Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh cây từ phôi non các giống lúa indica phục vụ chuyển gen

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI


NGUYỄN VIẾT THẠCH


NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY
TỪ PHÔI NON CÁC GIỐNG LÚA INDICA
PHỤC VỤ CHUYỂN GEN





LUẬN VĂN THẠC SĨ





HÀ NỘI – 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI


NGUYỄN VIẾT THẠCH


NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY
TỪ PHÔI NON CÁC GIỐNG LÚA INDICA

PHỤC VỤ CHUYỂN GEN


LUẬN VĂN THẠC SĨ

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. PHAN HỮU TÔN
TS. MAI ðỨC CHUNG


HÀ NỘI – 2013
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này
là chính xác và chưa hề ñược sử dụng ñể bảo vệ bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam ñoan tất cả mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này
ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ
nguồn gốc.
Tác giả


Nguyễn Viết Thạch

Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp ii

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi ñã nhận
ñược sự hướng dẫn, giúp ñỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị, các em và
các bạn. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin ñược bày tỏ lới cảm ơn
chân thành tới:
Ban giám hiệu, Phòng ñào tạo sau ñại học, Bộ môn Sinh học phân tử
và Công nghệ sinh học ứng dụng ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi giúp ñỡ tôi
trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Phó giáo sư - Tiến sĩ Phan Hữu Tôn, người thầy kính mến ñã hết lòng
giúp ñỡ, dạy bảo, ñộng viên và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt
quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tiến sĩ Mai ðức Chung - phòng Thí nghiệm trọng ñiểm – Viện Di
truyền Nông nghiệp- một người ñáng kính trong công việc cũng như trong
cuộc sống. Anh ñã ñộng viện giúp ñỡ và chỉ bảo cho tôi rất nhiều ñể tôi có thể
hoàn thành ñược luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ Viện Di truyền Nông nghiệp ñã
giúp ñỡ, ñộng viên trong quá trình nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian
thực hiện ñề tài
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội ñồng chấm luận văn ñã
cho tôi những ñóng góp quý báu ñể hoàn chỉnh luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn bố mẹ, vợ và anh chị em ñã luôn ở bên cạnh

ñộng viên và giúp ñỡ tôi học tập làm việc và hoàn thành luận văn.
Từ trái tim mình, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới tất cả mọi người!
Hà Nội, ngày 26 tháng 10 năm 2013

Nguyễn Viết Thạch
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp iii

MỤC LỤC



Lời cam ñoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục chữ viết tắt vi
Danh mục bảng vii
Danh mục hình viii
Chương I MỞ ðẦU 1
1.1 ðặt vấn ñề 1
1.2 Mục ñích và yêu cầu 2
1.2.1 Mục ñích 2
1.2.2 Yêu cầu 2
1.3 Ý nghĩa khoa học 2
Chương II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Tình hình nghiên cứu mô tế bào thực vật 3
2.1.1 Lịch sử phát triển 3
2.2 Nguồn gốc và phân loại cây lúa 5
2.3 Tình hình nuôi cấy mô lúa và tái sinh cây 7
2.3.1 Trên thế giới 7
2.3.2 Ở Việt Nam 8

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình nuôi cấy phôi non và tái sinh cây lúa 10
2.4.1 Tuổi phôi 10
2.4.2 Kiểu gen của cây 11
2.4.3 Thành phần môi trường 11
Chương III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
3.1 ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 19
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp iv

3.2 Nội dung nghiên cứu 19
3.3 Phương pháp nghiên cứu 20
3.3.1 Phương pháp lấy mẫu và chuẩn bị mẫu 20
3.3.2 Phương pháp xác ñịnh hình thái và kích thước phôi non. 20
3.3.3 Phương pháp nuôi cấy tạo mô sẹo và tái sinh cây in vitro. 21
3.3.4 Môi trường nuôi cấy 21
3.4 Bố trí thí nghiệm: 21
3.4.1 Thí nghiệm 1: Xác ñịnh ảnh hưởng của tuổi phôi ñến sự hình thành
mô sẹo và tái sinh cây của giống lúa Indica: IR64. 21
3.4.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS và môi
trường N6 ñến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của giống lúa
Indica: IR64. 22
3.4.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất 2,4 D ; hàm lượng
kinetin ñến khả năng tạo mô sẹo của mẫu cấy 23
3.4.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ α-NAA, BAP ñến
khả năng tái sinh cây giống lúa Indica: IR64 23
3.4.5 Thí nghiệm 5: ðánh giá ñược khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của
các giống lúa Indica trên môi trường và ñiều kiện nuôi cấy tối ưu cho
phôi non giống lúa IR64 24
3.5 Các chỉ tiêu theo dõi 24
3.6 Phương pháp phân tích số liệu: 25
CHƯƠNG IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26

4.1 Xác ñịnh các pha phát triển của phôi lúa non và tuổi phôi non thích
hợp nhất cho nuôi cấy tạo mô sẹo và tái sinh cây giống IR64 26
4.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến tạo mô sẹo và tái sinh cây 28
4.2.1 Ảnh hưởng của chất ñiều hòa sinh trưởng ñến tạo mô sẹo phôi hóa
giống IR64 30
4.2.2 Ảnh hưởng của chất ñiều hòa sinh trưởng ñến tái sinh cây giống IR64 31
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp v

4.3 ðánh giá khả năng tạo mô sẹo phôi hóa và tái sinh cây hoàn chỉnh của
các giống lúa Indica trên môi trường nuôi cấy tối ưu cho giống lúa
IR64 33
4.4 Xây dựng quy trình tái sinh cây lúa từ phôi hạt non phục vụ chuyển gen 38
CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 40
5.1 Kết luận 40
5.2 ðề nghị 40
PHỤ LỤC 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
BAP: Benzylaminopurine
CS: Cộng sự
DNA: Deoxyribonucleic acid
MS Môi trường Murashige - Skoog (1962)
N6 Môi trường Chu et al (1975)
SE Sai số chuẩn
TB Trung bình

α-NAA 1-Naphthaleneacetic Acid


Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp vii

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

2.1 Phân biệt hình thái lúa loài phụ indica và loài phụ japonica 6

4.1 Kích thước phôi non của giống lúa IR64 ở các giai ñoạn tuổi
khác nhau (mm) 27

4.2 Ảnh hưởng của tuổi phôi ñến khả năng tạo mô sẹo và mô sẹo
phôi hóa của giống IR64 27

4.3 Ảnh hưởng của tuổi phôi non ñến khả năng tái sinh cây 28

4.4 Ảnh hưởng của môi trường cơ bản ñến tạo mô sẹo và mô sẹo
phôi hóa của giống IR64 29

4.5 Ảnh hưởng của môi trường ñến tái sinh cây giống IR64 29

4.6 Ảnh hưởng của chất ñiều hòa sinh trưởng ñến tạo mô sẹo phôi
hóa từ phôi non của giống IR64 30

4.7 Ảnh hưởng của chất ñiều hòa sinh trưởng ñến khả năng tái sinh
cây giống lúa IR64 32

4.8 ðánh giá khả năng tạo mô sẹo và mô sẹo phôi hóa của các giống
lúa Indica 34

4.9 ðánh giá khả năng tái sinh cây các giống Indica 35


Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp viii

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

4.1 Ảnh phôi non lúa ở các giai ñoạn 8, 12, 16, 20 ngày tuổi (từ trái
qua phải) dưới kính hiển vi của giống lúa indica: IR64 26
4.2 Một số hình ảnh về tạo mô sẹo và tái sinh cây IR64 33
4.3 Hình ảnh mô tả các bước tái sinh cây từ phôi non lúa 8 ngày tuổi
của 5 giống lúa: IR64, VS1, CR 203, C70, phiêu hương 1. 37
4.4 Quy trình tái sinh mô sẹo từ mô phôi non các giống lúa indica 39




Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp 1

Chương I
MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề
Lúa gạo là một trong những nguồn lương thực quan trọng của con
người ñặc biệt là với các nước châu Á. Nó cung cấp năng lượng, protein,

vitamin và một số khoáng chất có lợi cho cơ thể. Ở Việt Nam, lúa là cây
lương thực quan trọng số một, cung cấp 80% nhu cầu cacbonhydrat và 40%
nhu cầu protein trung bình của người dân Việt Nam.
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, tốc ñộ tăng dân số nhanh
tạo nên sức ép lớn cho thế giới. ðặc biệt với các nước ñang phát triển như
nước ta thì sức ép về an ninh lương thực càng trở nên nặng nề. Vì vậy chọn
tạo giống lúa là một quá trình liên tục nhằm thỏa mãn nhu cầu cung cấp lương
thực cho con người.
Các phương pháp chọn tạo giống truyền thống vẫn là phương pháp phổ
biến, Phương pháp này dựa vào sự tái tổ hợp của các kiểu gen và các nhiễm
sắc thể thông qua sinh sản hữu tính theo nguyên lý di truyền của Mendel.
Theo phương pháp này ñể tạo ra dòng thuần phải mất từ 7-8 ñời tự thụ liên
tiếp (7-8 năm). Mặt khác, qua nhiều ñời tự thụ một số kiểu gen quý và tốt sẽ
bị quá trình chọn lọc ñào thải, ñồng thời một số kiểu gen không mong muốn
lại có cơ hội ñược biểu hiện.
Nhìn chung, hầu hết các tác giả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường
nuôi cấy ñến tạo mô sẹo từ hạt lúa chín và sử dụng ñể biến nạp gen, vì vậy
hiệu quả biến nạp gen còn thấp có thể do hiệu quả tái sinh cây thấp. Do ñó, ñể
thu ñược hiệu quả chuyển gen cao cần thiết nghiên cứu ñể nâng cao khả năng
tạo mô sẹo và tái sinh cây. Trong số các vật liệu ñược sử dụng ñể tạo mô sẹo
và tái sinh cây, mô phôi non của hạt lúa non có khả năng tạo mô sẹo và tái
sinh cây cao. Các nghiên cứu chuyển gen vào các giống lúa Indica gần ñây
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp 2

trên thế giới tập trung vào xây dựng hệ thống tái sinh cây lúa từ mô phôi lúa
non và sử dụng hệ thống tái sinh cây tạo ra ñể phục vụ công tác biến nạp gen.
Ở nước ta nghiên cứu về tái sinh mô sẹo từ phôi non lúa và biến nạp gen vào
phôi non lúa còn rất ít ñược quan tâm.
Xuất phát từ tầm quan trọng của quy trình tái sinh cây in vitro từ phôi
non ñể ñạt ñược hiệu quả cao trong biến nạp gen lúa, chúng tôi tiến hành ñề

tài:
“Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh cây từ phôi non các giống lúa
Indica phục vụ chuyển gen”
.
1.2. Mục ñích và yêu cầu
1.2.1. Mục ñích
Xây dựng ñược quy trình tái sinh cây từ mô phôi non các giống lúa
Indica phục vụ chuyển gen
1.2.2. Yêu cầu
- Xác ñịnh ñược tuổi phôi và môi trường thích hợp ñể tạo mô sẹo và tái
sinh cây từ phôi non giống lúa IR64
- ðánh giá ñược khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của phôi non
giống lúa IR64 trên môi trường và ñiều kiện nuôi cấy tối ưu.
- ðánh giá ñược khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của các giống lúa
Indica trên môi trường và ñiều kiện nuôi cấy tối ưu cho mô phôi non giống
lúa IR64
- Xây dựng ñược quy trình tái sinh cây từ phôi hạt non ở các giống lúa
thuộc loài phụ Indica phục vụ chuyển gen.
1.3. Ý nghĩa khoa học
ðề tài làm cơ sở khoa học ñể xây dựng quy trình tái sinh cây từ phôi
hạt non ở các giống lúa thuộc loài phụ Indica phục vụ chuyển gen.
1.4. Ý nghĩa thực tiễn:
ðề tài nhằm xác ñịnh tuổi phôi và môi trường thích hợp ñể tạo mô sẹo
và tái sinh cây từ phôi non giống lúa IR64 và xây dựng quy trình tái sinh cây
từ phôi hạt non ở các giống lúa thuộc loài phụ Indica phục vụ chuyển gen.
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp
3

Chương II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tình hình nghiên cứu mô tế bào thực vật
2.1.1 Lịch sử phát triển
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật ñã ñược các nhà khoa học tiến hành vào
cuối thế kỷ XIX.
Quá trình phát triển ñó có thể tạm chia thành 4 giai ñoạn.
2.1.1.1. Giai ñoạn khởi xướng (1898-1930)
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật ñã ñược nhà Bác học
người ðức Grottied Haberlandt ñề xướng năm 1898. Ông ñã tìm cách nuôi
cấy các tế bào thực vật phân lập nhưng không thành công. Các công trình về
nuôi cấy mô tế bào của các nhà khoa học khác như Winker (1902), Thielman
(1924), Kuster (1929), cũng không ñạt ñược mục tiêu nghiên cứu.
Năm 1929 Schmacker ñã bước ñầu thành công trong lĩnh vực này. Sau
ñó có Schitterer (1931), Pfeiffer (1931), Lanrue (1933) cũng ñã có những
thành công bước ñầu trong nuôi cấy ñầu rễ phân lập trong môi trường nhân
tạo. ðiều ñó giúp cho các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu trên nhiều ñối
tượng khác nhau.
2.1.1.2. Giai ñoạn nghiên cứu sinh lý (1930 -1950)
Giai ñoạn này ñược bắt ñầu bằng công trình nuôi cấy ñầu rễ cây cà
chua trong môi trường nhân tạo, ñược thực hiện bởi nhà bác học White
(1934). Bằng thí nghiệm này ông là người ñầu tiên ñã chứng minh ñược rằng
mô phân sinh có thể duy trì thời gian sinh trưởng hơn nữa nếu chúng tiếp tục
ñược nuôi cấy bằng môi trường dinh dưỡng mới. Cũng trong thời gian này,
Gautherets ñã thành công trong nuôi cấy mô tượng tầng và tìm ñược môi
trường dinh dưỡng thích hợp cho nhiều loại cây.
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp
4

Năm 1935 Went và Thisnamn ñã khám phá ra auxin IAA có khả năng
kích thích sự hình thành mô sẹo.

Năm 1941, hai nhà khoa học người Mỹ Overbeek và Steward với thí
nghiệm nuôi cấy họ cà Datura, ñã chỉ ra rằng auxin kích thích sinh trưởng có
trong nước dừa. Cũng trong thời gian này hai ông ñã phát hiện ra tác dụng
chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin, ñã ñược nghiên cứu
và tổng hợp thành công như NAA, 2,4 D có ảnh hưởng tích cực trong việc tạo
mô sẹo và gây phân chia tế bào. Nhiều nhà khoa học ñã bổ sung các Auxin và
các Vitamin vào môi trường nuôi cấy và ñã khẳng ñịnh vai trò của chúng
trong môi trường nuôi cấy mô.
Năm 1955 Miller và Skoog trong khi nuôi cấy mô lõi cây thuốc lá ñã
xác ñịnh ñược vai trò của Kinetin tới việc kích thích sự phát triển của mô.
Những phát hiện mới mẻ về vai trò của các chất kích thích sinh trưởng 2,4D,
IAA, NAA, kinetin, các vitamin trong giai ñoạn này là bước tiến quan trọng
trong lịch sử của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
2.1.1.3. Giai ñoạn phát sinh hình thái (1950 - 1960)
Năm 1956 Miller và Skoog ñã thành công trong thí nghiệm tạo chồi từ
mô thuốc lá nuôi cấy. Chính Skoog ñã phát hiện ra vai trò của kinetin trong
sự phân hoá các cơ quan của cây thuốc lá.
Những năm 1958-1959 Reinert (ðức) và Steward (Mỹ) ñã nuôi cấy tế
bào cây cà rôt và thu ñược phôi soma từ mô của chúng.
Năm 1956 Nickell ñã nuôi cấy thành công tế bào ñơn Phaseolus
vulgais trong dung dịch lỏng.
Năm 1960, bằng kỹ thuật gieo tế bào, Bergman ñã tái sinh thành công
tế bào ñơn của cây thuốc lá.
2.1.1.4. Giai ñoạn nghiên cứu di truyền (1960 ñến nay)
Các thành tựu của giai ñoạn này ñã chính thức ứng dụng kỹ thuật nuôi
cấy mô và tế bào thực vật invitro vào công tác giống và nghiên cứu di truyền.
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp
5

Năm 1960 Cooking (Anh) ñã dùng men Cellulose ñể phân hủy vỏ

cellulose của tế bào thực vật và thu ñược các tế bào không có vỏ, còn gọi là
các tế bào trần (protoplast).
Nitsch (1967), Nakata và Tanaka (1968) là những người thành công
ñầu tiên trong việc tạo cây thuốc lá ñơn bội bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn.
Takabe (1971) tái sinh ñược cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast.
Melchers(1977) dung hợp protoplast thành công giữa khoai tây và cà
chua tạo cây “Pomate”
Năm 1985, cây thuốc lá mang gen biến nạp ñầu tiên ñược công bố.
Khái niệm chuyển gen trở thành phổ cập trong thuật ngữ công nghệ sinh học
thực vật. Ledoux cho rằng có thể gây ra biến dị di truyền ở biến dị tế bào,
thậm chí ở hạt giống bằng cách cho chúng hấp thụ ADN ngoại lai.
Từ năm 1980 ñến nay, hàng loạt thành công mới trong lĩnh vực công
nghệ ñược công bố. Nuôi cấy mô tế bào ñã trở thành một công cụ không thể
thiếu trong công nghệ tạo giống và nhân giống hiện ñại.
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào ñã mang lại những cơ sở lý luận mới mẻ
cho sinh học hiện ñại.
2.2. Nguồn gốc và phân loại cây lúa
Cây lúa là một trong những cây cốc có lịch sử trồng trọt lâu ñời nhất.
Về nguồn gốc thực vật học, cây lúa thuộc họ hòa thảo (Gramineae), chi
Oryza. Lúa trồng hiện nay là do lúa dại Oryza fatua hình thành thông qua một
quá trình chọn lọc nhân tạo lâu dài. Loài lúa dại này thường gặp ở Ấn ñộ, Việt
Nam, Thái Lan, Trung Quốc Họ hàng với cây lúa trồng là các loài trong chi
Oryza. Các công trình nghiên cứu cho thấy có 22 loài trong chi Oryza với 24
hoặc 48 nhiễm sắc thể. Trong số 22 loài của chi Oryza chỉ có 2 loài là Oryza
sativa và Oryza glaberrima là lúa trồng.
Kết quả của sự tiến hóa và ảnh hưởng của hệ thồng chọn lọc giống qua
hàng ngàn năm ñã hình thành một tập ñoàn các giống lúa, các loại hình thái
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp
6

rất ña dạng phong phú. ñể sử dụng có hiệu quả nguồn gen quý giá này rất
cần thiết phải phân loại giống lúa. Tuy nhiên, có nhiều cách phân loại khác
nhau theo các tiêu chí khác nhau (theo ñiều kiện sinh thái, theo thời gian
sinh trưởng, theo nguồn gốc hình thành, theo tính trạng ñặc trưng ). Cho
ñến nay, phân loại cây lúa theo hệ thống phân loại thực vật học của loài lúa
trồng Oryza sativa L ñã ñạt ñược sự thống nhất. Theo các tài liệu chính
thức thì loài Oryza sativa L gồm 3 loài phụ (indica, japonica và javanica), 8
nhóm biến chủng và 284 biến chủng. Theo cấu tạo của tinh bột còn phân
biệt lúa nếp (glutinosa) và lúa tẻ (utilissima). Tuy nhiên, theo ñịnh luật về
dãy biến dị tương ñồng của Vavilov thì cây lúa vẫn tiếp tục tiến hóa và
nhiều biến chủng mới vẫn tiếp tục xuất hiện, các nhà khoa học vẫn ñang
tiếp tục nghiên cứu, tâp hợp và bổ sung thêm cho hệ thống phân loại này
(Nguyễn Văn Hoan, 2006).
Theo tác giả Nguyễn ñình Giao, Nguyễn Thiện Huyên và cộng sự
(2001) thì loài phụ indica (lúa tiên) và japonica (lúa cánh) ñược phân loại theo
ñiều kiện sinh thái và vĩ ñộ ñịa lý. Về mặt phân bố: lúa indica ở vùng vĩ ñộ
thấp như: Ấn ñộ, Nam Trung Quốc, Việt Nam, Indonexia. Lúa japonica phân
bố ở vùng vĩ ñộ cao như Nhật Bản, Triều Tiên, Bắc Trung Quốc, Châu âu,
v.v. (Nguyễn ðình Giao và cs., 2001). Một số hình thái lúa loài phụ indica và
loài phụ japonica ñược thể hiện trong bảng dưới ñây:
Bảng 2.1 : Phân biệt hình thái lúa loài phụ indica và loài phụ japonica
ðặc tính Lúa japonica Lúa indica
Hình dáng và màu lá Hẹp và xanh ñậm Rộng và xanh nhạt
Góc ñộ lá cờ và nhánh Rộng Nhỏ
Chiều dài của thân Ngắn Dài
Năng suất tiềm thế Cao hơn Thấp hơn

Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp
7

Ngày nay, do nhu cầu giao lưu, việc phân bố của lúa indica và japonica
không nguyên dạng ban ñầu. Mặt khác, do tiến bộ khoa học kỹ thuật, có nhiều
phương pháp chọn tạo giống lúa mới cho phép tạo ra nhiều giống lúa mới với
những tính năng ưu việt. Các phương pháp lai xa nhằm khai thác ưu thế lai,
các phương pháp ñột biến, các phương pháp chọn tạo giống sử dụng công
nghệ sinh học ñã tạo ra nhiều giống lúa mới khiến cho việc phân loại truyền
thống gặp nhiều khó khăn.
2.3. Tình hình nuôi cấy mô lúa và tái sinh cây
2.3.1. Trên thế giới
Tái sinh cây từ mô sẹo ñược thông báo lần ñầu tiên ở loài cây ngũ cốc
bởi Tamaoki và Ullstrup (năm 1958). Cho ñến nay mô sẹo ñã ñược tạo ra từ
các mô lúa khác nhau như nát cắt thân (Furuhashi và Yatazawa, 1964), hoa
non, bao phấn, tiểu bào tử, ñỉnh rễ (Visarada và cs., 1998, Mandal và cs.,
2003), bao lá mầm (Oinam và Kothari 1995, Chand và Sahrawat 1997,
Sahrawat và Chand 2001), trụ dưới lá mầm (Wu và Li, 1971), hạt trưởng
thành (Lin và cs., 2005; Rachmawati, 2006).
Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các giống lúa indica có sự khác
nhau ñáng kể về phản ứng tạo mô sẹo và tái sinh cây (Khanna, 1999; Amin
M. A., 2004). Do ñó, ñể cải thiện hiệu quả tạo mô sẹo và tái sinh cây, cần
thiết tối ưu hóa môi trường cho các giống lúa indica.
Zhenyu (1999) ñã nghiên cứu và chỉ ra một số nhân tố ảnh hưởng ñến
tạo mô sẹo và tái sinh cây ở các giống lúa indica.
Lin và Zhang (2005), Ge và Cs., 2006) ñã tối ưu hóa môi trường và các
ñiều kiện nuôi cấy phuc vụ biến nạp gen cho hiệu quả cao ở các giống lúa
indica.
Rachmawati và Anzai (2006) ñã nghiên cứu tối ưu hóa môi trường tạo
mô sẹo và tái sinh cây lúa và sử dụng hệ thống tái sinh ñã ñược tối ưu hóa này
ñể biến nạp gen vào các giống lúa javanica. Họ cũng nhận thấy hiệu quả biến
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp
8

nạp gen phụ thuộc nhiều vào giống. (Rachmawati và Anzai, 2006).
Lin và Zhang (2005) ñã chỉ ra rằng nguyên nhân chính thu ñược tỷ lệ
biến nạp thành công thấp ở các giống lúa indica (so với các giống lúa
japonica) có thể do hiệu quả tái sinh của các giống lúa indica thấp hơn. Họ ñã
tìm ra ñược 2 môi trường mới ñể cấy chuyển, phân hóa mô sẹo và sử dụng
quy trình tái sinh cây ñể biến nạp cho các giống lúa indica. (Lin, 2005).
Hiei và cs. (2006) ñã tối ưu hóa quy trình biến nạp cho các giống lúa
indica bằng Agrobacterium tumefaciens sử dụng phôi non của hạt non sau thu
phấn 8-12 ngày. Quy trình ñã ñược áp dụng ñể biến nạp thành công với hiệu
quả cao (trên 7 dòng/phôi) cho các giống lúa indica IR8, IR24, IR26, IR36,
IR54, IR64, IR72, Xin Qing Ai 1, Nan Jin 11 và Suewon 258. (Hiei. và
Komari, 2006).
2.3.2. Ở Việt Nam
Kế thừa tiến bộ khoa học trên thế giới, nhiều nhà khoa học tâm huyết
và nhiều trung tâm, viện nghiên cứu ở Việt Nam ñã nghiên cứu và áp dụng
nuôi cấy mô trong chọn tạo giống lúa. Trong ñiều kiện còn nhiều hạn chế về
kinh phí, cơ sở vật chất và thiết bị nên các kết quả nghiên cứu chưa làm thỏa
mãn các nhà khoa học, cũng như chưa thể ñưa ra giống lúa mới ñáp ứng nhu
cầu thực tiễn sản xuất như ñã kì vọng.
Nghiêm Thị Như Vân ñã nghiên cứu sự hình thành mô sẹo từ hạt phấn
lúa trong ñiều kiện in vitro. Trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung 2 mg/l
2,4D, nuôi cấy trong tối, các kết quả tác giả cho thấy quá trình hình thành mô
sẹo, hình thái mô sẹo và mức ñộ ña bội xảy ra trong quá trình nuôi cấy
(Nghiêm Thị Như Vân, 1989, tr.27-30).
Hồ Hữu Nhị, Hoàng Thị Yên (1996) nghiên cứu khả năng tái sinh in
vitro của các dòng lúa bất dục phục vụ cho công nghệ sản xuất lúa lai. Tác giả
sử dụng môi trường nền Murashige- Skoog (MS, 1962) có bổ sung acid amin
(arginin, casein hydrolysate) và các phytohocmon (BAP, NAA) cho nuôi cấy
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp

9

tái sinh mô phân sinh và hoa non. Kết quả nghiên cứu này khẳng ñịnh vai trò
cụ thể của từng yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng tái sinh in vitro của mô phân
sinh và hoa non lúa. (Hồ Hữu Nhị và cs., 1996).
Bùi Bá Bổng ñã sử dụng môi trường có bổ sung thêm kinetine (1mg/l)
trong nuôi cấy túi phấn lúa lai thuộc tổ hợp Japonica x indica. Tác giả ñã cho
thấy môi trường nền N6 có hiệu quả trong tạo mô sẹo, tái sinh trên môi
trường nền MS. Tác giả ñồng thời khẳng ñịnh: “callus không thành lập nếu
chỉ bổ sung 2,4D (2mg/l)”. (Bùi Bá Bổng, 1997).
Nguyễn Mạnh ðôn nuôi cấy bao phấn lúa indica trên môi trường tạo
mô sẹo (G1, Fj và L8) trong tối ở nhiệt ñộ 25 ± 10C. Tái sinh cây trên môi
trường MS trong ñiều kiện chiếu sáng có bổ sung chất ñiều hòa sinh
trưởng. Tác giả bố trí thí nghiệm theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên,
số liệu ñược thu thập và xử lý thống kê theo chương trình SAS. Tỷ lệ tạo
mô sẹo dao ñộng từ 1,2% (giống VN23) ñến 28,4% (giống VN15) (Nguyễn
Mạnh ñôn, 2001).
Nguyễn Thị Hồng Châu và cs. ñã thực hiện chuyển gen vào giống lúa
C71 thông qua A. tumefaciens. Nhóm tác giả ñã sử dụng môi trường MS làm
nền cho tất cả các giai ñoạn nuôi cấy, chuyển gen và tái sinh. Gen ñược
chuyển gồm 3 gen là CryIA(b), CryIA(c) (gen mã hóa cho protein ñộc tố trừ
sâu của vi khuẩn Bt và gen Xa21 – gen kháng bệnh bạc lá). Vật liệu là giống
lúa C71. Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo callus của giống lúa C71 khoảng 92%.Tỷ
lệ biến nạp gen CryIA(c) ñạt 6,6%. Tác giả cũng cho rằng khả năng tái sinh
của lúa indica là thấp hơn so với lúa japonica. Thời gian cho cây chuyển gen
mất từ 4,5 ñến 5 tháng. (Nguyễn Thị Hồng Châu và cs., 2003).
Nguyễn Thị Thanh Huyền và Cs. ñã nghiên cứu và ñánh giá ảnh hưởng
của mối tương tác giữa nguồn gen lúa và môi trường nuôi cấy. Tác giả sử
dụng giống lúa C70 làm ñối chứng ñể ñánh giá cho tập ñoàn các giống lúa ñịa
phương; Nghiên cứu này cho rằng ñối với các nguồn gen trong thí nghiệm,

Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp
10

môi trường N6 tỏ ra thích hợp cho tạo mô sẹo hơn so với L8 và MS. (Nguyễn
Thị Thanh Huyền và Cs., 2003). Nhóm tác giả ñã sử dụng vật liệu là bao phấn
lúa, thí nghiệm bố trí theo phương pháp split-plot với giống là yếu tố chính,
môi trường nuôi cấy là yếu tố phụ, số liệu ñược thu thập và xử lý theo chương
trình IRRISTAT 3.1 (Nguyễn Thị Thanh Huyền, 2003).
Ngoài kết quả tổng hợp ở trên, còn nhiều công trình khác nghiên cứu về
công nghệ nuôi cấy mô tế bào và chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn. Tuy
nhiên, các tác giả này hầu như không sử dụng phần mềm xử lý số liệu mà
thực hiện thí nghiệm không lặp lại, có xử lý số liệu theo thống kê sinh học.
(Cao Lệ Quyên, 2008).
2.4. Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình nuôi cấy phôi non và tái sinh cây lúa
2.4.1. Tuổi phôi
Trong chọn tạo giống lúa, vật liệu khởi ñầu ñược sử dụng là mô phân
sinh ñỉnh (Park và CS. 1996, Arocliasamy và Ignacimuthu 2007) và mô sẹo là
những mô có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Mô sẹo ñược tạo ra từ
lát cắt thân (Furuhashi và Yatazawa, 1964), hoa non, bao phấn, tiểu bào tử,
ñỉnh rễ (Chen và CS. 1985, Kawata và Ishihara 1968, Sticklen 1991, Reddy
và CS.1985, Visarada và CS.1998, Mandal và CS. 2003), bao lá mầm (Oinam
và Kothari 1995, Chand và Sahrawat 1997), trụ dưới là mầm (Henke và CS.
1978), hạt chín (Lin và Zhang 2005, Rachmawati và Anzai 2006), và phôi non
từ hạt lúa non (Lai và Liu, 1982; Koetije và CS.1989; Zeba và CS. 1997;
Saker và CS. (2006); Hiei và CS. (2006); Hiei và Komari, 2008). Trong các
mô kể trên, mô sẹo ñược tạo ra từ hạt chín và hạt non ñược sử dụng phổ biến
hiện nay ñể tái sinh cây phục vụ chuyển gen.
Tuổi phôi từ các hạt non ñóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình
tạo mô sẹo, mô sẹo phôi hóa và tái sinh cây. Trong ñó, tuổi của phôi non cao
thì hiệu quả tái sinh cây thấp. Nghiên cứu của Lai và Liu (1982) cho thấy tỷ lệ

tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi non giai ñoạn 10 ngày tuổi cao hơn giai
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp
11

ñoạn 16, 18 ngày tuổi ở giống lúa Tainan No. 5. Do ñó, trong các nghiên cứu
biến nạp phôi non giai ñoạn 8-12 ngày tuổi thường ñược các nhà nghiên cứu
lựa chọn làm vật liệu chuyển gen lúa.
2.4.2. Kiểu gen của cây
Kiểu gen của cây ảnh hưởng rất lớn ñến kết quả nuôi cấy phôi non lúa. Các
kiểu gen khác nhau có phản ứng rất khác nhau với ñiều kiện nuôi cấy in vitro.
Theo Raina và Zapata các giống lúa thuộc loài phụ Japonica dễ nuôi
cấy hơn các giống lúa thuộc loài phụ Indica. Các giống lúa Japonica có hiệu
quả tái sinh cao hơn các giống lúa Indica do ñó hiệu quả biến nạp gen ở các
giống lúa Indica thường thấp hơn ở các giống Japonica (Khanna và Raina
1998, Amin và CS. 2004). Chen và CS. (2004). Hơn nữa các ñặc trưng di
truyền trong phản ứng tạo mô sẹo và tái sinh cây xanh là vấn ñề nan giải ñối
với các giống lúa thuộc loài phụ Indica. Hiệu suất tái sinh cây xanh rất thấp
ñối vơi loài phụ này. Theo nghiên cứu của Phan Hữu Tôn (2005), nuôi cấy
bao phấn lúa các giống thuộc loài phụ Japonica cho tỷ lệ thành công cao hơn
so với nuôi cấy bao phấn lúa các giống thuộc loài phụ Indica.
Theo Yamaghishi và CS cũng nhận thấy các giống lúa thuộc loài phụ
Indica và các dòng lúa lai giữa Japonica và Indica nói chung cho khả năng
nuôi cấy thấp so với các giống thuộc loài phụ Japonica. Ông cũng phát hiện ra
một vùng NST số 1 kiểm soát sự hình thành mô sẹo và vùng NST số 10 kiểm
soát tỷ lệ tái sinh cây xanh và cây bạch tạng.
Như vậy có thể thấy rằng kiểu gen của cây là yếu tố quyết ñịnh trong sự
hình thành mô sẹo và tái sinh cây xanh từ nuôi cấy bao phấn lúa.
2.4.3. Thành phần môi trường
Trong nuôi cấy mô lúa, môi trường nuôi cấy là ñiều kiện tối cần thiết,
ñóng vai trò quan trọng ảnh hưởng ñến kết quả nuôi cấy vì mỗi môi trường có

chứa các thành phần dinh dưỡng khác nhau quyết ñịnh sự phân hoá tế bào và
cơ quan trong nuôi cấy. Hiện nay, môi trường ñược dùng ñể nuôi cấy mô bao
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp
12

là N6, MS, L8, He5, B5 (Niizeki, 1999). Các môi trường này ñều ñược cải
tiến từ môi trường cơ bản MS (Murashinge và Skoog, 1962) bằng cách thay
ñổi nồng ñộ các chất dinh dưỡng khoáng ñặc biệt là Nitơ và bổ sung nguồn
dinh dưỡng hữu cơ ñã làm tăng rõ rệt kết quả tạo phôi từ nuôi cấy bao phấn.
Nuôi cấy bao phấn trải qua hai giai ñoạn là giai ñoạn tạo mô sẹo và tái sinh
cây. Mỗi giai ñoạn yêu cầu về môi trường và ñiều kiện nuôi cấy khác nhau.
Môi trường thích hợp nhất ñối với giai ñoạn tạo mô sẹo là môi trường
N6 ñối với hầu hết các kiểu gen (Phan Hữu Tôn, 2004) cao hơn gấp hai lần so
với môi trường MS. Theo Hoang và CS (1978) thì môi trường He5 thích hợp
nhất với các kiểu gen loài phụ Indica. Môi trường SK3 (Chen và CS, 1978)
thích hợp cho con lai giữa Indica và Japonica.
Môi trường MS ñược coi là môi trường thích hợp nhất ở giai ñoạn tái
sinh và nhân nhanh cây ñối với các kiểu gen.
Hàm lượng, số lượng các chất ñiều tiết sinh trưởng, các nguồn cacbon,
nitơ cũng ảnh hưởng ñến kết quả nuôi cấy bao phấn.
a. Nguồn cacbon
Mô tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị
dưỡng mặc dù nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng. Vì vậy,
cung cấp nguồn cacbon là thành phần bắt buộc của môi trường. Trong số các
thành phần môi trường thì nguồn và hàm lượng ñường là yếu tố quan trọng vì
nó làm tăng áp suất thẩm thấu trong môi trường và bổ sung năng lượng cho
hoạt ñộng tế bào.Theo Trigiane và Gray (2000): Hydratcacbon ñóng góp 50-
70% vào khả năng thẩm thấu của môi trường, phần còn lại là do các muối và
các thành phần khác gây ra vì thế có thể thay ñổi khả năng thẩm thấu của môi
trường qua thành phần hydratcacbon. ðối với lúa, nông ñộ ñường tối ưu theo

các tác giả có khác nhau. Theo kết quả nghiên cứu của Phan Hữu Tôn (2004)
cho thấy trên môi trường N6 dạng ñường Lactoza cho tỷ lệ tạo callus cao nhất
(8,39%), tiếp ñến là ñường Sucrose (6,82%) khi nghiên cứu trên 9 giống lúa.
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp
13

Kết quả này hơi khác với Chaleff (1982) và Zapata (1986) cho rằng ñường
Saccharose tốt hơn lactose. Nồng ñộ ñường cũng ảnh hưởng ñến kết quả nuôi
cấy, nồng ñộ sucrose cao làm tăng tái sinh cây xanh từ callus nhưng cũng
nhiều cây bạch tạng hơn. Ouyang và CS (1973) cho rằng: trong nuôi cấy bao
phấn lúa mỳ, tỷ lệ tạo callus tăng khi nồng ñộ sucrose tăng, ñồng thời kìm
hãm callus từ tế bào xoma, nhưng khi lượng sucrose quá cao sẽ có tác dụng
âm tính ñối với quá trình hình thành callus từ bao phấn. Nồng ñộ ñường
sucrose 3% tốt hơn 6% ở hầu hết các giống (Phan Hữu Tôn, 2004). Một số tác
giả khác cho rằng 6% ñường là hơi cao nên giảm xuống còn 4%-5% . Niizeki
cho rằng nồng ñộ ñường 3% ñược sử dụng thông thường hơn vì tỷ lệ tạo
callus ở trường hợp này là cao hơn.
Mannitol ở nồng ñộ 50mM tăng hình thành callus lên 34,5% (Li, Ni,
Chen, 1984) tiến hành làm thí nghiệm với mannitol ñã nhận thấy sự hình
thành callus tăng lên 1,5% so với môi trường ñối chứng. Glucose ở nồng ñộ
5g/l tăng hình thành callus và phần trăm cây bạch tạng, ñồng thời giảm sự tái
sinh cây xanh.
b. Nguồn nitơ
Nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy nồng ñộ ion NH
4
+
trong môi trường
cao sẽ làm ức chế hình thành callus trong nuôi cấy bao phấn. Theo Niizeki
(2001) thì dùng môi trường N6 với nồng ñộ NH
4

+
cao hơn sẽ giảm nhiều sự
hình thành callus. Ông cho biết kết quả tốt nhất khi phối hợp 28 mM KNO
3
và
35mM (NH
4
)
2
SO
4
. Chu và CS lại ñề xuất nên dùng môi trường N6 với nồng
ñộ (NH
4
)
2
SO
4
thấp và KNO
3
cao khi nuôi cấy bao phấn. Theo kết quả nghiên
cứu của Chung (1988) cho thấy khi bổ sung nguồn ñạm hữu cơ vào môi
trường tạo callus thì thấy có ảnh hưởng tốt rõ rệt ñến kết quả tái tạo callus.
Các nguồn nitơ hữu cơ như: Glutamin, Alanin, Casein hydrolysate,
Glutathion cũng ñược sử dụng trong nuôi cấy bao phấn lúa. Khi nghiên cứu
ảnh hưởng của việc thay thế nguồn ñạm vô cơ bằng nguồn ñạm hữu cơ dạng
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp
14

Glutamic acid của tác giả Phan Hữu Tôn (2004) thì thấy ở môi trường N6 +

3% ñường có chứa Glutamic acid kích thích tái tạo callus. ðây là tài liệu quý
báu cho sinh viên và các nhà khoa học ñang nuôi cấy về nuôi cấy bao phấn
cây trồng và cây lúa tham khảo, ñóng góp vào việc hoàn thiện quy trình nuôi
cấy bao phấn lúa Indica của Việt Nam.
c. Chất ñiều hoà sinh trưởng
Chất ñiều tiết sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi
trường nuôi cấy, nó có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái
thực vật in vitro. Hiệu quả tác ñộng của chất ñiều hoà sinh trưởng phụ thuộc
vào nồng ñộ sử dụng, hoạt tính vốn có của chất ñiều hoà sinh trưởng, mẫu
nuôi cấy ðối với nuôi cấy bao phấn lúa, trong môi trường cần thiết phải trải
qua hai bước với sự có mặt của auxin và cytokinin. Mặc dù các bao phấn
ñược biết là rất giàu các chất ñiều hoà sinh trưởng thực vật như Auxin và
Giberellin nhưng số lượng và chất lượng của các hormon và sự cân bằng giữa
Auxin - Cytokinin ñược xem là rất quan trọng ñể xác ñịnh phản ứng giữa bao
phấn với môi trường và sự thay ñổi sự biểu hiện di truyền (Evan, 1981).
Auxin cao và Cytokinin thấp sẽ xúc tiến quá trình phát sinh callus, ngược lại
sẽ thích hợp cho sự hình thành chồi và cây con. Trong một vài trường hợp lại
không cần thiết cho sự có mặt của Auxin.
Auxin ñược ñưa vào môi trường nhằm thúc ñẩy sinh trưởng và giãn nở
của tế bào, tăng cường các quá trình tổng hợp và trao ñổi chất, kích thích hình
thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính (Epstein và CS,
1989). Những Auxin dùng phổ biến là 2,4- D, IAA, α- NAA trong ñó 2,4- D
ở nồng ñộ 2mg/l ñược coi là thích hợp nhất cho sự tái sinh callus (Niizeki;
Nguyễn Văn Uyển; Phan Hữu Tôn). Tuy nhiên, (Chaleff, 1982) (Chung,
1988) lại cho rằng thay thế 2,4-D bằng α - NAA ở nồng ñộ 1-2mg/l ñược coi
là hiệu quả hơn so với các Auxin ñơn lẻ hoặc kết hợp chúng với nhau. Theo
Chu và CS (1976) callus từ mô có thể tái sinh ngay trên môi trường có auxin
Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp
15

ở nồng ñộ thấp, nhưng tốt hơn là ở môi trường không có auxin.
Trong môi trường tạo callus, nồng ñộ IAA cao kết hợp với 2,4-D làm tăng
tái sinh cây xanh và làm giảm sự sinh trưởng không kiểm soát ñược của callus
(Datta, 1990). Nồng ñộ cao của 2,4-D làm tăng các dạng cây bạch tạng (Wang,
1974). ðiều này có lẽ do ảnh hưởng bất lợi của 2,4-D ñến các ñặc tính di truyền
hình thái. Gần ñây, Bjornstad A và CS (1993) khẳng ñịnh rằng mỗi kiểu gen cần
những nồng ñộ khác nhau của 2,4-D và 2,4,5- T ñể tạo callus dạng phôi.
Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và phát triển
của chồi in vitro (Miller, 1961). Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ
và sự sinh trưởng của mô sẹo, nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt ñến phát
sinh phôi vô tính của mẫu nghiên cứu.
Cytokinin gồm Zeatin, Kinetin, BA ở nồng ñộ cao ñược coi là có lợi
cho sự tái sinh cây.
Sự kết hợp các hormon trong môi trường nuôi cấy ñã ñược nghiên cứu
rất nhiều nhưng sự kết hợp tối thích cần phải ñược thiết lập cho từng kiểu gen
bởi vì không có môi trường ñơn lẻ nào biểu hiện tốt nhất cho nhiều kiểu gen
(Karim và CS, 1987). Theo Nguyễn Thị Lang (2002), kết hợp 0,5mg/l 2,4- D
+ 1mg/l a - NAA + 0,5mg/l BA cho tỷ lệ tạo callus cao. Còn theo Huang, Wu,
Chen sử dụng kết hợp 2mg/l α- NAA + 1mg/l Kinetin trên môi trường N6 cho
chất lượng callus tốt có tỷ lệ tái sinh cây cao. Môi trường tái sinh cây là MS +
2mg/l α- NAA +1mg/l Kinetin là thích hợp (Phan Hữu Tôn, 2005).
Các chất chuyển hoá và các chất ñiều tiết sinh trưởng khác nhau như
ABA, DDT, actinomicyn- D và 2-deoxyglucose cũng ñược nghiên cứu. ABA
và DDT ñược coi là chất ngăn cản sự phân chia tế bào và kích thích sự hình
thành chồi xanh trong nuôi cấy bao phấn. Trong khi ñó, actinomicyn- D và 2-
deoxyglucose lại tăng cường sự hình thành callus ở lúa mì và lúa gạo. ABA
làm tăng sự tái sinh cây xanh nhưng mức tối thích lại tuỳ theo kiểu gen
(Zapata và Torizo, 1986).