Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh và chuyển gen sử dụng agrobacterium tumefaciens cho đối tượng cây bạch đàn urô (eucalyptus urophylla)

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .............................................................. Error! Bookmark not defined.
MỤC LỤC .................................................................................................................. i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. iii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ iv
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................v
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
Đặt vấn đề..................................................................................................................................... 1
Mục tiêu........................................................................................................................................ 2
Ý nghĩa của đề tài ........................................................................................................................ 2
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................3
1.1. Tổng quan về bạch đàn nói chung và bạch đàn Urô nói riêng ........................................ 3
1.2. Tình hình trồng bạch đàn Urô ở Việt Nam........................................................................ 5
1.3. Năng suất của cây bạch đàn Urô ở Việt Nam ................................................................... 6
1.4. Các hướng cải thiện giống bạch đàn bằng ứng dụng Công nghệ sinh học .................... 8
1.4.1. Nghiên cứu về hệ thống tái sinh in vitro cây bạch đàn............................................................ 8
1.4.2. Nghiên cứu về chuyển gen vào cây bạch đàn........................................................................... 9
1.4.3. Nghiên cứu phát triển và sử dụng các chỉ thị phân tử trong chọn tạo và lai giống .........11
1.4.4. Nghiên cứu thành lập ngân hàng cDNA và giải trình tự hệ genome của các loài bạch đàn12
1.5. Các hệ thống tái sinh cây phục vụ chuyển gen ............................................................... 12
1.5.1. Hệ thống tái sinh cây thông qua tạo đa chồi trực tiếp từ mẫu cấy phục vụ chuyển gen 13
1.5.2. Hệ thống tái sinh cây thông qua mô sẹo ....................................................................13
1.5.3. Hệ thống tái sinh cây thông qua tạo phôi soma .....................................................14
1.6. Kỹ thuật chuyển gen thực vật .........................................................................15
1.6.1. Giới thiệu về vi khuẩn A. tumefaciens .......................................................................15
1.6.2. Cấu trúc của Ti - plasmid và T - DNA .......................................................................16
1.6.3. Các loại vector dùng trong chuyển gen vào thực vật ..........................................16
1.6.4. Cơ chế của quá trình chuyển T - DNA vào tế bào thực vật ............................18
1.7. Thành tựu trong nghiên cứu tạo giống bạch đàn chuyển gen........................................ 21
1.7.1. Trên thế giới ....................................................................................................................................21
1.7.2. Tại Việt Nam ..................................................................................................................................27

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................28
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................................ 28
2.1.1. Vật liệu thực vật .............................................................................................................................28
2.1.2. Vật liệu di truyền và các chủng vi khuẩn .................................................................................28
2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................28
i


2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................29
2.3.1. Nuôi cấy mô ..............................................................................................................................29
2.3.2. Chuyển gen vào cây bạch đàn Urô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ..31
2.3.3. Phân tích thể nhận gen, mô sẹo, chồi và cây chuyển gen bằng phương pháp hóa sinh 33
2.3.4. Phân tích chồi, cây chuyển gen bằng phương pháp phân tử ...........................33
2.3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm .......................................................................................34
2.3.6. Các chỉ tiêu theo dõi .............................................................................................................35
2.3.7. Xử lý số liệu..............................................................................................................................35
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................36
3.1. Kết quả xây dựng quy trình tái sinh cây bạch đàn Urô thông qua mô sẹo .......................36
3.1.1. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo mô sẹo ...............................................37
3.1.2. Ảnh hưởng của BAP, NAA và Kinetin đến khả năng tạo chồi từ mô sẹo ................40
3.1.3. Ảnh hưởng của tổ hợp NAA và IBA đến khả năng ra rễ................................................43
3.2. Chuyển gen gus plus vào cây bạch đàn Urô thông qua Agrobacterium tumefaciens ....47
3.2.1. Xác định ngưỡng nồng độ chất chọn lọc kanamycin .......................................................47
3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy tới khả năng biến nạp gen ..............................51
3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn tới khả năng biến nạp gen..............................53
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy tới khả năng biến nạp gen............................55
3.2.5. Ảnh hưởng của chủng Agrobacterium tumefaciens đến khả năng biến nạp gen...........57
3.2.6. Ảnh hưởng của nguồn mẫu tới khả năng biến nạp gen ........................................................58
3.3. Chuyển gen GA20 vào cây bạch đàn Urô thông qua Agrobacterium tumefaciens .... 63
3.3.1. Đánh giá khả năng tái sinh chồi sau chuyển gen ....................................................................63

3.3.2. Đánh giá khả năng ra rễ và kiểm tra PCR cho chồi sau chuyển gen .................................65
Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................68
4.1. Kết luận ............................................................................................................................... 68
4.1.1. Xây dựng quy trình tái sinh cây bạch đàn Urô thông qua mô sẹo......................................68
4.1.2. Xây dựng quy trình chuyển gen gus plus vào cây bạch đàn Urô .......................................68
4.1.3. Kết quả chuyển gen GA20 vào cây bạch đàn Urô ................................................................69
4.2. Kiến nghị............................................................................................................................. 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................70
PHỤ LỤC .................................................................................................................78

ii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AS

:

Acetosyringone

BAP

:

6 - Benzylaminopurine

ĐC

:

Đối chứng

GA

:

Gibberellin

IAA

:

Indole - 3 acetic acid

IBA

:

Indole - 3 butyric acid

MS

:

Murashige và Skoog (1962)

NAA

:

 - naphthaleneacetic acid

ND

:

Nước dừa

cs

:

Cộng sự

iii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số cây trồng chuyển gen sử dụng hệ thống tái sinh chồi trực tiếp từ mô sẹo .13
Bảng 1.2. Một số cây trồng chuyển gen sử dụng hệ thống tái sinh qua tạo phôi soma ......14
Bảng 1.3. Danh sách các nghiên cứu về chuyển gen trên đối tượng Eucalyptus ......23
Bảng 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn A.tumefaciens.......................32
Bảng 2.2: Thành phần dung dịch đệm tách chiết ......................................................33
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng nhân gen GA20 .....................................................34
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng tạo mô sẹo ..............38
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP, NAA và Kinetin .........................................40
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tổ hợp NAA và IBA tới hiệu quả ra rễ............................44
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của kanamycin tới khả năng sống .........................................48
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của kanacycin đến khả năng ra rễ của bạch đàn Urô ............50

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy đến khả năng biến nạp gen .........52
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến khả năng biến nạp gen .........54
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp gen .......55
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của chủng A.tumefaciens đến khả năng biến nạp gen ...........57
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen ............................59
Bảng 3.11. Khả năng tái sinh của mẫu chuyển gen ..................................................64
Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra khả năng ra rễ của chồi sau chuyển gen .....................66

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Rừng bạch đàn Urô tại Brazil......................................................................4
Hình 1.2. Vai trò của GA20 trong tổng hợp GA dạng hoạt động............................10
Hình 1.3. Cấu tạo phân tử Ti - plasmid.....................................................................16
Hình 1.4. Hệ thống vectơ liên hợp ............................................................................17
Hình 1.5. Hệ thống vectơ nhị thể ..............................................................................17
Hình 1.6. Cơ chế lây nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật .......................20
Hình 2.1. pBI121 chứa gen gus (+) ...........................................................................28
Hình 2.2. pBI121 chứa gen GA20 ............................................................................28
Hình 3.1. Các loại mô sẹo bạch đàn Urô ..................................................................39
Hình 3.2. Chồi tái sinh từ mô sẹo trên môi trường C1 ..............................................41
Hình 3.3. Chồi tái sinh trên các công thức môi trường .............................................42
Hình 3.4. Chồi tái sinh từ mô sẹo trên môi trường C1 (e) và trên môi trường C4 (f) ......43
Hình 3.5. Chồi ra rễ trên các môi trường ..................................................................45
Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến sức sống của thân mầm .............50
Hình 3.7. Biểu hiện gen gus trên các mẫu thí nghiệm..............................................61
Hình 3.8. Chồi chuyển gen gus plus .........................................................................61
Hình 3.9. Chồi chuyển gen GA20 tái sinh trên môi trường chứa Km 150 ...............65
Hình 3.10. Cây chuyển gen GA20 trên môi trường ra rễ ..........................................66

Hình 3.11. Cây chuyển gen được trồng ngoài nhà lưới ............................................67
Hình 3.12. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen GA20 .............................................67

v


MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) là một trong những loài bạch đàn
chính được trồng chủ yếu ở Việt Nam. Đây cũng là loài cây chủ lực trong dự án
trồng mới 5 triệu hecta rừng đã được triển khai trong cả nước giai đoạn 1998 2010. Các nghiên cứu về tỷ trọng gỗ, hàm lượng xenlulozo, chiều dài sợi gỗ, ... đã
được thực hiện, kết quả thu được cho thấy các tính trạng sinh trưởng và chất lượng
gỗ ảnh hưởng lớn đến hiệu suất bột giấy cho ngành công nghiệp giấy. Các đánh giá
về sinh trưởng của bạch đàn Urô tại Việt Nam cũng cho thấy tỷ lệ sinh trưởng của
bạch đàn Urô tại Việt Nam chậm hơn so với các nước khác như Trung Quốc, Brazil
(Santos, 1990; Wei & Borralho, 1998a; Nguyễn Đức Kiên, 2009). Vì vậy, các
chương trình chọn giống bạch đàn ở Việt Nam tập trung chủ yếu vào tăng khả năng
sinh trưởng, cải thiện chất lượng gỗ và tăng sức chống chịu với điều kiện môi
trường bất lợi.
Hiện nay, diện tích rừng tự nhiên ngày càng bị thu hẹp do nạn khai thác bừa
bãi, đất đai bị hoang hóa và tác động tiêu cực gây ra bởi biến đổi khí hậu. Trong khi
nhu cầu nguyên liệu cho ngành chế biến gỗ và công nghệ bột giấy đang dần gia tăng
và tương lai có thể thiếu hụt trầm trọng nếu không có những giải pháp cụ thể và tích
cực. Do đó, vấn đề cải thiện giống cây trồng lấy gỗ phục vụ ngành chế biến gỗ và
công nghệ bột giấy đang là vấn đề cấp bách.
Công nghệ gen là một giải pháp quan trọng và rất hữu hiệu trong trường hợp
này. Thông qua việc sử dụng các kĩ thuật trong công nghệ gen cho phép tạo ra
những giống cây trồng mới; đột phá về năng suất, chất lượng cũng như khả năng
chống chịu. Không những thế cây trồng tạo ra từ công nghệ gen có nhiều đặc tính
ưu việt mà cây trồng hoang dại ban đầu không có được.

Để chuyển thành công các gen có giá trị vào cây bạch đàn Urô cần phải có
một quy trình tái sinh cây hiệu quả cao từ mô sẹo thông qua tạo đa chồi trực tiếp hoặc
tạo phôi soma. Quy trình tái sinh cây một số loài bạch đàn phục vụ chuyển gen đã
được các nhà khoa học đầu tư nghiên cứu: Bandyopadhyay và cs (1999) đã tiến
hành nghiên cứu tái sinh thành công hai loài bạch đàn E. nitens và E. globules từ
vật liệu là mảnh cấy của cây mầm; Cid và cs (1999) đã tiến hành nghiên cứu tái sinh
loài bạch đàn lai E. grandis x E. urophylla từ vật liệu cuống lá cây mầm; nghiên cứu
tái sinh loài bạch đàn E. tereticornis thông qua phôi soma cũng đã được Parakash và
cs (2005) công bố. Dibax và cs (2010) nghiên cứu tái sinh loài bạch đàn E.
cammaldulensis Dehn; Huang và cs (2010) đã nghiên cứu thành công quy trình tái
1


sinh loài bạch đàn Eucalyptus urophylla từ đỉnh thân mầm. Cho đến nay, nhiều loài
bạch đàn đã được nghiên cứu tái sinh thành công thông qua tạo đa chồi hoặc phôi
soma từ các vật liệu là mảnh lá, thân cây mầm. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu
thu được cho thấy ở mỗi loài bạch đàn, thậm chí ở các dòng trong cùng một loài thì
khả năng tái sinh là rất khác nhau (Ho và cs, 1998; Parthiban và cs, 1999; Dibax và
cs, 2005; Hajari và cs, 2006; Gonzales và cs, 2002; Tournier và cs, 2003; Alves và
cs, 2004).
Trên cơ sở các quy trình tái sinh, một số quy trình chuyển gen vào nhiều loài
bạch đàn cũng đã được các nhà khoa học xây dựng thành công bằng việc chuyển các
gen chỉ thị, gen chọn lọc và đang áp dụng hiệu quả để chuyển các gen có giá trị.
Tetsukawazu và cs (2003) đã được cấp bằng sáng chế về quy trình chuyển gen gus
vào loài bạch đàn E. camaldulensis, E. globulus, E. grandis, E. grandis x E. urophylla
và E. urophylla từ các mẫu cấy sinh dưỡng lấy từ cây bạch đàn trưởng thành; Chang
và cs (2006) cũng đã được cấp bằng sáng chế về quy trình chuyển gen và chọn lọc
cây chuyển gen cho loài bạch đàn E. urophylla. Các kết quả nghiên cứu cho thấy sử
dụng các dòng bạch đàn E. urophylla khác nhau cho hiệu suất chuyển gen khác nhau.
Điều này cho thấy để chuyển gen hiệu quả vào từng loài bạch đàn và từng dòng bạch

đàn cụ thể cần có một quy trình thích hợp.
Xuất phát từ cơ sở trên tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình
tái sinh và chuyển gen sử dụng Agrobacterium tumefaciens cho đối tượng cây bạch
đàn Urô (Eucalyptus urophylla)” nhằm cung cấp cơ sở cho việc tạo giống bạch đàn
Urô biến đổi gen sinh trưởng nhanh.
Mục tiêu
- Nghiên cứu, xây dựng được quy trình tái sinh cây bạch đàn Urô thông qua
mô sẹo;
- Nghiên cứu, xây dựng được quy trình chuyển gen vào cây bạch đàn Urô
thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Ý nghĩa của đề tài
Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học
có giá trị về khả năng tạo cây bạch đàn Urô biến đổi gen, sinh trưởng nhanh ở Việt
Nam. Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo cho việc giảng dạy về
phương pháp chuyển gen gián tiếp ở bạch đàn.
Ý nghĩa thực tiễn: Xây dựng thành công quy trình chuyển gen ở bạch đàn thông
qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sẽ làm cơ sở cho việc tạo giống bạch đàn
biến đổi gen sinh trưởng nhanh.
2


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về bạch đàn nói chung và bạch đàn Urô nói riêng
Bạch đàn (Eucalyptus) là một chi thực vật thuộc họ Sim (Myrtaceae), bộ Sim
(Myrtaces), phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp hai lá mầm (Dicotyledone).
Tên bạch đàn Eucalyptus lần đầu tiên được nhà thực vật học người Pháp
Charles Louis L’Heritier de Brutelle đặt cho vào năm 1788. Từ đó đến nay đã có tới
600 loài và biến chủng đã được mô tả và đặt tên, gần đây 500 loài đã được chấp nhận
chính thức. Theo Boland và cs (1987), Eldridge và cs (1993) chi bạch đàn được chia

làm 8 chi phụ. Trong đó, chi phụ Symphyomyrtus có nhiều loài được sử dụng vào
trồng rừng đại trà, như: Loài E. camaldulensis, E. urophylla, E. tereticornis, E.
grandis… Bạch đàn có xuất xứ từ Ôxtrâylia và chỉ có 2 loài bạch đàn phân bố ngoài
Ôxtrâylia là loài E. deglupta Blume và E. urophylla S.T. Blake. Cho đến nay, bạch
đàn đã được gây trồng phổ biến ở khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở các quốc gia
vùng nhiệt đới, ôn đới, như: Brazil, Trung Quốc, Ấn độ, Việt Nam,... (Nguyễn Hoàng
Nghĩa, 2000).
Bạch đàn là loài cây thân gỗ lâu năm, mọc nhanh, cây trồng 5 - 6 năm tuổi
thường có chiều cao trên 7 m và đường kính thân khoảng 9 - 10 cm. cây bạch đàn có
cơ chế tự bảo vệ nhờ một cơ quan dưới mặt đất được gọi là “củ gỗ” và cơ chế phát
triển nhanh nhờ chồi bất định và búp phụ, do đó cây có khả năng thích nghi cao với
nhiều loại lập địa và khí hậu.
Gỗ bạch đàn được coi là nguồn cung cấp nguyên liệu chính cho ngành công
nghiệp sản xuất giấy vì gỗ bạch đàn có thành phần hóa học và cấu tạo sợi rất thích hợp
cho sản xuất bột giấy. Mỗi năm trên thế giới có hàng triệu tấn bột giấy được sản xuất từ
gỗ bạch đàn. Bên cạch đó, gỗ bạch đàn còn được sử dụng làm đồ mộc, sản phẩm thủ
công mỹ nghệ, sản xuất ván dăm, ván sợi xuất khẩu, gỗ xây dựng, cột chống,… Ngoài
ra, lá của một số loài bạch đàn còn được sử dụng để tách chiết tinh dầu, tanin và chế biến
dược phẩm.
Trên thế giới, bạch đàn đang là cây trồng rừng sản xuất chính với diện tích ngày
càng được mở rộng. Theo số liệu công bố vào năm 1993 rừng trồng bạch đàn năm
1990 đã đạt khoảng 10 triệu hecta tại 3 châu lớn là châu Phi, châu Mỹ và châu Á và
Thái Bình Dương, chiếm tới 23% tổng diện tích rừng trồng. Brazil là nước có diện tích
rừng trồng bạch đàn lớn nhất thế giới, năm 1993 ước tính có khoảng 3 triệu hecta
(Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2000). Ở Việt Nam, cây bạch đàn được người Pháp đưa vào
gây trồng từ trước năm 1945, song việc gây trồng bạch đàn trên quy mô lớn mới chỉ
3


được bắt đầu từ năm 1960 (Bùi Thị Huế, 1996). Trong một thời gian ngắn, cây bạch

đàn đã phát triển mạnh mẽ và trở thành một trong số các loài cây lâm nghiệp trồng
rừng quan trọng của nước ta hiện nay.
Thực tế trồng rừng ở Việt Nam cho thấy, hầu hết các vùng được quy hoạch để
trồng rừng là các vùng đất trống bạc màu và đồi trọc nghèo dinh dưỡng vì vậy mà
năng suất cây trồng giảm mạnh do cây sinh trưởng chậm kéo dài luân kỳ khai thác.
Do đó, hiện nay việc nghiên cứu cải thiện giống cây lâm nghiệp với đặc tính sinh
trưởng nhanh trên các nền đất bạc màu rất được Bộ nông nghiệp và phát triển nông
thôn chú trọng.Việc nghiên cứu chọn tạo được giống bạch đàn sinh trưởng nhanh
trên các vùng đất nghèo dinh dưỡng sẽ quyết định đến việc nâng cao được năng suất
rừng trồng bạch đàn, mang lại giá trị kinh tế ổn định và bền vững cho người dân
trồng rừng.
Giống bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla)
Bạch đàn Urô (E. urophylla) có nguyên sản ở Indonesia (tập trung ở một số
đảo là Flores, Adona, Pantar và Timor), phân bố từ 7030 - 100 vĩ Nam và 1220 1270 kinh Đông trên các dốc núi và trong các thung lũng, trên các loại đất bazan,
diệp thạch và phiến thạch, đôi khi mọc ở núi đá vôi. Bạch đàn Urô phân bố ở độ cao
300 - 2960 m so với mặt nước biển. Nơi nguyên sản, bạch đàn Urô có thể cao 25 45 m, cá biệt có thể cao 55 m, đường kính đạt từ 1 - 2 m (Turnbull & Brooker,
1978; Eldridge và cs, 1993; Davidson, 1998).

Hình 1.1. Rừng bạch đàn Urô tại Brazil
Nguồn: />Lần đầu tiên bạch đàn Urô có mặt ở Việt Nam trong chương trình khảo
nghiệm loài và xuất xứ bạch đàn năm 1979 tại vùng nguyên liệu giấy trung tâm Bắc
4


Bộ. Các vườn giống cây trồng bằng hạt (Seedling Seed Orchard - SSO) của loài
hiện đã được xây dựng tại địa bàn các tỉnh Phú Thọ và Hà Tây cũ. Theo thông tin từ
Xí nghiệp giống Lâm nghiệp vùng trung tâm Bắc Bộ và Đồng bằng sông Hồng thì
hạt giống bạch đàn Urô thu tại rừng giống chuyển hoá xã Trạm Thản, Phù Ninh,
Phú Thọ là nguồn cung cấp hạt giống chính cho việc trồng rừng bạch đàn ở các tỉnh
Bắc Bộ và đáp ứng một phần nguyên liệu cho nhà máy giấy Bãi Bằng.

Cho đến nay, ở Việt Nam, loài bạch đàn Urô đã có 3 xuất xứ (Lembata cho
vùng Bắc Trung Bộ, Lewotobi và Egon cho các tỉnh miền Bắc và Tây Nguyên) và 6
dòng vô tính được công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật: PN2, PN14, PN10, PN46,
PN47, PN3d (Lê Đình Khả và cs, 2006) .
Bạch đàn Urô được đánh giá là loài có dáng thân rất đẹp, chất lượng gỗ tốt.
Tại nơi nguyên sản, gỗ bạch đàn này được sử dụng với rất nhiều mục đích như: Gỗ
xây dựng, làm đồ dùng trong gia đình, gỗ trụ mỏ,... Tuy nhiên, bạch đàn Urô được
xem như là nguyên liệu chính cho công nghiệp sản xuất giấy trên thế giới và Việt
Nam.
1.2. Tình hình trồng bạch đàn Urô ở Việt Nam
Bạch đàn được nhập vào Việt Nam từ những năm 1930, tuy nhiên đến đầu
những năm 1960 mới được phát triển mở rộng và sau đó được xem như là một trong
những loài cây chủ lực để phủ xanh đất trống đồi trọc và trồng cây phân tán. Bạch
đàn Urô sinh trưởng tốt trên các lập địa có tầng đất sâu ở miền Bắc và miền Trung,
cũng như tại các vùng thấp của cao nguyên Việt Nam. Gỗ bạch đàn Urô được dùng
làm nguyên liệu giấy (hiệu suất bột giấy 49,5 %), ván dăm, ván sợi ép, trụ mỏ, gỗ lớn
được dùng trong xây dựng, đóng đồ mộc và gỗ nhỏ dùng làm gỗ củi. Tính đến tháng
12 năm 1999, cả nước đã trồng được 349.043 hecta rừng bạch đàn. Trong đó rừng
trồng bạch đàn thuần loài là 249.324 hecta và rừng trồng hỗn giao với các loài cây
khác là 69.719 hecta. Ở vùng Đông Bắc có diện tích trồng bạch đàn lớn nhất
(88.341 hecta), tiếp theo là duyên hải Nam Trung Bộ (77.538 hecta), Bắc Trung Bộ
(69.910 hecta), đồng bằng sông Cửu Long (58.643 hecta), ít nhất là ở vùng Tây
Nguyên (10.556 hecta). Theo số liệu thống kê của Ban chỉ đạo kiểm kê rừng Trung
ương (2001), thì diện tích trồng các loài bạch đàn hiện nay lớn nhất so với các loài
cây khác, đạt 349.043 hecta và chiếm 24.03% so với tổng diện tích rừng trồng của
cả nước (1.452.470 hecta).
Vào những năm 1970, diện tích rừng trồng bạch đàn mới chỉ chiếm khoảng
10% so với tổng diện tích rừng trồng của toàn quốc. Giai đoạn 1986 – 1992 diện
tích rừng trồng bạch đàn cũng chỉ chiếm khoảng 11,75 %. Nhưng đến hết năm
1999, diện tích rừng trồng bạch đàn đã tăng lên 24,03 %. Từ năm 2000 đến tháng 9

5


năm 2003 cho thấy diện tích trồng bạch đàn tăng khá nhanh. Ở Công ty lâm nghiệp
Đông Bắc đã trồng được 4.400 hecta, chủ yếu là bạch đàn Urô. Thực hiện dự án 661
từ 1999 đến 2003, tỉnh Phú Thọ đã trồng được 6.900 hecta, trong đó phần lớn diện
tích là bạch đàn Urô và một số loài keo. Lâm trường song Hậu (Cần Thơ) đã trồng
được 5 triệu cây bạch đàn (Eucalyptus - W5) phân tán trên các bờ kênh, tương
đương với trên 3000 hecta (mật độ trồng quy đổi là 1.660 cây/hecta).
Số liệu thống kê của FAO cho thấy: Năm 1993 tổng diện tích rừng trồng
bạch đàn của Việt Nam và khoảng 245.000 hecta, xếp thứ 3 ở châu Á chỉ đứng sau
Ấn Độ (4.800.000 hecta), Trung Quốc (670.000 hecta) (FAO, 1996).
Theo số liệu thống kê, năm 2002 tổng diện tích rừng trồng bạch đàn của Việt
Nam là 348.000 ha chiếm khoảng 30% tổng diện tích rừng trồng, trong đó diện tích
rừng trồng loài bạch đàn Urô và bạch đàn lai Urô tính đến cuối năm 2001 là 200.000 ha
tại các tỉnh Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Yên Bái, Thái Nguyên và Quảng Ninh (Mard, 2002).
Cây bạch đàn Urô được xếp vào danh mục các loài cây chủ yếu cho trồng rừng
sản xuất theo 9 vùng sinh thái lâm nghiệp của Việt Nam (Theo Quyết định số
16/2005/QĐ-BNN ngày 15/3/2005 của Bộ trưởng Bộ NN&PTNT). Trong những năm
gần đây, nhiều vùng trong cả nước, đặc biệt là các vùng có điều kiện sinh thái phù hợp,
trồng rừng bạch đàn đã mang lại thu nhập cao cho người dân. Cây bạch đàn đã và đang
phát triển mạnh mẽ và trở thành một trong số các cây trồng rừng sản xuất chính của
nước ta hiện nay.
Như vậy, có thể thấy rừng trồng bạch đàn đã chiếm một tỷ lệ khá lớn trong
diện tích rừng trồng của cả nước, đồng thời diện tích trồng bạch đàn đã tăng khá
nhanh trong giai đoạn từ 1993 – 1999 và tiếp tục phát triển với tốc độ nhanh từ năm
2000 trở lại đây (Lê Phương Dung, 2009). Đến năm 2008, tổng diện tích rừng đã
đạt 586.000 hecta (Iglesias Trabado & Wilstermann, 2008). Điều đó cho thấy vai trò
của cây bạch đàn rất quan trọng trong cơ cấu cây trồng rừng ở nước ta trong những
năm qua, đồng thời loài cây này cũng là nguồn nguyên liệu chủ yếu phục vụ ngành

công nghiệp giấy sợi và ván nhân tạo, đóng góp không nhỏ vào sự phát triển của
nền kinh tế quốc dân.
1.3. Năng suất của cây bạch đàn Urô ở Việt Nam
Bạch đàn Urô là loài cây mọc nhanh, tăng trưởng đường kính bình quân từ
1,25 cm đến 2 cm/năm, tăng trưởng chiều cao đạt từ 1,2 - 1,5 m/năm tùy theo điều
kiện tự nhiên (thổ nhưỡng, khí hậu). Cây mọc thẳng, có thân tròn đều, ít bạnh vè.
Mặc dù tầm quan trọng của bạch đàn Urô trong trồng rừng sản xuất nhưng
năng suất của E. urophylla ở Việt Nam còn thấp (8 - 10 m³/hecta/năm). Tăng trưởng
6


của cây bạch đàn Urô ở Việt Nam tương đối chậm so với ở các nước khác. Tăng
trưởng chiều cao trung bình hàng năm trong cả hai thử nghiệm ở độ tuổi 5 đạt được
trong khoảng từ 1,9 - 2,7 m (Kien và cs, 2009), so với 3 - 5 m đạt được ở Trung
Quốc hay Brazil, nơi điều kiện phát triển thuận lợi hơn (Santos và cs, 1990; Wei &
Borralho, 1998a). Rõ ràng cải tiến di truyền E. urophylla ở Việt Nam rất cần chú
trọng thực hiện theo hướng tăng tăng trưởng.
Bạch đàn Urô hiển thị tốc độ tăng trưởng tương đối chậm tại các địa điểm
thử nghiệm ở miền Bắc Việt Nam, so với những ghi nhận ở các nước khác, nơi các
loài này được trồng. Công trình công bố trước đây từ các thử nghiệm xuất xứ của E.
urophylla ở miền Bắc Việt Nam báo cáo rằng các xuất xứ có triển vọng nhất là
Lewotobi và Egon từ Đảo Flores (Tai, 1994; Kha và cs, 2003). Hai xuất xứ này
cũng phát triển tốt ở khu vực Tây Nguyên và miền Trung Việt Nam (Kha và cs,
2003). Tính ưu việt của nguồn gốc Lewotobi cho sự tăng trưởng trước đó đã được
báo cáo từ các thử nghiệm nguồn gốc ở phía đông nam Trung Quốc (Wei &
Borralho, 1998b , Baix và cs, 2003). Một số thử nghiệm khác về nguồn gốc ở miền
bắc Việt Nam cũng cho thấy các xuất xứ Ulubaha từ đảo Wetar (Tai, 1994) và
Lembata từ Flores đảo (Kha, 2001) cũng tăng trưởng tốt. Nguồn gốc Lembata cũng
cho thấy sự tăng trưởng tốt ở miền Trung Việt Nam (Kha và cs, 2003).
Trong khi ở các nước trên thế giới, sinh trưởng của bạch đàn Urô đạt được ở

mức cao hơn nhiều. Eldridge và cs (1993) đã chỉ ra trong điều kiện phát triển thuận
lợi, sản lượng loài bạch đàn Urô ở Indonesia, Brazil và miền Nam Trung Quốc có
thể đạt từ 20-30 m³/hecta/năm. Một thử nghiệm gần Edea, Cameroon, châu Phi
trong 8 năm, bạch đàn Urô được trồng trên một điều kiện lập địa thích hợp thu được
sản lượng 30m³/hecta/năm (Eldridge và cs, 1993). Tại Mangombe, Cameron (độ
cao 30 m, lượng mưa 2.600 mm) bạch đàn Urô đã cho sản lượng 83 m³/hecta/năm ở
độ tuổi 8 năm (Eldridge và cs, 1993). Tại Cộng hòa Congo, tăng trưởng của bạch
đàn Urô là khoảng 40 m³/hecta/năm ở độ tuổi 5 năm (Eldridge và cs, 1993).
Gần đây, những nghiên cứu chọn tạo giống thông qua chọn dòng vô tính đã
đưa năng suất của rừng trồng bạch đàn Urô ở Việt Nam lên cao hơn. Một khảo
nghiệm được tiến hành tại vùng Trung tâm miền Bắc trong giai đoạn 1998-2003
được tiến hành cho 36 dòng gồm các dòng bạch đàn Urô được lẫn các giống GU1,
GU8, U6, W4 và W5 cùng giống đối chứng là cây hạt của bạch đàn Urô lấy từ sản
xuất. Kết quả khảo nghiệm dòng vô tính tại một số xã thuộc huyện Tam Nông và
Đoan Hùng cho thấy sau 3, 4, 5 năm ba dòng bạch đàn Urô PN10, PN46 và PN47 là
những dòng có thể tích thân cây tương ứng là 101, 127 và 103,6 dm 3/cây với năng
suất tương ứng là 23,38 và 30 m3/hecta/năm, trong khi giống đối chứng là cây hạt
7


của bạch đàn Urô chỉ có thể tích thân cây 41,4 - 43,8 dm3/cây và năng suất chỉ đạt 8
- 10 m3/hecta/năm (Nguyễn Sỹ Huống và cs 2003). Các dòng PN10, PN46 và PN47
đã được Bộ NN&PTNT công nhận là Giống tiến bộ kỹ thuật tại quyết định số
2722/KHCC - NNNT ngày 7 tháng 9 năm 2004 để phát triển ở vùng Trung tâm
miền Bắc.
Năm 2013, các nhà khoa học thuộc Viện Giống và Công nghệ sinh học Lâm
nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu, chọn tạo thành công
giống bạch đàn Urô 262 (mã số giống mới được công nhận BĐU.BV.12.27). Giống
bạch đàn Urô 262 có các đặc điểm chính như sinh trưởng, phát triển tốt, năng suất
bình quân đạt 23,9 m3/hecta/năm, không bị sâu bệnh, hiệu quả kinh tế cao gấp 1,5 2 lần so với giống thông thường. Giống bạch đàn Urô 262 đã được trồng thành công

Hà Nội, Nghệ An và những nơi có điều kiện sinh thái tương tự.
Cũng trong năm này, Bộ NN & PTNT công nhận 03 giống bạch đàn Urô là
giống tiến bộ kĩ thuật: Dòng bạch đàn Urô U416 (BĐU.BV.12.26), U821
(BĐU.BV.12.25), U1088 (BĐU.BV.12.24) và 6 xuất xứ tiến bộ kĩ thuật của bạch
đàn E. urophylla: Lembate, Mt.Egon, Lewotobi, Sirinumu, Oro Bay, Laura river,
Viện nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp.
Như vậy, sinh trưởng của bạch đàn Urô ở Việt Nam so với các nước khác
còn ở mức thấp. Rất cần những cải tiến về mặt giống, chăm sóc, gieo trồng,...Trong
đó quan trọng hơn cả là công tác chọn - tạo giống, ..., hướng tạo ra những dòng
bạch đàn Urô sinh trưởng nhanh thông qua biến đổi gen là một hướng giải quyết rất
có tiềm năng.
1.4. Các hướng cải thiện giống bạch đàn bằng ứng dụng Công nghệ sinh học
Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn, tạo giống bạch đàn đang
được thực hiện theo các hướng chính sau đây:
1.4.1. Nghiên cứu về hệ thống tái sinh in vitro cây bạch đàn
Tái sinh in vitro cây bạch đàn đã được nghiên cứu từ những năm 1980 xuất
phát từ nhu cầu thực tế là cần nhiều cây giống cho sản xuất. Nguồn nguyên liệu cho
nhân giống in vitro chủ yếu được lấy từ chồi ngọn. Hàng triệu cây mô đã được tạo
ra theo cách này. Năm 1987, đã có trên 20 loài bạch đàn được nhân giống thành
công bằng nuôi cấy mô. Đến năm 1991 nhân giống thành công 31 loài và đến nay
thì hầu hết các loài bạch đàn có thể nhân giống thành công in vitro. Diện tích rừng
trồng bạch đàn bằng cây mô cũng đã tăng lên nhanh chóng ở nhiều nước như Ấn
Độ, Australia, Trung Quốc, Việt Nam,.. (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2000).

8


Ở nước ta dòng bạch đàn U6 đã được Trung tâm giống và Công nghệ sinh học,
Đại học lâm nghiệp, Trung tâm nghiên cứu ứng dụng khoa học và sản xuất lâm
nông nghiệp Quảng Ninh nhân giống in vitro với quy mô hàng triệu cây/năm.

Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu thấy rằng hệ thống tái sinh trên chỉ phù hợp
cho nhân giống vô tính, vì hệ thống tái sinh này chủ yếu là thông qua phát triển
nhanh các chồi bên và chồi ngủ. Nếu chuyển gen vào hệ thống tái sinh này sẽ tạo ra
cây bạch đàn chuyển gen thể khảm, tính trạng sẽ biểu hiện không như mong muốn
và gen chuyển không duy trì được sang thế hệ sau. Để phục vụ mục đích cải tạo
giống bạch đàn bằng công nghệ sinh học mà cụ thể là bằng kỹ thuật gen thì cần thiết
phải có một hệ thống tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn tạo mô sẹo, từ mô
sẹo mới phát sinh chồi trực tiếp hoặc qua tạo phôi soma. Nhiều loài bạch đàn có giá
trị như E. nitens, E. globulus, E. grandis, E grandis x E. urophylla đã được tái sinh
thành công qua giai đoạn mô sẹo phát sinh chồi trực tiếp.
Theo nhiều tác giả, ảnh hưởng của tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng đóng vai
trò quyết định trong quá trình cảm ứng tạo mô sẹo và từ mô sẹo phát sinh chồi.
Bandyopadhyay và cs (1999) đã nghiên cứu thấy rằng môi trường MS bổ sung thêm
0,5 mg/l NAA + 1 mg/l BAP cho hiệu quả tạo chồi tốt nhất. Kết quả này cũng được
lặp lại bởi Dibax (2005) với tỷ lệ mô sẹo tạo chồi lên đến 54%. Tuy nhiên, Cid và
cs (1999) khi nghiên cứu từ vật liệu là cuống lá mầm lại cho thấy môi trường SP +
5µM zeatin + 0,5 µM NAA cho tỷ lệ mô sẹo tạo chồi cao nhất (98%).
Những nghiên cứu về tái sinh cây bạch đàn thông qua giai đoạn mô sẹo tạo
phôi soma còn rất ít. Gần đây, Parakash và cs (2005) đã thành công khi sử dụng
hướng này trên loài bạch đàn E. tereticornis. Kết quả cho thấy môi trường cảm ứng
tạo phôi soma MS + 2,22 µM BAP cho tỷ lệ tạo phôi cao nhất 54% với trung bình
33,3 phôi soma/mẫu cấy (Costa Pinto, 2007).
Từ những kết quả nghiên cứu của các nhóm tác giả trên cho thấy: Nghiên
cứu xây dựng hệ thống tái sinh cây bạch đàn trực tiếp thông qua giai đoạn tạo đa
chồi từ mô sẹo hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phôi soma của một số giống bạch
đàn đang được trồng phổ biến ở Việt Nam phục vụ cho công tác chuyển gen là có
thể thực hiện được.
1.4.2. Nghiên cứu về chuyển gen vào cây bạch đàn
Các hướng nghiên cứu tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen đang được
nhiều nhà khoa học lâm nghiệp trên thế giới quan tâm: Tạo cây kháng sâu và côn

trùng; tạo cây kháng nấm bệnh; tạo cây sinh trưởng nhanh; tạo cây có chất lượng gỗ
tốt và tạo cây kháng được các điều kiện bất lợi của môi trường (lạnh, mặn và hạn).
9


Đối với cây lâm nghiệp trồng rừng kinh tế thì tốc độ sinh trưởng và chất lượng gỗ là
những tính trạng được quan tâm hàng đầu, nhằm nâng cao giá trị kinh tế trên một
đơn vị diện tích rừng trồng. Theo báo cáo của FAO (2004) các nghiên cứu về cải
tạo giống cây lâm nghiệp có liên quan đến tăng tốc độ sinh trưởng nhanh và chất
lượng gỗ tốt chiếm 63%.
Hiện nay, những nghiên cứu về chuyển gen vào cây bạch đàn mới chỉ chủ yếu
tập trung vào chuyển gen chỉ thị gus nhằm xây dựng quy trình chuẩn cho việc chuyển
gen vào cây bạch đàn và bước đầu thử nghiệm trên một số tính trạng như chất lượng
gỗ, cải thiện tính chống chịu. Phương pháp chuyển gen vào bạch đàn phổ biến nhất là
sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens mang hệ thống vector nhị thể chứa gen gus và một số
gen chọn lọc như nptII, bar (Spokevicius và cs, 2005). Nguồn vật liệu để chuyển gen
cũng rất đa dạng, như: Thân cây mầm, thân thật, lá thật trên các loài bạch đàn E.
camaldulensis, E. globulus, E. grandis x E. urophylla. Năm 2003, Tetsu kawazu và cs
đã được cấp bằng sáng chế về quy trình chuyển gen vào cây bạch đàn từ các mẫu cấy
sinh dưỡng lấy từ cây bạch đàn trưởng thành.
Một số giống bạch đàn chuyển gen với các tính trạng như chất lượng gỗ tốt,
kháng sâu bệnh hại, chịu mặn, chịu hạn,... đã được tạo ra, như: Giống bạch đàn E.
camaldulensis chuyển gen (C4H, antisense CAD,
LIM domain transcription factor) làm giảm hàm
lượng lignin (Chen và cs, 2001; Valerio và cs, 2003;
Kawaoka và cs, 2006); giống bạch đàn E. urophylla
chuyển gen CecropinD kháng bệnh gây ra bởi
Pseudomonas solanaceanum (Shao và cs, 2002);
giống bạch đàn E. camaldulensis Dehnh. chuyển
gen codA 12 - 5B, codA 12-5C, codA 20 - C có khả

năng chịu mặn (Kikuchi và cs, 2006 Murakami,
2006; Xiang và cs, 2009); giống bạch đàn E. saligna
chuyển gen P5CS có khả năng chịu hạn (Dibax,
2010). Một số giống bạch đàn chuyển gen đã được
gây trồng khảo nghiệm và đưa vào sản xuất.
* Gen GA20 – gen điều hòa quá trình
sinh tổng hợp GA ở thực vật
Gibberellins (GAs) là các hợp chất sinh
trưởng thuộc dạng diterpenes có vai trò điều hòa
quá trình sinh trưởng ở thực vật và có ảnh hưởng
đến các quá trình phát triển khác nhau ở trong cây.
10

Hình 1.2. Vai trò của GA20 trong tổng hợp
GA dạng hoạt động (Eriksson và cs, 2000)


Cho đến nay đã xác định được hơn 100 chất thuộc nhóm này, tuy nhiên chỉ một vài
chất là có hoạt tính sinh học. Các nhóm chất GA được sinh tổng hợp theo con
đường isoprenoid bắt đầu từ acid mevalonic. Hàm lượng GA ở trong tế bào thực vật
được điều hòa bởi hoạt động của các gen ở mức độ phiên mã.
Trong số các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp GA dạng hoạt động thì
gen mã hoá cho enzym GA - 20 oxidase giữ vai trò rất quan trọng trong việc điều
khiển quá trình sinh tổng hợp GA ở tế bào thực vật. Enzym này xúc tác cho sự
chuyển hoá GA12/GA53 thành GA9/GA20 thông qua 3 phản ứng oxi hoá khử liên
tiếp, mà GA9/GA20 lại là tiền chất trực tiếp để tạo thành GA1/GA4 có hoạt tính
sinh học. Do đó enzym GA20 - oxidase được coi là một enzym chìa khoá quan
trọng trong quá trình điều hoà sinh tổng hợp gibberellin dạng hoạt động, có hoạt
tính kích thích sự biệt hóa và kéo dài mạch xylem làm cây thân gỗ tăng trưởng về
chiều cao và đường kính. Khi tăng cường biểu hiện gen mã hóa cho enzym GA - 20

oxidase ở trong cây Arabidopsis thaliana cho thấy các cây chuyển gen nở hoa sớm
hơn và chiều dài thân cao hơn so với cây đối chứng. Trong khi đó ở những cây
chuyển gen ức chế hoạt động của enzym này cho kết quả ngược lại. Chính vì vậy,
việc sử dụng các phương pháp sinh học nhằm tăng cường sinh tổng hợp GA ở các
loài cây lâm nghiệp sẽ là một hướng nghiên cứu triển vọng trong việc tạo giống cây
lâm nghiệp sinh trưởng nhanh (Eriksson và cs, 2000).
Gen GA20 đã được phân lập từ nhiều đối tượng khác nhau: Đậu Hà Lan, lúa
gạo, thuốc lá, rau diếp, Arabidopsis thaliana,…(Nakayama và cs, 2005). Ở cây
Arabidopsis, người ta đã xác định được trình tự nucleotide hoàn chỉnh của gen GA20
nằm trên nhiễm sắc thể số 5, gen có chiều dài 1357 bp với 3 đoạn exon và 2 đoạn
intron. 3 đoạn exon có chiều dài 1131 bp, mã hoá cho phân tử protein bao gồm 377
axit amin và có khối lượng phân tử là 43,4 kDa (Yun Ling Xu và cs, 1995).
Nghiên cứu chuyển gen GA20 vào cây Dương lai (Populus tremula và
P.tremuloides) cho thấy nồng độ GA ở lá tăng từ 9% lên 17%, các dòng chuyển gen
đều có tốc độ sinh trưởng nhanh và sinh khối tăng cao hơn so với cây đối chứng
không chuyển gen, ở chồi khối lượng khô tăng 64%, ở thân tăng 126%, sợi chất gỗ
nhiều hơn (Eriksson và cs, 2000).
1.4.3. Nghiên cứu phát triển và sử dụng các chỉ thị phân tử trong chọn tạo và
lai giống
Khác với lai giống truyền thống, việc sử dụng các chỉ thị phân tử sẽ giúp cho
việc lựa chọn được các cặp lai thích hợp với các tính trạng lai có định hướng và
nhanh chóng chọn được con lai có tích trạng mong muốn. Vì vậy, mà trong những
năm gần đây các nghiên cứu về phát hiện các chỉ thị phân tử liên kết chặt với một số
11


tính trạng quý ở cây bạch đàn đã phát triển nhanh chóng: Marques và cs (1998) đã
nghiên cứu tìm thấy 1QTL về hiệu suất bột giấy và 21 QTL về khả năng nhân giống
sinh dưỡng của giống bạch đàn lai (E. tereticornis x E. globulus). Các nghiên cứu về
bạch đàn E. globulus tại Australia đã tìm thấy 5 gen dự tuyển (candidate gene) liên

quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin (Thamarus và cs, 2002), 5 QTLs liên quan
đến mật độ gỗ, 3 QTLs về hiệu suất bột giấy, 3 QTLs về chiều dài sợi gỗ (Moran và
cs, 2002). Eugenia và cs (2002) bước đầu đã xác định được mối tương quan giữa các
chỉ thị phân tử với một số tính trạng như nứt gỗ ở loài bạch đàn E. grandis với chỉ thị
RAPD. Gần đây, Thumma và cs (2005) đã xác định được mối tương quan giữa mức
độ đa hình của gen Cinnamoyl CoA reductase (CCR) - một trong những gen chính
liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin của loài bạch đàn E. nitens và E.
globulus bằng chỉ thị SNP,... Việc phát hiện ra các chỉ thị phân tử này đã giúp chọn
tạo được nhiều giống bạch đàn mới với những tính trạng mong muốn.
1.4.4. Nghiên cứu thành lập ngân hàng cDNA và giải trình tự hệ genome của các
loài bạch đàn
Nhằm phân lập các gen có giá trị phục vụ cho việc tạo giống cũng đã sớm
được thực hiện: Jun-ichiro và cs (1997) đã thành lập được thư viện cDNA cho các
gen biểu hiện về sự phân hóa xylem trong quá trình hình thành độ kéo căng của gỗ
bạch đàn E. camaldulensis. Một số gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin,
cellulose, tính chất gỗ cũng đã được xác định cho các loài bạch đàn Eucalyptus
globulus (Poke và cs, 2003); E. gunnii (Lauvergeat và cs, 2002); E. camaldulensis
(Ho và cs, 2002); E. grandis (Martin và Alexander, 2006).
1.5. Các hệ thống tái sinh cây phục vụ chuyển gen
Mô, tế bào thực vật có nhiều loại, nếu xét theo khía cạnh khả năng tái sinh và
biến nạp có thể có thể chia thành các loại: Có khả năng tái sinh và biến nạp, có khả
năng tái sinh hoặc biến nạp và không có khả năng tái sinh và biến nạp.
Khả năng tái sinh phụ thuộc nhiều yếu tố, trong đó phải kể đến dạng vật liệu
ban đầu dùng để biến nạp (phôi non, mô sẹo, cuống lá, lá mầm, mẩu lá, thân mầm,
chồi); các yếu tố kiểu gen, tuổi mô, các chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ, ánh
sáng; và các phương thức nuôi cấy – tái sinh (nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy mô và
cơ quan tách rời, nuôi cấy mô phân sinh, nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, nuôi cấy
phôi (phôi vô tính, phôi hữu tính), nuôi cấy protoplast). Hệ thống tái sinh là điều
kiện tiên quyết để thực hiện thành công biến nạp gen. Xây dựng một hệ thống nuôi
cấy và tái sinh cây hoàn chỉnh đạt hiệu suất cao là tiền đề quan trọng cho thí nghiệm

chuyển gen. Đối với mỗi loài thực vật, nhất thiết phải nghiên cứu tối ưu hoá kỹ
thuật nuôi cấy thích hợp.
12


Hệ thống tái sinh cây hiện đang được sử dụng phổ biến trong phục vụ chuyển
gen thực vật gồm có hệ thống tạo đa chồi trực tiếp, hệ thống tái sinh thông qua mô
sẹo và hệ thống tái sinh thông qua phôi soma. Cây tái sinh thu được qua các hệ
thống này được bắt nguồn từ một tế bào ban đầu do vậy chuyển gen thông qua các
hệ thống tái sinh này sẽ thu được cây chuyển gen hoàn chỉnh (không bị thể khảm).
1.5.1. Hệ thống tái sinh cây thông qua tạo đa chồi trực tiếp từ mẫu cấy phục vụ
chuyển gen
Có hai hình thức tạo đa chồi đó là tạo đa chồi thông qua hoạt hóa chồi nách
và tạo đa chồi thông qua tạo chồi bất định. Đối với hình thức tạo chồi bất định: Xảy
ra ở các cây cảm ứng nhanh, chồi bất định có thể được hình thành trực tiếp trên các
mô nuôi cấy từ nhiều cơ quan (lá, thân, rễ,...); ở một số loài khác chồi chỉ mọc ở
một số mô nuôi cấy nhất định như vảy hành, phôi hạt hay mô cây con. Sau khi cảm
ứng đa chồi, mẫu mô được cấy chuyển sang môi trường tạo và phát triển cụm chồi.
Tái sinh cây thông qua tạo đa chồi thường ít phát sinh biến dị không mong muốn,
thời gian tái sinh ngắn; do vậy đây là một trong những hệ thống tái sinh được sử
dụng phổ biến cho chuyển gen.
1.5.2. Hệ thống tái sinh cây thông qua mô sẹo
Mô sẹo (callus) là khối tế bào mô mềm có mức độ cấu trúc di truyền thấp,
chưa phân hoá, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di truyền cao. Mô
sẹo thu được bằng nuôi cấy in vitro từ các cơ quan của thực vật như thân, lá, rễ,
hoa,… trong môi trường dinh dưỡng có chứa chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm
auxin và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Mô sẹo có thể được duy trì liên tục trên môi
trường nuôi cấy bằng cách cấy chuyển định kỳ.
Bảng 1.1. Một số cây trồng chuyển gen sử dụng hệ thống tái sinh chồi trực tiếp từ mô sẹo
Loài

Phương pháp
Vector
Gen chuyển
Tác giả
Phaseolus
Agrobacterium
Willy Dillen
pTJK136
uidA
acutifolius
tumefaciens
và cs, 1997
A.Mercuri và
Lilium longiflorum
A. tumefaciens
pBin18
rol + nptII
cs, 2003
pIG121H
Y.Hoshi và
Lilium cv.Acapulco
A. tumefaciens
uidA
m
cs, 2004
pCAMBI
Dichanthium
Súng bắn gen,
A1305,
Kumar J và

uidA + hpt
annulatum
A. tumefaciens
pCAMBI
cs, 2005
A1301
P5CSF129A Dibax và cs,
Eucalyptus saligna
A. tumefaciens
pBI121
, uidA, nptII 2010
Brachiaria
Ishigaki G và
Súng bắn gen
bar + uid
ruziziensis
cs, 2012
13


Mô sẹo khi cấy chuyển lên môi trường thích hợp có thể phát sinh chồi trực
tiếp hoặc tạo phôi soma và nảy mầm thành cây hoàn chỉnh. Đây là hệ thống nuôi
cấy có thể được sử dụng để biến nạp gen đạt hiệu quả cao. Cây chuyển gen phát
triển từ một tế bào mô sẹo không bị thể khảm (Lê Trần Bình và cs, 1997).
1.5.3. Hệ thống tái sinh cây thông qua tạo phôi soma
Ở thực vật bậc cao, phôi là sản phẩm tự nhiên của quá trình thụ tinh trong
sinh sản hữu tính. Tuy nhiên, phôi cũng có thể hình thành từ các tế bào soma qua
quá trình nuôi cấy in vitro. Phôi loại này được gọi là phôi vô tính (somatic embryos)
(Vũ Văn Vụ, 2007). Chúng rất giống phôi hữu tính (zygotic embryo) ở hình thái,
quá trình phát triển, sinh lý, nhưng không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao

tử đực và giao tử cái và vì vậy không có quá trình tái tổ hợp di truyền. Do đó, tất cả
những cây con tái sinh bằng con đường này thì có vật chất di truyền giống hệt với tế
bào sinh dưỡng đã sinh ra chúng (Nguyễn Văn Uyển, 1993). Dựa vào đặc tính này
có thể tạo ra những cá thể mới bằng những trình tự gen lạ được chèn thông qua các
kỹ thuật công nghệ sinh học. Phôi vô tính là nguyên liệu triển vọng cho chuyển gen
thực vật.
Bảng 1.2. Một số cây trồng chuyển gen sử dụng hệ thống tái sinh qua tạo phôi soma
Loài
Pinus radiate

Phương pháp

Vector

Gen chuyển

Biolistic

pRC 101

nptII và uidA

Biolistic

pMYC3425 +
pRN2 /pCW132

cry1Ac và nptII
hoặc cry1Ac,
nptII và uidA

Agrobacterium
tumefaciens

pBINUbiGUSINT

nptII và uidA

Biolistic

pASCCR-BAR

ccr

A. tumefaciens

pCAMBIA 2301

nptII và uidA

Leucaena
leucocephala

A. tumefaciens

pCAMBIA3201

bar và uidA

Quercus

robur

A. tumefaciens

nptII và gus

Hevea
brasiliensis

A. tumefaciens

Populus

A. tumefaciens

pBI121 hoặc
pUbiGUSINT
pCAMBIA 2301GFP hoặc
pCAMBIA 2300GFP
pSKI015 hoặc
pSKI074

Pinus radiate
Quercus
suber L.
Picea abies
[L.] Karst
Castanea
dentate

Grace và cs,
2005
Álvarez &
Ordás, 2007
Wadenbä
ck và cs, 2008
Andrade
và cs, 2009
Jube &
Borthakur,
2009
Vidal và cs,
2010

uidA, nptII và gfp
Leclercq
hoặc uidA, nptII,
và cs, 2010
gfp và EcGSH1
bar hoặc nptII

Nguồn: “Genetic transformation of forest tree” Oscaldo và cs, 2010

14

Tác giả
Walter và cs,
1998

Busov và cs,

2010


1.6. Kỹ thuật chuyển gen thực vật
Trước đây, để tạo một giống mới các nhà tạo giống thường sử dụng phương
pháp truyền thống để tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực vật tạo ra con lai mang
những tính trạng mong muốn. Tuy nhiên, phép lai chéo này bị hạn chế bởi nó chỉ có
thể thực hiện được giữa các cá thể cùng loài (lai gần), lai giữa những các thể khác loài
(lai xa) thường bị bất thụ do đó không thể tạo ra con lai được. Tuy nhiên, lai gần cũng
phải mất nhiều thời gian mới thu được những kết quả mong muốn và thông thường
những tính trạng quan tâm lại không tồn tại trong những loài có họ hàng gần nhau.
Ngày nay công nghệ chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một loài
cây trồng những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau,
không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau. Phương
pháp này hữu hiệu cho phép các nhà tạo giống thực vật thu được giống mới nhanh
hơn và vượt qua những giới hạn của kĩ thuật tạo giống truyền thống.
Các phương pháp chuyển gen vào thực vật có thể chia làm hai phương thức:
(1) Chuyển gen trực tiếp: Bằng súng bắn gen, vi tiêm, xung điện, siêu âm hay bằng
hoá chất. (2) Chuyển gen gián tiếp thông qua sinh vật trung gian (virus hoặc vi
khuẩn). Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được sử dụng rộng
rãi hơn cả, vì phương pháp này dễ sử dụng, ít tốn kém nhưng lại mang lại hiệu quả
cao (lượng bản sao gen biến nạp ít tạo thuận lợi cho việc phân tích cây chuyển gen
và không gây tổn thương tế bào). Hầu hết các nghiên cứu chuyển gen vào cây lâm
nghiệp đã công bố đều sử dụng vector trung gian là vi khuẩn A. tumefaciens (Chen
và cs, 2001; Han và cs, 2000; Vengadesan và cs, 2006).
1.6.1. Giới thiệu về vi khuẩn A. tumefaciens
Từ những năm đầu của thế kỷ 20, các nhà khoa học đã phát hiện ra một loại
vi khuẩn Agrobacterium có khả năng gây bệnh khối u ở thực vật. A.tumefaciens là
một loài vi khẩn đất thuộc vi khuẩn gram âm. Cả chủng A.tumefaciens và A.
rhizogenes đều được sử dụng phổ biến trong chuyển gen vào thực vật. Theo cơ chế

tự nhiên, hai loài này có khả năng xâm nhiễm qua vết thương của hầu hết thực vật
hai lá mầm, kết quả là gây ra những khối u hay hình thành lông rễ (Lê Trần Bình và
cs, 1997; Lê Duy Thành, 2001; Vũ Văn Vụ, 2005; Suzuki và cs, 2002; Jia, 2004).
Những tế bào của khối u hay lông rễ có thể phát triển in vitro khi vắng mặt bất cứ
hormone thực vật nào. Đây là do trong tế bào của các dạng hoang dại A.
tumefaciens hay A. rhizogenes chứa một loại plasmid đặc biệt gọi là Ti - plasmid
(tumor - inducing plasmid). Ti - Plasmid có kích thước khoảng 200kb đã được xác
định trình tự, chứa một đoạn DNA có chiều dài khoảng 25Kb gọi là T - DNA
(transfer DNA) có thể chuyển sang tế bào chủ theo cơ chế tự nhiên (Gelvin, 2003).
15


Do đó Agrobacterium là một hệ thống chuyển gen tự nhiên. Bằng cách cải biên (cắt
bỏ các gen gây khối u hay lông rễ), cài xen vào vùng T - DNA những gen thích hợp,
gen này sẽ được chuyển và gắn vào hệ gen tế bào thực vật dễ dàng. Những phát
hiện này có ý nghĩa rất quan trọng cho sự ra đời của phương pháp chuyển gen vào
thực vật nhờ vi khuẩn A. tumefaciens.
1.6.2. Cấu trúc của Ti - plasmid và T - DNA
Ti - plasmid có chứa 4 vùng A, B, C, D. Trong đó vùng A là T - DNA có
mang 2 hệ gen: Một hệ gen gồm 3 gen tổng hợp phytohormone là auxin và
cytokinin, chính hệ gen này gây bệnh khối u cho thực vật; hệ gen thứ hai điều khiển
tổng hợp các dẫn xuất của axit amin hay đường gọi là opine. Ở hai đầu của đoạn T DNA có hai trình tự lặp lại dài khoảng 25bp gọi là LB (left border) và RB (right
border), vùng này hoạt động giống như yếu tố tín hiệu cho vị trí chuyển (Fischer,
2006). Vùng B là vùng tái bản có mang điểm khởi đầu sao chép (ori T). Vùng C có
liên quan đến sự tiếp hợp. Vùng D gọi là vùng độc (virulence region) có chứa các
gen mã hoá các protein/enzym Vir. Có 9 loại protein Vir là A, C, G, B1 - 11, D1 - 2,
E1 - 2, F, H, J/AcvB (Gelvin, 2000). Các protein Vir này có vai trò quan trọng trong
việc chuyển T - DNA sang tế bào thực vật.

Hình 1.3. Cấu tạo phân tử Ti - plasmid

1.6.3. Các loại vector dùng trong chuyển gen vào thực vật
Dựa vào cấu trúc và hoạt động của T - DNA và Ti - plasmid trong tự nhiên,
các nhà khoa học đã cải tiến và thiết kế thành công các vector để chuyển những gen
mong muốn vào thực vật. Có hai họ vector được sử dụng trong biến nạp gen thông
qua vi khuẩn A.tumefaciens là vector liên hợp và hệ vector nhị thể.
Vector liên hợp: Là kết quả của sự liên hợp loại Ti - plasmid đã cắt bỏ gen
gây khối u, gen tổng hợp opine giữ lại vùng vir, trình tự biên trái (LB) và biên phải
16


(RB). Các phần bị cắt đó được thay thế bằng đoạn tương đồng của plasmid thứ hai.
Thực chất vector liên hợp là một loại vector lai có chỗ cho gen cần chuyển đi nhờ
như một hành khách vào tế bào thực vật (Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 1999).

Hình 1.4. Hệ thống vectơ liên hợp
Hệ vector nhị thể: Việc sử dụng trực tiếp Ti - plasmid của vi khuẩn A.
tumefaciens chuyển gen gặp khó khăn do nó có kích thước lớn. Mặt khác, Ti plasmid chứa các gen gây khối u gây bất lợi cho thực vật - cản trở quá trình sinh
trưởng, phát triển bình thường ở thực vật (Briew và Henry, 2000). Các enzym giới
hạn có thể cắt ADN của Ti - plasmid ở nhiều chỗ khác nhau. Trong khi đó công
nghệ gen lại cần những vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzym giới hạn
(Lê Trần Bình và cs, 1997, 2003; Lê Thu Hiền, 2003). Với các lí do trên đây, các
nhà khoa học đã cải tiến Ti - plasmid thành một hệ vector nhị thể gồm có vector
chuyển gen (Ti - plasmid tái tổ hợp) và vector bổ trợ (Lê Trần Bình và cs, 1997; Vũ
Văn Vụ, 2005).

Hình 1.5. Hệ thống vectơ nhị thể

17

Vector chuyển gen có cấu trúc từ Ti - plasmid với đoạn ADN được cắt bỏ
hết các gen không cần thiết như gen onc và gen tổng hợp opine ở giữa hai trình tự
LB và RB, gắn thêm một số thành phần tạo cấu trúc mới gồm: Các replicon để
ADN plasmid có thể vừa tự nhân bản trong cả E.coli và A. tumefaciens; các gen
chọc lọc, gen chỉ thị và vùng có chứa nhiều điểm cắt của các enzym giới hạn nằm ở
hai trình tự LB và RB để chèn gen mong muốn cần chuyển.
Vector bổ trợ có cấu trúc gồm các gen Vir được tách và được đưa vào chung
một plasmid đảm nhiệm chức năng vận chuyển gen vào tế bào thực vật. Plasmid
này được cải tiến loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển khối u, nhưng vẫn
duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật.
Hai cấu trúc này cùng được đưa vào vi khuẩn A. tumefaciens, khi các gen
trên vector bổ trợ hoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới đoạn T - DNA
trên vector chuyển gen dẫn đến sự chuyển đoạn T - DNA sang tế bào thực vật.
1.6.4. Cơ chế của quá trình chuyển T - DNA vào tế bào thực vật
Vùng Vir bao gồm ít nhất 6 operon (VirA, VirB, VirC, VirD, VirG và VirE)
và hai vùng không cơ bản (VirF, VirH). Số lượng gen trong một operon là khác
nhau: VirA, VirG, VirF chỉ có một gen; VirE, VirC, VirH có hai gen; VirD, VirB có
từ 4 -11 gen. Hai operon giữ chức năng cơ bản là VirA và VirG mã hoá cho hệ
thống hai thành phần (VirA -VirG), hai thành phần này có vai trò hoạt hoá quá
trình dịch mã của các gen Vir khác. Các protein mã hoá từ gen Vir đóng vai trò chủ
yếu trong quá trình chuyển gen của A. tumefaciens. Các vai trò này đã được thảo
luận trong nhiều tài liệu, ở đây chỉ nêu một số nét chính trong quá trình vận chuyển
đó. Protein VirA và protein VirG đóng vai trò là thành viên của hệ thống điều chỉnh
di truyền hai thành phần mẫn cảm với tín hiệu vận chuyển. Đầu tiên là hoạt động
của VirA, dấu hiệu để hoạt hoá VirA bao gồm pH axit, hợp chất phenol được tiết ra
từ thực vật như acetosyringone (Winans và cs, 1992) và một vài loại monosacharide
như glucose, galactose (Doty and Heath, 1996; Cangelosi và cs, 1990). Gen VirA
hoạt động sinh ra protein VirA. Protein VirA tự photphorin hoá và sau đó
photphorin hoá protein VirG. Dạng protein VirG không photphorin hoá không có
hoạt tính. Protein VirG bị photphorin hoá có khả năng điều khiển sự biểu hiện các

gen Vir khác (Jin và cs, 1990).
Hoạt động của các gen Vir sinh ra sợi đơn T - DNA làm xuất hiện bản copy
sợi bên dưới của T - DNA. Chỉ đoạn sợi đơn ADN giữa hai trình tự biên (LB và RB)
của T - DNA mới được chuyển vào tế bào thực vật, và được gắn vào genome của tế
bào. Đó là các yếu tố hoạt động cis của hệ thống vận chuyển T - DNA. Protein
VirD1, D2 đóng vai trò chìa khoá trong bước này, chúng nhận ra trình tự biên T 18


DNA và cắt sợi bên dưới tại mỗi bên. Điểm cắt là điểm đầu và kết thúc của sợi tái
sinh. Sau đó, protein VirD2 còn gắn kết với đầu cuối 5’ của sợi T - DNA. Sự kết hợp
ngăn cản enzym exonuclease tấn công vào đầu 5’ của sợi đơn T - DNA
(Durrenberger và cs,1998) và nhận ra đầu 5’ như là đầu dẫn đường cho quá trình
chuyển T - DNA vào tế bào thực vật (Christie, 1997). Nếu gây đột biến hay loại bỏ
đoạn RB thì hầu như mất hoàn toàn khả năng chuyển T - DNA, còn nếu làm biến đổi
LB sẽ làm giảm hiệu quả chuyển T - DNA (Hille và cs, 1983). Điều đó chứng tỏ tổng
hợp sợi T - DNA là từ đầu 5’ đến 3’, được bắt đầu từ đoạn RB và kết thúc ở LB.
Phương tiện để chuyển đoạn T - DNA vào nhân tế bào thực vật là phức
protein và sợi T - DNA. Theo đa số các nhà khoa học cho rằng phức hợp sợi đơn TDNA VirD2 được bao bọc bởi protein VirE2 có trọng lượng 96 kDa. Sự phối hợp
này giúp ngăn cản sự tấn công của nuclease, hơn nữa sợi đơn T - DNA duỗi thẳng
làm giảm kích thước của phức xuống xấp xỉ 2 nm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá
trình di chuyển qua các kênh dẫn truyền trên màng tế bào (Gustavo và cs, 1998b).
Protein VirE2 chứa đựng 2 tín hiệu định vị trong nhân tế bào thực vật và một
protein VirD2 (Bravo Angel và cs, 1998). Thực tế cho thấy hai protein này có vài
trò quan trọng trong việc dàn xếp sự hấp thụ phức vào trong nhân tế bào thực vật
(Rossi và cs, 1996; Zupan và cs, 1996). Nếu loại bỏ tín hiệu định vị trong nhân thì
một trong các protein này bị giảm, nhưng không ức chế hoàn toàn quá trình chuyển
T - DNA và tương tác giữa T - DNA với genome của tế bào thực vật, chứng tỏ có
một thành viên khác có thể đảm nhận một phần tối thiểu vai trò của protein bị thiếu
(Gustavo và cs, 1998a). Protein VirE cần thiết đối với quá trình bài xuất protein
VirE2 sang tế bào thực vật (Binns và cs, 1995).

Các nghiên cứu công bố đã miêu tả vai trò của operon VirB có kích thước 9,5 kb
trong quá trình sản sinh cấu trúc bề mặt của tế bào đối với sự vận chuyển phức từ vi
khuẩn sang tế bào thực vật (Finberg và cs, 1995; Stephens và cs, 1995; Fernandez
và cs, 1996).
Protein VirD4 cũng là bắt buộc với sự vận chuyển phức ssT - DNA. Chức
năng của protein VirD4 là liên kết với ATP độc lập với phức protein cần thiết với
quá trình di truyền T - DNA. Protein VirB là protein có đặc tính kị nước tương tự
protein kết hợp trên màng khác (Shirasu và cs, 1990, 1994). Phần lớn protein VirB
đã được phát hiện giống như kênh protein xuyên màng (Stephen và cs, 1995; Ward
và cs, 1988). Tuy nhiên, cũng có thể vài protein VirB khác được phân phối lại trong
quá trình phát sinh sinh vật và thực hiện chức năng của kênh kết hợp qua tế bào vận
chuyển (Christie, 1997). Có thể có trường hợp của protein VirB2, một protein có
nguồn gốc thực hiện chức năng ngoại bào. VirB2 có dạng tiền protein trọng lượng
19


12kDa, nó phải trải qua quá trình hoạt hoá để trở thành dạng protein chức năng có
trọng lượng 7kDa (Jones và cs, 1996). Protein Vir B4, B11 là các ATPase kỵ nước
cần thiết đối với hoạt động chuyển T - DNA. VirB11 cấu tạo nên các phần nhỏ hoà
tan, trong thời gian ngừng hoạt động được giữ lại để kết hợp với màng nguyên sinh
chất. Đây là tính chất không điển hình đối với dạng protein này và chứng tỏ có thể
cùng tồn tại các dạng cấu tạo khác nhau trong cơ thể sống (Gustavo và cs, 1998b).
Protein VirB4 kết hợp chặt chẽ với màng nguyên sinh chất (Dang and Christie,
1997). Tổng hợp protein VirB4 có liên quan đến sự tích luỹ và phân phối protein
VirB3. Protein VirB7 được xem là dạng cấu tạo chủ yếu của bộ máy vận chuyển.
Protein VirB7 tương tác với dạng nhị phân VirB9 và có khả năng tạo đa phức
(Gustavo và cs, 1998b). Tổng hợp protein VirB9 và tích lũy ổn định của nó phụ
thuộc vào dạng nhị phân, điều đó chỉ ra rằng protein VirB9 có thể không ổn định và
đòi hỏi kết hợp với protein VirB7 (Anderson và cs, 1996). Protein VirB2, VirB11 là
thành phần cơ bản của bộ máy vận chuyển T - DNA từ tế bào vi khuẩn sang tế bào

thực vật (Berger và Christie, 1994; Zhou và Christie, 1997).

Hình 1.6. Cơ chế lây nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật
(Nguồn: Zhu và cs, 2000)
Cho đến nay, phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium được ứng
dụng rộng rãi và mang lại nhiều thành quả to lớn (Đoàn Thị Mai và cs, 2003). Ước
tính sơ bộ gần 80% cây trồng chuyển gen thương mại hóa được tạo ra thông qua
chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium như thuốc lá, cà chua, đậu tương, bông,
cam quýt… Gần đây, nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn, các cây 1 lá
mầm cũng có thể sản xuất opine và có thể khai thác khả năng chuyển gen ở cây một
20