các tác nhân
như: vi sinh vật, hoá học, vật lý… phân hủy thành những chất có hại. Chẳng
hạn như: các chất đạm bị phân hủy thành amoniac, hydrosulphua, các chất
amin độc; Các chất béo có thể bị oxy hóa thành các peroxyt, aldehyd, cetol,…;
Nitrat bị chuyển thành nitrit…Các chất này không những làm cho thức ăn có
mùi khó chịu mà có thể còn gây ngộ độc cho người sử dụng [4].
2.2. Ngộ độc do ăn phải thức ăn bản thân có chất độc
Một số động vật, thực vật bản thân nó có chứa trong tế bào những chất
độc, hoặc trong điều kiện nào đó tiết ra chất độc có thể gây ra ngộ độc khi cơ
thể người ăn phải. Ngộ độc loại này chia làm ba nhóm [4]:
- Một số thực vật có chất độc: khoai tây nảy mầm, sắn, măng, hạnh nhân. Một
số loại hạt, vỏ cây, rễ cây có chứa saponin có tính chất tán huyết, phá hủy

hồng cầu, tăng huyết áp, tăng sự hấp thụ và tác dụng của các alkanoid vào cơ
thể,…
- Một số động vật có chất độc: Loài nhuyễn thể Mytilus oedulis (chứa chất độc
mytilotoxin gây chóng mặt, nôn mửa, ỉa chảy, buồn tay chân, không kiểm soát
được cơ vận động dần dần dẫn đến tê liệt, tử vong); Loài cóc (có chứa chất
độc bufogin, bufidin trong đó bufonin, bufotalin đều có nhân sterolic. Các chất
độc này có tính chất kích thích mạnh niêm mạc gây tê liệt); Loài cá nóc (có
chứa chất độc tetrodonin, acid tetrodonic, tetrodotoxin (trong buồng trứng) và
- 6 -
hepatoxin (trong gan). Ngộ độc gây tê liệt dần dần các cơ sau đó dẫn đến tử
vong).
- Ngộ độc do ăn phải nấm độc: do người sử dụng chưa biết rõ nguồn gốc ăn
phải.
2.3. Ngộ độc do hóa chất thêm hoặc lẫn vào thực phẩm
Có rất nhiều loại hóa chất cho vào thực phẩm với các mục đích khác
nhau như các chất sát khuẩn, chất kháng sinh, chất chống oxy hóa hóa, chất
bảo quản… có thể gây ngộ độc cho người ăn. Ví dụ: các chất thêm vào với
mục đích tăng tính hấp dẫn như chất làm ngọt nhân tạo, hương liệu, các phẩm
màu. Hoặc các chất thêm để chế biến đặc biệt như: sử dụng các hóa chất làm
tăng độ sáng bóng, độ dai, độ giòn của thực phẩm. Hoặc các hóa chất lẫn vào
thực phẩm trong quá trình chế biến, bảo quản, phân phối, hoặc tồn tại trong
thức ăn do xử lý nông nghiệp, xử lý trong thời gian tàng trữ, bảo quản trong
kho tàng hoặc những chất độc có sẵn hoặc do chuyển hóa sinh ra. Tất cả
những chất này đều có thể trở thành chất độc nếu sử dụng liều lượng vượt quá
cho phép với giới hạn an toàn sức khỏe của con người [4].
2.4. Ngộ độc do vi sinh vật và độc tố của vi sinh vật
Thông thường các vi sinh vật khi nhiễm vào thực phẩm chúng tiết độc tố
gây ngộ độc cho người sử dụng. Độc tố của vi sinh vật có thể có bản chất
protein hoặc không, được sản xuất bởi vi khuẩn nhằm tiêu diệt các tế bào vật
chủ [6]. Độc tố do vi sinh vật sinh ra được chia làm hai loại:

Ngoại độc tố (exotoxin): là chất độc được sinh ra trong tế bào rồi tiết ra
ngoài tế bào. Các ngoại độc tố có tính độc cao đối với cơ thể động vật [6].
Nội độc tố (endotoxin): là độc tố được tạo thành liên kết với các thành
phần của tế bào vi sinh vật, chỉ giải phóng ra ngoài khi tế bào chết hoặc bị
phân hủy. Nội độc tố có tính độc yếu hơn ngoại độc tố nhưng bền nhiệt (ở
nhiệt độ sôi của nước độc tố không bị mất hoạt tính) [6].
Ngộ độc thực phẩm do ăn phải thức ăn có độc tố của vi sinh vật mà
không cần có mặt các tế bào sống của chúng. Ngộ độc thức ăn trong trường
- 7 -
hợp này là ngộ độc do độc tố vi sinh vật điển hình, thường là do ăn phải một
lượng lớn ngoại độc tố có trong thức ăn [6].
Ngộ độc do ăn phải một lượng lớn vi sinh vật chủ yếu là do vi khuẩn
trong thức ăn khi vào trong cơ thể chúng tiếp tục sinh trưởng, phát triển và sản
sinh độc tố. Trong cơ thể chúng tiết độc tố hoặc khi bị chết sinh khối của
chúng tự phân giải và giải phóng độc tố gây ngộ độc. Ngộ độc dạng này gọi là
ngộ độc thức ăn có điều kiện hay là ngộ độc thực phẩm nhiễm khuẩn [6].
3. Một số vi sinh vật thường gây ngô độc thực phẩm.
Ngộ độc do vi khuẩn Salmonella
Vi khuẩn gây ngộ độc chủ yếu là Salmonella typhimurium, Salmonella
choleraesuis và Salmonella enteritidis ngoài ra còn có các loại Salmonella
thompson, Salmonella derby, Salmonella newport,…Salmonellae là loại trực
khuẩn gram âm, không sinh bào tử, lên men đường glucose sinh hơi, thường
không lên men đường lactose, sucrose. Nhiệt độ tối thích để chúng phát triển
là 37
0
C, khoảng pH dành cho sự phát triển là 4,1 – 9,0. Khả năng chịu nhiệt độ
và phát triển phụ thuộc vào loại thực phẩm và type huyết thanh. Vi khuẩn bị
tiêu diệt ở 66
0
C ít nhất là 12 phút hoặc 60

0
C trong 78 – 83 phút, trong sữa
trứng là 81,5
0
C trong 3 phút.
Điều kiện cần thiết để ngộ độc do Salmonellae bộc phát là: (1) thực
phẩm phải chứa hoặc nhiễm vi khuẩn; (2) thực phẩm phải là môi trường tốt để
vi khuẩn phát triển, nhiệt độ thích hợp và thời gian đủ dài để sinh sôi nảy nở;
(3) vi khuẩn phải được đưa vào ống tiêu hóa. Vi khuẩn vào ruột rồi phát triển
tại đó, theo hệ thống bạch huyết và tuần hoàn gây nên tình trạng nhiễm trùng
huyết. Do đó trong thời kì đầu, lấy máu người bệnh cấy truyền sẽ phát hiện vi
khuẩn. Vi khuẩn gây viêm ruột, phá hỏng tế bào niêm mạc ruột tiết ra độc tố.
Độc tố này thấm qua thành ruột vào máu. Ngoài ra, vi khuẩn trong hệ tuần
hoàn cũng tiết ra nội độc tố. Nội độc tố chủ yếu tác động trên hệ thần kinh vận
động của huyết quản, làm tăng độ bền của thành mao quản và giảm chức năng
điều tiết thân nhiệt của cơ thể.
- 8 -
Triệu chứng gây bệnh: triệu chứng bộc lộ phụ thuộc vào số lượng và tỷ
lệ vi khuẩn nhiễm vào thực phẩm. Thời gian ủ bệnh khoảng 12 – 24 giờ, có
khi vài giờ nhưng có khi vài ngày. Triệu chứng trước tiên là nhức đầu, chán
ăn, mặt tái nhạt, toát mồ hôi, nôn mửa, đau bụng và tiêu chảy. Thân nhiệt tăng
lên 38-40
0
C trong vòng 2 – 4 ngày sau khi phát hiện bệnh và tùy theo mức độ
nặng nhẹ mà kéo dài 3 – 7 ngày. Bệnh nặng gây ra viêm dạ dày ruột [10].
Ngộ độc do vi khuẩn E. coli
E. coli là một phần của hệ vi sinh vật đường ruột của người và động
vật. E. coli gây bệnh thường gặp trên thú non, trẻ em, nhiễm trùng huyết ở trẻ
sơ sinh. Còn gây ngộ độc thực phẩm có thể là do các type gây bệnh phát triển
mạnh mẽ trong thức ăn, đó là các serotype: O

3
, O
4
, O
44
, O
26
, O
56
, O
86
, O
111
,
O
125
, O
126
, O
127
, O
157
…
Dựa vào hội chứng bệnh và tính chất gây bệnh của E. coli người ta
chia thành 5 nhóm: EaggEC (enteroaggregative E. coli = E. coli kết tập ở
ruột), EHEC (enterohemorrhagic E. coli = E. coli gây xuất huyết ở ruột),
EIEC (enteroinvasive = E. Coli xâm lấn niêm mạc ruột), EPEC (entero-
pathogenic E. coli = E. coli gây bệnh đường ruột) và ETEC (enterotoxogenic
E. coli = E. coli sinh độc tố ruột). Thời gian ủ bệnh từ 8 – 44 giờ tùy theo
dòng vi khuẩn và loại độc tố. Loại độc tố ruột có thời gian gây bệnh trung bình

26 giờ, biến thiên từ 4 – 44 giờ. Loại độc tố tế bào (cytotoxin) có thời gian gây
bệnh trung bình 11giờ, biến thiên từ 8 – 24giờ. Bệnh phát ra đột ngột, đau
bụng dữ dội rất ít nôn mửa, đi phân lỏng khoảng 1 – 15 lần/ngày. Nhiệt độ cơ
thể bình thường hoặc tăng nhẹ, bệnh kéo dài 1 – 3 ngày rồi khỏi. Trường hợp
nặng thì có thể sốt cao, mệt mỏi, chân tay co quắp, thời gian khỏi bệnh tương
đối dài [10].
Ngộ độc do vi khuẩn Shigella.
Ngộ độc do Shigella được ghi nhận tại Mỹ, nhưng hầu hết là do nguồn
nước bị nhiễm S. sonnei, S. flexnen, S. disentenae và S. boydii. Nhiệt độ tối
thích cho vi khuẩn phát triển là 37
0
C, biến thiên từ 10 – 40
0
C. Chúng chịu
được nồng độ muối 5 – 6%. Vi khuẩn gây bệnh bằng nội độc tố loại
- 9 -
liposaccharide tác động trực tiếp trên niêm mạc ruột. Thời gian ủ bệnh từ 1 – 7
ngày, trung bình dưới 4 ngày. Triệu trứng thay đổi từ nặng đến nhẹ như: đau
thắt bụng, ớn lạnh, tiêu chảy có máu lẫn màng niêm mạc mủ, đau đầu, ói mửa.
Ngoài ra còn nhiều loại vi khuẩn, virus gây ngộ độc thực phẩm. Trong
đó đáng chú ý là vi khuẩn yếm khí C. perfrigens đã được nhiều tác giả trong
và ngoài nước nghiên cứu và xác định là một trong những tác nhân quan trọng
gây ngộ độc thực phẩm [10].
4. Những hiểu biết về vi khuẩn C. perfringens
Lần đầu tiên Feser (1865) phát hiện C. perfringens, sau đó các tác giả
lần lượt nghiên cứu về vi khuẩn và bệnh do vi khuẩn này gây ra. Loài C.
perfringens lần đầu tiên được phân lập và mô tả bởi Welch và Nuttall (1892)
trong tổ chức có hơi của xác người chết và được đặt tên là Bacillus aerogens
capsulatus, về sau được đổi tên là Bacillus perfringens do Veillon và Zuber
(1898) và thành Bacillus welchii [13]

4.1. Đặc điểm hình thái, tính chất bắt màu
C. perfrigens là trực khuẩn có khả năng sinh nha bào, nha bào hơi lệch
tâm, vi khuẩn không có khả năng di động chỉ hình thành giáp mô trong cơ thể
động vật. Là trực khuẩn ngắn bắt màu thuốc nhuộm gram dương đứng riêng rẽ
hoặc kết thành chuỗi hoặc đứng song song. Kích thước vi khuẩn (0,6 – 2,4) 
(1,3 - 19) m [13], [14].
Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn C. perfringens
- 10 -
4.2. Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường Fluid Thioglycolate: sau 24 – 28 giờ nuôi cấy vi khuẩn
phát triển tốt làm đục môi trường.
Trên môi trường thạch máu: sau 24 – 28 giờ nuôi cấy ở 37
o
C, vi khuẩn
phát triển tạo khuẩn lạc tròn ướt có hai vòng dung huyết xung quanh [14].
Trên môi trường SPS, TSC agar vi khuẩn phát triển cho khuẩn lạc tròn
màu đen, do vi khuẩn sinh H
2
S tác dụng với Fe (trong môi trường) tạo thành
FeS có màu đen [20].
Trên môi trường nước thịt gan yếm khí vi khuẩn mọc rất tốt, nhanh
chóng làm đục môi trường.
4.3. Đặc tính sinh vật, hóa học
Môi trường Egg yorlk, vi khuẩn phát triển sinh men lecithinane phân
giải lecithin tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc.
Trên môi trường Litmus milk: vi khuẩn lên men đường lactose, làm đông
vón casein. Môi trường chuyển từ tím sang nâu rồi sang trắng với chỉ thị pH
Litmus.
Vi khuẩn có khả năng lên men các loại đường: glucose, lactose,
maltose, sucrose. Không lên men manitol, không sinh indol [20].

4.4. Phân loại.
Dựa vào khả năng sinh độc tố chính (alpha, beta, epsilon, iota), người ta
chia C. perfrigens thành 5 type độc tố khác nhau bao gồm các type: A, B, C,
D, E. Ngoài ra vi khuẩn còn sản sinh một số các độc tố khác như: gama, delta,
eta, theta, kappa, lambda, mu, nu, neuraminidase, enterotoxin. Trong những
năm gần đây một số tác giả còn phát hiện độc tố beta 2 [11].
- 11 -
Bảng 1.2 Các độc tố chính của vi khuẩn C. perfringens
Alpha
Beta
Epsilon
Iota
A
+
-
-
-
B
+
+
+
-
C
+
+
-
-
D
+
-

+
-
E
+
-
-
+
Tất cả các type đều sản sinh Alpha toxin (gene mã hoá là Cpa), là loại
phospholipase C có khả năng thuỷ phân phosphotidylcholine và
sphingomyeline là nguyên nhân gây tan huyết, cả 2 loại protein này đều có thể
kết hợp với màng tế bào của vật chủ [16].
Beta toxin (gene mã hoá là Cpb) nằm trên plasmid của vi khuẩn, gây tổn
thương các tế bào biểu mô ruột, tế bào màng trong ruột. Ngoài ra, beta toxin
còn tác động đến mô thần kinh làm ảnh hưởng đến trao đổi canxi màng gây rối
loạn chức năng thần kinh bình thường. Mới đây nhiều tác giả còn đề cập đến
độc tố Beta toxin 2 (Cpb2) nhưng vai trò của nó trong gây bệnh còn chưa xác
định rõ, gene mã hoá của nó nằm trên plasmid. Theo khảo sát của Dawn và
cộng sự (2003) [15] tại trường đại học Arizona Mỹ thì tỷ lệ lưu hành của gene
Cpb2 trong các chủng C. perfringens phân lập trên bò bị bệnh tiêu chảy, bệnh
nhiễm độc huyết đường ruột và chết đột tử là 21,4%, trên bê bị bệnh do type A
là 11,8%, type C là 40% và type E là 97,3%.
Epsilon toxin, gene mã hóa độc tố nằm trên plasmid. Đích của độc tố
này là nhóm lipid: cholesterol và sphingolipid có mặt trên màng tế bào của
Độc
tố
Type
- 12 -
động vật Eukaryotic, vì vậy độc tố này tập trung ở não và thận. Độc tố epsilon
được tiết ra như là 1 tiền độc tố và được kích hoạt bằng men proteolytic.
Iota toxin có 2 vị trí: vị trí gắn độc tố với tế bào biểu mô đích (Ib) và

vị trí hoạt hóa enzyme (Ia). Sau khi độc tố gắn vào thụ thể đặc hiệu trên bề
mặt tế bào, Ia xâm nhập vào tế bào chất và gây chết tế bào.
Enterotoxin: là độc tố được sản xuất bởi chủng vi khuẩn type A, và là
độc tố chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm. Gen mã hoá độc tố là CPE, gen này
thường tìm thấy trên plasmid hoặc nằm trên nhiễm sắc thể. Trong hầu hết các
chủng phân lập từ thực phẩm bị nhiễm độc, thì gen này nằm trên nhiễm sắc
thể. Độc tố enterotoxin là một chuỗi polypeptid gồm khoảng 319 acid amin,
trọng lượng phân tử khoảng 3,5 kDa. Khi bị nhiễm độc enterotoxin các triệu
chứng xuất hiện bao gồm: tiêu chảy, nôn mửa, sốt kéo dài trong vòng 1 ngày.
Thời gian ủ bệnh 6 – 24 giờ thường từ 10 – 12 giờ [23].
4.5. Đặc tính gây bệnh
C. perfrigens là loại vi khuẩn gây bệnh rộng rãi trong tự nhiên và gây
bệnh cho nhiều loài gia súc, gia cầm cũng như con người. Các type khác nhau
gây bệnh khác nhau [14], [20]. Trong đó:
- Type A: gây bệnh hoại thư sinh hơi, ngộ độc thực phẩm, tiêu chảy ở
người. Gây nhiễm độc tố máu: bò, dê, ngựa, lạc đà, một số khác. Gây viêm
ruột ở ngựa, viêm dạ dày cấp tính ở động vật gần con người, con người và
các loại khác. Gây bệnh nhiễm độc máu gây vàng da ở cừu.
- Type B: gây bệnh lị ở cừu, cừu con, gây nhiễm độc tố ở dê, cừu, bò,
ngựa sơ sinh, chuột lang, cừu non.
- Type C: gây nhiễm độc tố ở cừu non, lợn, cừu, bê, ngựa non, gây bệnh
viêm ruột hoại tử ở gia cầm.
- Type D: gây bệnh máu nhiễm độc tố ruột ở cừu, bệnh mềm thận ở cừu
non.
- Type E: gây bệnh máu nhiễm độc tố ruột ở bò bê, chuột lang, thỏ, gây
bệnh lị ở cừu.
- 13 -
4.6. Sức đề kháng của C. perfringens
C. perfringens là thành viên của họ Bacillacae, chúng có khả năng sinh
nha bào. Tùy theo chủng nha bào có thể chống chịu được với nhiệt độ hoặc

không (1 – 30 phút ở 100
0
C). Phần lớn các chủng nhạy cảm với nhiệt độ
nhưng những chủng gây bệnh lại chịu được nhiệt độ cao. Các nha bào sống sót
rất lâu trong môi trường và chịu được điều kiện lạnh đông [7].
Về khả năng sống sót qua thời gian trữ đông kết quả nghiên cứu ở thịt
gà đông lạnh cho thấy chỉ có 4% tế bào sống sót được khi trữ ở - 17,7
0
C sau
180 ngày trong khi tỷ lệ này ở bào tử khô là 40% sau 90 ngày và 11% sau 180
ngày. Về pH, nhiều chủng tăng trưởng trong khoảng 5,5 – 8,5 nhưng thường
không dưới 5,5 và không trên 8,5. Nồng độ Sodium chlorua 5% ức chế sự phát
triển của vi khuẩn và vài dòng thì bị ức chế ở 2,5% sodium nitrat [3].
4.7. Ngộ độc do C. perfringens
Vi khuẩn C. perfringens là một ví dụ điển hình về type huyết thanh gây
ngộ độc thực phẩm trong giống Clostridia, chiếm một vị trí khá đặc biệt vừa là
tác nhân gây bệnh do thực phẩm vừa gây ngộ độc thực phẩm. Một mặt C.
perfringens gây bệnh khi nạn nhân ăn phải một lượng lớn tế bào vi khuẩn, mặt
khác chúng còn sinh độc tố gây ngộ độc [3].
Vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm là do C. perfringens type A. Triệu
chứng gây bệnh: hầu hết sự ngộ độc xảy ra khi người tiêu thụ thực phẩm
nhiễm C. perfringens ở mật độ khoảng 1 triệu vi khuẩn/1gam. Triệu chứng
thường biểu hiện sau 8 – 24 giờ, trung bình là 12 giờ, gồm: đau bụng, tiêu
chảy và giải phóng nhiều chất khí, sốt, buồn nôn, ít khi ói mửa. Trong quá
trình vi khuẩn hình thành bào tử chúng giải phóng độc tố ruột, hậu quả là trong
ruột tích lũy một lượng lớn chất lỏng. Độc tố này bị bất hoạt ở 60
0
C trong 10
phút [3].
Điều kiện và nguồn gốc giúp ngộ độc bộc phát là: (1) thực phẩm phải

có sẵn vi khuẩn hoặc bị vấy nhiễm C. perfringens, (2) thực phẩm không được
trữ lạnh thích hợp, nhiệt độ thích hợp và đủ thời gian cho vi khuẩn phát triển
- 14 -
đủ số lượng, (3) thực phẩm không được đun nấu lại trước khi sử dụng, và (4)
vi khuẩn hình thành bào tử trong ống tiêu hóa và hình thành độc tố ruột [10].
Bào tử thường tìm thấy trong hầu hết các thực phẩm tươi sống cũng
như trong đất, nước thải và phân gia súc. Thịt gia súc các loại chiếm
4
3
các
đợt ngộ độc của C. perfringens [10].
4.8. Một số nghiên cứu về C. perfringens trong những năm gần đây
Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về C. perfringens gây
bệnh trên động vật cũng như bệnh ngộ độc thực phẩm ở người. Dưới đây là
một số nghiên cứu mà chúng tôi tham khảo được.
Dennis L. Stevens và cộng sự (1986) đã nghiên cứu so sánh giữa đơn
và kết hợp nhiều nhân tố kháng khuẩn trong việc ngăn cản bệnh sinh hơi hoại
thư gây ra bởi C. perfringens. Ông đã chứng minh việc kết hợp nhiều loại
kháng sinh điều trị có hiệu quả hơn so với điều trị bởi riêng một loại kháng
sinh.
Qiyi Wen thì tiến hành phân lập chủng C. perfringens có trên các mẫu
thực phẩm bán lẻ ở Mỹ gây ngộ độc. Ông đã thu được tất cả các mẫu là type
A, gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là type này do độc tố enterotoxin nằm trên
nhiễm sắc thể gây ra, nha bào của những chủng này đều có khả năng chịu
được nhiệt độ cao [19].
Tại các trang trại gà ở Cario Ai Cập bị bệnh viêm ruột hoại tử, Effat và
cộng sự đã phân lập C. perfringens từ các mẫu gà bị bệnh. Kết quả nghiên cứu
cho thấy: tất cả những vi khuẩn phân lập được đều là C. perfringens, có khuẩn
lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu cừu với hai vòng dung huyết. Soi trên
kính hiển vi điện tử chúng là các trực khuẩn Gram dương và không di động.

Ông đã định type vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật Multiplex – PCR với
4 cặp mồi đặc hiệu mã hóa cho 4 gene sản sinh độc tố alpha, betha, epsilon,
iota. Kết quả là type A với độc tố alpha là nguyên nhân gây bùng phát bệnh
viêm ruột hoại tử ở các trang trại này [17].
- 15 -
5. Thịt và con đường nhiễm vi sinh vật vào thịt
Thịt gà là một thực phẩm giàu dinh dưỡng, trong thịt có các thành phần:
protein, lipid, các chất khoáng, vitamin, nước. Do đó thịt là không chỉ là thực
phẩm tốt cho người và còn là môi trường thích hợp cho vi sinh vật phát triển.
Vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm không chỉ gây thiệt hại lớn về giá trị dinh
dưỡng, chất lượng của thực phẩm mà còn có thể gây bệnh cho con người.
Các con đường lây nhiễm vi sinh vật vào thịt [6]:
- Do bản thân gia súc, gia cầm đã bị bệnh trước khi giết mổ do đó trong
thực phẩm đã có sẵn vi sinh vật.
- Thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường bên ngoài như đất, nước
và các dụng cụ không sạch nhiễm vào thực phẩm, thực phẩm bị hỏng, ôi
thiu, ô nhiễm chéo vào thực phẩm.
- Lây nhiễm vi sinh vật do vật môi giới lây truyền: đó là ruồi, nhặng,
muỗi, côn trùng… mang vi sinh vật từ phân hoặc rác thải nhiễm vào khi
chúng nhiễm vào thịt.
Chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt tươi được quy định theo TCVN 7046 –
2002 do bộ khoa học và công nghệ ban hành theo quyết định số 22/2002/QĐ –
BKHCN. TCVN quy định sản phẩm thịt tươi đạt tiêu chuẩn với số lượng C.
perfringens không quá 10 vi khuẩn/gam [2].
- 16 -
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
1. Nội Dung.
 Phân lập vi khuẩn C. perfrigens trên thịt gà ở một số chợ trong TP Nha
Trang.

 Định lượng vi khuẩn C. perfringens có trong 1 gam thịt gà.
 Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn phân lập
được.
 Xác định type độc tố vi khuẩn bằng kỹ thuật Multiplex - PCR.
 Xác định khả năng hình thành nha bào của vi khuẩn C. perfringens.
2. Đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu.
2.1. Đối tượng nghiên cứu.
- Vi khuẩn C. perfrigens nhiễm trên thịt gà tươi được lấy từ bốn chợ trong
thành phố Nha Trang: chợ Vĩnh Hải, chợ Vĩnh Thọ, chợ Đầm, chợ Xóm Mới.
2.2. Nguyên liệu nghiên cứu
- Môi trường sử dụng (Các môi trường nuôi cấy do hãng Merk - Đức sản
xuất): Fluid Thyoglycolate, TSC aga, BHI broth, các môi trường đường, Egg
yolk, Limus milk,…
- Dung dịch hoá chất cho phản ứng PCR (Chúng tôi đã sử dụng các sinh
phẩm được sản xuất bởi hãng Invitrogen) gồm: dung dịch đệm Buffer, enzyme
Taq- DNA polymerase, dNTPs, MgCl
2
, DNA mẫu, primer đặc hiệu, nước cất.
2.3. Trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm.
Nồi hấp, tủ ấm, tủ lạnh, tủ lạnh – 80
0
C, tủ sấy, tủ cấy vô trùng, máy luân
nhiệt PCR,…
Hộp lồng, ống nghiệm, que cấy, cối chày…
- 17 -
3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.
- Địa điểm lấy mẫu: chợ Vĩnh Hải, chợ Vĩnh Thọ, chợ Đầm, chợ Xóm Mới.
- Thời gian lấy mẫu: vào lúc 10 giờ trưa.
- Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn nghiên cứu Vi trùng - Phân viện thú y miền
Trung - Nha Trang, Khánh Hoà.

- Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 01/08/2008 đến 30/10/2008.
4. Phương pháp nghiên cứu.
4.1. Phương pháp lấy mẫu.
Lấy mẫu thịt gà theo TCVN 4833 - 1 : 2002 (ISO 3100 - 2 : 1988) [1].
Mẫu sau khi lấy để riêng trong túi PE vô trùng. Ký hiệu mẫu: Thời gian lấy
mẫu, địa điểm lấy mẫu và ký hiệu mẫu rõ ràng. Sau đó cho mẫu vào thùng đá,
vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm.
Thời gian và số lượng mẫu được bố trí lấy như ở bảng 2.1.
Bảng 2.1 Thời gian và số lượng mẫu khảo sát ở mỗi địa điểm
STT
Địa điểm
Thời gian
Số lượng mẫu
1
Chợ Vĩnh Hải
10 giờ
6
2
Chợ Xóm Mới
10 giờ
6
3
Chợ Đầm
10 giờ
6
4
Chợ Vĩnh Thọ
10 giờ
6
4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn C. perfringens

Chúng tôi áp dụng quy trình phân lập vi khuẩn C. perfringens theo quy trình
phân lập của Bộ môn nghiên cứu Vi trùng Phân viện Thú y miền Trung.
- 18 -
Sơ đồ phân lập
4.3. Phương pháp đếm số lượng vi khuẩn có trong 1gam thịt gà
Chúng tôi áp dụng phương pháp đếm khuẩn lạc theo: Thường quy kỹ thuật
định lượng C. perfringens trong thực phẩm (Ban hành kèm theo Quyết định số
3348/QĐ-BYT ngày 31 tháng 7 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế ) [8].
- Chẩn bị mẫu, dung dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
Cân chính xác 25 gam mẫu thịt gà, cắt nhỏ hoặc nghiền nát trong điều
kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất. Sau đó bổ sung 225 ml nước
muối sinh lý lắc đều từ 2 - 3 phút thu được dung dịch mẫu thử có nồng độ 10
-1
.
Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10
-1
cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml
nước muối sinh lý. Lắc đều trong 2-3 phút thu được dung dịch nồng độ 10
-2
.
Làm tương tự ta thu được các dung dịch mẫu thử nồng độ 10
-3
, 10
-4
,…

Mẫu
Fluid
Thyoglycolate
Môi trường đặc
hiệu (TSC agar)
Chọn khuẩn lạc tăng sinh
trên môi trường thạch máu
Xác định các đặc tính
sinh vật hóa học
Định danh vi khuẩn
Định type vi khuẩn
- 19 -
- Cấy đếm vi khuẩn trên đĩa thạch
Đổ khoảng 15ml môi trường TSC vào mỗi đĩa petri đã được đánh dấu
nồng độ pha loãng. Ở mỗi nồng độ pha loãng, hút chính xác 1ml canh khuẩn
nhỏ lên mặt thạch sau đó dùng pipet dàn đều mẫu trên bề mặt thạch, mỗi nồng
độ cấy trên 2 đĩa tương ứng. Đợi bề mặt thạch khô, đổ tiếp 15ml môi trường
TSC rồi láng đều để môi trường phủ kín bề mặt đĩa. Khi môi trường đông lại,
lật ngược đĩa, cho đĩa vào túi yếm khí, đặt vào tủ ấm 37
0
C, 10%CO
2
.
Sau 18 – 24 giờ nuôi cấy, tiến hành đọc kết quả sơ bộ. Đếm toàn bộ
những khuẩn lạc có các đặc tính tròn, lồi, bờ đều nhẵn, màu đen. Số lượng vi
khuẩn có trong 1 gam thịt gà được tính bằng trung bình cộng giữa các đĩa nuôi
cấy cùng nồng độ pha loãng nhân với hệ số pha loãng tương ứng.
Chọn khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường TSC, cấy kiểm tra trên môi
trường thạch máu. Sau đó kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học. Trên cơ sở
những đặc tính sinh vật, hóa học đã được kiểm tra tiến hành định danh vi

khuẩn.
- Số lượng vi khuẩn có trong 1 gam thịt được tính bằng:
N = M * 10
n
Trong đó: N: là số vi khuẩn có trong 1 gam thịt.
M: là số khuẩn lạc trung bình.
10
n
: Độ pha loãng tương ứng.
Ghi nhận kết quả tổng số vi khuẩn C. perfringens có trong 1 gam thịt
tươi so sánh với tiêu chuẩn cho phép đối với vi khuẩn C. perfringens do Bộ
Khoa học và Công nghệ ban hành theo quyết định số 22/2002/QĐ – BKHCN.
TCVN quy định sản phẩm thịt tươi đạt tiêu chuẩn với số lượng C. perfringens
không quá 10 vi khuẩn/gam.
4.4. Kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn C. perfrigens bằng phương
pháp soi tươi.
Làm tiêu bản giọt treo: Cho một giọt canh khuẩn từ môi trường Fluid
Thyoglycolate lên giữa kính phủ vật. Xoay ngược lá kính cho giọt canh khuẩn
- 20 -
quay xuống phía dưới rồi đặt lên phần lõm của phiến kính lõm (không để giọt
canh khuẩn lan rộng hay chạm vào phần đáy của phần lõm). Đặt tiêu bản lên
kính hiển vi và quan sát ở vật kính dầu [3].
4.5. Phương pháp kiểm tra hình thái của vi khuẩn C. perfringens
Để kiểm tra hình thái của vi khuẩn chúng tôi sử dụng phương pháp
nhuộm Gram, soi dưới kính hiển vi với với vật kính dầu [3].
Làm tiêu bản cố định phiến phết: Dùng que cấy lấy một giọt canh
khuẩn, dàn đều canh khuẩn trên một lam kính sạch. Để dịch khuẩn tự khô
hoàn toàn, hơ mặt dưới của lam kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần,
tránh không để tiêu bản quá nóng [3].
Tiến hành nhuộm: Phủ dung dịch Crystal Violet lên lam kính đã được

cố định trong 1 phút, rửa Crystal violet với nước cất. Phủ dung dịch Lugol
trong 1 phút, sau đó đổ bỏ dung dịch Lugol và rửa nhẹ với nước cất. Cầm một
đầu lam kính, nhỏ từ từ cồn 95% cho đến khi vùng phiến phết bạc màu đi (thời
gian tẩy cồn thông thường khoảng 5 – 10 giây), rửa ngay với nước để dừng
công đoạn tẩy cồn. Sau đó phủ dung dịch Fuchsin lên lam kính 1 phút, đổ bỏ
dung dịch và rửa nhẹ qua nước.
Để tiêu bản khô tự nhiên hoặc dùng giấy thấm để thấm khô, quan sát
hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi vật kính 40X [3].
Phương pháp kiểm tra Gram bằng KOH 3%
Nhỏ 1 giọt KOH 3% lên một phiến kính sạch, dùng que cấy lấy khuẩn
lạc cần kiểm tra đặt vào vị trí có giọt KOH 3%. Dùng que cấy làm tan khuẩn
lạc trong KOH. Sau đó từ từ đưa que cấy lên, nếu có sợi tơ keo, nhầy kéo lên
thì vi khuẩn cần kiểm tra là vi khuẩn Gram âm, nếu không có sợi tơ nhầy kéo
theo thì vi khuẩn cần kiểm tra là Gram dương [3].
4.6. Phương pháp kiểm tra đặc tính nuôi cấy, một số đặc tính sinh vật hoá
học của vi khuẩn
- Kiểm tra khả năng dung huyết trên môi trường thạch máu: Dùng que cấy vô
trùng lấy một lượng nhỏ môi trường Fluid thioglycolate ria đều trên bề mặt
- 21 -
thạch máu. Sau đó bỏ trong túi yếm khí, đặt trong tủ ấm 37
0
C, 10% CO
2
nuôi
cấy trong vòng 24 – 28 giờ, nếu xung quanh khuẩn lạc có 2 vòng dung huyết
thì phản ứng dương tính và ngược lại.
- Xác định khả năng lên men đường glucose, lactose, maltose, saccarose:
Dùng que cấy vô trùng chọn lấy một khuẩn lạc cần kiểm tra, chích sâu xuống
đáy mỗi ống nghiệm có chứa từng loại đường riêng biệt, để tủ ấm 37
0

C, 10%
CO
2
. Sau 24 – 28 giờ lấy ra đọc kết quả, phản ứng dương tính khi môi trường
chuyển từ màu đỏ sang vàng và ngược lại.
- Kiểm tra khả năng sinh hơi: Vi khuẩn có khả năng sinh hơi nếu trên các môi
trường đường, thạch bị nứt hoặc bị đẩy lên trên, và ngược lại.
- Kiểm tra trên môi trường Mannitol – Motility: Dùng que cây vô trùng lấy
khuẩn lạc cần kiểm tra cấy một đường chích sâu xuống đáy ống nghiệm, để tủ
ấm 37
0
C từ 24 – 28 giờ sau đó đọc kết quả.Vi khuẩn có khả năng lên men
đường thì làm môi trường chuyển từ đỏ sang vàng với chỉ thị phenol đỏ. Vi
khuẩn có khả năng di động sẽ làm môi trường đục đều, vi khuẩn di động yếu
chỉ làm đục môi trường xung quanh đường cấy, vi khuẩn không di động chỉ
mọc trên đường cấy.
- Kiểm tra khả năng phát triển trên môi trường Limus milk: Dùng que cấy vô
trùng lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường Litmus milk, nuôi cấy trong tủ ấm
37
0
C, 10% CO
2
sau 24 – 28 giờ kiểm tra. Phản ứng dương tính khi vi khuẩn
lên men lactose, làm đông vón casein, môi trường chuyển từ màu tím sang nâu
sang trắng với chỉ thị pH litmus.
- Kiểm tra khả năng phát triển trên môi trường Egg yorlk: Dùng que cấy vô
trùng chọn lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy ria đều trên môi trường Egg yolk. Bỏ
đĩa vào trong túi yếm khí, đặt trong tủ ấm 37
0
C, 10% CO

2
sau 24 – 28 giờ lấy
ra đọc kết quả. Phản ứng dương tính khi vi khuẩn phát triển sinh men
lecithinase phân giải lecithin tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc
và ngược lại.
- 22 -
4.7. Phương pháp giữ giống vi khuẩn
Dùng pipet 1000μl, hút 1000μl môi trường nuôi cấy vi khuẩn cho vào
ống eppendof. Tiến hành ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút trong vòng 4 phút. Bỏ
nước trong, giữ lại cặn. Hút 500μl glycerol, sau đó bổ sung thêm 500μl môi
trường nuôi cấy vi khuẩn. Voltex cho hỗn hợp đồng nhất, sau đó giữ lạnh ở
nhiệt độ - 80
0
C.
4.8. Phương pháp định type độc tố vi khuẩn C. perfringens bằng kỹ thuật
Multiplex – PCR
Để xác định type vi khuẩn, chúng tôi dựa vào việc xác định gen mã hoá các
độc tố chính của các vi khuẩn phân lập được bằng việc sử dụng phản ứng
Multiplex – PCR. Từ đó kết luận type vi khuẩn phân lập được.
Ở đây chúng tôi sử dụng cặp mồi cho phản ứng Multiplex – PCR do Bộ môn
nghiên cứu Vi trùng Phân Viện Thú Y Miền Trung cung cấp. Trình tự các mồi
được sử dụng trong phản ứng Multiplex – PCR như ở bảng 2.2.
Bảng 2.2 Trình tự các mồi sử dụng trong phản ứng Multiplex – PCR.
Genes
Trình tự mồi
Kích cỡ (bp)
CPA
5’-GTTGATAGCGCAGGACATGTTAAG -3’
5’-CATGTAGTCATCTGTTCCAGCATC -3’
402

CPB
5’-ACTATACAGACAGATCATTCAACC -3’
5’-TTAGGAGCAGTTAGAACTACAGAC -3’
236
etx
5’-ACTGCAACTACTACTCATACTGTG -3’
5’-CTGGTGCCTTAATAGAAAGACTCC -3’
541
CPI
5’-GCGATGAAAAGCCTACACCACTAC -3’
5’-GGTATATCCTCCACGCATATAGTC -3’
317
4.8.1. Tách chiết DNA
Sử dụng phương pháp sốc nhiệt để tách chiết DNA, gồm 3 bước sau:
- 23 -
- Bước 1: Hút 200 µl dung dịch mẫu (canh khuẩn trong môi trường Fluid
Thyoglycolate) cho vào ống Eppendorf. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 4 phút ở
4
0
C. Hút bỏ dịch nổi (giữ lại cặn có chứa DNA)
- Bước 2: Thêm 150 µl nước siêu sạch vào ống chứa cặn DNA trộn đều.
Đun cách thuỷ 100
0
C trong 10 phút. Làm lạnh nhanh trong ngăn đông của tủ
lạnh trong thời gian 5 phút
- Bước 3: Ly tâm ở 4
0
C, tốc độ 4000 vòng trong thời gian 4 phút. Thu dịch
nổi có chứa DNA mẫu cho phản ứng PCR. Bảo quản ở 4 – 8
0

C
4.8.2. Các thành phần của phản ứng
Bảng 2.3 Các thành phần của phản ứng Multiplex – PCR.
STT
Thành phần
Thể tích (μl)
1
H
2
O
12.6
2
Buffer x10
2.5
3
MgCl
2
25mM
1.5
4
dNTPs 10mM
2
5
Qx5
1
6
CPA
1
10 pmol
0.25

7
CPA
2
10 pmol
0.25
8
CPB
1
10 pmol
0.25
9
CPB
2
10 pmol
0.25
10
CPI
1
10 pmol
0.25
11
CPI
2
10 pmol
0.25
12
etx
1
10 pmol
0.25

13
etx
2
10 pmol
0.25
14
Taq DNA
0.4
15
DNA
2
- 24 -
4.8.3. Chu trình nhiệt của phản ứng.
Hình 2.1 Chu trình nhiệt trong phản ứng Multiplex – PCR.
4.8.4. Phát hiện sản phẩm
Sản phẩm của phản ứng PCR được phát hiện bằng phương pháp chạy điện di
trên gel agarose nồng độ 1,5%.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị thạch: lấy 1,5 gam agarose cho vào 100ml đệm TBE cho vào
lọ thuỷ tinh chịu nhiệt, lắc đều và cho vào lò vi sóng trong 5 phút để làm nóng
chảy agarose.
Để nguội gel khoảng 50
0
C, cho 6μl thuốc nhuộm Ethydium Bromide đã
lắc đều vào, đổ gel đã tan chảy vào bể điện di. Sau 20 phút gel đông lại, rút
răng lược ở bể điện di ra sẽ được một dãy các giếng. Hút 10μl sản phẩm
Multiplex – PCR cho vào các giếng. Hút 8μl maker cho vào giếng, hút 10μl
mẫu đối chứng dương được cung cấp từ phòng thí nghiệm Bộ môn nghiên cứu
Vi trùng Phân viện Thú y miền Trung. Sau khi điện di, gel được soi qua tia
cực tím (UV) và chụp ảnh bằng máy đọc gel kết nối với máy tính.

4.9. Kiểm tra khả năng hình thành nha bào vi khuẩn C. perfringens
Chúng tôi tiến hành kiểm tra theo phương pháp Pasteur và quan sát sự sinh
trưởng: lấy các chủng vi khuẩn đã định type ở trên, nuôi cấy trên môi trường
Fluid Thyoglycolate sau 6 đến 8 ngày. Xử lý với nhiệt độ 75
0
C trong 15 phút,
30 chu kỳ
94
o
C
5 phút
94
o
C
1 phút
55
o
C
1 phút
72
o
C
1 phút
72
o
C
10 phút
4
o
C

∞
- 25 -
sau đó đổ mỗi ống đã xử lý nhiệt vào từng ống môi trường Fluid
Thyoglycolate tương ứng để tủ ấm 37
0
C, 10% CO
2
sau 24 giờ. Nếu vi khuẩn
có khả năng hình thành nha bào thì môi trường vẩn đục, vi khuẩn không có
khả năng hình thành nha bào môi trường vẫn trong suốt. Chúng tôi sử dụng
chủng vi khuẩn E. coli làm đối chứng bởi vì theo tài liệu thì vi này không có
khả năng hình thành nha bào. Đối chứng khác là môi trường Fluid
Thyoglycolate.