Khảo sát đặc điểm di truyền liên quan đến tính kháng thuốc và độc lực của các chủng streptococcus suis serotype 2 phân lập từ bệnh nhân và heo tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


NGUYỄN THANH TÒNG


KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN LIÊN QUAN ĐẾN
TÍNH KHÁNG THUỐC VÀ ĐỘC LỰC CỦA CÁC CHỦNG
STREPTOCOCCUS SUIS SEROTYPE 2 PHÂN LẬP
TỪ BỆNH NHÂN VÀ HEO TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGÔ THỊ HOA


Thành phố Hồ Chí Minh–Năm 2012


Lời cảm ơn

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với TS. Ngô Thị Hoa,
người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành
luận văn này.
Tiếp theo, tôi xin cảm ơn ThS. Trần Thị Bích Chiêu, một người chị luôn luôn

nhiệt tình và tận tâm trong việc hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn đến tất cả thầy cô khoa Sinh trường Đại học Khoa học tự nhiên đã
dạy tôi trong suốt quá trình đại học và cao học.
Xin cảm ơn Đơn vị nghiên cứu lâm sàng – Trường Đại học Oxford, Bệnh
viện Bệnh nhiệt đới, các anh chị trong nhóm Microbiology và các anh chị trong
những nhóm khác ở OUCRU đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận
văn.
Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn đối với ba mẹ vì đã cho con sức
mạnh, động lực và niềm tin để con hoàn thành khóa học này.

Tháng 09 – 2012
Nguyễn Thanh Tòng


Trang 1


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

MỞ

ĐẦU
Streptococcus suis gây ra hàng loạt các bệnh trên người và heo như viêm
màng não, nhiễm trùng máu, viêm nội tâm mạc, viêm phổi và viêm khớp. Tại Việt
Nam, tình hình nhiễm Streptococcus suis ở người đang có xu hướng gia tăng trong
những năm gần đây, chủ yếu tập trung tại những khu vực chăn nuôi heo. Đồng thời
với phát triển chăn nuôi trong nông nghiệp, kháng sinh được sử dụng một cách rộng
rãi nhưng chưa được quản lý chặt chẽ. Do đó, tính kháng thuốc trên các chủng phân
lập từ heo sẽ ảnh hưởng đến quá trình điều trị bệnh ở người.
Mặt khác, không phải chủng nào trên heo cũng gây bệnh cho người. Quá

trình sinh bệnh của Streptococcus suis phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố độc lực và
yếu tố vật chủ. Tại Việt Nam, chưa có khảo sát nào so sánh độc lực giữa các chủng
phân lập từ người với các chủng phân lập từ heo.
Chính vì vậy, với mong muốn hiểu rõ hơn về tình hình kháng thuốc và các
yếu tố độc lực, tôi đã thực hiện đề tài:
“Khảo sát đặc điểm di truyền liên quan đến tính kháng thuốc và độc lực
của các chủng Streptococcus suis serotype 2 phân lập từ bệnh nhân và heo tại
Việt Nam”.





Trang 2


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

 Mục tiêu nghiên cứu
− Khảo sát tính kháng thuốc và cơ chế kháng của các chủng Streptococcus suis
phân lập từ bệnh nhân và heo.
− Khảo sát các gen độc lực của Streptococcus suis, từ đó biết được kiểu gen
thường gây bệnh cho người và heo đang lưu hành tại Việt Nam.
Mục tiêu phụ:
So sánh tính kháng thuốc và đặc điểm di truyền của các chủng Streptococcus
suis phân lập từ người và heo nhằm khảo sát sự tương đồng giữa các chủng.

 Ý nghĩa đề tài
− Cung cấp những thông tin về tình hình kháng thuốc, từ đó góp phần vào quá
trình phòng và điều trị bệnh nhiễm Streptococcus suis ở người và heo.

− Hiểu thêm về bệnh học nhiễm S. suis trên người và heo.
− Ngoài ra, đề tài cũng một phần nào giúp chúng ta hiểu rõ hơn về nguồn gốc
lây nhiễm Streptococcus suis ở người từ heo bệnh hay heo khỏe mang trùng.








Trang 3


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

1. Giới thiệu chung về Streptococcus suis
1.1. Phân loại
Vào thập niên 1950, tại Anh và Hà Lan, các nhà nghiên cứu thuộc ngành thú
y đã phát hiện được một tác nhân thuộc nhóm Streptococcus gây viêm màng não và
viêm khớp ở heo. Đây là liên cầu khuẩn được xếp vào nhóm D theo phân loại của
Lancefield và được đặt tên là Streptococcus suis (theo tiếng La-tinh “suis” nghĩa là
heo).
Năm 1987, Kilpper-Bälz và Schleifer đã phân loại Streptococcus suis như
sau:
Giới Vi khuẩn
Ngành Firmicutes
Lớp Bacilli
Bộ Lactobacillales
Họ Streptococcaceae

Giống Streptococcus
Loài Streptococcus suis
Streptococcus suis (S. suis) hay liên cầu khuẩn heo là cầu trùng gram dương,
dạng liên cầu nhưng đôi khi ở dạng đơn hoặc dạng đôi, kỵ khí tùy ý, mọc trên môi
trường thạch máu ở 37
0
C và 5 – 10% CO
2
. Trên môi trường thạch máu, S. suis tạo
khuẩn lạc nhỏ, màu xám với đường kính 0,5 – 1 mm. S. suis sản xuất yếu tố dung
huyết kiểu alpha trên môi trường thạch máu cừu và yếu tố dung huyết kiểu beta trên
môi trường thạch máu ngựa [51].
Đến nay, bộ gen S. suis đã được giải trình tự hoàn toàn có kích thước khoảng
2.007.491 bp với tỷ lệ GC là 41,3%. Trong đó, khoảng 20 – 30% số lượng gen vẫn
chưa biết rõ chức năng. Do đó, các nhà nghiên cứu đề nghị rằng chúng có liên quan
đến các yếu tố độc lực và quá trình phát sinh bệnh [34].
Trang 4


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

Dựa vào kháng nguyên vỏ nang, S. suis được chia thành 35 serotype khác
nhau, được đánh số từ 1 đến 34 và serotype ½. S. suis serotype ½ là chủng thể hiện
kết quả dương tính với cả hai phản ứng ngưng kết kháng huyết thanh đặc hiệu cho
serotype 1 và serotype 2 [25]. Chỉ một vài trong số 35 serotype chịu trách nhiệm
gây bệnh ở heo bao gồm các serotype 1, 2, 3, 7, 8, 9 và 14 [38], [64]. Trong đó, S.
suis serotype 2 (S. suis 2) là độc lực nhất do nó được phân lập thường xuyên nhất
trên bệnh nhân và heo bệnh [20], [34]. Gần đây, dựa vào kết quả phân tích trình tự
gen chaperonin 60 (cpn60) và 16S rRNA, một số nghiên cứu cho rằng S. suis
serotype 32 và serotype 34 là thuộc loài Streptococcus orisratti [26].

1.2. Dịch tễ học
1.2.1. Con đường lây nhiễm
S. suis thường cư trú ở đường hô hấp trên (amidan và xoang mũi), đường
tiêu hóa và đường sinh sản (heo nái). Sự cư trú ấy đóng một vai trò quan trọng trong
quá trình lây truyền S. suis trong đàn heo [34]. Thông thường, S. suis dễ dàng lây
truyền giữa các con heo với nhau thông qua sự tiếp xúc. Trong đó, heo mang trùng
hoặc heo bệnh là nguồn lây nhiễm chính cho cả đàn. Heo nái thường truyền vi trùng
cho con trong quá trình sinh sản và giai đoạn nuôi con. Phân, chất độn chuồng, các
loại thực phẩm và nước uống có thể trở thành nguồn lây nhiễm thứ cấp [51]. Bên
cạnh đó, S. suis cũng có thể được lây truyền trên diện rộng từ trại này sang trại khác
thông qua đường không khí và các thể mang như ruồi và chuột [5], [13], [63].
Nghiên cứu về khả năng sống sót của S. suis 2, Clifton Hadley đã khảo sát
chúng trong các điều kiện khác nhau về môi trường, nhiệt độ và thời gian. Kết quả
cho thấy rằng S. suis có thể sống ở 60
0
C trong 10 phút, 50
0
C trong 2 giờ và đến 6
tuần trong xác súc vật ở 10
0
C. Ở 0
0
C, liên cầu khuẩn heo có thể tồn tại trong bụi 1
tháng và trong phân hơn 3 tháng. Trong khi đó, ở 25
0
C , chúng chỉ có thể sống được
24 giờ trong bụi và 8 ngày trong phân [9]. Tuy nhiên, S. suis dễ dàng bị tiêu diệt
bằng chất sát trùng hay cồn 70% [34].
Trang 5

Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

1.2.2. Tình hình nhiễm S. suis trên heo
Heo ở bất kỳ lứa tuổi nào cũng có thể nhiễm S. suis. Khả năng nhiễm và gây
bệnh của vi khuẩn ở heo con cao hơn heo trưởng thành. Khoảng 81% heo sau cai
sữa (4 đến 10 tuần tuổi) nhiễm S. suis nhưng không phải tất cả đều phát sinh bệnh,
chỉ một số ít trong chúng mang chủng có khả năng gây bệnh [11]. Heo bệnh thường
tập trung trong giai đoạn sau cai sữa vì đây là giai đoạn heo con không còn nhận
kháng thể bảo vệ từ sữa mẹ. Dấu hiệu heo bệnh do nhiễm S. suis là sốt (có thể lên
đến 42
0
C), biếng ăn, suy nhược, đi đứng khập khiễng, khó thở, nổi ban đỏ và
thường chết một cách đột ngột [10]. Tỷ lệ chết trong đàn có thể lên đến 20% nếu
tình trạng vệ sinh chuồng trại kém, thiếu các biện pháp phòng ngừa và điều trị [11].
Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của TS. Ngô Thị Hoa và cộng sự về tình hình
mang trùng ở heo, kết quả phân lập được 317 chủng S. suis thuộc nhiều serotype
khác nhau. Trong đó, các chủng thuộc serotype 2 chiếm tỷ lệ cao nhất khoảng
14,2% [27]. Trong tình trạng mang trùng, S. suis có thể gây bệnh khi gặp các điều
kiện thuận lợi như cơ thể vật chủ bị suy yếu do mắc các bệnh truyền nhiễm khác.
Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng sự nhiễm virus gây hội chứng rối loạn
sinh sản và hô hấp (PRRSV) sẽ làm tăng tính mẫn cảm của heo đối với S. suis [14].
1.2.3. Tình hình nhiễm S. suis ở người trên thế giới và tại Việt Nam
Vào năm 1968, trường hợp nhiễm S. suis ở người được mô tả đầu tiên tại
Đan Mạch. Sau đó, bệnh do S. suis được ghi nhận như một bệnh lây truyền từ động
vật sang người tại nhiều nước trên thế giới. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể thông
qua vết thương trên da hoặc qua niêm mạc của khoang mũi miệng. Bệnh nhân
nhiễm S. suis được tìm thấy thường xuyên hơn ở các vùng nuôi heo tập trung.
Những người làm nghề chăn nuôi, giết mổ và bán thịt heo có nguy cơ nhiễm S. suis
cao gấp 1500 lần so với những người làm các nghề khác [20].

Trang 6


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

Tình hình nhiễm S. suis ở người đang có xu hướng gia tăng trong khoảng 10
năm gần đây. Điển hình như trận dịch vào năm 2005 tại tỉnh Tứ Xuyên (Trung
Quốc) với 215 người nhiễm S. suis, trong đó có 38 người tử vong [20]. Trận dịch
này đã thu hút mối quan tâm rất lớn của các nhà khoa học và cộng đồng trên thế
giới về tác nhân gây bệnh này. Theo số liệu thống kê (tính đến năm 2008) về tình
hình nhiễm S. suis ở người trên thế giới đã có khoảng hơn 800 ca. Hầu hết các ca
nhiễm chủ yếu tập trung tại khu vực Đông Á như Trung Quốc, Việt Nam và Thái
Lan (Hình 1.1) [62].

Hình 1.1: Tình hình người nhiễm Streptococcus suis trên thế giới chủ yếu tập
trung tại các khu vực chăn nuôi heo [62].
Tại Việt Nam, theo báo cáo tổng kết của bệnh viện Bệnh nhiệt đới, trong 10
năm gần đây, số trường hợp nhiễm liên cầu khuẩn heo ngày càng gia tăng. Giai
Trang 7


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

đoạn từ năm 1996 đến 1998, mỗi năm chỉ ghi nhận được khoảng 3 bệnh nhân. Từ
năm 1999 đến năm 2003, trung bình mỗi năm là 13 trường hợp. Trong năm 2004 có
đến 19 trường hợp. Tính đến tháng 7/2007, tổng số bệnh nhân nhiễm Streptococcus
suis là khoảng 230 trường hợp. Theo nghiên cứu thực hiện tại bệnh viện Bệnh nhiệt
đới thành phố Hồ Chí Minh về viêm màng não mủ ở người thì S. suis là tác nhân
gây bệnh hàng đầu chiếm 33,6% so với những vi khuẩn gây viêm màng não khác
[35].

Hầu hết các trường hợp viêm màng não mủ trên thế giới và Việt Nam chủ
yếu do S. suis serotype 2 gây ra. Bên cạnh đó, S. suis thuộc những serotype như 4,
14 và 16 cũng gây bệnh cho người nhưng chiếm một tỷ lệ rất thấp [3], [23], [39].
1.3. Các yếu tố độc lực
S. suis dễ dàng xâm nhiễm và gây bệnh là nhờ vào các yếu tố độc lực như
polysaccharide vỏ nang, suilysin, hệ thống truyền tín hiệu hai thành phần
SalK/SalR Chúng giúp vi khuẩn chống lại hệ miễn dịch của ký chủ. Do đó, việc
nghiên cứu các yếu tố độc lực sẽ làm sáng tỏ cơ chế sinh bệnh của vi khuẩn.
1.3.1. Polysaccharide vỏ nang
Khi S. suis xâm nhập vào mô hoặc dòng máu, chúng sẽ đối mặt với những tế
bào thuộc hệ thống miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thích ứng. Tuy vậy, thực tế lại
không có sự hiện diện những kháng thể đặc hiệu. Điều đó cho thấy rằng S. suis có
thể kháng lại quá trình thực bào và tồn tại dai dẳng với nồng độ cao trong máu, dẫn
đến hậu quả nhiễm trùng máu, sốc độc tố và viêm nhiễm tại các cơ quan. Sự tồn tại
đó của vi khuẩn phụ thuộc rất lớn vào sự tổng hợp polysaccharide vỏ nang. Những
thí nghiệm in vitro và in vivo về những chủng đột biến gen cps (capsular
polysaccharide), kết quả cho thấy rằng sự vắng mặt polysaccharide vỏ nang làm
tăng tính thực bào và vi khuẩn nhanh chóng bị loại khỏi dòng máu [44], [47]. Như
Trang 8


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

vậy, vỏ nang đóng một vai trò rất quan trọng trong việc giúp vi khuẩn thoát khỏi các
tế bào thuộc hệ thống miễn dịch.
Thành phần polysaccharide vỏ nang được cấu tạo từ 5 loại đường: galactose,
glucose, rhamnose, N-acetyl galactosamine và acid sialic (acid N-acetyl
neuraminic). Vỏ nang serotype 1 khác serotype 2 về đường N-acetyl glucosamine
thay cho rhamnose [12]. Vỏ nang S. suis tương tự Streptococcus nhóm B đều chứa
gốc acid sialic. Acid sialic ở Streptococcus nhóm B liên kết 2-3 với galactose nhưng

liên kết 2-6 ở S. suis [54]. Đối với Streptococcus nhóm B, acid sialic có tác dụng
ngăn cản việc bám protein C3, do đó hoạt hóa bổ thể theo con đường tắt bị khóa lại.
Vai trò như thế vẫn chưa được chứng minh đối với S. suis. Bên cạnh đó, acid sialic
liên kết 2-6 với galactose của vỏ nang S. suis serotype 2 và 14 tương tự epitope
đường hiện diện trên bề mặt các tế bào động vật hữu nhũ [19]. Điều này dẫn đến
việc hệ thống miễn dịch không nhận diện được kháng nguyên. Thực tế, các kết quả
nghiên cứu cho thấy vỏ nang S. suis 2 có tính miễn dịch nguyên rất kém ở heo [2].
Mặc dù polysaccharide vỏ nang đóng vai trò quan trọng trong tính độc lực
nhưng hầu hết chủng không độc lực vẫn có vỏ nang. Điều đó cho thấy tính độc của
S. suis không chỉ đơn thuần dựa vào vỏ nang mà còn phụ thuộc vào những yếu tố
độc lực khác.
1.3.2. Suilysin
S. suis có thể dễ dàng xâm lấn vào tế bào biểu mô và ngăn cản thực bào nhờ
vào suilysin. Đây là protein ngoại bào có khối lượng phân tử khoảng 54 kDa được
mã hóa bởi gen sly. Gen sly hiện diện hầu hết trong các serotype. Trong đó S. suis
serotype 2 mang gen sly chiếm khoảng 95% các chủng phân lập ở châu Âu và châu
Á nhưng chỉ chiếm 7% các chủng phân lập ở Bắc Mỹ [43]. Suilysin thuộc họ độc tố
ly giải tế bào bằng cách tạo các lỗ trên màng thông qua việc gắn vào nhóm chức
thiol của cholesterol. Bên cạnh đó, suilysin mất hoạt tính trong điều kiện oxy hóa và
có hoạt tính trở lại sau khi thêm những tác nhân khử. Những thành viên được biết
Trang 9


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

nhiều nhất của họ độc tố này gồm streptolysin O, listeriolysin O, perfringolysin O
và pneumolysin. Tất cả chúng đều chứa trình tự gồm 11 peptide bảo tồn
(ECTGLAWEWWR) định vị gần đầu C. Trình tự này đóng vai trò nhận diện thụ
thể và hoạt tính ly giải [6]. Về đặc điểm di truyền, suilysin có độ tương đồng cao
với pneumolysin của Streptococcus pneumoniae [30].

Ngoài việc phá hủy những tế bào biểu mô và những tế bào thuộc hệ miễn
dịch, suilysin còn phóng thích hemoglobin do ly giải tế bào hồng cầu. Sự hiện diện
của hemoglobin cùng với thành phần vách tế bào tạo nên phản ứng viêm rất mạnh
mẽ bằng cách kích thích đại thực bào và tế bào bạch cầu sản xuất những cytokine
gây viêm như TNF-α, IL-1β, IL-6 và IL-12. Sự tiết quá nhiều cytokine nếu không
được kiểm soát sẽ dẫn đến hiện tượng sốc nhiễm trùng. Ngoài ra, những cytokine
này còn tham gia vào quá trình gây viêm màng não như IL-1β giúp tăng cường tính
thấm của hàng rào máu não nên vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào hệ thần kinh trung
ương, TNF-α thúc đẩy sự viêm tại không gian gần màng nhện và nồng độ IL-6
trong dịch não tủy cao có nguy cơ dẫn đến tử vong [53].
Tuy nhiên, vào năm 2003, Lun và cộng sự đã tiến hành khảo sát vai trò của
suilysin trên heo bằng cách sử dụng những chủng đột biến gen sly nhưng kết quả
không có sự giảm độc tính [33]. Hơn nữa, hầu hết chủng phân lập từ bệnh nhân và
heo bệnh tại Bắc Mỹ không chứa gen sly [7], [43]. Do đó, suilysin không phải là
yếu tố độc lực duy nhất và mang tính phổ quát của S. suis 2.
1.3.3. Protein phóng thích muramidase (muramidase released protein –
MRP) và yếu tố protein ngoại bào (extracellular protein factor – EF)
Vecht và cộng sự đã nghiên cứu protein của các chủng S. suis 2 phân lập từ
heo mang trùng và heo bệnh, kết quả cho thấy khoảng 77% chủng phân lập từ heo
bệnh chứa protein phóng thích muramidase (MRP) và yếu tố protein ngoại bào (EF)
nhưng khoảng 86% chủng phân lập từ heo mang trùng không chứa cả 2 protein trên.
Những chủng có kiểu hình MRP
+
EF
+
có tiềm năng độc lực hơn so với những chủng
Trang 10


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

MRP
−
EF
−
. Do đó, ông đề nghị rằng hai loại protein này liên quan đến tính độc lực
của S. suis 2 [58].
Protein phóng thích muramidase được mã hóa bởi gen mrp là protein liên
quan đến thành phần vách tế bào, có khối lượng phân tử khoảng 136 kDa và được
phóng thích trong suốt quá trình tăng trưởng của vi khuẩn. Trái lại, yếu tố protein
ngoại bào chỉ được phát hiện trong dịch nổi nuôi cấy, do gen epf mã hóa và có khối
lượng phân tử khoảng 110 kDa. Các chủng độc lực khác nhau sẽ sản xuất các loại
MRP và EF khác nhau. Đến nay, các nhà nghiên cứu đã phát hiện thêm các protein
biến thể của MRP bao gồm MRP
S
(120 kDa), MRP* (145 kDa) và MRP** (155
kDa) [46]. Tương tự, EF có đến 5 biến thể bao gồm 155 kDa, 160 kDa, 175 kDa,
180 kDa và 190 kDa (Hình 1.2). Những biến thể này được gọi chung là protein EF*.
Những protein EF* có chứa thêm các đoạn acid amin lặp lại so với protein EF.
Những chủng sản xuất protein EF* thường là những chủng độc lực yếu hoặc không
gây bệnh [48]. Do đó, sự vắng mặt của các đoạn acid amin lặp lại trong protein EF
có liên quan đến tính độc lực. Kết quả nghiên cứu về những chủng đột biến mất khả
năng tổng hợp hai loại protein MRP và EF cho thấy chúng vẫn độc lực như những
chủng hoang dại [50].
Mặc dù gen mã hóa protein EF và MRP đã được tạo dòng và mô tả nhưng
những trình tự acid amin không cung cấp thông tin gì về những chức năng có thể
của chúng [49]. Vaccine tiểu đơn vị chứa EF và MRP có thể bảo vệ heo khỏi những
chủng có kiểu hình MRP
+
EF

+
[65]. Tuy nhiên, vaccine dạng này không hữu ích đối
với những chủng độc lực ở Bắc Mỹ vì những chủng này không biểu hiện MRP và
EF [17], [18].
Trang 11


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng


Hình 1.2: Sự hiện diện các đoạn lặp lại trong trình tự của các EF* và EF.
(R1 đến R11 là những đoạn lặp lại. E: EcoRV, P: PstI, S: SnaBI)
[48]
1.3.4. Hệ thống truyền tín hiệu hai thành phần SalK/SalR
Lịch sử y học thế giới đã từng chứng kiến hai trận dịch lớn do S. suis 2 gây
ra tại tỉnh Giang Tô (1998) và tỉnh Tứ Xuyên (2005) ở Trung Quốc. Ngoài viêm
màng não và nhiễm trùng huyết, một tỷ lệ lớn các bệnh nhân trong hai trận dịch này
có biểu hiện hội chứng sốc độc tố (toxic shock like syndrome). Đây chính là điểm
khác biệt so với những bệnh nhân nhiễm S. suis ở những nơi khác. Năm 2007, Chen
và cộng sự đã phát hiện được đảo gen độc lực 89K (PAI - pathogenicity island) chỉ
hiện diện trong những chủng phân lập từ hai trận dịch tại Trung Quốc [8]. Những cơ
Trang 12


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

chế phân tử như quorum sensing, hệ thống truyền tín hiệu hai thành phần và hệ
thống vận chuyển ABC thường liên quan đến đảo gen độc lực này. Do vậy, đảo gen
độc lực có thể đáp ứng lại những tín hiệu đối với môi trường bên ngoài và thực hiện
các chức năng then chốt góp phần vào độc lực của tác nhân gây bệnh. Phân tích

trình tự cho thấy đảo gen độc lực 89K chứa một vùng trình tự tương đồng với hệ
thống truyền tín hiệu hai thành phần SalK/SalR của Streptococcus salivarius [32].

Hình 1.3: Mô tả đặc điểm của hệ thống truyền tín hiệu hai thành phần
SalK/SalR.
A) Hệ thống truyền tín hiệu hai thành phần SalK/SalR định vị trên đảo gen độc lực
89K. B) Tỷ lệ GC của salKR thấp hơn nhiều so với đảo gen độc lực 89K và toàn bộ bộ gen S. suis

[32].
Hệ thống truyền tín hiệu hai thành phần hoạt động theo cơ chế cảm biến
(histidine kinase gắn màng) và đáp ứng (protein gắn DNA) giúp vi khuẩn thích nghi
và tồn tại trong những điều kiện môi trường khác nhau. Histidine kinase tự
phosphoryl hóa khi tiếp nhận những thay đổi của môi trường và chuyển nhóm
phosphat cho thành phần thứ hai – protein điều hòa đáp ứng. Khi bị phosphoryl hóa,
Trang 13


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

protein điều hòa đáp ứng thay đổi cấu hình và trở nên có hoạt tính kích thích hoặc
ức chế biểu hiện gen mục tiêu [52].
Ở S. suis, hệ thống truyền tín hiệu hai thành phần SalK/SalR bao gồm protein
cảm biến được mã hóa bởi gen salK (histidine kinase) và protein điều hòa đáp ứng
được mã hóa bởi gen salR. Phân tích trình tự cho thấy tỷ lệ GC của SalK/SalR rất
thấp so với đảo gen độc lực 89K và toàn bộ bộ gen của vi khuẩn. Chính vì vậy, hệ
thống này được xem là có nguồn gốc ngoại lai và được thu nhận trong quá trình
chuyển gen theo chiều ngang (Hình 1.3).
Để hiểu rõ vai trò của SalK/SalR trong tính độc lực, năm 2008, Ming Li và
cộng sự đã tiêm những chủng S. suis 2 đột biến gen salKR vào heo, kết quả cho thấy
heo không bị chết nhưng chủng đột biến lại mất khả năng cư trú tại mô so với chủng

hoang dại. Hơn nữa, SalK/SalR có thể kiểm soát tính độc lực của S. suis 2 bằng
cách điều hòa biểu hiện gen ở mức độ trên toàn bộ bộ gen [32].

Hình 1.4: Sự khác biệt về trình tự promoter salKR giữa chủng S. suis phân lập
tại Việt Nam với chủng S. suis phân lập tại Trung Quốc.
(P1: promoter salKR Trung
Quốc, P2: promoter salKR Việt Nam)
Trang 14


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

Theo nghiên cứu của TS. Ngô Thị Hoa và cộng sự, vùng upstream của salKR
đối với các chủng phân lập tại Việt Nam bị mất một đoạn khoảng 5 Kb bao gồm
promoter salKR so với các chủng phân lập tại Trung Quốc (kết quả chưa công bố).
Do đó, nhóm nghiên cứu đã xác định một promoter tiềm năng cho salKR đối với
các chủng phân lập tại Việt Nam (Hình 1.4).
1.4. Quá trình sinh bệnh của S. suis
1.4.1. Khu trú tại đường hô hấp trên và xâm nhập vào tế bào biểu mô
của ký chủ
S. suis có thể tồn tại dai dẳng và thoát khỏi hệ thống miễn dịch của heo sau
khi xâm nhập và cư ngụ tại amidan. Ở amidan, S. suis khu trú trong những hốc được
hình thành bởi tế bào biểu mô thuộc mô lympho lõm sâu vào [42].
Miễn dịch qua trung gian IgA đóng một vai trò quan trọng trong việc chống
lại những tác nhân gây bệnh xâm nhập qua biểu mô màng nhầy. Tuy nhiên, S. suis
có khả năng sản xuất IgA1 protease nên chúng có thể thoát khỏi hệ thống bảo vệ
này. Những chủng đột biến mất khả năng sản xuất IgA1 protease giảm độc lực một
cách đáng kể và không gây chết heo. Ngoài ra, vi khuẩn còn lợi dụng sự phóng
thích những phân đoạn Fab từ sự phân cắt IgA để tăng cường tính kỵ nước trên bề
mặt nhằm giúp cho việc bám vào tế bào chủ tốt hơn [61], [66].

Sau khi thoát khỏi miễn dịch qua trung gian IgA, liên cầu khuẩn heo tương
tác với tế bào biểu mô và những protein chất nền ngoại bào thông qua những
protein bám dính. Những protein này hiện diện trên bề mặt của S. suis dường như bị
cản trở bởi polysaccharide vỏ nang vì những chủng đột biến mất vỏ nang bám dính
tốt hơn so với những chủng hoang dại [4]. Do vậy, một giả thuyết cho rằng S. suis
giảm điều hòa biểu hiện polysaccharide vỏ nang trong suốt giai đoạn đầu của quá
trình xâm nhiễm để sự tương tác giữa protein bám dính và thụ thể tế bào chủ tốt hơn
[15].
Trang 15


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

Liên cầu khuẩn heo có thể gắn vào fibronectin và fibrinogen của người trong
những thí nghiệm in vitro thông qua protein gắn fibronectin Fbps (fibronectin
binding protein). Tuy nhiên, những chủng đột biến fbps không có giảm sự gắn vào
fibronectin của người. Điều đó đề nghị rằng protein này được sản xuất dư thừa
nhằm mục đích tương tác với những protein chất nền ngoại bào. Những thí nghiệm
trên heo với chủng đột biến fbps cho thấy Fbps không cần thiết trong việc khu trú ở
hạch amidan nhưng nó lại đóng một vai trò quan trọng trong việc khu trú tại những
cơ quan chuyên biệt liên quan đến sự nhiễm S. suis [21]. Bên cạnh đó, enolase S.
suis không chỉ gắn vào plasminogen mà còn cả fibronectin. Enolase biểu hiện cao
trong in vivo và cảm ứng sản xuất kháng thể ở heo nhiễm. Dipeptidylpeptidase
DppIV sản xuất bởi liên cầu khuẩn heo cũng tương tác với fibronectin người và
chủng đột biến dppIV cho thấy có sự giảm độc lực. Hơn nữa, những protein như
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconate dehydrogenase,
amylopullulanase và glutamine synthetase cũng góp phần vào sự bám dính của S.
suis đối với tế bào biểu mô [15]. Ngoài ra, trong giai đoạn đầu của quá trình xâm
nhiễm, suilysin đóng vai trò quan trọng trong quá trình phá vỡ tế bào biểu mô giúp
vi khuẩn xâm nhập sâu vào trong mô (Hình 1.5).

Trang 16


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

Hình 1.5: Sự tương tác giữa Streptococcus suis với tế bào biểu mô và những
protein chất nền ngoại bào [15].
1.4.2. Tồn tại trong máu và lan tràn đến các cơ quan
Một khi xâm nhập sâu vào trong mô hoặc dòng máu, vi khuẩn sẽ tăng điều
hòa biểu hiện polysaccharide vỏ nang và tất cả những protein liên quan đến quá
trình kháng lại đáp ứng miễn dịch (Hình 1.6).
Polysaccharide vỏ nang giúp vi khuẩn kháng lại thực bào. Một cơ chế khác
trong việc thoát khỏi đáp ứng miễn dịch là gắn vào đại thực bào thông qua acid
sialic. Sự tiết suilysin làm giảm thực bào bằng cách ly giải bạch cầu đơn nhân và
bạch cầu trung tính. S. suis cũng có thể ngăn cản sự chiêu mộ của bạch cầu trung
tính bằng cách phân hủy IL-8 nhờ vào serine protease SspA [55]. DNase neo trên
vách tế bào S. suis có hoạt tính phân cắt DNA mạch đôi hoặc mạch đơn [16]. Điều
này góp phần làm tăng thêm tính độc lực cho vi khuẩn trong việc phá vỡ “bẫy”
DNA của bạch cầu trung tính (neutrophil extracellular traps) [60]. Tuy nhiên, nếu bị
thực bào do hiện diện với một số lượng rất thấp thì S. suis vẫn còn sở hữu những
yếu tố khác góp phần kháng lại cơ chế giết nội bào như superoxide dismutase và hệ
thống arginine deiminase [22].

Trang 17


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

Hình 1.6: Streptococcus suis thoát khỏi đáp ứng miễn dịch bẩm sinh của tế bào

chủ [15].
Cuối cùng, S. suis theo dòng máu lan tràn đến các cơ quan trong cơ thể và
gây ra tình trạng viêm nhiễm như nhiễm trùng huyết, viêm nội tâm mạc, viêm phổi
và viêm khớp.
1.4.3. Xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương và gây viêm màng não
Nếu heo không chết do nhiễm trùng huyết hoặc hội chứng sốc độc tố nhưng
với sự hiện diện nồng độ cao trong máu, S. suis có thể gây viêm màng não. Để xâm
nhập được vào trung ương thần kinh, vi khuẩn tiếp tục vượt qua hàng rào máu – não
bao gồm xâm nhập vào mao mạch thuộc não và xâm nhập từ máu vào dịch não tủy
tại các đám rối mạch [15].
Nơi nối tiếp mạch máu ngoại vi với mao mạch não bộ và giữa mao mạch
thuộc não với đám rối mạch có tính thẩm thấu hạn chế (ở cả hai phía) do sự gắn kết
chặt chẽ của tổ chức gian bào. Khi tiếp xúc với các tế bào nội mạc thuộc đám rối
mạch, vi khuẩn xâm nhập và gây độc đồng thời làm tăng tính thẩm thấu của các
mao mạch. Những thí nghiệm in vitro cho thấy cơ chế xâm nhiễm của chúng tương
tự trên các tế bào của lợn và của người. Tuy vậy, các tế bào của lợn mẫn cảm hơn so
với dòng tế bào của người [56]. Nếu vi khuẩn xâm nhiễm thành công, chúng sẽ gây
viêm màng não.
1.5. Kháng sinh và vi khuẩn kháng kháng sinh
1.5.1. Kháng sinh
Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán
tổng hợp, tổng hợp. Kháng sinh có khả năng kìm hãm sự phát triển vi khuẩn hoặc
tiêu diệt vi khuẩn.

Trang 18


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

1.5.2. Cơ chế tác động của kháng sinh

Các cơ chế tác động của kháng sinh (Hình 1.7):
- Ức chế sự tổng hợp vách tế bào như penicillin, glycopeptide và
cephalosporin. Các loại kháng sinh trong những nhóm này tác động lên quá trình
tổng hợp vách tế bào nên vi khuẩn dễ dàng bị phá vỡ do sự thay đổi áp suất thẩm
thấu và bị các đại thực bào tiêu diệt.
- Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein:
 Aminoglycoside gắn vào thụ thể trên tiểu đơn vị 30S ribosome làm cho quá
trình dịch mã không chính xác.
 Tetracyclin gắn vào tiểu đơn vị 30S ribosome ức chế sự gắn aminoacyl-
tRNA vào vị trí tiếp nhận.
 Phenicol gắn vào tiểu đơn vị 50S ribosome ức chế enzyme
peptidyltransferase do đó ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi
polypeptide.
 Macrolide và lincosamide gắn vào tiểu đơn vị 50S ribosome ngăn cản quá
trình dịch mã.
- Ức chế sự tổng hợp acid nucleic:
 Quinolone ức chế DNA gyrase hoặc topoisomerase IV làm cho hai mạch của
DNA không thể duỗi xoắn dẫn đến việc ngăn cản quá trình nhân đôi DNA.
 Trimethoprim ức chế enzyme dihydrofolate reductase của vi khuẩn nên ức
chế tổng hợp acid tetrahydrofolic, tiền chất của thymidine monophosphate.
1.5.3. Vi khuẩn kháng kháng sinh
- Kháng tự nhiên:
 Vi khuẩn đã có sẵn tính kháng trước khi tiếp xúc với kháng sinh.
 Cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn không thấm với kháng sinh.
Trang 19


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

- Kháng mắc phải:

Vi khuẩn đang nhạy với kháng sinh nhưng sau một thời gian tiếp xúc, vi
khuẩn trở nên không nhạy với kháng sinh đó nữa, do:
 Đột biến hoặc kháng qua nhiễm sắc thể.
 Mọi vi khuẩn đều có protein đích để gắn kháng sinh tại ribosome, DNA
gyrase, RNA polymerase… nhưng do đột biến, các protein đích thay đổi và không
còn gắn kháng sinh nữa.
 Kháng qua plasmid: sản xuất các enzyme làm bất hoạt kháng sinh, sản xuất
các protein bảo vệ ribosome khỏi tác động của kháng sinh, thay đổi con đường
chuyển hóa hoặc giảm sự tích lũy kháng sinh nội bào bằng hệ thống bơm đẩy thuốc.
Vi khuẩn có thể kháng nhiều loại kháng sinh hơn thông qua plasmid. Vi khuẩn
kháng kháng sinh có thể phát triển sự kháng chéo với các kháng sinh trong cùng họ.

Hình 1.7: Cơ chế tác động của các họ kháng sinh.

Cell wall synthesis
Vancomycin
Bacitracin
Penicillin
Cephalosporin
Cell wall integrity
β-lactamase
DNA synthesis DNA gyrase
Metronidazole Quinolone
RNA polymerase
Rifampicin
Protein systhesis
(50S inhibitors)
Macrolide
Chloramphenicol
Lincosamide

Protein synthesis
(30S inhibitors)
Tetracycline
Streptomycin
Spectinomycin
Phospholipid membrane
Polymyxins

Trang 20


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

1.5.4. Các cơ chế kháng đối với tetracyclin ở Streptococcus
Cơ chế kháng tetracyclin ở Streptococcus phụ thuộc vào hai cơ chế chính: cơ
chế bảo vệ ribosome và cơ chế bơm tetracyclin ra khỏi tế bào. Những protein bảo vệ
ribosome thường được mã hóa bởi các gen tet(M) và tet(O), chúng có nhiệm vụ đẩy
tetracyclin ra khỏi ribosome để quá trình dịch mã được diễn ra liên tục. Cơ chế bơm
tetracyclin ra khỏi tế bào thông qua hệ thống bơm xuyên màng thường được mã hóa
bởi các gen tet(K) và tet(L).
Trong số các gen qui định tính kháng tetracyclin, gen tet(M) được phân bố
một cách rộng rãi nhất ở vi khuẩn Gram dương và Gram âm (42 giống vi khuẩn). Sự
phân bố này liên quan đến những yếu tố có khả năng tiếp hợp và sát nhập như ICE
(integrative and conjugative element) và transposon (họ Tn916 – Tn1545).
Transposon là những đoạn phân tử DNA có thể chèn vào tại một hoặc vài vị trí
trong bộ gen. Cấu trúc transposon bao gồm hai đầu chứa các trình tự lặp lại, bên
trong chứa các gen kháng thuốc và các gen cần thiết cho việc chuyển vị như gen xis
mã hóa excisionase có nhiệm vụ cắt DNA, gen int mã hóa integrase có nhiệm vụ sát
nhập và nối DNA. Những nghiên cứu trước đây cho thấy rằng gen tet(M) có mối
liên hệ mật thiết đối với transposon Tn916 [41] (Hình 1.8).

Hình 1.8: Mối liên hệ giữa tet(M) và transposon Tn916 [59].
(xis: excisionase, int: integrase)

Trang 21


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

1.5.5. Các cơ chế kháng đối với erythromycin ở Streptococcus
Cơ chế kháng kháng sinh erythromycin diễn ra theo hai cơ chế. Cơ chế thứ
nhất do gen erm(A) hoặc erm(B) mã hóa. Những rRNA methylase do các gen này
mã hóa sẽ methyl hóa 23S rRNA vi khuẩn, từ đó làm bất hoạt vị trí gắn của thuốc.
Cơ chế thứ hai là sự thải loại thuốc ra khỏi tế bào thông qua hệ thống bơm thuốc do
gen mef(A) hoặc mef(E) mã hóa.
1.6. Điều trị và phòng bệnh
1.6.1. Điều trị
Cho đến nay, chúng ta vẫn chưa có một phác đồ điều trị riêng biệt cho bệnh
nhiễm liên cầu khuẩn heo. Trên thực tế, liên cầu khuẩn vẫn còn nhạy với nhiều loại
kháng sinh được sử dụng để điều trị cầu trùng Gram dương. Do đó, nguyên tắc điều
trị bệnh nhiễm S. suis cũng tương tự như những trường hợp nhiễm Streptococcus
nói chung. Kháng sinh thường được lựa chọn trong việc điều trị bao gồm penicillin,
ampicillin và ceftriaxone. Trong đó, penicillin G là kháng sinh được sử dụng nhiều
nhất và được dùng phối hợp với corticoides [34].
Thời gian điều trị thông thường là 10 ngày. Đôi khi kéo dài đến 2 hoặc 3 tuần
tuỳ thuộc vào đáp ứng lâm sàng và cận lâm sàng (kết quả xét nghiệm dịch não tủy).
Đối với người lớn, penicillin G được sử dụng với liều lượng 4 triệu đơn vị mỗi 6
giờ (trẻ em – 400 ngàn đơn vị/kg/ngày), ampicillin 2g mỗi 4 giờ (trẻ em – 200
mg/kg/ngày), ceftriaxone 2g mỗi 12 giờ (trẻ em – 100 mg/kg/ngày) [34].
1.6.2. Các biện pháp phòng ngừa bệnh và dịch bệnh

Biện pháp phòng ngừa nhiễm S. suis ở người chủ yếu là kiểm soát dịch bệnh
ở heo. Trong đó, việc kiểm dịch trong chăn nuôi và giết mổ heo đóng một vai trò rất
quan trọng nhằm ngăn chặn sự lây lan từ heo sang người [34].
Trang 22


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

Việc sử dụng thuốc chủng ngừa nhiễm S. suis cho heo cũng đang được triển
khai một cách rộng rãi. Các vaccine được sử dụng bao gồm chủng ngừa và phun khí
dung gây miễn dịch niêm mạc để phòng ngừa nhiễm trùng hô hấp ở heo. Tuy nhiên,
hiệu quả vaccine vẫn chưa cao [34].
Hiện nay, chúng ta vẫn chưa có vaccine phòng bệnh cho người. Do đó, nhằm
ngăn chặn nhiễm bệnh cho người, bên cạnh việc phát hiện, tiêu diệt nguồn bệnh,
việc tuyên truyền giáo dục sức khoẻ cho người dân cũng cần được tăng cường, nhất
là trong thời điểm xảy ra dịch bệnh. Theo khuyến cáo của WHO chỉ nên sử dụng
thịt heo sau khi đã nấu chín trên 70
o
C.

Trang 23


Luận văn thạc sĩ HVTH: Nguyễn Thanh Tòng

(
−)

2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, tôi sử dụng 97 chủng Streptococcus suis serotype 2
được phân lập từ người và heo bao gồm:
- 22 chủng được phân lập vào tháng 03/2009 từ mẫu amidan của heo khỏe.
Những mẫu amidan này được thu nhận từ heo đã được kiểm tra sức khỏe trước khi
đem đến các cơ sở giết mổ ở tỉnh Tiền Giang.
- 17 chủng được phân lập từ các cơ quan như tim, gan, phổi, lách, máu và não
của heo nhiễm S. suis, trong đó gồm có 5 chủng ở Hà Nội (tháng 03/2007), 2 chủng
ở Bắc Giang(tháng 04/2007), 3 chủng ở Đồng Nai (tháng 02/2009), 4 chủng ở Sóc
Trăng (tháng 07/2010) và 3 chủng ở Tiền Giang (tháng 08/2010).
- 58 chủng được phân lập từ dịch não tủy và máu của những bệnh nhân nhiễm
S. suis điều trị tại bệnh viện Bệnh nhiệt đới (thành phố Hồ Chí Minh) từ tháng
03/2009 đến tháng 12/2010 ở các tỉnh miền nam Việt Nam.
2.2. Cách bố trí thí nghiệm

97 chủng
S. suis 2
Kháng sinh đồ:
SXT, CHL, LEV, ENR,
MAR, OFX, ERY, TET,

AMI, CRO, FEP, AMX,
PEN, AMP, VAN, CLI
và SPT
MP-PCR:
tet(M), tet(O),
tet(L) và tet(K)
PCR: Tn916
và tetM-rev-2
[tet(M) (+)]
MP-PCR:
erm(B), erm(A)
và mef(A/E)
MP-PCR: cps2J,
sly, epf và mrp
Giải trình tự:
những gen epf
biến thể
PCR: phát hiện
biến thể mrp
PCR: salKR
PCR: promoter
SalK/SalR
(Trung Quốc)
PCR: promoter
SalK/SalR
(Việt Nam)