PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ VÚ NGƯỜI VIỆT NAM VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM

9. Pham PV, Vu NB, Duong TT, Nguyen TT, Truong NH,
Phan NLC, Vuong TG, Pham VQ, Nguyen HM, Nguyen KT,
Nguyen NT, Nguyen KG, Khat LT, Le DV, Truong KD, Phan NK
(2012) “Suppression of human breast tumors in NOD/SCID mice by
CD44 shRNA gene therapy combined with doxorubicin treatment”.
OncoTargets and Therapy 2012(5), pp.77-84.
!






ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




PHẠM VĂN PHÚC




PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO
GỐC UNG THƯ VÚ NGƯỜI VIỆT NAM VÀ BƯỚC
ĐẦU ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM

Chuyên ngành: Sinh lý Ngườ i và Động vật
Mã số: 62 42 30 01




TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC











Tp. Hồ Chí Minh năm 2012
!

Công trình được hoàn thành tại
PTN Nghiên cứu và Ứng dụ ng Tế bào gốc, Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp.HCM

Người hướng dẫn khoa học:
GS.TS. Trương Đình Kiệt
TS.BS. Lê Văn Đông

Phản biện 1: GS.TS. Trần Linh Thước
Phản biện 2: GS.TS. Nguyễn Sào Trung
Phản biện 3: TS. Huỳnh Nghĩa
Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Trần Cát Đông
Phản biện độc lập 2: TS. Nguyễn Đăng Quân



Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp cơ sở đào
tạo họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia
Tp.HCM vào hồi 14 giờ 00 ngày 16 tháng 11 năm 2012.

Có thể tìm hiểu luận án này tại thư viện:
1. Thư viện Khoa học Tổ ng hợp Tp.HCM
2. Thư viện Trường Đại học KHTN, Đại học Quốc gia
Tp.HCM





DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC
1. Phạm Vă n Phúc, Lê Thành Trung, Trương Hải Nhung,
Vương Gia Tuệ, Dương Thanh Thủy, Phan Kim Ngọc (2010) “Thu
nhận tế bào ung thư từ khối u vú”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 8(4),
tr.1775-1783.
2. Phạm Văn Phúc, Chi Jee Hou, Lê Văn Đông, Trương Đình
Kiệt, Phan Kim Ngọc (2010) “Biệt hóa in vitro tế bào đơn nhân từ
máu cuống rốn người thành tế bào tua”, Tạp chí Công nghệ sinh học,

8(3B), tr.1111-1120.
3. Pham Van Phuc, Tran Thi Thanh Khuong, Le Van Dong,
Truong Dinh Kiet, Tran Tung Giang and Phan Kim Ngoc (2010).
“Isolation and characterization of breast cancer stem cells from
malignant tumours in Vietnamese women”, Journal of Cell and
Animal Biology, 4(12), pp.163–16.
4. Pham Van Phuc, Siah Chia Keng, Nguyen Thi Minh
Nguyet, Duong Thanh Thuy, Phan Kim Ngoc (2010). “Isolation and
comparison of tumorigenicity of different cell population in MCF-7
breast cancer cell line based on CD44 and CD24 markers”, Journal
of Biotechnology, 8(4), pp.13-19.
5. Phuc PV, Lam DH, Ngoc VB, Thu DT, Nguyet NTM, Ngoc
PK (2011) “Production of functional dendritic cells from menstrual
blood—a new dendritic cell source for immune therapy”, In Vitro
Cell Dev Biol Anim, 47(5-6), pp.368-375.
6. Pham Van Phuc, Chi Jee Hou, Nguyen Thi Minh Nguyet,
Duong Thanh Thuy, Le Van Dong, Truong Dinh Kiet and Phan Kim
Ngoc (2011) “Effects of breast cancer stem cell extract primed
dendritic cell transplantation on breast cancer tumor murine
models”, Annual Review & Research in Biology, 1(1), pp.1-13.
7. Phuc PV, Nhan PLC, Nhung TH, Tam NT, Hoang NM, Tue
VG, Thuy DT, Ngoc PK (2011) “Downregulation of CD44 reduces
doxorubicin resistance of CD44
+
CD24
-
breast cancer cells”,
OncoTargets and Therapy, 4, pp.71-7.
8. Phuc V Pham, Nhan LC Phan, Nhung T Nguyen, Nhung H
Truong, Thuy T Duong, Dong V Le, Kiet D Truong and Ngoc K

Phan (2011) “Differentiation of breast cancer stem cells by
knockdown of CD44: promising differentiation therapy”, Journal of
Translational Medicine, 9(1), p.209.


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư vú (UTV) là một bệnh phức tạp. Nhiều nghiên cứ u đã
tiến hành để tìm ra nguyên nhân và phương pháp điều trị că n bệ nh
này. Trong 20 năm qua, tỉ lệ tử vong do UTV đã giảm nhiều. Sự giảm
này là do sự phát triển các kĩ thuật chẩn đoán sớm và các liệu pháp trị
liệu hiệu quả, kể cả các liệu pháp bổ trợ . Tuy nhiên, vẫn có đến 50%
khối u vú không đáp ứng thuốc, cũng như kháng với các liệu pháp này
và có hơn 70% bệ nh nhân sẽ tái phát sau 5 năm điều trị. Nguyên nhân
của tình trạng này là sự tồn tại của tế bào gốc ung thư vú (TBGUTV)
trong tất cả các khối u vú. Những TBGUTV được cho là nguồn gốc
của các khối u và đóng góp vào sự di căn và tái phát trong bệnh nhân
UTV. Do đó, liệu pháp tấn công vào TBGUTV được xem là liệu pháp
mới và hứa hẹn.
Trong 5-10 năm qua, nhiều đặc điểm của tế bào gốc ung thư
(TBGUT) đã được xác định và sử dụng như đích tấn công trong một
số chiến lược trị liệu. Vài đích tấn công trên TBGUTV đã được sử
dụng thử nghiệm lâm sàng; trong số đó đã có một số đã được phát
triển trở thành thuốc điều trị thường quy cho UTV. Tuy nhiên, vì sự
phức tạp trong kiểu hình của UTV giữ a các chủng tộc và vùng địa lý,
mà hiệu quả điều trị UTV bằng các liệu pháp này vẫn còn thấp. Mặc
dù chưa có số liệu về hiệu quả của các liệu pháp này trong điều trị
UTV trên bệnh nhân Việt Nam, các nhà nghiên cứu trên nhiều quốc
gia đều cho thấy có đến hơn 50% khối u không đáp ứng với các liệu
pháp này cũng như kháng thuốc. Vì thế, các nghiên cứu về đặc điểm

TBGUTV được phân lậ p từ khối u người phụ nữ Việt Nam cũng như
tìm kiếm các phương pháp trị liệu mới nhằm cải thiện hiệu quả điều trị
UTV ở bệnh nhân Việt Nam là cần thiết.
Từ hiểu biết của mình, chúng tôi thấy rằng các liệu pháp gen
và liệu pháp miễn dịch là hai hướng điều trị phù hợp có thể được sử
dụng để tấn công TBGUTV.


2
Vì thế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với tên đề tài
“Phân lập, xác định đặc điểm tế bào gốc ung thư vú người Việt Nam
và bước đầu ứng dụng điều trị thực nghiệm” nhằm phát triển các
liệu pháp mới để tấn công TBGUTV dựa vào liệu pháp gen và liệu
pháp miễn dịch.
Mục tiêu của nghiên cứu
Mục tiêu chính của nghiên cứu này là:
- Phân lập và nuôi cấy được tế bào ung thư vú (TBUTV) từ khối u vú
ác tính của người Phụ nữ Việt Nam.
- Phân lập và nuôi cấy TBGUTV từ các quần thể TBUTV phân lập
được.
- Thiết lập một số bước cơ bản trong liệu pháp gen và liệu pháp miễn
dịch để tấn công TBGUTV thực nghiệ m.
Vấn đề chính yếu trong nghiên cứu này là thiết lập được
những dòng TBGUTV đầu tiên ở Việt Nam từ khối u vú ác tính mà nó
là nguyên liệu quan trọng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo để sử
dụng liệu pháp gen và liệu pháp miễn dịch tấn công TBGUTV để điều
trị UTV.

3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Sự tồn tạ i TBGUT có thể giúp giải thích tại sao và làm thế
nào sự thay đổi trong hóa mô của mô phản ánh các cấp độ ác tính của
khối u. Với các đặc điểm tương tự tế bào gốc (TBG), TBGUT có thể
gây xâm lấn mạnh (bởi vì tính tự làm mới) và gây dị hợp kiểu hình
biệt hóa mạnh trong khối u (bởi vì khả năng biệt hóa) (Kakarala &
Wicha, 2008; Shay & Wright, 2010).
TBG trưởng thành thường tăng sinh chậm hơn các tế bào đã
biệt hóa, do đó chúng có thể gia tăng tuổi thọ. Vì nguyên nhân này,
chúng có thể tiếp xúc với nhiều tác nhân gây đột biến hơn các tế bào
biệt hóa, do đó chúng có thể tích lũy nhiều đột biến hơn. Và những đột
biến này có thể truyền sang các thế hệ con cháu (gọi là các tế bào tăng
sinh nhanh hay các tế bào khuếch đại chuyển tạ m thời) (Dontu et al.,
2003). Điều này có nghĩa là các con cháu của những TBG trưởng
thành bình thường có thể là các TBGUT. Nghĩa là trong cùng một
khối u nếu chúng ta có thể thu nhận cả TBG bình thường và TBGUT
thì các TBGUT sẽ thừa hưởng nhiều đặc đ iểm của TBG bình thường.
Thật vậy, một số nhà nghiên cứu cho thấy rằ ng các TBGUT có thể

chia sẻ một số con đường truyền tín hiệu với TBG cũng như một số
marker. Chẳng hạn, con đường truyền tín hiệu Notch biểu hiện mạnh
trong cả TBGUTV và TBG tuyến vú (Farnie and Clarke, 2007).
Vấn đề chính củ a TBGUT là khả năng tạo ra khối u từ chỉ một
vài tế bào, do đó nó có thể dễ dàng gây nên tái phát và khả năng kháng
mạnh với hóa chất và xạ trị. Sự tái phát cao là bởi vì tính tự làm mới
và khả năng kháng mạnh với hóa chất và tia xạ. Bở i vì đặc tính TBG
của TBGUT có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau và có
thể tạo ra một khối u dị hợp về kiểu hình (Campbell & Polyak, 2007).
Mặc dù tế bào trưởng thành thiếu khả năng tự làm mới và
tiềm năng tăng sinh thấp (Ginestier et al., 2007), cả tế bào trưởng
thành và TBG đều có thể hình thành TBGUTV (Dontu et al., 2003).


4
Thật vậy, các tế bào trưởng thành hay các tế bào tiền thân cũng có thể
trở thành TBG thông qua quá trình khử biệt hóa – đây là quá trình mà
từ một tế bào trưởng thành có thể đạt các đặc điểm của TBG
(Cobaleda et al., 2007).
Phát hiện đầu tiên về TBGUT trong khối u vú được báo cáo
vào năm 2003 bởi Al-Hajj và cs. Họ phát hiện một quần thể nhỏ các tế
bào có biể u hiện marker bề mặt là CD44
+
CD24
-/low
ESA
+
và Lin
-

(không biểu hiện CD2, CD3, CD10, CD16, CD18, CD31, CD64 và
CD140b). Chỉ với 200 tế bào này, chúng có thể gây ra khối u khi tiêm
vào chuột NOD/SCID trong khi đó 10
4
tế bào không biểu hiện marker
này thì không thể gây khối u (Al-Hajj et al., 2003). Khối u này có kiểu
hình dị hợp, chứa một quần thể tế bào có kiểu hình TBG ban đầu
CD44
+
CD24
-/dim
Lin
-
và có thể tiếp tục gây u khi cấy vào chuột liên tục
nhiều lần (Al-Hajj et al., 2003).
Sau đó kiểu hình CD44
+
CD24
-
được sử dụng để xác định và
tách TBGUT với khả năng gây u tăng cao. Thật vậy, các khối cầu
(mammosphere) thu từ việc nuôi TBUTV có kiểu hình CD44
+
CD24
-
/dim
có thể gây u mạnh khi tiêm vào chuột NOD/SCID. Tuy nhiên, chỉ
cần một ít tế bào CD44
+
CD24

-/low
cũng có thể hình thành nên khối cầu
(Ponti et al., 2005). Thật vậy, các dòng TBUTV chứa đến 90%
TBGUTV CD44
+
CD24
-/low
có khả năng gây u không cao hơn các dòng
tế bào mà chỉ chứa 5% tế bào có cùng kiểu hình này (Fillmore &
Kuperwasser, 2008). Điều này cho thấy rằng chỉ một quần thể nhỏ tế
bào có kiểu hình CD44
+
CD24
-/low
là có khả năng tự làm mới và sinh u.
Do đó liệu pháp tấn công TBGUTV được xem xét là liệu pháp tốt nhất
để loại bỏ sự tái phát và kháng với hóa và xạ trị trong điều trị UTV.






21
ĐỀ NGHỊ
Nghiên cứu này có một số giớ i hạn. Để có thể ứng dụng liệu
pháp gen làm giảm biểu hiện CD44 và liệu pháp tế bào tua nạp kháng
nguyên TBGUTV trong lâm sàng, một số thí nghiệm tiếp theo cần
được tiến hành:
1. Đánh giá tính an toàn của cấu trúc vector shRNA CD44,

nghiên cứu cải tiến để làm giảm độc tính nếu có thể hay
thay thế bằng hệ vector khác hoặc phương pháp khác để
điều hòa giảm biểu hiện CD44 với hiệu quả tương tự.
2. Đánh giá các tác động phụ của liệu pháp tế bào tua, đặc
biệt đáp ứng miễn dịch mà có thể gây bệnh tự miễn.
3. Đánh giá liều vector lentivirut hay liều tế bào tua có thể
sử dụng hiệu quả trên người.
4. Nghiên cứu các biến đổi trong nhiều con đường truyền tín
hiệu liên quan đến sự điều hòa giảm biểu hiện CD44 trong
TBGUTV.
5. Tối ưu hóa việc đánh giá hiệu quả điều trị UTV bằng tế
bào tua trên mô hình chuột nhân hóa hệ miễn dịch; sử
dụng hệ thống quét tín hiệu để đo sự di căn và kích thích
khối u thay vì quan sát khối u bằng mắt thường.




20
doxorubicin, trọng lượng khối u giảm đ áng kể đến 4,38 lần so với
nhóm đối chứng.
4. Bước đầu thiết lập thành công liệu pháp miễn dịch sử dụng tế
bào tua nạp kháng nguyên TBGUTV trên mô hình chuột
Tế bào tua từ tủy xương chuột được sản xuất thành công và sử
dụng chúng trong liệu pháp tế bào tua. Nếu chuột được điều trị vào
ngày 10 sau khi tiêm TBGUTV, có đến 60,0 ± 20% chuột không hình
thành khối u sau khi tiêm tế bào tua đã nạp kháng nguyên TBGTV sau
18 ngày. Trong khi đó có đến 100% chuột mang khối ở chuột đối
chứng (tiêm PBS) sau 15 ngày. Có 0,095±0,018% tế bào tua tồn tại
trong tách vào ngày 3 sau khi ghép. Lượng tế bào CD8 và CD45 trong

lô ghép tế bào tua tăng cao hơn so với chuột đối chứng.




















5
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Phân lập TBUTV từ khối u vú ác tính
TBUTV được phân lập từ các khối u vú của bệnh nhân đã
đồng ý tự nguyện cho mẫu. Về cơ bản, các khối u sẽ được rửa sạch và
cắt thành từ mảnh nhỏ. Những mẩu mô này được nuôi trong điều kiện
thích hợp. Trong nghiên cứu này có hai loại môi trường nuôi được sử
dụng để nuôi tế bào từ mảnh mô. Trong giai đoạn 1, chúng tôi sử dụng
môi trường được biến đổi từ Speirs et al. (1998). Trong giai đoạn 2,

chúng tôi sử dụng một loại môi trường khác, đó là M171 bổ sung với
yếu tố kích thích phát triển tế bào biểu mô tuyến vú MEGS của
Invitrogen Ltd.
Các tế bào thu nhậ n được đánh giá biể u hiện marker CD24
bằng hóa tế bào miễn dịch và phân tích phần trăm tế bào biểu hiện
CD24 và CD90 bằng kĩ thuật flow cytometry. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi tiến hành loại bỏ các tế bào tạp nhiễm bằng kĩ thuật tách tế
bào âm tính với marker CD90. Sau khi thu nhận được quần thể
TBUTV, chúng tôi tiến hành xác định đặc điểm của tế bào này như:
khả năng gây u in vivo trên mô hình chuột, sự biểu hiện gen Brca1, sự
biểu hiện các gen liên quan đến sự hình thành khối u và di căn như
Cyclin D1, Cyclin E2, EGFR, Mucin 1 và Myc. Cuối cùng, dòng tế
bào thu nhận được được phát hiện sự nhiễm mycoplasma.
2.2. PHÂN LẬP TBGUTV
TBGUTV ứng viên được phân lập bằng tách quần thể
CD44
+
CD24
-
. Các TBGUTV ứng viên được nuôi cấy trong
DMEM/F12 bổ sung 10% FBS và 1% antibiotic-mycotic, ủ trong tủ
ấm 37
0
C, 5% CO
2
. Quần thể tế bào này được sử dụng để xác định đặc
điểm đặc trưng của TBGUTV như xét nghiệm hình thành
mammosphere, khả năng gây u in vivo trên mô hình chuột
NOD/SCID, khả năng kháng thuốc chống khối u (doxorubicin và

6
verapamil). Cuối cùng, quần thể TBGUTV đư ợc đánh giá sự nhiễm
mycoplasma.
2.3. ĐIỀU HÒA GIẢM BIỂU HIỆN CD44 VÀ SỰ KHÁNG
THUỐC DOXORUBICIN CỦA TBGUTV
siRNA được sử dụng để làm giảm biểu hiện CD44 trong
TBGUTV. Việc chuyển nhiễm siRNA CD44 bằng bộ kit theo hướng
dẫn củ a nhà sản xuất (Santa Cruz Biotechnology Inc). Sau 48h chuyển
nhiễm, tế bào được sử dụng đánh giá sự biểu hiện của CD44 bằng RT-
PCR và hóa tế bào miễn dịch.
Các tế bào sau khi được khẳng định điề u hòa giảm biểu hiện
CD44 thành công, chúng được sử dụng để đánh giá khả năng kháng
thuốc với thuốc chống khối u. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử
dụng doxorubicin để khảo sát ở các nồng độ 0, 1, 3 và 6 µg/mL. Tế
bào được tiếp xúc với các nồng độ này của doxorubicin trong 48 giờ
và sau đó được sử dụng để đánh giá chu kì tế bào, sự tăng sinh và
apoptosis.
2.4. BIỆT HÓA TBGUTV BẰ NG CÁCH LÀM GIẢ M BIỂU
HIỆN CỦA CD44
Trong thí nghiệm này, đầu tiên chúng tôi tiến hành phân lập
các quần thể tế bào, trong đó có quần thể TBGUTV đã đượ c phân lập
và 3 quần thể khác biểu hiện marker khác với TBGUTV là CD44
-
CD24
-
, CD44
+
CD24
+

, CD44
-
CD24
+
. Ba quầ n thể này được trộn đều
với tỉ lệ 1:1:1 để hình thành quần thể mới được gọi là tế bào không có
kiểu hình TBGUTV và được gọi là chung là TBUTV.
Tiếp theo, TBGUTV được làm giảm biểu hiện CD44 bằng
việc chuyển CD44 shRNA trên vector lentivirut. Các tế bào được
chuyển nhiễm và chọn lọc các tế bào nhận vector chuyển bằng cách
chọn lọc trong môi trường bổ sung puromycin dihydrochloride theo
hướng dẫn của nhà sản xuất. Sự điều hòa giảm biểu hiện của CD44


19
- Trong điều kiện in vitro, các TBGUTV điều hòa giảm biểu hiện
CD44 biểu hiện một số đặc điểm:
+ tăng sinh chậm sau khi xử lí với doxorubicin.
+ tăng mức apoptosis và thay đổi chu kì tế bào. Tác động gây
apoptosis được quan sát rõ trong TBGUTV đã bị điều hòa giảm biểu
hiện CD44 có thể đạt đến 34,19% tế bào chết khi xử lí 1,0 µg/mL
doxorubicin và đạt đến 40.2% khi xử lí doxorubicin ở nồng độ 6,0
µg/mL.
+ Thay đổi biểu hiện của các gen quan trọng liên quan đến
tính gốc, tính kháng thuốc và di căn như Muc-1, MMP9 và Myc biểu
hiện giảm, sự biểu hiện của LEF1 liên quan đến tính gốc cũng giảm.
+ chu kì tế bào cũng bị tác động. Pha G2/M và pha S trong
TBGUTV bị điều hòa giảm CD44 tương tự với TBUTV. Pha G2/M
trong TBGUTV bị điều hòa giảm CD44 giảm tương tự với TBUTV
(24,23±0,34% so với 23,41±0,50%) trong khi đó pha S thì tăng từ

13,93±0,69% ở TBGUTV lên 16,98±0,95% trong TBGUTV đã điều
hòa giảm biểu hiện CD44, so với 20,08±0,31% trong TBUTV.
- Trong mô hình chuột NOD/SCID, TBGUTV điều hòa giảm biểu
hiện CD44 cho thấy khả năng gây u giảm về cả tốc độ phát triển khối
u và kích thước khối u hình thành so với TBGUTV.
+ TBGUTV gây u trên 66,67% (2/3) chuột khi bị tiêm 10
3
tế
bào; trong khi đó TBUTV cần đến 10
6
tế bào để gây u 33,33% (1/3)
chuột. Ở liều 10
4
tế bào, TBGUTV đã điều hòa giảm biểu hiện CD44
không có khả năng gây u so với 100% chuột bị u khi tiêm TBGUTV.
+ Kích thước và trọng lượng khối u có sự khác biệt đáng kể
giữa các nhóm điều trị theo phác đồ điều trị bằng liệu pháp điều hòa
giảm CD44 kết hợp doxorubicin trên mô hình chuột. So với chuột đối
chứng, kích thước của chuột giảm đi 1,74; 3,04 và 12,47 lần tương
ứng trong trong nhóm Doxorubicin, CD44 shRNA, và CD44 shRNA
kết hợp doxorubicin. Trong nhóm kết hợp CD44 shRNA kết hợp


18
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT KUẬN
1. Tế bào ung thư vú từ 23 mẫu khối u vú đã được phân lập và
nuôi cấy. Đã thiết lập thành công 2 dòng tế bào ung thư vú
VNBRC1 và VNBRC2 từ các mẫu này. Các tế bào ung thư vú thu

nhận được biểu hiện các đặc điểm chính sau:
- chứa 0,11% tế bào dương tính CD90, 96,45±1,76% tế bào dương
tính với CD24
- biểu hiện rất thấp gen Brca1, trong khi đó biểu hiện mạnh các gen
cyclin D1, cyclin E2, EGFR và Mucin 1 so với dòng tế bào ung thư vú
thương mại MCF-7.
- hình thành khối u trong chuột NOD/SCID khi tiêm 2.10
6
tế
bào/chuột.
- âm tính với các mycoplasma chính M. arginini, M. faucium, M.
fermentans, M. hyorhinis, M. orale) và Acholeplasma laidlawii.
2. Thiết lập thành công hai dòng tế bào gốc ung thư vú (BCSC1 và
BCSC2). Các TBGUTV biểu hiện các đặc điểm đặc trưng sau:
- biểu hiện mạnh protein CD44, không biểu hiện hay biểu hiện rất yếu
protein CD24 trên bề mặt tế bào
- có khả năng tự làm mới in vitro và hình các khối cầu trong môi
trường không huyết thanh
- có khả năng gây u trên chuột NOD/SCID với liều 10
3
TBGUTV khi
tiêm dưới da
- kháng mạnh với verapamil ở nồng độ cao (50 µg/mL) so với tế bào
ung thư vú
- âm tính với các mycoplasma chính M. arginini, M. faucium, M.
fermentans, M. hyorhinis, M. orale) và Acholeplasma laidlawii.
3. Liệu pháp gen điều hòa giảm biểu hiện CD44 được thiết lập
thành công trên mô hình chuộ t.

7
được khẳng định bằng kĩ thuật flow cytometry và hóa tế bào miễn
dịch.
Sau khi đánh giá biểu hiện CD44, chỉ những mẫu có >90% tế
bào không biểu hiện CD44 được sử dụng để tiến hành các đánh giá
tiếp theo.
Trạng thái biệt hóa của TBGUTV được đánh giá dựa vào sự
tương đồng của TBGUTV sau khi điều hòa giảm biểu hiện CD44 với
TBUTV và sự khác biệt giữa TBGUTV và tế bào đã điều hòa giảm
biểu hiện CD44. Các đặc điểm khảo sát bao gồm khả năng sinh u trên
mô hình chuột NOD/SCID, sự biểu hiện các gen liên quan đến tính
gốc và di căn, chu kì tế bào.
Có 22 gen được chia thành 2 phức hợp gen được khảo sát, bao
gồm: Phức hợp 1 gồm 17 gen: Bcl-2 [Genebank:NM_000633], Fos
[Genebank: NM_005252], ICAM1 [Genebank:NM_000201], CCND1
[Genebank: NM_053056], MMP7 [Genebank:NM_002423], Myc
[Genebank:NM_002467], PRKCE [Genebank:NM_005400], TP53
[Genebank:NM_000546], VCAM1 [Genebank:NM_001078], IL4R
[Genebank:NM_000418], PTCH1 [Genebank:NM_000264], HSPB1
[Genebank: NM_001540], PTGS2 [Genebank: NM_000963], HSF1
[Genebank:NM_005526], LEF1 [Genebank:NM_016269], TCF7
[Genebank:NM_003202], and FASN [Genebank:NM_004104]; phức
hợp 2 gồm 5 gen: Muc-1 [Genebank:NM_002456], cyclin E2
[Genebank:NM_004702], EGFR [Genebank:NM_005228], Myc
[Genebank:NM_002467], and cyclin D1 [Genebank:BC001501].
2.5. ỨC CHẾ SỰ PHÁT TRIỂN KHỐI U TRÊN MÔ HÌNH
CHUỘT BẰNG LIỆU PHÁP GEN ĐIỀU HÒA GIẢM BIỂU
HIỆN CD44 KẾT HỢP VỚI DOXORUBICIN
Trong thí nghiệm này, chúng tôi xác định tỉ lệ xâm nhiễm cho
hiệu quả nhất giữa lượng hạt virus mang shRNA CD44 và tế bào của

khối u. Các tỉ lệ được khảo sát bao gồm 2:1, 1:1 và 1:2 tương ứng với


8
tỉ lệ giữa TBGUTV và hạt lentivirut mang shRNA CD44 với lô đối
chứng không bổ sung hạt lentivirut. Các tế bào được nuôi tiếp tục 5
ngày sau khi nhiễm với lentivirut và sử dụng để phân tích tỉ lệ phần
trăm tế bào biểu hiện CD44 bằng kĩ thuật flow cytometry.
Sau đó, chuột NOD/SCID được tiêm TBGUTV để gây tạo
khối u dưới da. Sau 2 tuần, khối u hình thành và đủ lớn, chúng được
chia thành 4 nhóm. Nhóm 1 (đối chứng, 4 con), các chuột mang u
không được điều trị. Nhóm 2 (Doxorubicin –Dox), chuột được tiêm
vào khối u doxorubicin với liều 2mg/kg hàng tuần trong 4 tuần. Nhóm
3 (shRNA), chuột được tiêm với CD44 shRNA lentivirut với liều
được xác định trong thí nghiệm trên. Nhóm 4 (CD44 shRNA kết hợp
với doxorubicin, shRNA+Dox), chuột được tiêm CD44 shRNA
lentivirut với lượng tương đương nhóm 3 cùng với doxorubicin với
lượng và chế độ tiêm cùng với nhóm 2. Kích thước và trọng lượng
khối u được ghi nhận.
2.6. TÁC ĐỘNG CỦA TẾ BÀO TUA ĐƯỢC NẠP DỊCH CHIẾT
TBGUTV LÊN MÔ HÌNH CHUỘT MANG KHỐI U VÚ
Trong thí nghiệm này, dịch chiết TBGUTV được tạo ra như
sau 5.10
6
TBGUTV được thu nhận cho vào ống li tâm 1.5 mL. Tế bào
được xử lí với 400µl Pro-PREP và trộn kĩ. Huyền phù này được làm
lạnh nhanh trong -20
0
C trong 10-20 phút. Dịch nổi tế bào được
chuyển sang ống li tâm mới và bảo quản để sử dụng trong các thí

nghiệm tiếp theo.
Tế bào tua được biệt hóa từ tế bào đơn nhân tủy xương chuột.
Chuột mô hình u vú được tạo ra bằng cách tiêm 10
6
TBGUTV vào
dưới da vùng mỡ vú chuột. Để ức chế sự đào thải tế bào ghép, chuột
được tiêm busulfan (liều 20 mg/kg) và cyclophosphamide (liều 200
mg/kg).
Chế phẩm tế bào tua sử dụng để tiêm cho chuột được tạo ra
như sau 100 µl dịch chiết TBGUTV được thêm vào 1 mL tế bào tua


17
sau 18 ngày ghép, trong khi đó có đến 100% chuột mang khối u trong
lô đối chứng sau 15 ngày tiêm PBS.
Về khả năng di cư của tế bào tua ghép đến lách, phân tích sự
tồn tại tín hiệu huỳnh quang Vybrant Dil-CM đã đánh dấu trên tế bào
tua bằng kĩ thuật flow cytometry cho thấ y có 0,095±0,018% tế bào tua
ghép hiện diện trong lách trong tổng số tế bào lách. Kết quả phân tích
mô học quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang cũng cho thấy có sự
tồn tại tín hiệu huỳnh quang trong lát cắt lách.
Tiếp theo việc đánh giá sự thay đổi đáp ứng miễn dịch khi
ghép tế bào tua thông qua thành phần tế bào CD8 và CD45 trong lách
so với chuột đối chứng và chuột bình thường cho thấ y tỉ lệ tế bào CD8
tăng cao hơn so với chuột đối chứng và chuộ t bình thường (tương ứng
là 26,33%; 9,52% và 2,61% trong chuột ghép tế bào tua, chuột bình
thường và chuột đối chứng). Điều này cho thấy rằng việc ghép tế bào
tua đã kích hoạt đáp ứng miễn dịch thông qua tế bào T gây độc. Kết
quả phân tích cũng cho thấy việc ghép tế bào tua đã làm tăng tỉ lệ tế
bào CD45 so với chuột đối chứng (76,97% so với 48,11%). Tuy

nhiên, tỉ lệ này tương đối thấp so với chuộ t bình thường. Điều này là
vì tác động của chất ức chế miễn dịch.













16
shRNA riêng rẽ là như nhau; nhưng khi kết hợp, chúng có thể gây tác
động ức chế mạnh với sự thay đổi kích thước, trọng lượng có ý nghĩa
thống kê so với các lô điều trị riêng rẽ.
So với chuột đối chứng, kích thước khối u giảm đi 1,74; 3,04
và 12,47 lần tương ứng trong trong nhóm Doxorubicin, CD44 shRNA,
và CD44 shRNA kết hợp doxorubicin. Trong nhóm kết hợp CD44
shRNA và doxorubicin, trọng lượng khối u giảm đáng kể đến 4,38 lần
so với nhóm đối chứng.
Như vậy, sự biểu hiện mạnh CD44 trong TBGUTV có ý nghĩa
quan trọng trong sự tăng sinh, sự kháng thuốc của các tế bào này. Từ
kết quả nghiên cứu, chúng tôi cho rằng liệu pháp kết hợp giữ a điều
hòa giảm biểu hiện CD44 và doxorubicin có thể ức chế mạnh sự phát
triển của khối u so với đối chứng. Kết quả này hứa hẹn cho một liệu
pháp mới sử dụng kết hợp liệu pháp gen và hóa trị liệu để tấn công

TBGUTV trong điều trị UTV.
3.4. LIỆU PHÁP TẾ BÀO TUA LÀ LIỆU PHÁP TIỀM NĂNG
TRONG ĐIỀU TRỊ UTV
Trong thí nghiệm đầu tiên chúng tôi đã chuẩn bị thành công
TBGUTV và tế bào tua. Các TBGUTV tăng sinh đủ số lượng để tiến
hành các thí nghiệm nhưng vẫn giữ kiểu hình CD44
+
CD24
-
. Các tế
bào tua được biệt hóa từ tế bào đơn nhân tủy xương chuột. So với,
trước khi cảm ứng các tế bào biểu hiện một số đặc điểm kiểu hình như
CD40, CD80 và CD86, trong khi đó CD14 thì không biểu hiện. Sau
đó, các tế bào tua này được nạp kháng nguyên TBGUTV để hoạt hóa
đáp ứng miễn dịch chuyên biệt với TBGUTV. Đáp ứng này được đánh
giá thông qua 3 chỉ tiêu: hiệu quả điều trị ung thư trên chuột, sự di cư
của tế bào tua ghép vào đến lách và sự thay đổi thành phần tế bào T
CD8 và T CD45 trong tách.
Về hiệu quả ức chế sự phát triển khối u, kết quả cho thấy
trong lô thí nghiệm có khoảng 60,0 ± 20% chuột không mang khối u


9
tương ứng 10
6
tế bào tua. Ủ hỗn hợp này trong 24 giờ ở tủ ấm 37
0
C.
Sau khi đã nạp kháng nguyên, tế bào tua được nhuộm với chất phát
huỳnh quang Vybrant Dil-CM để theo dõi sự di cư của chúng khi tiêm

vào chuột.
Phác đồ điều trị trên chuột: sau 10 ngày chuột được tiêm với
TBGUTV được tiêm chế phẩm tế bào tua vào tĩnh mạch với liều là
10
6
tế bào chứa trong 0,2 mL PBS; trong khi đó, chuộ t trong lô đối
chứng chỉ được tiêm 0,2 mL PBS. Chuột đư ợc theo dõi sự hình thành
khối u có thể nhận thấy được bằng mắt thường. Để theo dõi sự di cư
của tế bào ghép, một số chuột được giết vào ngày 3 sau khi ghép, lách
của chuột được thu nhận để đánh giá sự tồn tại tế bào ghép. Sự kích
hoạt hệ miễn dịch của chuột ghép tế bào tua cũng được khảo sát thông
qua sự thay đổi thành phần tế bào CD45 và tế bào lympho T CD8
trong lách.

10
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
3.1. PHÂN LẬP THÀNH CÔNG TẾ BÀO UNG THƯ
Kết quả cho thấy rằng tế bào từ mô với hai hình dạng chính: tế
bào giống tế bào biểu mô và tế bào giống trung mô (nguyên bào sợi, tế
bào nền). Sự khác biệt giữa hai kiểu tế bào này có thể nhận diện bằng
nhuộm với kháng thể kháng CD90 và phân tích bằng flow cytometry:
một quần thể dương tính CD90 và một quần thể âm tính CD90. Tuy
nhiên, chúng không phải là TBUTV. Thật vậy, những tế bào biểu mô
bình thường cũng tồn tại trong khối u vú này. Để làm giàu và nâng cao
độ tinh sạch TBUTV, chúng tôi nuôi sơ cấp các mảnh mô trong môi
trường chuyên biệt cho TBUT biểu mô phát triển và loại bỏ các tế bào
nhiễm. Chúng tôi đặt tên cho dòng TBUTV ứng viên thu nhận được là
VNBRC1. Để khẳng định các tế bào thu nhận được là TBUTV, các thí
nghiệm tiếp theo, chúng tôi đã tiến hành các phân tích biểu hiện các
gen liên quan đến sự di căn và hình thành ung thư. Kết quả cho thấy
rằng có những khác biệt quan trọng trong sự biểu hiện những gen này
giữa VNBRC1 với tế bào tuyến vú bình thường nhưng lại tương tự với
tế bào MCF-7, đặc biệt những gen liên quan đến UTV. So với tế bào
MCF-7, VNBRC1 biểu hiện nhiều gen liên quan sự di căn mạ nh hơn.
Dựa vào những kết quả này, chúng tôi khẳng định rằng các tế bào thu
nhận được là TBUTV. VNBRC1 không giống với MCF-7 bởi vì
chúng biểu hiện này gen liên quan đến di căn mạnh (Mucin 1, Cyclin
E2, EGF receptor, Myc và Cyclin D1) hơn ở tế bào MCF-7.
Một số đặc điểm khác củ a VNBRC1 cũng được xác định như
chúng biểu hiện rất thấp gen BRCA1. Gen này liên quan đến sự rủi ro
hình thành UTV cũng như nhiều ung thư khác. BRCA1 là gen ức chế
khối u, duy trì sự toàn vẹn bộ gen và ngăn chặn các đột biến gây nên
ung thư. Do đó, sản phẩm gen này được cho là có vai trò sửa chữa

DNA, điều hòa sự phiên mã gen cũng như nhiều chức năng khác. Gen
này biểu hiện rất thấp trong một số ung thư, đặc biệt UTV. VNBRC1


15
Sự thay đổi biểu hiện các gen quan trọng đã kéo theo sự thay
đổi trong chu kì TBGUTV bị làm giảm biểu hiện CD44 theo kiểu của
tế bào không phải TBGUTV. Pha S của tế bào tăng và pha G2/M lại
giảm trong TBGUTV bị làm giảm biểu hiệ n CD44 và tương tự ở tế
bào không có kiểu hình TBGUTV.
Sự khác biệt chính được khảo sát tiếp theo là khả năng gây u
khi tiêm chúng vào chuột. Tiềm năng sinh u là tiêu chuẩn vàng để
đánh giá một tế bào có phải là TBGUT. Kết quả cho thấy, khi tiêm 10
3

TBGUTV có khả năng gây u trong chuột NOD/SCID, trong khi đó
TBGUTV đã bị làm giảm biểu hiện CD44 cần đến 10
6
tế bào để gây u,
tương tự quần thể tế bào không có kiểu hình TBGUTV.
Như vậy, việc điều hòa giảm biểu hiện CD44 đã gây biệt hóa
TBGUTV thành kiể u hình tế bào không mang tính gốc.
3.3.3. Liệu pháp gen điều hòa giảm biểu hiện CD44 ức chế khối u
vú trên mô hình chuột NOD/SCID
Từ kết quả của các thí nghiệm trên, chúng tôi nhận thấy rằng
việc kết hợp liệu pháp biệt hóa bằng điều hòa giảm biểu hiện CD44
với hóa trị liệu có thể ức chế và tiêu diệt khối u. Trong thí nghiệm này,
chúng tôi tiến hành thử nghiệm cận lâm sàng điều trị khối u vú trên
mô hình chuột bằng liệu pháp kết hợp giữa liệu pháp gen đ iều hòa
giảm CD44 và hóa trị liệu với thuốc chống khối u doxorubicin.

Sau 48 giờ, được tiêm với vector lentivirut CD44 shRNA,
chuột được điều trị với doxorubicin. Thời đ iểm này được chọn dự a
vào các nghiên cứu trước đây cho thấy rằng virut có thể xâm nhiễm và
ức chế sự biểu hiện gen sau 24 giờ. Doxorubicin được sử dụng ở liều
2 mg/kg trọng lượng chuột. Kết quả cho thấy rằng sự khác biệt có ý
nghĩa thống kê về kích thước và trọng lượng của khối u giữa các lô
chuột khác nhau. Việc điều trị bằng doxorubicin và shRNA CD44
riêng rẽ hay kết hợp đều có tác động ức chế sự phát triển khối u. Tuy
nhiên, tác động ức chế của việc điều trị với doxorubicin hay CD44


14
cũng được khẳng định trong các TBUT dương tính với CD44 và
TBUT tuyến liệt.
Dựa vào kết quả của nghiên cứu này, chúng tôi đã giả thuyết
rằng CD44 có thể là mục tiêu để điều trị ung thư, đặc biệt UTV. Sử
dụng siRNA CD44 tấn công TBGUTV với kiểu hình CD44
+
CD24
_
có
thể là chiến lược liệu pháp gen hiệu quả để điều trị UTV. Tuy nhiên,
ứng dụng liệu pháp gen để làm giảm biểu hiện gen CD44 vẫn đương
đầu với các thử thách lớn bởi vì nhiều tế bào trong cơ thể dương tính
với CD44. Do đó, liệu pháp gen tiêm vào khối u với
polyethylenimine/siRNA CD44 có thể là lựa chọn tốt nhất trong
trường hợp này.
3.3.2. Làm giảm biểu hiện CD44 gây nên sự biệt hóa của
TBGUTV
Trong thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi xác định cơ chế tác

động của việc làm giảm biểu hiện của CD44 lên tính kháng thuốc điều
trị ung thư. Chúng tôi tiến hành làm giảm biểu hiện CD44 bằng vector
lentivirut shRNA và chọn lọc puromycin để tạo quần thể tế bào giảm
biểu hiện CD44 ổn định.
Sau đó, tính gốc của 3 quần thể tế bào, bao gồm: TBGUTV,
TBGUTV đã làm giảm biểu hiện gen CD44 và tế bào không phải
TBGUTV (tế bào không biểu hiện kiểu hình CD44
+
CD24
-
thu nhận từ
quần thể TBUTV) được so sánh với nhau. Các chỉ tiêu so sánh bao
gồm: sự biểu hiện các gen liên quan đến TBG và di căn, sự kháng
thuốc, sự thay đổi chu kì tế bào, khả năng hình thành khối u in vivo
trong chuộ t NOD/SCID.
Kết quả cho thấy TBGUTV bị làm giảm biểu hiện gen có sự
biểu hiện giảm rõ rệt các gen khảo sát và tương tự mức biểu hiện ở tế
bào không phải TBGUTV. Đặc biệt các gen liên quan đến khả năng di
căn như Muc-1, MMP9, Myc giảm biểu hiện mạnh ở TBGUTV bị
điều hòa giảm CD44 và tương tự ở tế bào không có kiểu hình TBG.


11
biểu hiện gen này rất thấp và thấp hơn trên dòng TBUTV thương mại
MCF-7.
Tiêu chuẩn vàng để khẳng định liệu một quần thể tế bào có
phải là TBUT là khả năng gây u của chúng khi tiêm vào chuột suy
giảm miễn dịch hay chuột NOD/SCID. Trong nghiên cứu này,
VNBRC1 có thể gây u trên chuột suy giảm miễn dịch và chuột
NOD/SCID khi tiêm 2.10

6
tế bào với 1 lần tiêm duy nhất.
Tóm lại, trong nội dung thứ nhất của nghiên cứu, chúng tôi đã
thiết lập thành công hai dòng TBUTV từ khối u vú ác tính của phụ nữ
Việt Nam. Chúng tôi đặt tên chúng là VNBRC1 và VNBRC2 (là từ
viết tắt của Vietnamses breast cancer cells 1 và Vietnamese breast
cancer cells 2). So với các kĩ thuật khác, nghiên cứu này đã xây dựng
kĩ thuật mới trong thiết lập dòng TBUTV với một số thuận lợi. Các kĩ
thuật trước sử dụng kĩ thuật nuôi cấy sơ cấp và cấy chuyền liên tục để
đạt quần thể TBUTV tinh sạch. Mặc dù kĩ thuật này cũng có một số
lợi ích như dễ tiến hành, rẻ nhưng đương đầu với việc nhiễm các tế
bào khác như tế bào biểu mô bình thường, nguyên bào sợi và tốn thời
gian. Cải tiến kĩ thuật này, chúng tôi sử dụng kĩ thuật loại bỏ các tế
bào nhiễm bằng môi trường nuôi, cấy chuyền liên tục và chọc lọc tế
bào quan tâm bằng loại bỏ các tế bào không mong muốn bằng marker
bề mặt.
3.2. PHÂN LẬP THÀNH CÔNG TBGUTV TỪ DÒNG TBUTV
VIỆT NAM
Kết quả của chúng tôi tương tự với những phát hiện của Al-
Hajj và cs về quần thể TBGUTV trong khối u ác tính. Đó là chỉ có
một quần thể nhỏ TBGUTV với kiểu hình CD44
+
CD24
-/dim
trong khối
u vú ác tính. Tuy nhiên, kết quả của Honeth và cs (2008) cho thấy có
đến 31% tế bào có kiểu hình này trong khối u vú ác tính. Ở một
nghiên cứu khác, các tác giả cho thấy có đến 59% tế bào biểu hiện
kiểu hình CD44
+

CD24
-
trong khối u vú.


12
Quần thể tế bào thu nhận được biểu hiện mạnh protein CD44,
nhưng không biểu hiện hay biểu hiện yếu protein CD24 trên bề mặt tế
bào. Kết quả này được khẳng định bởi kĩ thuật flow cytometry và hóa
tế bào miễn dịch. Theo kết quả của Clarke và cs (2006), cấy ghép dị
loại sử dụng để tách quần thể tế bào CD44
+
CD24
-
có tiềm năng gây u
trong mô hình chuột NOD/SCID. Họ cho thấy rằng 200 tế bào với
kiểu hình này có thể gây u khi tiêm vào chuột NOD/SCID trong khi
đó khi tiêm 20.000 tế bào không biểu hiện kiểu hình trên vẫn không
có khả năng gây u in vivo. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiêm
1000 TBGUTV mà chúng tôi thu nhận được thì cũng có khả năng gây
u.
Trong xét nghiệm tiếp theo, chúng tôi kiểm tra đặc tính tiếp
theo của TBGUTV là khả năng tự làm mới bằng kĩ thuật nuôi cấy tạo
mammosphere. Kết quả cho thấy các TBGUTV thu nhận được có khả
năng tạo mammosphere manh.
Đặc tính kháng thuốc của TBGUT cũng được khảo sát trong
nghiên cứu này. Các TBGUT với kiểu hình CD44
+
CD24
-

kháng mạnh
với thuốc verapamil so với TBUTV không biểu hiện kiểu hình này.
Từ nội dung này, chúng tôi đã tạo được 2 dòng TBGUTV,
được đặt tên là BCSC1 và BCSC2.
3.3. CD44 LÀ ĐÍCH TIỀM NĂNG TRONG ĐIỀU TRỊ TRÚNG
ĐÍCH UTV
3.3.1. Điều hòa giảm biểu hiện CD44 làm giảm tính kháng thuốc
của TBGUTV
Các TBGUTV bị điều hòa giảm biểu hiện CD44 nhạy cảm với
doxorubicin hơn các TBGUTV. Ngay khi ở nồng độ cao, doxorubicin
thất bại giết các TBGUTV CD44
+
CD24
-
, trong khi đó ở nồng độ này
doxorubicin có thể gây apoptosis ở TBGUTV bị điều hòa giảm biểu
hiện CD44. Điều này cho thấy rằng việc điều hòa giảm biểu hiện
CD44 đã làm giảm khả năng kháng doxorubicin của TBGUTV. Hay


13
nói cách khác, điều hòa giảm biểu hiện CD44 đã làm TBGUTV nhạy
cảm với tác nhân chống ung thư. Thật vậy CD44 là một protein xuyên
màng được tổng hợp ở dạng nhiều isoform bởi mRNA splicing. Mặc
dù CD44 thiếu domain quan trọng cho sự truyền tín hiệu, nó cũng
được mô tả là cần thiết cho sự “trở về nhà” và chứa một số đặc điểm
quan trọng cho TBGUT máu. Có một số bằng chứng rằng CD44 hỗ
trợ sự bám dính in vitro và sự phát triển của khối u cũng như sự di căn
trong khối u rắn. Chức năng kích thích khối u của CD44 xảy ra thông
qua sự đồng kích thích với các tín hiệu bởi các thụ thể của các nhân tố

tăng trưởng như EGF receptor-2 (Her 2), EGF receptor 1 (Her1) và
yếu tố phát triển tế bào gan (Met). CD44 cũng được xem là các
marker hữu dụng để phát hiện và làm giàu TBGUT. Các tế bào dương
tính CD44 có khả năng di căn và gây u. Hơn nữa, marker CD44 được
sử dụng để tách TBGUT tuyến tiền liệt, tuyến tụy và đại tràng. Một
đặc điểm quan trọng của TBGUT trong khối u là sự biểu hiện cao của
các ABC transporter, đặc biệt ABCG2. Vì thế các TBGUT có khả
năng kháng thuốc, ngay cả hóa trị liệu. Về lâm sàng, hóa trị liệu có thể
tiêu diệt hầu hết các tế bào trong khối u rắn. Tuy nhiên, một quần thể
nhỏ các tế bào gọi là TBGUT có khả năng kháng thuốc, bởi vì sự hiện
diện của các kênh ABC transporter giúp đẩy các thuốc trị ung thư ra
ngoài. Sự biểu hiện gia tăng của ABC transporter trong TBGUT dẫn
đến sự đào thải Hoechst 33342 và Rhodamine 123 mà có thể phát hiện
bằng kĩ thuật flow cytometry. Những tế bào có khả năng này gọi là
quần thể phụ.
Trong nghiên cứu này, sự làm giảm biểu hiện của CD44 làm
giảm tính kháng thuốc của TBGUTV. Điều này cho thấy rằng sự
tương quan giữa tính kháng thuốc và sự biểu hiệ n của CD44 hay các
con đường truyền tín hiệu liên quan đến protein này. Sự điều hòa giảm
biểu hiện củ a CD44 có thể ức chế sự tăng sinh và gây nên apoptosis