Biểu hiện và tiết Enzym Nattokinase tái tổ hợp ở Bacillus subtilis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



HOÀNG THỊ KHÁNH HỒNG


BIỂU HIỆN VÀ TIẾT ENZYM NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP
Ở BACILLUS SUBTILIS


Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. LÊ THỊ THÚY ÁI



THÀNH PHỐ HỐ CHÍ MINH – 2012

Luận văn Thạc sĩ Sinh học



MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT i
DANH MỤC CÁC BẢNG iii
DANH MỤC CÁC HÌNH iv
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. BỆNH NGHẼN MẠCH DO HUYẾT KHỐI 3
1.1.1. Khái niệm về huyết khối 3
1.1.2. Tình hình nghẽn mạch do huyết khối 3
1.1.3. Cơ chế hình thành huyết khối 4
1.1.4. Sự phân hủy huyết khối bởi enzym nội sinh plasmin 8
1.1.5. Các nhân tố trong điều trị bệnh nghẽn mạch do huyết khối 9
1.2. NATTOKINASE 12
1.2.1. Nguồn gốc, đặc tính của Nattokinase 12
1.2.2. Cơ chế phân hủy fibrin của Nattokinase 14
1.2.3. Sinh tổng hợp và sản xuất Nattokinase 15
1.2.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất Nattokinase tái tổ hợp trong và ngoài nước 17
1.3. CÁC HỆ THỐNG VECTOR BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG
TẾ BÀO VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 19
1.3.1. Biểu hiện gen trong tế bào vật chủ E. coli và Bacillus subtilis 19
1.3.2. Hệ thống biểu hiện dựa trên vector sát nhập 20
1.3.3. Hệ thống biểu hiện dựa trên vector plasmid có khả năng tự sao chép 25
1.4. HỆ THỐNG TIẾT CỦA BACILLUS SUBTILIS 27
Luận văn Thạc sĩ Sinh học



CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU 29
2.1.1. Dụng cụ 29
2.1.2. Thiết bị 29

2.1.3. Hóa chất 30
2.1.4. Môi trường 33
2.1.5. Vật liệu sinh học 34
2.2. PHƯƠNG PHÁP 37
2.2.1. Phân lập Bacillus subtilis từ mẫu sản phẩm Natto 37
2.2.2. Phương pháp thử nghiệm khả năng phân hủy fibrin người 38
2.2.3. Tách chiết genom của vi khuẩn Bacillus subtilis 38
2.2.4. Thu nhận gen aprE bằng phản ứng PCR 39
2.2.5. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại gen aprE 40
2.2.6. Thu nhận plasmid bằng phương pháp SDS kiềm 40
2.2.7. Tạo dòng tế bào E. coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein
Nattokinase trong vector pBluescript II KS (+) 41
2.2.8. Tạo dòng tế bào E. coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein
Nattokinase trong hệ thống vector pAX01 43
2.2.9. Tạo dòng tế bào E. coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein
Nattokinase trong hệ thống vector pBG01 46
2.2.10. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5và hóa biến nạp sản phẩm nối vào tế
bào khả nạp E. coli DH5 48
2.2.11. Tinh chế sản phẩm cắt qua cột 49
2.2.12. Chuẩn bị tế bào khả nạp Bacillus subtilis và biến nạp vector tái tổ hợp vào
tế bào khả nạp B. subtilis 49

Luận văn Thạc sĩ Sinh học



2.2.13. Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pAX01 chứa
gen aprE 50
2.2.14. Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pBG01 chứa
gen aprE 52

2.2.15. Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pAX01 trong Bacillus subtilis 53
2.2.16. Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pBG01 trong Bacillus subtilis DB104 54
2.2.17. Phân tích protein biểu hiện bằng SDS-PAGE 54
2.2.18. Phương pháp xác định hoạt tính Nattokinase 55
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CHỦNG BACILLUS SUBTILIS NATTO TỪ SẢN
PHẨM NATTO 56
3.2. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG GEN MÃ HÓA SUBTILISIN VÀ CHỌN TRÌNH TỰ
GEN MÃ HÓA ĐẠI DIỆN 59
3.2.1. Tách chiết DNA bộ gen Bacillus sp. phân lập từ Natto 59
3.2.2. Thu nhận gen mã hóa Nattokinase 60
3.2.3. Tạo dòng tế bào E. coli mang gen aprE 61
3.2.3.1. Sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5 có mang plasmid chứa gen aprE 61
3.2.3.2. Sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5 có mang plasmid chứa gen aprE
bằng phương pháp PCR 61
3.2.3.3. Kiểm tra dòng tế bào E. coli DH5 có mang plasmid chứa gen aprE
bằng phương pháp cắt bằng enzym cắt hạn chế 63
3.2.3.4. Giải trình tự gen aprE, nhận định và tuyển chọn gen mã hóa thích hợp
cho Nattokinase 64

Luận văn Thạc sĩ Sinh học



3.3. DÒNG HÓA GEN aprE VÀO CÁC VECTOR ĐƯỢC CẤU TRÚC CHO BIỂU
HIỆN Ở BACILLUS 68
3.3.1. Hệ thống biểu hiện pAX01 68
3.3.2. Hệ thống biểu hiện pBG01 72
3.4. TẠO CÁC DÒNG BACILLUS SUBTILIS MANG CASSET BIỂU HIỆN
NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP 74

3.4.1. Sát nhập casset biểu hiện gen aprE được kiểm soát của Pxyl vào bộ gen các
chủng Bacillus subtilis 75
3.4.2. Dòng hóa casset biểu hiện gen aprE được kiểm soát của Pgrac vào bộ gen các
chủng Bacillus subtilis DB104 78
3.5. KIỂM TRA SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP NATTOKINASE
80
3.5.1. Kiểm tra sự biểu hiện của gen aprE dưới sự kiểm soát của Pxyl 80
3.5.2. Kiểm tra sự biểu hiện của gen aprE trong hệ thống pBG01 83
3.6. KIỂM TRA HOẠT TÍNH ENZYM NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP 85
3.6.1. Kiểm tra hoạt tính sơ bộ 85
3.6.2. Xác định hoạt độ phân hủy fibrin 86
CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN 88
4.2. ĐỀ NGHỊ 88
TÀI LIỆU THAM KHẢO 89
PHỤ LỤC 93
Luận văn Thạc sĩ Sinh học


- i -

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT
Amp
APC
bp
dH
2
O
dNTP
DNA

EDTA
EGTA
Ery
GRAS

Kb
kDa
LB
LS
MCS
Neo
OD
PAI-1

pB
PCR
Rnase
SD
Amp
icillin
Activated Protein C
base pair
distilled water
DeoxyriboNucleotide Triphosphate
DeoxyriboNucleic Acid
Ethylene Diamine TetraAcetic Acid
Ethylene Glycol Tetraacetic Acid
Erythromycin
Generally recognized as safe
organism

Kilobaze
kilo Dalton
Luria – Bertani
Linsmaier - Skoog
Multicloning site
Neomycin
Optical Density
Plasminogen Activator Inhibitor 1

pBluescript II KS (+)
Polymerase chain reaction
RiboNuclease
Shine - Dalgarno
Kháng sinh ampicillin
Protein hoạt hóa C
Cặp baze
Nước cất
Các loại axít nucleotid
Axít deoxyribonucleic


Kháng sinh erythromycin
Vi sinh vật an toàn


Trọng lượng kDa
Môi trường LB
Môi trường LS
Vị trí tạo dòng
Kháng sinh neomycin

Mật độ quang học
Chất kìm hãm hoạt hóa
plasminogen
Plasmid pB
Phản ứng PCR
Enzym Rnase
Trình tự gắn ribosom
Luận văn Thạc sĩ Sinh học


- ii -

SDS
SDS-
PAGE
SK
Spec
TE
tPA
TAE
u-PA

X-gal



S
odium
D
odecyl

S
ulphate

SDS-PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis
Streptokinase
Spectinomycin
Tris-EDTA
tissue Plasminogen Activator
Tris-Acetic acid- EDTA
urokinase Plasminogen Activator

5-bromo-4 chloro-3 indolyl-beta-D-
glactoside
Dung dịch SDS
Điện di SDS-PAGE

Thuốc chống đông máu
Kháng sinh spectinomycin
Dung dịch TE
Chất hoạt hóa plasminogen mô
Dung dịch đệm chạy điện di TAE
Chất hoạt hóa plasminogen
urokinase

Luận văn Thạc sĩ Sinh học


- iii -

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 1.1. Các yếu tố đông máu 6
Bảng 2.1. Thành phần môi trường HS 33
Bảng 2.2. Thành phần môi trường LS 34
Bảng 2.3. Các trình tự mồi được sử dụng trong luận văn 36
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR 39
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt plasmid pB bằng EcoRV 42
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối pB và aprE 43
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt kiểm tra pB-aprE bằng BamHI . 43
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt plasmid pAX01 và gen aprE bằng BamHI 45
Bảng 2.9. Thành phần phản ứng cắt plasmid pAX01 và gen aprE bằng SacII 45
Bảng 2.10. Thành phần phản ứng nối 45
Bảng 2.11. Thành phần phản ứng cắt plasmid pBG01 và gen aprE bằng BamHI
và XbaI 47
Bảng 2.12. Thành phần phản ứng nối 47
Bảng 3.1. So sánh hoạt độ phân hủy fibrin của dịch ngoại bào ở các chủng Bacillus
87









Luận văn Thạc sĩ Sinh học

- iv -

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Cơ chê hình thành huyết khối 5
Hình 1.2. Sự hoạt hóa và tác động lẫn nhau của các yếu tố đông máu 7
Hình 1.3. Cơ chế phân hủy fibrin in-vivo 9
Hình 1.4. Sản phẩm Natto 13
Hình 1.5. Cơ chế phân giải fibrin in-vivo bởi Nattokinase 14
Hình 1.6. Sơ đồ vector sát nhập chứa promoter xylA được sử dụng trong luận văn 23
Hình 1.7. Sự sát nhập pAX01 vào DNA Bacillus subtilis nhờ trao đổi đồng dạng tại
locus lacA . 24
Hình 1.8. Sơ đồ vector biểu hiện pBG01 được sử dụng trong luận văn 26
Hình 2.1. Sơ đồ vector pBluescript II KS (+) 35
Hình 2.2. Thang chuẩn DNA 1kb và protein 37
Hình 2.3. Chương trình PCR thu nhận gen aprE 40
Hình 3.1. Sản phẩm Natto dùng phân lập được thử nghiệm hoạt tính sơ bộ 57
Hình 3.2. Các dạng khuẩn lạc Bacillus phân lập được từ sản phẩm Natto . 58
Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm nhanh hoạt tính phân hủy fibrin người ở các chủng
phân lập sau 6 giờ ủ 59
Hình 3.4. DNA bộ gen chủng Bacillus sp. phân lập từ sản phẩm Natto và sản phẩm
khuếch đại gen aprE trên gel agarose 1% . 60
Hình 3.5. Kết quả sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5

có mang pB-aprE bằng phản ứng
PCR 62
Hình 3.6. Kết quả sàng lọc 12 dòng tế bào E. coli DH5


có mang pB-aprE tương
ứng bằng phản ứng PCR, bản mẫu là các plasmid . 63
Luận văn Thạc sĩ Sinh học


- v -

Hình 3.7. Kết quả đại diện chọn dòng tế bào E. coli DH5

có mang pB- aprE bằng
enzym cắt hạn chế BamHI 64
Hình 3.8. Trình tự peptide trưởng thành gồm 275 amino acid ở Nattokinase 65
Hình 3.9. So sánh một phần trình tự nucleotide gen aprE của chủng phân lập với trình tự
chuẩn 66
Hình 3.10. Trình tự codon mã hóa gen aprE khuyết cytosine tại vị trí 437 66
Hình 3.11a. Trình tự gen aprE của chủng B2 cho thấy có sự khác biệt 9 nucleotide so với
aprE công bố 67
Hình 3.11b. Một phần trình tự mã hóa gen aprE của chủng B2 được so sánh với
Nattokinase cho thấy khác biệt ở vị trí quan trọng Valin 298 (tương ứng vị trí 193 ở
peptide trưởng thành) 68
Hình 3.12. Sơ đồ các bước tạo dòng gen aprE vào hệ thống pAX01 trong Bacillus
subtilis 1012, DB104 69
Hình 3.13. Kết quả dòng hóa ở E. coli DH5

70
Hình 3.14. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi pAX01-
F/aprE-R. 71
Hình 3.15. Plasmid tái tổ hợp cắt với EcoRV. 71
Hình 3.16. Sơ đồ các bước tạo dòng gen aprE vào hệ thống pBG01 trong Bacillus
subtilis DB104 . 72

Hình 3.17. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi aprE-
F/pMTL-R. 73
Hình 3.18. Plasmid tái tổ hợp pBG01-aprE cắt với HindIII 74
Hình 3.19. Kết quả sàng lọc chủng Bacillus subtilis 1012 khả nạp trên 2 đĩa môi trường
có bổ sung kháng sinh . 76
Hình 3.20. Kết quả kiểm tra chủng B. subtilis DB104 khả nạp bằng phản ứng PCR
khuẩn lạc với mồi pAX01-F/aprE-R 77
Luận văn Thạc sĩ Sinh học


- vi -

Hình 3.21. Kết quả kiểm tra chủng B. subtilis DB104 khả nạp bằng phản ứng PCR với
bản mẫu là bộ gen, mồi pAX01-F/aprE-R. 78
Hình 3.22. Kết quả sàng lọc chủng Bacillus subtilis DB104 khả nạp trên đĩa môi trường
có bổ sung kháng sinh chloramphenicol. 79
Hình 3.23. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi aprE-
F/pMTL-R 79
Hình 3.24. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR với bản mẫu là các plasmid tái
tổ hợp, cặp mồi aprE-F/pMTL-R 80
Hình 3.25. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 5 ml dịch môi trường sau nuôi
cấy 81
Hình 3.26. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml dịch môi trường nuôi cấy
chủng B. subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi Pxyl 82
Hình 3.27. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml môi trường nuôi cấy
chủng B. subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi P
Sgrac
84
Hình 3.28. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp nội bào ở Bacillus subtilis DB104 ở trường
hợp kiểm soát bởi P

Sgrac
85
Hình 3.29. Kết quả thử khả năng phân giải fibrin của dịch ngoại bào ở chủng B. subtilis
DB104 mang pBG01-aprE được cảm ứng IPTG sau 2 giờ ủ 86


Luận văn Thạc sĩ Sinh học













MỞ ĐẦU

Luận văn Thạc sĩ Sinh học


- 1 -

Ngày nay, tỉ lệ bệnh nghẽn mạch (như chứng nhồi máu cơ tim hay nhồi máu não)
đang tăng cao ở một số nước châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Việt Nam,
Philippin do xu hướng “âu hóa” trong các chế độ ăn uống. Nếu huyết tụ ở não sẽ làm cản
trở việc cung cấp oxy cho các mô não gây ra các bệnh lý nguy hiểm như: tai biến mạch máu
não, suy não, giảm trí nhớ, đột quỵ. Nếu huyết khối ở tim gây ra các bệnh lý như: co thắt
động mạch vành, nhồi máu cơ tim… Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới mỗi năm có
khoảng 17 triệu người chết vì bệnh tim mạch và dự báo rằng bệnh do nghẽn mạch (hay
huyết khối xơ vữa) sẽ là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu vào các năm tới đây. Huyết khối
xơ vữa đã thật sự trở thành mối đe dọa đối với sức khỏe con người.
Tại Nhật Bản, sản phẩm lên men truyền thống Natto đã rất được phổ biến và thu hút
nhiều sự chú ý. Nó được xem là một loại thức ăn giúp giảm thiểu sự nghẽn mạch máu vì
Natto chứa enzym phân hủy huyết khối “Nattokinase”, một nhân tố mang đến sự trường thọ
cho người Nhật. Nattokinase (còn gọi là Subtilisin natto) là một serine protease được chiết
tách từ sản phẩm lên men đậu tương với vi khuẩn Bacillus subtilis natto. Enzym này có khả
năng làm tan đặc hiệu fibrin là một protein dạng sợi cấu trúc nên huyết khối. Hơn nữa,
Nattokinase còn hỗ trợ tăng cường sản sinh ra Plasmin (enzym do cơ thể sản sinh làm tan
huyết khối bám chặt nội mạc). Nattokinase thực sự mạnh hơn những thuốc làm tan huyết tụ
thông thường khác như Urokinase, Streptokinase, và tissue Plasminogen Activator (t-PA).
Tuy nhiên, Urokinase và Streptokinase có tính đặc hiệu thấp với fibrin, chỉ hiệu quả khi
dùng đường tiêm tĩnh mạch và thường không hiệu quả khi động mạch của bệnh nhân đột
quỵ và đau tim đã chai cứng ở nhiều vị trí. t-PA thể hiện hoạt tính phân hủy fibrin mạnh

nhưng t-PA có giá thành khá cao và thời gian bán phân hủy ngắn trong cơ thể. Nattokinase
có hoạt tính phân hủy huyết tụ cao gấp 4 lần Plasmin, thực nghiệm cho thấy Nattokinase
phân cắt plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) dẫn tới việc loại bỏ hiệu quả cấu
trúc huyết khối trong cơ thể. Nattokinase đã được chứng minh có hiệu quả trong điều trị lâm
sàng và không gây phản ứng phụ.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học


- 2 -

Từ trước đến nay, Nattokinase được thu nhận chủ yếu bằng con đường lên men bán
rắn chủng Bacillus subtilis natto trên cơ chất đậu nành nấu chín hay lên men dịch thể. Thực
tế, Nattokinase được ly trích từ cơ chất hay môi trường lỏng thường có hàm lượng không
cao và hoạt tính ít ổn định. Vì thực nghiệm đã cho thấy rằng sự tổng hợp Nattokinase trong
tự nhiên ở Bacillus subtilis natto khá phức tạp và chỉ đạt mức độ giới hạn. Hay nói cách
khác, cách tiếp cận trên thường chỉ hiệu quả nếu đi kèm công nghệ lên men hoàn hảo với các
thông số đã được nghiên cứu tối ưu hóa. Tuy nhiên, các công nghệ này thường ít được công
bố.
Theo thống kê, nhu cầu sản phẩm Nattokinase ngày càng tăng cao ở thị trường Nhật
Bản và Đài Loan. Ở các nước đang phát triển như Trung Quốc và Việt Nam, người dân đã
bắt đầu quan tâm sử dụng. Trong nước, các công ty dược phẩm cũng bắt đầu cho ra các sản
phẩm từ Nattokinase với nguyên liệu ngoại nhập chủ yếu từ Nhật Bản với giá thành cao.
Việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu Nattokinase có hoạt tính ổn định và giá cả phù hợp là định
hướng của nhiều công ty trong nước. Do vậy, việc tìm hiểu và thu nhận nguồn gen mã hóa
Nattokinase tốt từ các chủng Bacillus natto và xây dựng hệ thống tái tổ hợp là tiếp cận mở ra
triển vọng cho công nghệ sản xuất và thu nhận Nattokinase hoạt tính cao nhằm làm nguyên
liệu cho dược phẩm, thực phẩm chức năng.
Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi thực hiện các nội dung như sau:
 Phân lập chủng Bacillus subtilis natto từ 4 mẫu sản phẩm Natto có nguồn gốc từ Nhật
Bản

 Thu nhận gen mã hóa Nattokinase từ các chủng phân lập bằng phương pháp PCR
 Dòng hóa gen mã hóa Nattokinase cùng trình tự tiết tự nhiên vào các hệ thống vector
khác nhau ở Escherichia coli
 Biến nạp vector tái tổ hợp trên vào chủng Bacillus subtilis DB104.
 Điện di phân tích sự biểu hiện ngoại bào của Nattokinase tái tổ hợp.


Luận văn Thạc sĩ Sinh học








Chương 2

VẬT LIỆU
PHƯƠNG PHÁP


Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học


- 29 -
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Dụng cụ
Một số dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm Vi sinh như sau: que cấy, que trải, đèn
cồn, eppendorf, bộ pipetman (0,5-10l, 10-100l, 20-100l, 100-1000l), đầu típ các loại,

ống đong, ống falcon các loại, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống nghiệm thủy tinh, đĩa petri,
tăm vô trùng, bình tia, thùng đá, giấy thấm, kéo, kẹp, bông thấm, bông không thấm, giấy
bạc, găng tay cao su, đồng hồ bấm giây…
2.1.2. Thiết bị
- Bộ điện di ngang DNA Horizon 58 (Life Technology)
- Hộp soi đèn tử ngoại Hoefer (UVTM – 19 – 230V)
- Bộ điện di protein (Biorad)
- Máy ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettich Zentrifugen)
- Máy đo quang phổ Ultrospec 2000
- Máy đo quang phổ chuyên dụng GenQuantpro (Amersham Biosciences)
- Máy lắc ổn nhiệt (Stualrt Scientific)
- Máy chụp hình gel Imagemaster VDS (Amersham Biosciences)
- Nồi hấp khử trùng Autoclave (SS325-TOMY)
- Máy điều nhiệt theo chu kì Eppendorf Mastercycler Personal
- Máy Vortex (IKA, Mỹ)
- Máy đo pH (Orion, Anh)
- Tủ ấm Memmert (Đức), Tủ sấy Memmert (Đức)
- Tủ cấy vô trùng Class II (Mỹ)
- Bể ổn nhiệt (Memmert)
- Cân kỹ thuật Ohaus (Mỹ), Cân phân tích Precica (Thụy Sỹ)
- Máy khuấy từ gia nhiệt Bibby (Anh )
- Tủ mát 4
o
C (Nhật ), Tủ lạnh -20
o
C (Nhật )
Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học


- 30 -

2.1.3. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong luận văn bao gồm:
a) Hóa chất dùng cho tách chiết DNA vi khuẩn
- Lysis buffer: 0,1M NaCl, 0,05M EDTA, pH 8,0
- Dung dịch SDS 10%,
- Lysozym 20mg/ml, Proteinase K 20mg/ml
- Phenol bão hòa trong TE, pH 8,0
- Chloroform, Sodium acetat 3M
- Ethanol 99% lạnh (giữ ở -20
o
C), Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20
o
C)
- Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1mM pH 8,0
b) Hóa chất dùng cho tách chiết plasmid từ vi khuẩn
- Dung dich I: glucose 50mM, Tris-HCl 25mM pH 8,0, EDTA 10mM pH 8,0
- Dung dịch II (pha trước khi dùng): SDS 10%, NaOH 5N
- Dung dịch III: glacical acetic acid 0,2M, CH
3
COOK 0,2M pH 4,8
- RNase 10mg/ml
- Phenol bão hòa trong TE, pH 8,0
- Chloroform, Sodium acetat 3M
- Ethanol 99% lạnh (giữ ở -20
o
C), Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20
o
C)
- Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1mM pH 8,0
c) Hóa chất dùng cho phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

- PCR buffer Taq DNA polymerase 10X
- PCR buffer DeepVent DNA polymerase 10X
- Dung dịch MgCl
2
, MgSO
4
25mM
- dNTP 8mM
- Mồi aprE-F-BamHI, aprE-R-SacII, E-anh-R, pAX01-F-seq, pMTL-R
- Nước cất hai lần (ddH2O)
Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học


- 31 -
d) Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose
- Agarose (Sigma), Safe View
- Ethidium bromide 10mg/ml,
- Dung dịch điện di TAE 50X (242g Tris, 57,1g acetic acid băng, 100ml EDTA
500 mM trong 1 lít).
- Dung dịch nạp mẫu DNA 6X (orange G 0,2%, xylene cyanol 0,05%,
bromophenol blue 0,09%, glycerol 60% và EDTA 60mM).
e) Hóa chất dùng cho điện di SDS-PAGE
- Dung dịch tạo gel polyacrylamide 12,5%: gel polyacrylamide 100x100x0,75mm
nồng độ 12,5% polyacrylamide có thành phần như sau:
+ Gel phân tích 12% (4 gel): nước cất 4,46ml, Tris-HCl 1,5M (pH 8,8) 3,95ml,
30% Acrylamide/Bisacrylamide 0,8% 7,1ml, 157,5l SDS 10%, 79l
ammonium persulfate 10%, 7,9l TEMED
+ Gel gom 4% (4 gel): nước cất 3,5ml, Tris-HCl 0,5M (pH 6,8) 1,625ml, 30%
Acrylamide/Bisacrylamide 0,8% 2,264 ml, 75l SDS 10%, 15l ammonium
persulfate 10%, 5l TEMED

- Dung dịch điện di 5X: Tris-HCl 15,1g, glycine 94g, SDS 5g, nước cất đủ 1000ml,
pH 8,3
- Dung dịch nạp mẫu 5X: Tris-HCl 0,3M, SDS 10,28%, glycerol 36%, DTT 0,6M,
bromophenol blue 0,012%, pH 6,8
- Dung dịch nhuộm gel: coomassie brilliant blue 0,625g, ethanol tuyệt đối 112,5ml,
glacical acetic acid 25ml, nước cất đủ 250ml
- Dung dịch giải nhuộm: glacical acetic acid 100ml, ethanol tuyệt đối 100ml, nước
cất đủ 1000ml
f) Hóa chất dùng cho phản ứng cắt hạn chế
- Enzym: BamHI, SacII, HindIII, EcoRV, EcoRI, XbaI
- Buffer Blue 10X, Green 10X, Red 10X
Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học


- 32 -
g) Hóa chất dùng cho tinh chế phản ứng PCR và phản ứng cắt
- Chloroform, Sodium acetat 3M
- Ethanol 99% lạnh (giữ ở -20
o
C), Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20
o
C)
h) Hóa chất dùng cho phản ứng nối
- Enzym T4 DNA ligase
- Buffer ligation 10X
- ATPase, PEG
i) Hóa chất dùng trong cảm ứng biểu hiện gen
- Xylose 25%, IPTG 100mM
- Dung dịch TE, Tris 1M
- Enzym lysozym

- TCA 100%
- Ethanol tuyệt đối lạnh, Ethanol 70% lạnh
j) Kháng sinh
Ampicillin, Spectinomycin, Erythromycin, Neomycin, Chloramphenicol
k) Hóa chất làm tế bào khả nạp E. coli DH5


- Glycerol 50% (hấp riêng) (giữ ở 4
o
C)
- CaCl
2
1M (hấp riêng) (giữ ở 4
o
C)
- Hỗn hợp dung dịch CaCl
2
0.1M và Glycerol 15% vô trùng (giữ ở 4
o
C)
l) Hóa chất cho xác định hoạt tính Nattokinase
- Tris-HCl 1M (pH 7,8)
- Fibrin heo 0.12%
- TCA 0,1M
Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học


- 33 -
2.1.4. Môi trường
a) Môi trường LB (Luria – Bertani)

- Thành phần môi trường lỏng như sau: 1,0% trypton, 0,5% cao nấm men, 0,5%
NaCl
- Môi trường LB thạch: bổ sung 2% agar trong LB lỏng
- Môi trường LB-Amp: bổ sung kháng sinh ampicillin trong môi trường LB để có
nồng độ cuối là 100g/ml
- Môi trường LB-Spec: bổ sung kháng sinh spectinomycin trong môi trường LB để
có nồng độ cuối là 100g/ml
- Môi trường LB-Ery: bổ sung kháng sinh erythromycin trong môi trường LB để có
nồng độ cuối là 100g/ml, 1g/ml
- Môi trường LB-Neo: bổ sung kháng sinh neomycin trong môi trường LB để có
nồng độ cuối là 15g/ml
- Môi trường LB-Cm: bổ sung kháng sinh chloramphenicol trong môi trường LB để
có nồng độ cuối là 10g/ml
b) Môi trường thử hoạt tính tan fibrin
Thành phần môi trường: agarose 2% w/v, fibrinogen 0,6% w/v, đệm phosphate 50
mM, thrombin (10 NIH unit/ml).
c) Môi trường HS (môi trường làm tế bào khả nạp Bacillus subtilis)

Thành phần Thể tích sử dụng
MgSO
4
1M
10

l
10X-S-base, Mg
2+
10ml
Glucose 20% 2,5ml
L-tryptophan 0,1% 5ml

Casein 2% 1ml
B
ảng 2.1.
Thành ph
ần môi tr
ư
ờng
H
S

Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học


- 34 -
Cao nấm men 10% 5ml
Arginin 8% + Histidin 0,4% 10ml
Nước cất vô trùng hai lần (ddH
2
O) 66,5ml
Tổng thể tích 100ml
Hấp khử trùng từng thành phần ở 121
o
C, 15 phút, riêng L-tryptophan và hỗn hợp
Arginin + Histidin lọc khử trùng, không hấp.
 Thành phần 10X-S-base, Mg
2+
: (NH4)
2
SO4 2,0g, K
2

HPO4 14,0g, KH
2
PO4 6,0g,
Natrium citrate 1,0g
Cho nước vào đủ 100ml, đem hấp khử trùng ở 121
o
C, 15 phút. Sau đó bổ sung thêm
0,1ml MgSO
4
1M đã hấp khử trùng riêng.
d) Môi trường LS (môi trường dùng biến nạp tế bào Bacillus subtilis)

Thành phần Thể tích sử dụng
10X-S-base, Mg
2+
10ml
Glucose 20% 2,5ml
L-tryptophan 0,1% 0,5ml
Casein 2% 0,5ml
Cao nấm men 10% 1ml
MgCl
2
1M 0,25ml
CaCl
2
1M (cho sau cùng) 0,25ml
Nước cất vô trùng hai lần (ddH
2
O) 85ml
Tổng thể tích 100ml

2.1.5. Vật liệu sinh học
a) Chủng vi sinh vật sử dụng
- Chủng Escherichia coli DH5 [F- endA1 hsdR17 (rk/mk-) sup E44 thi l- recA1
gyrA96 DlacU169 (f80lacZDM15)] (Takara) được sử dụng làm tế bào chủ để
nhân bản các plasmid.
Bảng 2.2. Thành phần môi trường LS
Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học


- 35 -
- Chủng vi sinh vật dùng để biểu hiện vector tái tổ hợp mang gen mục tiêu aprE:
+ Bacillus subtilis 1012 được dùng làm tế bào chủ biểu hiện protein tái tổ hợp
bằng vector pAX01.
+ Bacillus subtilis DB104 [his, nprR2, nprE18, aprED3](Bacillus Gentics
Stock Centre at Ohio) được dùng làm tế bào chủ biểu hiện protein tái tổ hợp
bằng các vector pAX01 và pBG01.
b) Plasmid
- Plasmid pBluescript II KS (+) được sử dụng làm vector dòng hóa, mang gen
kháng kháng sinh Amp
R
, gen lacZ mã hóa cho 146 acid amin đầu N của enzym -
galactosidase, vùng MCS được chèn vào giữa gen lacZ, cho phép dòng hóa gen mục tiêu vào
vector pBluescript II KS (+) (Hình 2.1).

- Plasmid pAX01 được sử dụng làm vector dòng hóa và vector biểu hiện gen mục
tiêu. Plasmid này có kích thước 7781bp chứa promoter xylA được cảm ứng bằng xylose.
Trên plasmid có đoạn trình tự lacA mang gen mã hóa cho enzym -galactosidase tương ứng
với vùng lacA trên bộ gen của Bacillus subtilis, mang gen kháng kháng sinh Amp
R
(chọn lọc
Hình 2.1. Sơ đồ vector pBluescript II KS (+)
Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học


- 36 -
cho tế bào E. coli và erythromycin Ery
R
(chọn lọc cho B. subtilis). Sơ đồ đặc điểm của
plasmid pAX01 được trình bày ở Hình 1.6.
Plasmid pBG01 là vector biểu hiện protein dựa trên vector plasmid có khả năng tự
sao chép. Đặc điểm plasmid này được trình bày ở Hình 1.8.
c) Mồi
Các mồi được sử dụng trong phản ứng khuếch đại gen, tạo dòng và giải trình tự
được thiết kế bởi Phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên –
Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh có trình tự như sau:

Tên mồi

Trình tự nucleotide Mục đích sử dụng
aprE-F-
BamHI
CATGGATCCAGAATGAGAAGCAAAAAATTG
TGGATC

Khuếch đại gen aprE

aprE-R-
SacII
CATCCGCGGTTATTGTGCAGCTGCTTG
TACGTT
pAX01-
F-seq
GTTTATTGGATAAACAAACTAAC


Giải trình tự gen aprE

aprE-R-
seq
GCGGAACTCATGGCACTAATTGTC

pMTL-R
GGTATAAACTTTTCAGTTGCAGACAAAGAT
Kiểm tra sự hiện diện
của gen aprE trên pBG01

T3
AATTAACCCTCACTAAAGGG

Kiểm tra sự hiện diện
của gen aprE trên
pBluescript
T7
GTAATACGACTCACTATAGGGC

d) Thang chuẩn DNA và protein
- Thang 1 kb (Fermentas, Đức), Ladder, # SM0311/2/3
Bảng 2.3. Các cặp mồi được sử dụng trong luận văn
Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học


- 37 -
- Thang phân tử lượng protein (Low weigh molecular, LWM) (Amersham
Bioscience)










e) Các bộ kít
Bộ kít (EZ – 10 Spin Columm DNA gel Extration Kit của Bio Basis INC) dùng để
tinh chế DNA được thu nhận từ gel agarose, quy trình tinh sạch được thực hiện qua các
bước: làm tan gel, hấp thu DNA trên cột, rửa và dung ly để thu nhận DNA.
Trường hợp cần tinh chế sản phẩm PCR, hỗn hợp PCR sau phản ứng được bơm vào

cột tinh chế DNA (EZ – 10 Spin Column PCR purification Kit của Bio Basis INC), ly tâm
và rửa, DNA sẽ được giữ lại trên cột. Sau đó dung ly và thu nhận DNA đã được tinh sạch.
2.2. PHƯƠNG PHÁP
2.2.1. Phân lập Bacillus subtilis từ mẫu sản phẩm Natto
Các bước thực hiện bao gồm:
- Lấy một ít hạt đậu từ mẫu Natto hòa với 9ml nước cất vô trùng
- Hút 100l dịch pha loãng trải lên đĩa LB
- Ủ đĩa ở 37
o
C qua đêm, sau đó quan sát các dạng khuẩn lạc mọc trên đĩa
Hình 2.2. Thang chuẩn DNA 1kb và protein
Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học


- 38 -
- Lấy từng khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng ria lại trên đĩa LB mới, ủ ở 37
o
C qua
đêm. Tiến hành lặp lại cho đến khi thu được các khuẩn lạc riêng rẽ, đồng nhất.
- Dùng que cấy vòng cấy khuẩn lạc lên đĩa thạch chứa. Ủ ở 37
o
C qua đêm.
Quan sát vòng phân giải và tiến hành chọn lọc những dòng có khả năng phân hủy
fibrin mạnh để tiến hành nuôi cấy cho các thí nghiệm sau.
2.2.2. Phương pháp thử nghiệm khả năng phân hủy fibrin người
Hoạt tính thủy phân fibrin được xác định theo phương pháp Astrup và Mullertz cải
tiến (Choi et al., 2004): 10ml hỗn hợp agarose (2% w/v) và fibrinogen (0,6% w/v) trong đệm
50mM phosphate pH 7,4. Thêm 100µl dung dịch Thrombin (10 NIH unit/ml) khuấy đều, đổ
dung dịch agarose vào đĩa petri, ổn định 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Tạo các lỗ đường kính 4mm
trên lớp agarose, 50µl dịch nổi môi trường nuôi cấy Bacillus phân lập được chuyển vào mỗi

lỗ, ủ trong 3 -18 giờ ở 37
o
C. Nhận diện sơ bộ hoạt tính theo diện tích vòng phân hủy fibrin
[40].
2.2.3. Tách chiết genom của vi khuẩn Bacillus subtilis
Các bước tiến hành như sau:
- Nuôi cấy qua đêm chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong 20ml môi trường LB, lắc
ở tốc độ 180 vòng/phút, 37
o
C.
- Cho dịch nuôi cấy vi khuẩn vào ống falcon loại 50ml (hoặc loại 15ml), ly tâm ở
5.000 vòng/phút trong thời gian 7 phút, nhiệt độ phòng.
- Thu và rửa tế bào bằng 10ml lysis buffer (0,1M NaCl, 0,05M EDTA, pH 8,0) và ly
tâm như ở trên. Sau đó, huyền phù lại bằng 2ml lysis buffer.
- Thêm 25l (hoặc 100l) lysozym nồng độ 20mg/ml, ủ trong thời gian 30 phút,
nhiệt độ 37
o
C.
- Thêm 200l SDS 10% và 10l proteinase K 20mg/ml, tiếp tục ủ ở 37
o
C trong 15
phút.