nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen dreb5 phân lập từ hai giống đậu tương địa phương xuân lạng sơn và lơ bắc giang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM







VŨ THỊ HƢỜNG






NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GEN DREB5 PHÂN LẬP
TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG ĐỊA PHƢƠNG XUÂN LẠNG SƠN
VÀ LƠ BẮC GIANG

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC



Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS. Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên, 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

i




LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa có ai công bố
trong một công trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ii
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ chuyên
ngành Di truyền học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm- Đại học Thái Nguyên, tôi đã
nhận đƣợc sự ủng hộ, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các đồng nghiệp, bạn bè
và gia đình.
Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hoàng
Mậu đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý
báu để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Trƣờng Đại
học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình
thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Sinh- KTNN và khoa Sau
đại học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm- Đại học Thái Nguyên. Tôi xin chân thành
cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại đã giúp đỡ và
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, bạn bè và
đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua.

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 4 năm 2012
Tác giả

Vũ Thị Hƣờng




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iii
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 3
3. Nội dung nghiên cứu 3
Chƣơng 1 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1.CÂY ĐẬU TƢƠNG 4
1.1.1.Đặc điểm sinh học cây đậu tƣơng 4
1.1.2. Giá trị kinh tế của cây đậu tƣơng 6
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và ở Việt Nam 7
1.2. GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG
11
1.2.1. Nhóm gen chức năng liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn của cây đậu
tƣơng 12
1.2.2. Nhóm gen điều khiển quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn 15
1.3. NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB5 VÀ GEN DREB5 20
1.3.1. Nhân tố phiên mã DREB5 20

1.3.2. Gen DREB5 21
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 27
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 27
2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 28
2.2.1. Hóa chất 28
2.2.2 Thiết bị 28
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.3.1. Phƣơng pháp sinh học phân tử 30
2.3.2. Phƣơng pháp phân tích trình tự gen 36
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iv
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
3.1. KẾT QUẢ NHÂN BẢN GEN DREB5 TỪ HỆ GEN CỦA HAI GIỐNG
ĐẬU TƢƠNG XLS VÀ LBG 37
3.1.1. Tách chiết DNA từ lá non hạt đậu tƣơng 37
3.1.2. Kết quả nhân bản gen GmDREB5 bằng phản ứng PCR 38
3.2. TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN GmDREB5 40
3.3. SO SÁNH TRÌNH GEN GmDREB5 PHÂN LẬP TỪ HAI GIỐNG ĐẬU
TƢƠNG XLS VÀ LBG VỚI CÁC TRÌNH TỰ ĐÃ CÔNG BỐ 43
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

v
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

2,4 D
2,4- Diclorophenoxyacetic acid
ABA
Abscisis acid
bp
Cặp base
BAP
6- Bezyl amino purin
đtg
Cộng sự
DNA
Deoxiribonucleic acid
DREB
Dehydration- Responsive Element Binding
EDTA
Ethyen Diamin Tetraacetic Acid
HSP

Heat shock protein
kb
Kilo base
LEA
Late Embryogenesis Abundant protein (Protein tích luỹ với số
lƣợng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi)
LTP
Lipid Tranfer protein (Protein vận chuyển lipid)
LBG
Lơ Bắc Giang
MGPT
Môi giới phân tử
MS
Murashige- Skoog
NAA
Naphtyacetic acid
PCR
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)
P5CS
Pyrroline- 5- Carboxylate Synthetase
TAE
Tris acetat EDTA
TBE
Tris borat EDTA
XLS
Xuân Lạng Sơn


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
Bảng 1.1
Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ 2005- 2011
9
Bảng 2.1
Nguồn gốc của các giống đậu tƣơng nghiên cứu.
27
Bảng 2.2
Danh mục các thiết bị đã sử dụng
29
Bảng 2.3
Trình tự cặp mồi nhân gen DREB5
31
Bảng 2.4
Thành phần phản ứng PCR
32
Bảng 2.5
Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
32
Bảng 2.6
Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT
34
Bảng 3.1
Giá trị mật độ quang của phổ hấp thụ DNA ở bƣớc sóng
260nm và 280nm của giống đậu tƣơng XLS và LBG
38

Bảng 3.2
Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác của trình tự gen
GmDREB5 của 2 giống đậu tƣơng LBG và XLS với trình
tự gen GmDREB5 của 6 giống đậu tƣơng công bố trên
ngân hàng gen quốc tế
46
Bảng 3.3
Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác của trình tự amino
acid của Protein DREB5 của 2 giống đậu tƣơng LBG và
XLS với trình tự amino acid của Protein DREB5 của 6
giống đậu tƣơng công bố trên ngân hàng gen quốc tế

52



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

vii
DANH MỤC HÌNH

Hình
Tên hình
Trang
Hình 1.1
Sản xuất đậu tƣơng của Việt Nam
10
Hình 1.2
Sơ đồ mô tả gen và vùng mã hóa của gen GmDREB5 ở
đậu tƣơng

22
Hình 1.3
Sơ đồ mô tả protein GmDREB5 ở đậu tƣơng
22
Hình 1.4
Trình tự amino acid của vùng AP2 của protein
DREB5 ở đậu tƣơng
23
Hình 1.5
Mô hình cấu trúc của miền AP2 của protein DREB5
23
Hình 1.6
Điểm liên kết với DNA của protein DREB5 (DNA
binding site)
24
Hình 1.7
Sơ đồ các điểm DNA- Binding của protein DREB5 ở
đậu tƣơng
24
Hình 1.8
Sự đa dạng và mối quan hệ của vùng AP2 của protein
DREB5 ở đậu tƣơng
25
Hình 2.1
Hình ảnh các giống đậu tƣơng nghiên cứu
27
Hình 2.2
Sơ đồ vector pBT
34
Hình 3.1

Hình ảnh điện di DNA tổng số của 2 giống XLS và
LBG
38
Hình 3.2
Hình ảnh điện di sản phẩm nhân gen GmDREB5
39
Hình 3.3
Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E.coli chủng
DH5 chứa vector tái tổ hợp mang gen GmDREB5
40
Hình 3.4
Plasmid mang gen GmDREB5
41
Hình 3.5
So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5 phân
lập từ hai giống đậu tƣơng LBG và XLS
42
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

viii
Hình 3.6
So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5 phân
lập từ hai giống đậu tƣơng LBG và XLS với sáu trình
tự nucleotide của gen GmDREB5 đã công bố trên
Ngân hàng gen quốc tế
45
Hình 3.7
Biểu đồ hình cây so sánh mức độ tƣơng đồng gen
GmDREB5 của 8 giống đậu tƣơng

47
Hình 3.8
So sánh trình tự amino acid mã hoá bởi gen DREB5
phân lập từ 2 giống đậu tƣơng LBG và XLS

49
Hình 3.9
So sánh trình tự amino acid mã hoá bởi gen
GmDREB5 phân lập từ 2 giống đậu tƣơng LBG và
XLS với trình tự amino acid mã hoá bởi gen
GmDREB5 của 6 giống đậu tƣơng đã công bố trên
ngân hàng gen quốc tế

50
Hình 3.10
Biểu đồ hình cây so sánh mức độ tƣơng đồng Protein
DREB5 của 8 giống đậu tƣơng

52

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1
MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày có vị
trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp, là loại cây trồng chiến lƣợc
của nhiều quốc gia trên thế giới bởi có tác dụng nhiều mặt và có hiệu quả kinh
tế cao, có thời gian sinh trƣởng ngắn lại dễ trồng. Sản phẩm từ cây đậu tƣơng

đƣợc sử dụng cho ngƣời và gia súc do đáp ứng đƣợc nhu cầu đạm trong khẩu
phần ăn hằng ngày của ngƣời cũng nhƣ gia súc [1], [3].
Hạt đậu tƣơng đƣợc dùng làm thực phẩm cho con ngƣời, thức ăn cho gia
súc, nguyên liệu cho công nghiệp, là mặt hàng xuất khẩu. Trong hạt đậu
tƣơng có hàm lƣợng dinh dƣỡng cao, chứa 35%- 52% protein, 18%- 25% lipit,
20% glucid và nhiều loại axit amin cần thiết nhƣ: leucin, isoleucin, lysin,
metionin, phenylalanin, tryptophan, valin. Ngoài ra, trong hạt đậu tƣơng còn
chứa nhiều vitamin (B1, B2, A, D, E, K…) là thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng
cao rất cần thiết cho cơ thể ngƣời và động vật. Đặc biệt, protein của đậu tƣơng
đƣợc coi là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lƣợng đáng
kể các amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể, dễ tiêu hoá và không
có các thành phần tạo cholesterol. Lipit của đậu tƣơng chứa tỉ lệ lớn các axit
béo chƣa no, có hệ số đồng hoá lớn (98%), chỉ số iot cao (120-137). Sử dụng
protein và lipit của hạt đậu tƣơng còn có tác dụng chữa một số bệnh nhƣ: đái
tháo đƣờng, béo phì, huyết áp cao, chảy máu não… [3].
Ngoài ra, ở rễ cây đậu tƣơng có các nốt sần, đó là kết quả của sự cộng
sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ. Vì vậy, đậu tƣơng là loại cây
trồng có tác dụng cải tạo đất, làm cây trồng vụ sau phát triển tốt hơn, góp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
phần phá vỡ chu kỳ sâu bệnh, chống ô nhiễm môi trƣờng do lạm dụng phân
bón và thuốc trừ sâu [3].
Với những giá trị to lớn đó, cây đậu tƣơng đƣợc trồng phổ biến ở nhiều
nơi từ 55
o
vĩ Bắc đến 55
o
vĩ Nam, từ vùng thấp hơn mực nƣớc biển đến vùng
cao trên 2000m so với mực nƣớc biển với diện tích đạt khoảng hơn 74,7 triệu

ha. Ở Việt Nam hiện nay, cây đậu tƣơng chiếm một vị trí rất quan trọng trong
nền nông nghiệp, đƣợc gieo trồng ở cả 7 vùng nông nghiệp trên cả nƣớc với
mục đích giải quyết vấn đề thiếu protein cho ngƣời và gia súc, xuất khẩu và
cải tạo đất. Tuy nhiên, hiện nay diện tích trồng cây đậu tƣơng còn khá phân
tán, năng suất và chất lƣợng chƣa ổn định. Một trong những nguyên nhân làm
ảnh hƣởng đến năng suất và chất lƣợng hạt là do sự biến đổi khí hậu toàn cầu
theo hƣớng sa mạc hoá, gây hạn hán kéo dài. Vì vậy vấn đề đặt ra là phải
nghiên cứu và tuyển chọn những giống có khả năng chống chịu với điều kiện
bất lợi của môi trƣờng.
Khô hạn là yếu tố chính làm giảm năng suất đậu tƣơng. Hiện nay, ngƣời
ta đang tập trung vào đối tƣợng khô hạn và mặn, hai dạng gây stress phi sinh
học quan trọng đến sản xuất đậu tƣơng và đặt ra mục tiêu nghiên cứu hƣớng
tới cải tiến giống đậu tƣơng trên toàn cầu. Khô hạn có thể làm giảm 70% năng
suất cây trồng nói chung [12].
Có 2 nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn của cây trồng nói chung và
cây đậu tƣơng nói riêng, đó là nhóm gen mà sản phẩm của chúng tác động
trực tiếp tới quá trình chịu hạn (LEA, HSP, P5CS ) và nhóm gen mà sản
phẩm của chúng kích hoạt quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn. Trong
đó, các protein DREB là nhân tố tham gia vào quá trình phiên mã của nhóm
gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tƣơng. Protein DREB là nhân tố
kích thích các gen chức năng hoạt động và không phụ thuộc vào ABA. Tuy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
DREB không trực tiếp tham gia vào quá trình kháng hạn nhƣng nó giữ vai trò
là nhân tố kích hoạt đồng thời sự biểu hiện của các gen liên quan đến khả
năng chịu hạn. Do vậy, việc nghiên cứu gen DREB là cơ sở để cải thiện đặc
tính chịu hạn của cây đậu tƣơng thông qua kỹ thuật chuyển gen là cần thiết.
Xuất phát từ lý do trên tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm cấu
trúc gen DREB5 phân lập từ hai giống đậu tương địa phương Xuân Lạng

Sơn và Lơ Bắc Giang”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định đƣợc sự khác biệt về trình tự gen DREB5 của hai giống đậu
tƣơng địa phƣơng Xuân Lạng Sơn và Lơ Bắc Giang và sự đa dạng về cấu trúc
gen DREB5 ở cây đậu tƣơng trên cơ sở phân tích các trình tự đã công bố.
3. Nội dung nghiên cứu
- Khuếch đại gen DREB5 của hai giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn và Lơ
Bắc Giang bằng kỹ thuật PCR;
- Tách dòng và xác định trình tự gen DREB5 của hai giống đậu tƣơng
Xuân Lạng Sơn và Lơ Bắc Giang;
- So sánh trình tự gen DREB5 của hai giống giống đậu tƣơng Xuân Lạng
Sơn và Lơ Bắc Giang;
- So sánh trình tự gen DREB5, trình tự amino acid của protein DREB5
của các giống đậu tƣơng nghiên cứu với các trình tự đã công bố trên Ngân
hàng gen quốc tế.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG
Cây đậu tƣơng đƣợc thuần hóa ở Trung Quốc và đƣợc đƣa đến Triều
Tiên, Nhật Bản, Nga, sang Nam Á và Đông Nam Á qua con đƣờng tơ lụa. Ở
Việt Nam cây đậu tƣơng đƣợc trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh thuộc khu
vực trung du, miền núi phía Bắc và miền đông Nam Bộ.
Cây đậu tƣơng có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill có bộ nhiễm
sắc thể 2n = 40, là loại cây trồng thuộc họ Đậu (Fabaceae), họ phụ Cánh
Bƣớm (Papilionoideae) và bộ Phaseoleae. Cũng nhƣ một số cây họ đậu khác,

đậu tƣơng có khả năng cải tạo đất thông qua việc cố định đạm khí trời trên
các nốt sần ở rễ góp phần làm giảm nguy cơ thoái hoá đất do sử dụng phân
bón quá nhiều.
1.1.1. Đặc điểm sinh học cây đậu tƣơng
Cây đậu tƣơng là cây trồng cạn ngắn ngày, gồm các bộ phận chính: rễ,
thân, lá, hoa, quả, hạt.
Đậu tƣơng là cây hai lá mầm có rễ cọc, gồm rễ cái và rễ bên. Khi hạt
nảy mầm, phôi phát triển thành rễ cái. Rễ tập trung ở tầng đất mặt 30 – 40 cm,
ăn lan khoảng 20– 40 cm. Trên rễ có nhiều nốt sần, những nốt sần này đƣợc
ví nhƣ nhà máy sản xuất đạm. Trên nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium
japonicum có khả năng cố định đạm của không khí tạo thành đạm dễ tiêu. Nốt
sần có phẩm chất tốt thì to, có màu hồng. Số lƣợng và trọng lƣợng nốt sần có
liên quan trực tiếp đến sinh trƣởng và năng suất cây đậu tƣơng.
Cây đậu tƣơng là cây thân thảo, ít phân cành, dạng bụi. Thân hình tròn,
nhiều lông, mang nhiều đốt, thân thƣờng đứng, có khi bò hay nửa bò, thân
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
thƣờng có màu xanh, có từ 14 – 15 lóng, chiều cao trung bình từ 0,5 – 1,2 m,
thay đổi tuỳ theo giống, thời vụ, mật độ cây, đất đai, phân bón…
Cành đậu tƣơng mọc ra từ các đốt trên thân. Đốt đầu tiên của thân chính
mang hai lá mầm, đốt thứ hai mang hai lá đơn đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên
mỗi đốt mang một lá kép.
Lá đậu tƣơng có hình dạng khác nhau: tròn, hẹp, bầu dục, lƣỡi mác
hoặc hình thoi…nhƣng thƣờng quy thành hai loại là lá rộng và lá hẹp. Gồm có
các dạng lá theo từng thời kì sinh trƣởng, phát triển của cây: lá mầm, lá đơn
và lá kép có 3 lá chét, đôi khi có 4-5 lá chét.
Thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào
giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hƣởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ.
Hoa đậu tƣơng thuộc hoa cánh bƣớm, mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ

7 – 8 hoa, có màu trắng hoặc tím, mọc ở ngọn hay nách lá.
Quả đậu tƣơng thuộc loại quả ráp, đa số ngoài vỏ có lông bao phủ, khi
chín có màu vàng hoặc xám đen. Mỗi quả có 1 - 4 hạt, nhƣng thƣờng có 2 hạt.
Hạt đậu tƣơng có hình dạng tròn hay bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, vỏ hạt
thƣờng nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu đen…nhƣng đa số là hạt
màu vàng. Khối lƣợng hạt dao động từ 200 – 400 mg/hạt.
Cây đậu tƣơng có 2 đặc tính sinh trƣởng: sinh trƣởng hữu hạn và sinh
trƣởng vô hạn; căn cứ vào thời gian sinh trƣởng có 3 loại: chín sớm (75- 85
ngày), trung bình (80- 100 ngày), chín muộn (110- 120 ngày).
Đậu tƣơng là cây trồng tƣơng đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh.
Trong tập đoàn giống đậu tƣơng, có những giống chỉ trồng vào vụ hè, ngƣợc
lại có những giống chỉ trồng vào vụ đông [3], [5].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
1.1.2. Giá trị kinh tế của cây đậu tƣơng
Đậu tƣơng là cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Sản phẩm của
nó làm thức ăn cho con ngƣời, gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, là hàng xuất
khẩu, cải tạo đất tốt.
Giá trị về mặt thực phẩm
Mặc dù thành phần hóa sinh của hạt phụ thuộc vào giống cây, điều kiện
canh tác, khí hậu, dịch bệnh…Nhƣng so với các loài thực vật khác thì hạt đậu
tƣơng có hàm lƣợng protein cao nhất, hàm lƣợng protein trung bình khoảng
35% - 40%. Trong khi đó hàm lƣợng protein trong gạo chỉ chứa 6,2- 12%,
ngô 9,8- 13,2%, thịt bò 21%, thịt gà 20%, cá 17- 20% và 13- 14,8%. Trong
hạt đậu tƣơng, protein dự trữ (chủ yếu là albumin và globulin) chiếm 70%
protein tổng số, Hàm lƣợng lipit từ 18%- 25%, glucid 20%. Ngoài ra là các
enzyme; các chất ức chế protease và lectin; muối khoáng; các vitamin nhóm
B; các amino acid cơ bản nhƣ isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin,

tryptophan, valin. Đặc biệt, protein của đậu tƣơng đƣợc coi là một nguồn
cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lƣợng đáng kể các amino acid không
thay thế cần thiết cho cơ thể, dễ tiêu hoá và không có các thành phần tạo
cholesteron. Do có thành phần dinh dƣỡng cao nên đậu tƣơng có khả năng
cung cấp năng lƣợng khá cao, khoảng 4700 cal/kg.
Hiện nay, từ hạt đậu tƣơng ngƣời ta đã chế biến ra đƣợc trên 600 sản
phẩm khác nhau, trong đó có hơn 300 loại làm thực phẩm nhƣ: đậu phụ,
tƣơng, xì dầu, sữa, bánh kẹo Ngoài ra, lipit của đậu tƣơng chứa tỉ lệ lớn các
axit béo chƣa no, có hệ số đồng hoá lớn (98%), chỉ số iot cao (120-137).


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
Giá trị về mặt công nghiệp
Đậu tƣơng là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau nhƣ
chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, dầu
bôi trơn trong ngành hàng không nhƣng chủ yếu đậu tƣơng đƣợc dùng để ép
dầu. Hiện nay, trên thế giới có 8 loại cây lấy dầu quan trọng đó là: đậu tƣơng,
bông, lạc, hƣớng dƣơng, cải dầu, dừa và cọ. Trong đó, đậu tƣơng là cây đứng
đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu. Dầu đậu tƣơng chiếm 50% tổng
lƣợng dầu thực vật. Từ dầu đậu tƣơng ngƣời ta chế biến ra hàng trăm sản
phẩm công nghiệp khác nhƣ làm nến, xà phòng, ni lông Về xuất khẩu, đậu
tƣơng là mặt hàng nông sản có giá trị ổn định trên thị trƣờng thế giới. Trung
bình một năm, lƣợng hạt đậu tƣơng xuất khẩu ƣớc tính khoảng 24- 26 triệu
tấn và khoảng 2- 4 triệu tấn dầu.
Giá trị về mặt nông nghiệp
Đậu tƣơng là nguồn thức ăn tốt cho gia súc. 1kg hạt đậu tƣơng tƣơng
đƣơng với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi. Toàn cây đậu tƣơng có hàm lƣợng
đạm khá cao nên các sản phẩm phụ nhƣ thân lá tƣơi có thể sử dụng làm thức

ăn cho gia súc. Đậu tƣơng còn là cây luân canh cải tạo đất tốt. 1ha trồng đậu
tƣơng nếu sinh trƣởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30 – 60kg Nitơ. Trong
hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tƣơng vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ
có tác dụng tốt đối với cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây
trồng mà giảm chi phí cho việc bón đạm. Thân và lá đậu tƣơng dùng bón
ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm lƣợng Nitơ trong thân chiếm 0,05%,
trong lá chiếm 0,19%.
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và ở Việt Nam
Với những giá trị kinh tế và và giá trị sử dụng, cây đậu tƣơng đƣợc xem
là một loại cây trồng chiến lƣợc của nhiều quốc gia, với vị trí thứ tƣ, sau lúa,
ngô và lúa mỳ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
Đậu tƣơng có khả năng thích ứng khá rộng nên đƣợc trồng khắp các
châu lục, đặc biệt là châu Mỹ (75,68%) và châu Á (21,27%).
Trong những năm gần đây, do kết quả của việc ứng dụng những tiến bộ
của công nghệ sinh học từ chọn, tạo giống đến sản xuất nên năng suất đậu
tƣơng đã tăng lên đáng kể, đƣa đậu tƣơng trở thành cây trồng quan trọng
trong cơ cấu cây trồng của nhiều quốc gia.
Hiện nay, đậu tƣơng đƣợc trồng ở gần 80 quốc gia khác nhau trên thế giới.
Trong đó, 4 nƣớc có sản lƣợng đậu tƣơng đứng đầu là: Mỹ, Brazil, Argentina và
Trung Quốc. Đậu tƣơng là nguồn cung cấp dầu và protein quan trọng.
Ở Việt Nam, đậu tƣơng đƣợc trồng từ rất lâu, trƣớc cây đậu xanh và
các cây họ đậu khác. Các giống đậu tƣơng ở nƣớc ta bao gồm các giống đậu
tƣơng nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tƣơng đột biến và các giống đậu
tƣơng địa phƣơng.
Trƣớc cách mạng tháng 8 năm 1945, diện tích gieo trồng đậu tƣơng ở
Việt Nam chỉ khoảng 32 ha, năng suất 4,1 tạ/ha. Hiện nay, diện tích đó đã
đƣợc tăng lên đáng kể, cả nƣớc có 7 vùng nông nghiệp đều trồng đƣợc đậu

tƣơng với diện tích gieo trồng (năm 1997) lớn nhất là miền núi phía bắc
(46,6%), tiếp đến là đồng bằng sông Hồng (19,3%), vùng Tây Nguyên (11%),
miền Đông Nam Bộ (10,2%). đồng bằng sông Cửu Long (8,9%), khu Bốn
(2,3%), vùng Duyên hải miền Trung (1,6%) [5].
Cây đậu tƣơng chiếm một vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp của
nƣớc ta hiện nay, đặc biệt ở những vùng nông thôn nghèo, kinh tế chƣa phát
triển.
Mặc dù quy mô sản xuất còn khá nhỏ và nhu cầu tiêu thụ trong nƣớc có
xu hƣớng giảm, nhƣng sản lƣợng đậu tƣơng nƣớc ta năm 2010 vẫn đạt
297.000 tấn, tăng 39% so với năm 2009. Nguyên nhân chính là do sự mở rộng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9
đáng kể về diện tích cây trồng (khoảng 35%) và những nỗ lực nhằm cải thiện
năng suất của ngành. Tuy nhiên, sản lƣợng trên vẫn còn thấp so với mục tiêu
đề ra cho năm 2010 là 325.000 tấn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông
thôn do chi phí sản xuất tăng và năng suất đậu tƣơng của nƣớc ta chƣa cao.
Theo số liệu thống kê chính thức của chính phủ, đậu tƣơng đƣợc trồng
ở 28 tỉnh trên khắp cả nƣớc, trong đó 70% ở miền bắc và 30% ở miền nam.
Khoảng 65% đậu tƣơng nƣớc ta đƣợc trồng ở vùng cao, những nơi đất không
cần màu mỡ; và 35% đƣợc trồng ở những vùng đất thấp ở khu vực đồng bằng
sông Hồng. Đậu tƣơng đƣợc trồng ở nhiều địa phƣơng trên khắp cả nƣớc vào
từng thời điểm khác nhau nên có cả vụ xuân, vụ hè và vụ đông.
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ 2005- 2011

2005
2006
2007
2008
2009

2010
2011
Diện tích canh
tác (nghìn ha)
204,1
185,6
190,1
192,1
146,2
197,
8
215*
Sản lƣợng
(tấn/ha)
1,43
1,39
1,45
1,39
1,46
002
1,63*
Tổng sản lƣợng
(nghìn tấn)
292,7
258,1
275,5
267,6
213,6
296,
9

350*
(Nguồn: Tổng cục thống kê Việt Nam, * số liệu ước tính của FSA)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10

Hình 1.1. Sản xuất đậu tƣơng của Việt Nam
Tuy nhiên, do chƣa đƣợc đầu tƣ cao nên năng suất đậu tƣơng còn
nhiều hạn chế. Xét về diện tích gieo trồng vẫn tăng qua các năm nhƣng tỉ lệ
diện tích gieo trồng đậu tƣơng còn thấp, chỉ khoảng 1,5- 1,6%. Năng suất
đậu tƣơng của nƣớc ta rất thấp, chỉ bằng 50- 70% năng suất đậu tƣơng của
toàn thế giới. Sản lƣợng đậu tƣơng sản xuất ra chƣa đủ đáp ứng nhu cầu
trong nƣớc. Hàng năm, chúng ta vẫn phải nhập khẩu một số lƣợng đáng kể
từ nƣớc ngoài.
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng trên, có thể là do dịch bệnh,
kỹ thuật canh tác, nhƣng chủ yếu là do biến đổi khí hậu và hạn hán. Vì vậy
một trong những yêu cầu thực tiễn đặt ra là nghiên cứu tạo ra giống đậu tƣơng
có khả năng thích nghi với những điều kiện sinh thái ở những vùng khác nhau.
Trong những năm gần đây, cùng với việc nghiên cứu các công nghệ
sinh học và các loại đậu tƣơng cao sản mới để tìm ra giống cho năng suất cao
với chi phí sản xuất thấp, các nhà chọn giống Việt Nam còn quan tâm nghiên
cứu các giống đậu tƣơng địa phƣơng có năng suất thấp nhƣng lại có chất
Năm
TSL nghìn tấn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11
lƣợng hạt cao và có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi
trƣờng nhƣ: nóng, lạnh, mặn, phèn, hạn

1.2. GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU
TƢƠNG
Cây đậu tƣơng thuộc nhóm cây chịu hạn kém. Các cây họ đậu nói
chung, cây đậu tƣơng nói riêng do có hàm lƣợng protein và lipid trong hạt cao
nên nhu cầu về nƣớc nhìn chung cao hơn các loại cây khác. Để tổng hợp 1 kg
chất khô cần 500- 530 kg nƣớc. Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nƣớc
của đậu tƣơng cũng khá cao, khoảng 50%, trong khi đó ở ngô là 30%, ở lúa là
26% [6].
Đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng liên quan chặt chẽ đến đặc điểm
hoá keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất. Tính chịu
hạn của cây đậu tƣơng mang tính đa gen. Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh
khác nhau: sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm tƣơng đối, cũng nhƣ
bản chất di truyền của từng giống trong quá trình sinh trƣởng và phát triển có
khả năng sử dụng nƣớc tiết kiệm.
Hạn hán và độ mặn cao có ảnh hƣởng làm giảm mạnh năng suất cây
trồng trên toàn thế giới (Boyer 1982) trong đó có đậu tƣơng. Để thích ứng
với điều kiện nhƣ vậy cơ thể thực vật đã phát triển một loạt các cơ chế đòi hỏi
sự khởi động của nhiều gen liên quan chống lại stress do các điều kiện bất lợi
vô sinh. Một số lƣợng lớn các gen liên quan đến khả năng chịu hạn và chịu
mặn đã đƣợc xác định. Tuy nhiên, vẫn còn một số lƣợng đáng kể các gen liên
quan đến tính chống chịu của thực vật chƣa đƣợc xác định (Bzay 1997, Zhu
2002). Vì vậy điều quan trọng là nghiên cứu các chức năng của gen liên quan
đến stress để cải thiện khả năng chống chịu của cây trồng với hạn hán. Có hai
nhóm gen có liên quan chủ yếu đến tính chịu hạn của cây đậu tƣơng:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
(1). Nhóm gen mà sản phẩm của chúng có ảnh hƣởng trực tiếp tới đặc
tính chịu hạn; (2). Nhóm gen mà sản phẩm của chúng kích hoạt quá trình
phiên mã của nhóm gen chịu hạn.

1.2.1. Nhóm gen chức năng liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn của cây
đậu tƣơng
Các gen chức năng liên quan đến tính chịu hạn bao gồm: LEA, HSP,
Chaperons, LTP, P5CS….
LEA (Late embryogenesis abundant protein)
LEA là loại protein đƣợc tổng hợp với số lƣợng lớn trong giai đoạn
cuối của quá trình hình thành phôi, là một trong những nhóm protein liên
quan đến điều kiện mất nƣớc của tế bào. Nhóm gen mã hóa loại protein LEA
đóng vai trò quan trọng trong sự chịu khô hạn của hạt và liên quan đến khả
năng chống hạn của cây. Khi hiện tƣợng mất nƣớc xảy ra, gen LEA phiên mã
tổng hợp một số lƣợng lớn mRNA trong hạt chín và bị phân giải hết trong quá
trình nảy mầm. Mức độ phiên mã của gen LEA đƣợc điều khiển bởi acid
abcisic (ABA) và độ mất nƣớc của tế bào, áp suất thẩm thấu trong tế bào.
Protein LEA đƣợc chú ý trong điều kiện thực vật bị stress do thiếu
nƣớc [10], [12]. Nhiều gen LEA đã đƣợc nghiên cứu, phân lập, xác định chức
năng. Đặc điểm nổi bật của nhóm LEA là: giàu acid amin ƣa nƣớc, không
chứa cystein và tryptophan, có vùng xoắn α và có khả năng chịu nhiệt. Chúng
thay thế vị trí nƣớc trong tế bào và thực hiện các chức năng khác nhau nhƣ: cô
lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủy protein biến tính và điều chỉnh
áp suất thẩm thấu. Sự biểu hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại
phân tử của nó cho thấy nó có vai trò trong bảo vệ cây trồng chống chịu sự
mất nƣớc [11]. Protein LEA đƣợc tạo ra hàng loạt trong giai đoạn muộn của
quá trình hình thành phôi.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
LEA đƣợc chia thành 6 nhóm: nhóm 2- D19, nhóm 2- D11 (còn gọi là
dehydrin), nhóm 3- D7, nhóm 4- D113, nhóm 5- D29, nhóm 6- D95. Khi điều
kiện mất nƣớc xảy ra, LEA đƣợc tổng hợp với số lƣợng lớn, trong đó
dehydrin có thể chiếm tới 1% tổng số protein hòa tan của hạt. Ngày nay,

ngƣời ta đã phân lập đƣợc 30 gen khác nhau thuộc thành viên của nhóm gen
dehydrin ở các cây trồng khác nhau. Gen mã hóa protein dehydrin ở đậu
tƣơng đã đƣợc nghiên cứu tại một số phòng thí nghiệm trên thế giới và tới nay
đã có một số trình tự gen dehydrin đậu tƣơng và một số thực vật khác đƣợc
công bố trên ngân hàng trình tự gen quốc tế.
HSP (Heat Shock Protein) và môi giới phân tử (Chaperons)
HSP có mặt hầu hết ở các loài thực vật nhƣ: lúa mì, lúa mach, ngô,
đậu… chiếm khoảng 1% protein tổng số trong lá và có hầu hết ở các loài thực
vật. Sự xuất hiện của HSP có chức năng ngăn cản hoặc sửa chữa sự phá hủy
do stress nóng và mở rộng giá trị ngƣỡng nhiệt độ với sự chống chịu nhiệt độ
cao. Trong các tế bào thực vật HSP tế bào chất tập trung thành các hạt sốc
nhiệt (HSG- Heat Shock Granules). Ngƣời ta cho rằng HSG gắn kết trên các
RNA polymerase để ngăn cản sự phiên mã tổng hợp mRNA trong quá trình
stress nóng. Sau khi gặp sốc nóng, các hạt này phân tán và liên kết dày đặc
với các ribosome hoạt động sinh tổng hợp protein. HSP xuất hiện trong các
quá trình sinh trƣởng bình thƣờng, các giai đoạn biệt hóa mô và cả trong thời
kỳ sinh trƣởng của thực vật. Ngoài ra, chúng đƣợc tổng hợp thêm trong điều
kiện cực đoan của môi trƣờng [4].
Dựa trên khối lƣợng phân tử, HSP có thể chia thành 6 nhóm: HSP110,
HSP90, HSP70, HSP60, HSP20, HSP8,5. Trong nhóm HSP có rất nhiều đại
diện của chất môi giới phân tử (MGPT) là HSP70, HSP60 nhƣng cũng có
HSP không phải là MGPT nhƣ HSP8,5 (Ubiquitin). Ubiquitin đƣợc xem là
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
chất bảo vệ tế bào, chúng có hoạt tính protease và thực hiện chức năng phân
giải các protein không có hoạt tính enzyme, ngăn chặn các protein này gây
độc cho tế bào. Ubiquinin đóng vai trò quan trọng trong tự sửa chữa tế bào
bằng cách loại bỏ các protein biến tính khi gặp yếu tố cực đoan.
Các MGPT là chìa khóa tham gia nội cân bằng tế bào trong các điều

kiện sinh trƣởng cực thuận và đối lập. MGPT là một nhóm gồm nhiều loại
protein khác nhau. Phần lớn các MGPT có hoạt tính ATP- ase. Chức năng
chính của MGPT là: (1) Giữ ổn định chuỗi polypeptid khi đang tổng hợp và
tạo cấu trúc không gian đúng cho chúng; (2) Tạo lại cấu trúc không gian của
protein sau khi vận chuyển qua màng tế bào; (3) Lắp ráp các chuỗi polypeptid
vào phức để tạo cấu trúc bậc 4; (4) MGPT đƣợc tăng cƣờng nhờ quá trình
tổng hợp trong điều kiện cực đoan do nhu cầu cấp thiết của tế bào, nhất là sốc
nhiệt [18].
MGPT có 5 họ chính là: HSP 70 (Dnak), HSP 60 (Chaperonin), HSP
90, HSP 100 và sHSP (small HSP) trong đó có hai họ môi giới phân tử đƣợc
nghiên cứu nhiều nhất là chaperonin và HSP70. HSP70 đã đƣợc phân lập ở
đậu xanh.
Yang và đtg (2008) đã phân lập gen HSP 60 ở đậu tƣơng và đăng ký
trên ngân hàng gen NCBI với mã số EU036414, kích thƣớc là 498 bp [36].
Wang và đtg (2010) đã nghiên cứu phân lập gen HSP 90 và đăng ký
trên ngân hàng gen NCBI với mã số FJ969431, kích thƣớc là 2100 bp [35].
Lei và đtg (2011) đã phân lập gen GmHSP 70, kích thƣớc 1683 bp [23].



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

15
P5CS (pyrroline- 5- carboxylase)
P5CS là một trong những enzyme chức năng, cấu trúc của nó bao gồm
hai domain xúc tác của hai enzyme là glutamyl kinase và glutamic
seminaldehyde synthase. P5CS tham gia vào quá trình tổng hợp proline.
Proline đóng vai trò quan trọng trong quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu
trong cơ thể thực vật. P5CS biểu hiện mạnh mẽ làm tăng hàm lƣợng proline,
qua đó tăng cƣờng áp suất thẩm thấu của tế bào và cây trong điều kiện khô

hạn. Gen mã hóa cho enzyme P5CS đã đƣợc nghiên cứu và tách dòng ở nhiều
loại cây khác nhau. Nhiều cây trồng đã đƣợc chuyển gen P5CS nhằm tăng
cƣờng khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng.
Prorcel và đtg (2005) đã nghiên cứu phân lập gen P5CS ở đậu tƣơng và
đã đăng ký trên ngân hàng gen NCBI với mã số là AJ715851, kích thƣớc là
831 bp [29]. Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Thuý Hƣờng và đtg (2009) đã phân lập
gen P5CS từ mRNA với kích thƣớc 2148 bp [28].
LTP (Lipid transfer protein)
Gen LTP có khả năng tổng hợp ra protein thúc đẩy quá trình vận
chuyển phospholipid qua màng. LTP liên quan đến sinh tổng hợp các biểu
bì, làm tăng độ dày của lớp màng tế bào, qua đó làm giảm sự mất nƣớc ở
thực vật.
Gen LTP đã đƣợc phân lập ở một số cây trồng nhƣ đậu xanh,
Arabidopsis [24], [25], [26].
1.2.2. Nhóm gen điều khiển quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn
Tuy không tác động trực tiếp đến tính chịu hạn của thực vật nhƣng các
gen điều khiển phiên mã lại có vai trò đáng kể trong việc kích thích sự biểu
hiện các gen chức năng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16
Các gen điều khiển sự phiên mã mà sản phẩm của chúng có khả năng
hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen chức năng thông qua việc bám
vào trình tự DNA điều khiển (nhân tố tác động cis) trên vùng khởi động
(promoter) của gen và tƣơng tác với RNA polymerase tạo thành phức hợp
khởi đầu quá trình phiên mã của các gen chức năng.
Theo nghiên cứu của một số tác giả đã đƣợc công bố trên Ngân hàng
gen quốc tế, có nhiều yếu tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chịu hạn nhƣ:
DREB, ABRE, NAC, bZIP, ZFHD…[17], [21], [33].
Gen DREB

Stress phi sinh học và sinh học ảnh hƣởng tiêu cực đến sinh trƣởng,
phát triển và năng suất cây trồng. Gần đây, một số yếu tố phiên mã tác động
đến sự biểu hiện của của các gen liên quan đến stress đã đƣợc phát hiện. Một
trong những nhóm của yếu tố phiên mã đó là nhóm DREB/CBF liên kết với
các yếu tố tác động cis đáp ứng hạn hán. DREBs thuộc họ ERF của các yếu tố
phiên mã bao gồm hai nhóm con, là DREB1/CBF và DREB2 đƣợc gây ra bởi
lạnh và mất nƣớc. Các DREBs tham gia vào con đƣờng tín hiệu stress sinh
học. Từ đó có thể cho phép thực hiện các kỹ thuật tạo cây trồng chuyển gen
bằng cách điều khiển sự biểu hiện của DREBs. Điều này sẽ mở ra một cơ hội
tuyệt vời để phát triển cây trồng có khả năng chống chịu với các điều kiện bất
lợi [37].
Nhóm DREB là một trong những nhân tố phiên mã đã đƣợc công bố
trên Ngân hàng gen quốc tế, bao gồm: DREB, AREB, NAC, bZIP, MYB,
ZFHD…
Nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới cho
rằng, DREB là nhân tố phiên mã tham gia tích cực vào quá trình này bằng
cách kích hoạt nhanh chóng sự hoạt động của các gen tham gia trực tiếp