Nghiên cứu nhân nhanh invitro cây chuối tiêu hồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI














VŨ VĂN ðẠI



NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH INVITRO
CÂY CHUỐI TIÊU HỒNG



LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI














VŨ VĂN ðẠI



NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH INVITRO
CÂY CHUỐI TIÊU HỒNG



CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ : 60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS PHAN HỮU TÔN


HÀ NỘI – 2013
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

ii

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và không trùng lặp với các ñề tài khác.
Tôi cũng xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược
ghi rõ nguồn gốc.

Học viên



Vũ Văn ðại

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

iii

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi ñã nhận ñược sự quan tâm,
giúp ñỡ của nhiều cá nhân và cơ quan ñơn vị. Nay luận văn ñã hoàn thành,
tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới:
PGS. TS. Phan Hữu Tôn, người ñã tận tình hướng dẫn và tạo mọi ñiều
kiện, giúp ñỡ tôi nghiên cứu và thực hiện ñề tài.
Các thầy giáo, cô giáo thuộc Khoa Công nghệ sinh học, trường ðại
học Nông nghiệp Hà Nội ñã nhiệt tình giảng dạy và tạo mọi ñiều kiện cho tôi
hoàn thành khóa học.
Các cán bộ, kỹ thuật viên phòng Ứng dụng tiến bộ KHCN– Sở Khoa học
và Công nghệ Bắc Ninh ñã nhiệt tình hướng dẫn, giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện
cho tôi thực hiện luận văn. Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền
Nông nghiệp Việt Nam ñã cung cấp mẫu vật nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia ñình
và bạn bè ñã giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt thời gian học tập.
Bắc Ninh, tháng 9 năm 2013
Học viên

Vũ Văn ðại



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

iv

MỤC LỤC


Lời cam ñoan ii
Lời cảm ơn iii
Mục lục iv
Danh mục các chữ viết tắt vii
Danh mục bảng viii
Danh mục hình ix
MỞ ðẦU 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1 VÀI NÉT VỀ PHÂN LOẠI VÀ ðẶC ðIỂM CỦA CHUỐI 4
1.1.1 ðặc ñiểm thực vật học của họ chuối 4
1.1.2 ðặc ñiểm thực vật học của chi chuối Tiêu. 6
1.1.3 ðặc diểm thực vật học của chuối Tiêu Hồng. 6
1.2 ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
THỰC VẬT TRONG CÔNG TÁC NHÂN GIỐNG CÂY
TRỒNG 7
1.2.1 Các hướng nghiên cứu ứng dụng 7

1.2.2 Ưu thế của nhân giống in vitro 7
1.2.3 Các phương thức nhân giống in vitro 8
1.2.4 Quy trình nhân giống in vitro 9
1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CHUỐI BẰNG KỸ
THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO 11
1.3.1 Các nghiên cứu trong nước 11
1.3.2 Các nghiên cứu của nước ngoài 13
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1 VẬT LIỆU, ðỊA ðIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 14

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

v

2.1.1 Vật liệu thực vật 14
2.1.2 Hóa chất và thiết bị 14
2.1.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu. 14
2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 15
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 15
2.3.2 Phương pháp pha môi trường và nuôi cấy 15
2.3.2 Phương pháp ra cây 16
2.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 17
2.3.4 Phương pháp thu thập số liệu và xử lý số liệu 23
2.3.5 Phương pháp tính toán kết quả 24
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25
3.1 So sánh ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy MS, B5 và
Phytamax tới sự phát sinh chồi và tạo cụm chồi chuối Tiêu Hồng. 25
3.2 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm
cytokinin tới sự phát sinh chồi và tạo cụm chồi chuối Tiêu Hồng. 27

3.2.1 Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi và tạo cụm chồi chuối Tiêu
Hồng. 27
3.2.2 Ảnh hưởng của kinetin lên sự phát sinh chồi và tạo cụm chồi ở
chuối Tiêu Hồng. 30
3.3 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin
tới sự phát sinh rễ chuối Tiêu Hồng. 32
3.3.1 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng α-NAA ñến sự phát
sinh rễ của chuối Tiêu Hồng. 32
3.3.2 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IAA ñến sự phát sinh
rễ của chuối Tiêu Hồng. 33
3.3.3 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IBA ñến sự hình
thành rễ của chuối Tiêu Hồng. 34

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

vi

3.4 Ảnh hưởng của tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng thuộc
nhóm cytokinin và auxin ñến sự sinh trưởng của chuối Tiêu
Hồng. 36
3.4.1 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và α-
NAA ñến sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng. 36
3.4.2 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IAA
ñến sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng. 37
3.4.3 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IBA
ñến sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng. 38
3.4.4 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và α-
NAA ñến sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng. 39
3.4.5 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IAA
ñến sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng. 41

3.4.6 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IBA
ñến sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng. 42
3.5 Ảnh hưởng của giá thể ñến sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng. 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46
KẾT LUẬN 46
KIẾN NGHỊ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
PHỤ LỤC 51




Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

α-NAA
ABA
BAP
IAA
IBA
KC
MS
RE
VW
Axit α-naphthaleneacetic
Axit abscisic
Benzylamino purine

Axit indol axetic
Axit indol butyric
Knudson C
Murashige and Skoog
Robert Ernst
Vacin and Went




Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

viii

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

3.1 So sánh ảnh hưởng của môi trường MS, B5 và Phytamax tới sự
phát sinh chồi và tạo cụm chồi ở chuối Tiêu Hồng. 25
3.2 Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi và tạo cụm chồi ở chuối
Tiêu Hồng. 29
3.3 Ảnh hưởng của kinetin tới sự phát sinh chồi và tạo cụm chồi ở chuối
Tiêu Hồng. 31
3.4 Ảnh hưởng của α-NAA tới sự phát sinh rễ chuối Tiêu Hồng 32
3.5 Ảnh hưởng của IAA tới sự phát sinh rễ ở chuối Tiêu Hồng 33
3.6 Ảnh hưởng của IBA tới sự phát sinh rễ ở chuối Tiêu Hồng. 35
3.7 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và α-
NAA tới sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng. 37
3.8 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IAA

tới sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng. 38
3.9 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IBA
tới sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng. 39
3.10 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và α-
NAA tới sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng. 40
3.11 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IAA
tới sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng. 41
3.12 Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IBA
tới sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng. 43
3.13 Kết quả ra cây 44



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

ix

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

3.1 So sánh ảnh hưởng của môi trường MS, Phytamax và B5 tới sự
phát sinh chồi và tạo cụm chồi chuối Tiêu Hồng. 27
3.2 Ảnh hưởng của kinetin tới sự phát sinh chồi và tạo cụm chồi ở
chuối Tiêu Hồng 31
3.3 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin
tới sự phát sinh rễ của chuối Tiêu Hồng. 35
3.4 Hình ảnh sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng trên giá thế ñất + cát
+ trấu hun (1:1:1) 45

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

1

MỞ ðẦU

1. ðẶT VẤN ðỀ
Công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật ñã trải qua hơn một trăm năm
hình thành và phát triển, ñem lại giá trị to lớn cho loài người. Hiện nay, hầu
hết các cơ sở nghiên cứu giống cây trồng trên thế giới ñều áp dụng công nghệ
này với các mục ñích khác nhau.
Ở Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật ñã ñược bắt ñầu
nghiên cứu và ứng dụng từ giữa những năm 70 của thế kỷ XX. Những kết quả
bước ñầu trong nghiên cứu và ứng dụng ñã ñạt kết quả khả quan ñối với một
số ñối tượng cây trồng như khoai tây, mía, lúa…, ñặc biệt là chuối.
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt ñới gió mùa, nóng ẩm mưa nhiều, là
ñiều kiện lý tưởng cho sự sinh trưởng và phát triển của chuối. Chuối như một
loại cây quan trọng trong chuyển dịch cơ cấu cây trồng trong nông nghiệp ven
ñô. Trong thế giới các loài chuối, chuối Tiêu Hồng ñược ưa chuộng hơn cả.
Chuối Tiêu Hồng có màu sắc ñẹp, ñộ chín của quả ñồng ñều. Ngoài giá trị dinh
dưỡng, chuối còn có ý nghĩa lớn trong nền kinh tế quốc dân. Giống chuối này từ
lâu ñã ñược con người thuần hoá, sưu tầm ñể tạo ra giống như ý muốn phục vụ
nhu cầu của con người. Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, chuối
Tiêu Hồng ñược nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô hiện ñại với hệ số
nhân giống cao, sạch bệnh, cây cho thu hoạch ñồng loạt. Hiện nay quy trình
sản xuất cây giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật ñã ñược hoàn thiện bởi
các Viện nghiên cứu như ( Viện Rau quả, Viện Di truyền Nông nghiệp,
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ). Hàng năm các Viện ñã cung cấp rất
nhiều cây giống ñến tay người sản xuất. Tuy nhiên cây giống sản xuất bằng
nuôi cấy mô thường ñắt ñỏ và ñể chủ ñộng cung cấp nguồn cây giống tại chỗ,

theo yêu cầu thời vụ và sản xuất hàng hóa tập trung thì việc sản xuất cây giống

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

2

in vitro trực tiếp tại các tỉnh là lựa chọn tối ưu cả về kinh tế cũng như từng
bước nâng cao trình ñộ chuyên môn cho ñội ngũ kỹ thuật viên tại các tỉnh.
Hiện nay tại Bắc Ninh sau khi thực hiện chủ trương dừng sản xuất gạch
thủ công mặt bằng bãi gồ ghề, phần lớn diện tích hiện vẫn bỏ hoang hóa tổng
diện tích ñất bãi sản xuất nông nghiệp là 2400ha. Do vậy việc ñưa vào trồng
cây chuối Tiêu Hồng ñược nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào
góp phần quan trọng vào việc khai thác tiềm năng về ñất ñai, lao ñộng ñể từng
bước phát triển một nền sản xuất nông nghiệp hàng hóa có giá trị kinh tế cao
trên cơ sở áp dụng những tiến bộ khoa học công nghệ tiên tiến. Với mục tiêu
ñó thì Trung tâm Thông tin và Ứng Dụng tiến bộ khoa học công nghệ có
nhiệm vụ ñưa cây chuối nhân nhanh in vitro vào tại tỉnh nhằm hạ giá thành
cây giống và chủ ñộng cung cấp cây giống ñáp ứng nhu cầu sản xuất là cần thiết.
Xuất phát từ yêu cầu ñó chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:
“Nghiên cứu nhân nhanh invitro cây chuối Tiêu Hồng (M.acuminata)”
trong ñiều kiện thực tế phòng thí nghiệm của ñịa phương nhằm nhân
nhanh giống chuối Tiêu Hồng sạch bệnh, góp phần nâng cao hiệu quả cho
người trồng chuối và thúc ñẩy việc áp dụng tiến bộ khoa học công nghệ
vào sản xuất nông nghiệp tỉnh Bắc Ninh.
2. MỤC ðÍCH, YÊU CẦU CỦA ðỀ TÀI
2.1. Mục ñích
- Tìm ñược môi trường tối ưu trong nhân giống in vitro chuối Tiêu Hồng.
- Tìm ñược giá thể thích hợp nhất ñể ñưa cây chuối Tiêu Hồng từ trong
ống nghiệm ra môi trường tự nhiên.
2.2. Yêu cầu

- Xác ñịnh ñược môi trường nuôi cấy tốt nhất.
- Xác ñịnh ñược môi trường thích hợp cho việc nhân nhanh ñể cho hệ
số nhân cao và chất lượng tốt.
- Xác ñịnh ñược môi trường thích hợp cho việc tạo rễ cho chồi và môi

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

3

trường thích hợp cho sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng.
- Xác ñịnh ñược giá thể thích hợp cho cây con ngoài vườn ươm.
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN.
3.1. Ý nghĩa khoa học.
- Các kết quả thu ñược sẽ làm cơ sở cho việc nghiên cứu và giảng dạy
ñối với cây chuối Tiêu Hồng.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn.
- Là cơ sở cho việc ñề xuất ñược quy trình nhân giống in vitro và thích
ứng cho cây chuối Tiêu Hồng cho phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tại Bắc Ninh.
- Góp phần bảo tồn, thúc ñẩy sản xuất cây chuối Tiêu Hồng như một
nghề trồng chuối mang lại giá trị kinh tế tại Bắc Ninh và các vùng lân cận.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. VÀI NÉT VỀ PHÂN LOẠI VÀ ðẶC ðIỂM CỦA CHUỐI
1.1.1. ðặc ñiểm thực vật học của họ chuối
Ngành : Ngọc Lan (Mangolophya)
Lớp : Hành (Liliopsida)
Phân lớp : Hành (Lilidae)
Bộ : Gừng (Zingibereles)
Họ : Chuối (Musacea)
Họ chuối gồm 2 chi với 70 loài, trong ñó: chi Ensete gồm 10 loài, phân bố
chủ yếu vùng Châu Phi; chi Musa gồm 60 loài phân bố ở các vùng nhiệt ñới [5].
Cây chuối có nguồn gốc từ ðông Nam Á, sau ñó ñược di thực sang
Châu Úc rồi tới các nước Trung và Nam Mỹ. Một số tác giả còn cho rằng từ
ðông Nam Á cây chuối ñược chuyển qua Madagasca vào lục ñịa Châu Phi,
sau ñó tới các ñảo Canari và Santodomigo (Champion,1976) [4].
Họ chuối gồm 2 chi với 70 loài, trong ñó: chi Ensete gồm 10 loài, phân bố
chủ yếu vùng Châu Phi; chi Musa gồm 60 loài phân bố ở các vùng nhiệt ñới [5].
Cây chuối có nguồn gốc từ ðông Nam Á, sau ñó ñược di thực sang
Châu Úc rồi tới các nước Trung và Nam Mỹ. Một số tác giả còn cho rằng từ
ðông Nam Á cây chuối ñược chuyển qua Madagasca vào lục ñịa Châu Phi,

sau ñó tới các ñảo Canari và Santodomigo (Champion,1976) [4].
1.1.1.1. Rễ chuối
Rễ chùm, có 2 loại là rễ ngang và rễ thẳng .
Rễ ngang: mọc xung quanh củ chuối và phân bố ở lớp ñất mặt từ 0 -
30cm, phần nhiều tập trung ở ñộ sâu 0,15cm, bề ngang rộng tới 2 - 3 cm loại
rễ này sinh trưởng khỏe, phân bố rộng, ñó là loại rễ quan trọng nhất ñể hút
nước và dinh dưỡng nuôi cây.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

5

Rễ thẳng: mọc ở phía dưới củ chuối, ăn sâu tác dụng chủ yếu giữ cây
ñứng vững. Rễ chuối chứa nhiều nước, giòn, mềm, yếu, dễ gãy ; sức chịu hạn,
chịu úng ñều kém so với nhiều loại cây ăn trái khác [7;22].
1.1.1.2.Thân thật
Thân thật hay còn ñược gọi là củ chuối, có hình tròn dẹt và ngăn, khi phát
triển ñầy ñủ có thể rộng 30cm. Phần bên ngoài xung quanh củ chuối ñược bao
phủ bởi những vết sẹo từ bẹ lá có dạng tròn. Ở ñáy mỗi bẹ lá ñều có một chồi
mầm nhưng chỉ các chồi ở phần giữa củ là phát triển ñược, có khuynh hướng
mọc trồi dần lên. Các sẹo lá mọc rất gần nhau làm thành khoảng cách rất ngắn.
Củ chuối sống lâu năm, là cơ quan chủ yếu dự trữ chất dinh dưỡng, ñồng thời là
nơi ñể rễ, lá, mầm và cuống hoa mọc ra. Do ñó củ chuối to mập là cơ sở ñảm bảo
cho cây sinh trưởng nhanh, năng suất cao. Xung quanh củ chuối có nhiều mầm
ngủ, sau này sẽ phát triển thành cây con [22].
1.1.1.3.Thân giả và lá
Thân cây chuối là thân giả, hình trụ do nhiều bẹ lá lồng vào nhau làm
thành. Khi mầm chuối mới mọc lên thì bắt ñầu mọc ra những lá vảy (không
có thân lá) có tác dụng bảo vệ mầm chuối. Tiếp ñó mọc ra loại lá dài và hẹp
gọi là “lá kiếm ”. Về sau mọc ra những lá to bình thường gọi là lá thật. ðến

khi mầm hoa phân hóa thì mọc ra một lá chót nhỏ, ngắn có tác dụng che chở
buồng chuối.
Lá chuối phát triển mạnh nhất từ tháng 5 ñến tháng 8, mỗi tháng mọc ra
3 - 4 lá, phiến lá to, dày, màu xanh ñậm và bóng. Từ tháng 10 trở ñi, cách 2 -
3 tuần mới ra 1 lá mới, lá thường mỏng, nhỏ, màu xanh nhạt, sinh trưởng
chậm. ðến tháng 12 - 1 mỗi tháng chỉ mọc ñược 1 lá [22].
1.1.1.4.Hoa chuối
Cây chuối con sau khi mọc (hoặc sau khi trồng) 8 - 10 tháng bắt ñầu hình
thành mầm hoa, sau ñó khoảng 1 tháng bắt ñầu trổ buồng. Hoa chuối thuộc loại
hoa chùm gồm 3 loại: hoa cái, hoa lưỡng tính và hoa ñực [22].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

6

Hoa cái: tập trung ở phía gốc cuống buồng, phần này dài nhất (50 - 100
cm). Loại hoa này nở ra trước tiên, nhị cái phát triển, nhị ñực thoái hóa. Chỉ
có hoa cái là phát triển thành trái ñược. Do ñó, khi trồng, chọn lọc cây giống
tốt, chăm bón kịp thời ñể hình thành nhiều hoa cái là nhân tố quan trọng bảo
ñảm năng suất cao [22] .
Hoa lưỡng tính: nằm ở phần giữa bắp chuối, loại hoa này không nhiều
lắm, về sau sẽ rụng và không hình thành trái ñược [22].
Hoa ñực: nằm ở phía ñầu bắp chuối, nhị cái thoái hóa, nhị ñực phát
triển, dài bằng nhị cái. Loại hoa ñực không thể hình thành trái ñược sau này sẽ
khô ñi và rụng dần [22].
1.1.2. ðặc ñiểm thực vật học của chi chuối Tiêu.
Chuối tiêu thuộc loại cây thảo, sống lâu năm, thân cây tròn, mềm,
thẳng, có bẹ lá. Cuống hình tròn có khuyết rãnh, lá to, dài. Trái nằm trên
buồng, có từ 6-8 nải, mỗi nải khoảng 12 trái. Trái nhỏ, dài, mùi thơm. Khi
chín, vỏ vẫn màu xanh nhưng khi chín mùi thì màu vàng. Quả chuối có vị

ngọt, tính rất lạnh (tính hàn), không ñộc.
1.1.3. ðặc diểm thực vật học của chuối Tiêu Hồng.
Giống chuối tiêu hồng thuộc nhóm phụ chuối tiêu vừa. Thân giả màu
hồng ñỏ, có những mảng ñen nâu lớn liên tục. Lá ñứng, ñầu lá uốn cong, gân
chính màu trắng sáng ở gốc có nhiều phấn trắng, ñuôi gân lá ít phấn.
- Thân giả cao 2,2-2,6 m, ñường kính 17,9-18,3 cm.
- Thời gian từ trồng ñến thu hoạch 10-11 tháng.
- Buồng quả hình trụ có 9 nải, 168 quả. Khối lượng buồng 20,4 kg.
- Kích thước quả: dài 18,3 cm, ñường kính 3,9 cm
()

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

7

1.2. ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC
VẬT TRONG CÔNG TÁC NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG
1.2.1. Các hướng nghiên cứu ứng dụng
Nhân giống in vitro là một trong những ứng dụng chính của công nghệ tế
bào thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các ñiểm sinh trưởng
hoặc các mô phân sinh của cây. Theo các công trình thí nghiệm của Amato
(1977), chỉ có ñỉnh sinh trưởng của chồi mới ñảm bảo sự ổn ñịnh về di truyền,
tiếp ñến là mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp với xử lý nhiệt ñể làm
sạch bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống.
Kỹ thuật nhân nhanh ñược ứng dụng nhằm phục vụ cho các mục ñích
chính như: duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm, làm vật liệu cho
công tác chọn giống; duy trì và nhân nhanh các cá thể ñầu dòng ñể cung cấp
hạt giống cho các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, cây rau,
cây cảnh ; nhân nhanh ở ñiều kiện vô trùng cách ly tái nhiễm kết hợp với
việc làm sạch bệnh virut, rút ngắn thời gian ñưa các cây lai và các cây tự

nhiên có ñặc ñiểm tốt; bảo quản tốt tập ñoàn giống vô tính về các loài cây
giao phấn trong ngân hàng gen [2], [19].
1.2.2. Ưu thế của nhân giống in vitro
Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian ñưa giống vào sản xuất. Từ một cây
trong vòng 1-2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây. Nhân ñược số lượng cây
lớn trong một diện tích nhỏ, trong 1m
2
có thể ñể 18000 cây [19], [26].
Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng với nguồn bệnh, vì vậy ñảm
bảo giống sạch bệnh; thuận tiện trong vận chuyển và bảo quản (cây giống giữ
ở 4
0
C trong hàng tháng vẫn cho tỷ lệ sống 95%). ðồng thời, có thể sản xuất
quanh năm mà không phụ thuộc vào mùa vụ, có tiềm năng công nghiệp hoá
cao [26].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

8

1.2.3. Các phương thức nhân giống in vitro
1.2.3.1. Nuôi cấy mô phân sinh hoặc ñỉnh sinh trưởng
Theo Lê Trần Bình (1997), mô phân sinh nuôi cấy là mẫu vật nuôi cấy
ñược tách từ ñỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp
của chóp ñỉnh sinh trưởng. Tuy nhiên trong thực tế việc nuôi cấy mẫu vật như
vậy rất khó thành công, người ta chỉ tiến hành nuôi cấy khi mục ñích là làm
sạch virut cho cây trồng. Nuôi cấy mô phân sinh hoặc ñỉnh sinh trưởng ñược
tiến hành phổ biến nhất ở các ñối tượng chuối, phong lan, dứa, mía
Trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc ñỉnh sinh trưởng cần chú ý tới
tương quan giữa ñộ lớn chồi, tỷ lệ sống và mức ñộ ổn ñịnh về mặt di truyền

của chồi, vì thông thường nếu ñộ lớn của chồi tăng thì tỷ lệ sống và mức ñộ
ổn ñịnh di truyền tăng nhưng hiệu quả kinh tế giảm và ngược lại. Do vậy
phải kết hợp giữa các yếu tố ñể tìm ra phương pháp lấy mẫu tối ưu. Một
ñỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở ñiều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một hay
nhiều chồi và các chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh có rễ ñầy ñủ. Nếu
xét về nguồn gốc các cây tái sinh từ nuôi cấy nguyên liệu ban ñầu là mô
phân sinh hoặc ñỉnh sinh trưởng thì có ba khả năng: cây phát triển từ chồi
ñỉnh (chồi ngọn); cây phát triển từ chồi nách phá ngủ; cây phát triển từ chồi
mới phát sinh. Tuy nhiên trong thực tế rất khó phân biệt ñược chồi phá ngủ
và chồi mới phát sinh [28].
Có 2 phương thức hình thành cây tái sinh từ nuôi cấy mô phân sinh hoặc
ñỉnh sinh trưởng. Cây tái sinh trực tiếp từ chồi ñỉnh hoặc chồi nách phá ngủ.
Phương thức này chủ yếu ở các ñối tượng 2 lá mầm như: khoai tây, thuốc lá,
cam, chanh, hoa cúc, nhưng có cả cây 1 lá mầm như dứa sợi, mía cây tái
sinh qua giai ñoạn hình thành dẻ hành (protocorm), chủ yếu gặp ở các ñối
tượng một lá mầm như: phong lan, dứa, hoa huệ Gần ñây phương thức này
cũng bắt ñầu ñược bắt ñầu ñược áp dụng có kết quả ở các cây ăn quả và cây
lâm nghiệp, trong ñó có cây quý như cà phê, táo, lê, cây thông, bồ ñề Tổng
số có trên 30 chi khác nhau ñược nuôi cấy thành công [2].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

9

1.2.3.2. Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây
Vì tế bào thực vật có tính toàn năng nên ngoài mô phân sinh và ñỉnh sinh
trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công, các bộ phận còn lại của cơ thể thực
vật ñều có thể thực hiện cho việc nhân giống in vitro ñược. Các bộ phận ñó là:
ñoạn thân ở các ñối tượng như ở thuốc lá, cam, chanh, ; mảnh lá ở thuốc lá,
cà chua, bắp cải ; cuống lá ở Nacissus; các bộ phận của hoa như súp lơ, lúa

mì và nhánh củ ở hành tỏi [2].
1.2.4. Quy trình nhân giống in vitro
1.2.4.1. Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc
Vì trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những ñặc tính và tính trạng
của cây mẹ ban ñầu nên trong giai ñoạn này cần chọn lọc cây mẹ cẩn thận,
cây mẹ thường là cây có nhiều ñặc tính ưu việt, khoẻ, có giá trị kinh tế cao.
Sau ñó, chọn cơ quan ñể lấy mẫu thường là mô non, ñoạn thân có chồi ngủ, lá
non hoặc hoa non Mô chọn ñể nuôi cấy thường là mô có khả năng tái sinh
cao trong môi trường nuôi cấy sạch bệnh, giữ ñược các ñặc tính sinh học quý
của cây mẹ, ít nguy cơ biến dị. Tuỳ theo ñiều kiện, giai ñoạn này có thể kéo
dài 3-6 tháng [19].
1.2.4.2. Thiết lập hệ thống cấy vô trùng
Là giai ñoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy ñể tạo nguyên
liệu sạch bệnh cho nhân giống, giai ñoạn này ñược tiến hành theo các bước:
Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy.
Cấy mẫu vật vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn môi trường
nhân tạo (giai ñoạn này là giai ñoạn cấy mẫu in vitro).
Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus sẽ ñược nuôi
trong phòng nuôi cấy với ñiều kiện nhiệt ñộ ánh sáng phù hợp. Sau một thời gian
nhất ñịnh, từ mẫu nuôi cấy ñã bắt ñầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc các cơ quan
hoặc các phôi vô tính. Giai ñoạn này phụ thuộc vào từng ñối tượng ñem nhân
giống, thông thường kéo dài từ 2-12 tháng hoặc ít nhất 4 lần cấy chuyển [19].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

10

1.2.4.3. Nhân nhanh chồi
ðây là giai ñoạn sản xuất cây nhân giống quyết ñịnh hiệu quả của quá
trình nuôi cấy mô, cây ñược nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy. Khi

mẫu cấy sạch ñã ñược tạo ra, từ ñó nhận ñược các cụm chồi và các phôi vô
tính sinh trưởng tốt trong quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai ñoạn sản xuất.
Người ta cần tạo ra tốc ñộ nhân nhanh cao nhất trong ñiều kiện nuôi cấy.
Thành phần và ñiều kiện môi trường cần tối ưu hoá ñể tạo ñược mục tiêu
nhân nhanh. ðối với môi trường nhân chồi, người ta sử dụng các chất kích
thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin (BAP, kinetin) với nồng ñộ khác
nhau tuỳ từng ñối tượng cây. Quy trình cấy chuyển ñể nhân nhanh chồi
thường trong khoảng 1-2 tháng tuỳ loài cây. Tỷ lệ nhân nhanh khoảng 2-8 lần
sau một lần cấy chuyển. Nhìn chung giai ñoạn này thường kéo dài 10-36
tháng. Giai ñoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban ñầu không nên kéo dài
quá lâu ñể tránh sự hình thành biến dị sôma [19].
1.2.4.4. Tạo rễ (tạo cây hoàn chỉnh)
Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát triển rễ tự sinh,
nhưng thông thường các chồi này phải cấy chuyển sang một môi trường khác
ñể kích thích tạo rễ. ðối với môi trường tạo rễ, người ta thường sử dụng chất
kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin như α-NAA, IAA, IBA. Thông
thường giai ñoạn này kéo dài 2-8 tuần tuỳ ñối tượng. Khi cây có ñủ các bộ
phận thân, lá, rễ với kích thích nhất ñịnh ñảm bảo cho sinh trưởng, phát triển
bình thường ngoài tự nhiên, người ta mới tiến hành giai ñoạn tiếp theo là ñưa
cây ra ngoài môi trường tự nhiên [19].
1.2.4.5. Chuyển cây ra ñất trồng
ðây là giai ñoạn ñầu cây ñược chuyển từ ñiều kiện vô trùng trong ống
nghiệm ra ngoài môi trường tự nhiên. Giai ñoạn này quyết ñịnh khả năng ứng
dụng của quy trình nhân giống in vitro. ða số các loài cây trồng chỉ sau khi
chồi ñã ra rễ tạo thành cây hoàn chỉnh với kích thước nhất ñịnh mới ñược

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

11

huấn luyện và chuyển ra ngoài vườn ươm. Cây nuôi cấy in vitro ñược sinh
trưởng và phát triển trong những ñiều kiện tối ưu về nhiệt ñộ, ñộ ẩm, pH, dinh
dưỡng Vì vậy, trước khi ñưa ra trồng, người ta cần huấn luyện cây ñể thích
nghi với ñiều kiện tự nhiên. Quá trình thích nghi với ñiều kiện bên ngoài của
cây ở giai ñoạn ñầu yêu cầu cần ñược chăm sóc ñặc biệt. Vì vậy, cây ñược
chuyển từ môi trường từ bão hoà hơi nước sang vườn ươm với những ñiều
kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần phải ñáp ứng các yêu cầu: che cây non
bằng nilon và có hệ thống phun sương cung cấp ñộ ẩm và làm mát cây; giá
thể trồng cây có thể là ñất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa ñất,
mùn cưa và bọt biển Giai ñoạn này ñòi hỏi 4-16 tuần [19].
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CHUỐI BẰNG KỸ
THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO
1.3.1. Các nghiên cứu trong nước
Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật không chỉ ñược sử
dụng trong nghiên cứu mà còn ñược áp dụng rộng rãi vào thực tiễn chọn giống,
không chỉ ở cây ngũ cốc mà còn ở cây rau, hoa cây cảnh và cây ăn quả.
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật phục vụ nhân giống cây trồng ñã triển
khai trên 20 năm ở nước ta. Nhân giống thương mại quy mô lớn ñã ñạt ñược ở
một số cây trồng như nhân nhanh chuối, nhân nhanh khoai tây sạch bệnh,
nhân nhanh các giống mía nhập nội… Quy trình công nghệ nhân nhanh giống
chuối và giống mía ñã ñược Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn công
nhận và áp dụng [2].
Các nghiên cứu về nhân giống chuối trước ñây chỉ chú trọng các biện
pháp kỹ thuật nhân bằng củ và tách chồi. Những kỹ thuật này hiện còn ñược
áp dụng khá phổ biến ở nhiều vùng miền và nhất là ở quy mô sản xuất nhỏ.
Kỹ thuật nhân giống vô tính chuối bằng phương pháp in vitro ở nước ta
cũng thu ñược một số kết quả sau:
ðoàn Thị Ái Thuyền và cộng sự (1993) ñã ñưa ra quy trình nhân giống

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

12

chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô bao gồm 5 công ñoạn chính sau: ñưa
mẫu vào nuôi cấy → tạo và nhân nhanh chồi chuối → tạo rễ cây → ươm
chuối trong vườn ươm → bầu chuối và trồng ra ruộng sản xuất. Và cũng cho
biết cây chuối nuôi cấy mô ở vườn ươm 60 - 70 ngày (luống ươm 30 - 40
ngày và bầu ñất 30 ngày) thì ñược xuất vườn, khi ñó cây cao 40 - 50 cm [21].
Theo ðỗ Năng Vịnh và cộng sự (1994) cho biết tỷ lệ tái sinh dao ñộng
từ 68,42 - 92,31% do bị chi phối bởi bản chất di truyền của giống chuối và
các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Hệ số nhân của chuối Tiêu cao
nhất khi bổ sung BAP từ 7 - 9 mg/lít. Nước dừa không biểu hiện ảnh hưởng
ñến chuối Tiêu nhưng có ảnh hưởng tốt tới hệ số nhân của chuối Rừng ở
lượng 10%, khi có mặt BAP với lượng 7 mg/lít [26].
Theo Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (1995) cho biết hoàn toàn có
thể sử dụng phương pháp in vitro ñể nhân nhanh cây chuối, vật liệu nuôi cấy
tốt nhất cho mục ñích nhân nhanh là các mô chồi ñỉnh và chuối có thể sử
dụng kỹ thuật bóc bẹ không cần khử trùng, môi trường thích hợp cho quá
trình khởi ñộng phát sinh chồi ban ñầu là môi trường MS + (5 - 7) ppm BA,
môi trường nhân nhanh tương tự như môi trường khởi ñộng nhưng sau nhiều
lần cấy chuyển cần giảm hàm lượng BA thậm trí tới 0 ppm và có thể bổ sung
nước dừa là 10%. Còn môi trường ra rễ tốt nhất là MS + 0,2 g/lít than hoạt
tính và cũng nhận xét việc ñưa cây chuối in vitro ra vườn ươm vụ hè thu là
hoàn toàn thuận lợi, tỷ lệ sống ñạt 100% trên cả 3 giá thể nghiên cứu là: cát,
ñất thịt nhẹ, ñất + cát + phân chuồng [17].
Theo ðỗ Năng Vịnh và Cộng sự (1995), cây chuối nuôi cấy mô cần
ñưa ra luống giâm gồm 3 lớp: lớp dưới là ñất dày 5cm, lớp giữa là phân
chuồng ải trộn với ñất cát pha tỷ lệ 1:1 dày 7cm, lớp trên cùng là cát vàng 5 -7
cm; mật ñộ giâm là 300 - 400 cây/m2; thời gian ở luống giâm là 30 ngày. Sau
ñó, chuối ñược ñưa ra bầu ñất có kích thước 7 - 10 × 10 - 15 cm; thời gian ở

bầu ñất từ 45 - 60 ngày, mùa ñông rét có thể lâu hơn. Như vậy, tổng thời gian

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

13

ở vườn ươm là 2,5 - 3 tháng hoặc lâu hơn nữa. Cũng có thể ñưa thẳng cây non
ra bầu ñất không qua luống giâm. ðất ñóng bầu có thành phần: phân hữu cơ
vi sinh + cát + ñất phù sa hoặc ñất pha cát (tỷ lệ 1:1:1) là tốt nhất [26].
Theo Phạm Kim Thu và ðặng Thị Vân (1997), từ nghiên cứu hoàn thiện
quy trình sản xuất cây giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô, Tác giả kết
luận môi trường nuôi cấy chuối là MS (1962) có bổ sung 1 ppm Thiamin HCl
ñã làm tăng khả năng tái sinh chồi chuối, nền giá thể ra cây cho tỷ lệ sống cao
nhất là 1/3 ñất + 1/3 phân hữu cơ + 1/3 cát ñen và thời vụ ra cây thích hợp từ
thánh 4 ñến tháng 10. Ứng dụng kết quả này ñã sản xuất ñược hàng triệu cây
giống cung cấp cho các tỉnh phía Bắc (Nam ðịnh, Thái Bình…).
1.3.2. Các nghiên cứu của nước ngoài
Chuối là ñối tượng cây ăn quả có hình thức sinh sản vô tính với phương
thức nhân giống truyền thống là sử dụng chồi nách làm giống trồng những
thế hệ kế tiếp.Vì vậy, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào nhân giống chuối
ñã ñược nghiên cứu, ứng dụng từ rất lâu nhiều nước trên thế giới như
Malayxia, Asutralia, Pháp, Trung Quốc… và ñã góp 1 phần ñáng kể phục vụ
ngành sản xuất chuối xuất khẩu.
Theo Reuveni (1986), kỹ thuật nuôi cấy in vitro chuối có một số ưu
ñiểm sau :
- Nhân ñược số lượng lớn giống như cây trồng ban ñầu ñã xác ñịnh tính trạng.
- Chất lượng cây giống hoàn toàn sạch bệnh, tránh ñược những sâu
hại gây ra qua nguồn ñất (tuyến trùng) vì vậy tiết kiệm ñược chi phí hóa
chất do sử lý ñất.
- Cây nuôi cấy mô có thể trồng một vụ với mức ñộ thâm canh cao, thời

gian sinh trưởng ngắn, có ñiều khiển ñược thời gian thu hoạch.
- Tỷ lệ cây sống cao trên ñiều kiện ñồng ruộng (>98%), khả năng sinh
trưởng nhanh hơn cây có nguồn gốc từ chồi nách.
- Cây giống in vitro phát triển ñồng ñều, ra hoa ñồng loạt và thời gian
thu hoạch ngắn.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

14

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU, ðỊA ðIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
2.1.1. Vật liệu thực vật
Chồi chuối Tiêu Hồng trong giai ñoạn in vitro do phòng Công nghệ tế
bào thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
* Hóa chất
Các chất kích thích sinh trưởng, ñường saccarose, agar, nước dừa, vv.
Nuôi cấy ñược tiến hành trên nền môi trường MS, B5 và môi trường
Phytamax (Bảng thành phần môi trường theo phụ lục 01ñính kèm).
* Dụng cụ
Bình tam giác, pipet, cốc thủy tinh ñịnh mức.
Bông, giấy làm nút, giấy thấm.
Bình tam giác 250ml.
Bộ ñồ cấy gồm: dao cấy, que cấy, ñĩa cấy…
Buồng cấy vô trùng (Biological Safety Cabinets) của hãng Nuarie, Mỹ.
Nồi khử trùng (Auto Clave) của hãng ToMy, Nhật bản.
Bình phun ñể tưới cây.
Panh, kéo, chậu nhựa, rổ nhựa, giá thể trồng cây…

2.1.2. ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu.
2.1.2.1. ðịa ñiểm
Các nội dung nghiên cứu ñược tiến hành tại phòng thí nghiệm nuôi cấy
mô và vườn thực nghiệm Sở Khoa học & Công nghệ Bắc Ninh.
2.2.2.2. Thời gian: Từ 01/06/2012 ñến 03/2013

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………

15

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường cơ bản MS, B5 và Phytamax
ñến sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm
cytokinin ñến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng.
- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm
auxin ñến phát sinh rễ và tạo cây hoàn chỉnh.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng thuộc
nhóm auxin và nhóm cytokinin lên sự sinh trưởng của chuối Tiêu Hồng.
- Nghiên cứu tìm ra loại giá thể thích hợp nhất cho ra cây chuối Tiêu
Hồng (ñất, cát, trấu hun …).
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm ñược bố trí một cách ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần
nhắc lại, mỗi lần nhắc 30 bình, mỗi bình 5 mẫu.
2.3.2. Phương pháp pha môi trường và nuôi cấy
2.3.1.1. Pha môi trường nuôi cấy
Pha môi trường ñặc với thành phần và nồng ñộ các chất phù hợp. Môi
trường có ñầy ñủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin… Tất cả các hóa
chất phải ñược tan ñều, không kết tủa. Môi trường có bổ sung chất ñộn là

thạch làm giá ñỡ không quá rắn hay quá mềm ñể khi cấy mẫu vật ñược dễ
dàng. Khử trùng môi trường theo phương pháp Pasteur.
2.3.1.2. Phương pháp nuôi cấy
Trước khi tiến hành nuôi cấy, cần khử trùng box cấy bằng ñèn UV
trong thời gian 30-60 phút, khử trùng bộ cấy bằng cách ñốt trên ngọn lửa ñèn
cồn, sau ñó ñể nguội.