Biểu hiện, tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp staphylococcal enterotoxin b (seb) phục vụ chế tạo kít phát hiện nhanh độc tố seb trong thực phẩm và môi trường

Số hóa bởi trung tâm học liệu
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC





NGUYỄN BÍCH LOAN




BIỂU HIỆN, TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP
STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ
CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ SEB
TRONG THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƢỜNG





LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC





Thái Nguyên - 2013
Số hóa bởi trung tâm học liệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC




NGUYỄN BÍCH LOAN



BIỂU HIỆN, TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP
STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ
CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ SEB
TRONG THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƢỜNG


Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01


LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC


Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGHIÊM NGỌC MINH



Thái Nguyên - 2013

Số hóa bởi trung tâm học liệu
i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây do tôi và nhóm cộng
sự nghiên cứu phòng Công nghệ sinh học Môi trường - Viện Công nghệ sinh
học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện từ tháng 06
năm 2012 tới tháng 06 năm 2013.
Tác giả

Nguyễn Bích Loan



Số hóa bởi trung tâm học liệu
ii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường
- Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn và tạo điều kiện về kinh phí, hóa
chất thiết bị trong suốt thời gian thực hiện luận văn tại phòng.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới KS. Nguyễn Thị Hoài Thu và các
anh chị, cán bộ phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ sinh
học đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi
hoàn thành luận văn này.
Tôi xin cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh cùng các thầy
cô giáo trong nhà trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên; các thầy
cô Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè
những người đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình
học tập và thực hiện luận văn này.

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013
Học viên

Nguyễn Bích Loan


Số hóa bởi trung tâm học liệu
iii
MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC BẢNG viii
DANH MỤC HÌNH ix
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm 3
1.1.1. Tình hình nhiễm độc thực phẩm chung 3
1.1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố
ruột Staphylococal enterotoxin B trên thế giới và Việt Nam 5
1.2. Một vài nét về tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 8
1.2.1. Đặc điểm hình thái 8
1.2.2. Đặc điểm phân loại 9
1.2.3. Tính chất và phân bố 11
1.2.4. Đặc điểm hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 12

1.2.5. Độc tố và khả năng gây bệnh 12
1.3. Nội độc tố ruột Staphyloccoccal enterotoxin B 16
1.3.1. Đặc điểm cấu trúc 16
1.3.2. Cơ chế gây bệnh 18
1.3.3. Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng . 19
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 22
2.1.1. Đối tượng thí nghiệm 22
2.1.2. Chủng vi khuẩn và plasmid 22


Số hóa bởi trung tâm học liệu
iv
2.1.3. Các bộ kit 22
2.1.4. Hóa chất, máy móc và thiết bị 22
2.1.5. Môi trường và đệm 23
2.1.6. Phần mềm 23
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 23
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 23
2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu 24
2.2.2.1. Phương pháp biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli
BL21(DE3) 24
2.2.2.2. Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli
BL21(DE3) 25
2.2.2.3 Phương pháp xử lý enzym hạn chế 26
2.2.2.4. Biểu hiện protein Staphyloccoccal enterotoxin B trong tế bào vi
khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) 27
2.2.2.5. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 28
2.2.2.6. Phương pháp sạc cột Ni - NTA 31
2.2.2.7. Phương pháp tinh sạch protein 32

2.2.2.8. Định lượng protein theo phương pháp Bradford 33
2.2.2.9. Phương pháp kiểm tra độc tính của protein SEB đột biến 35
2.2.2.10. Phương pháp gây miễn dịch trên chuột 38
2.2.2.11. Phương pháp Western blot 39
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41
3.1. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa cho protein tái tổ hợp
Staphylococcal enterotoxin B 41
3.1.1. Biến nạ pET21a+ mang gen seb vào chủng E. coli
41
3.1.2. Nghiên cứu biểu hiện gen seb với các điều kiện tối ưu 44
3.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp 46
3.3. Định lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford 48


Số hóa bởi trung tâm học liệu
v
3.4. Kiểm tra độc tính của protein 50
3.4.1. Đánh giá độc tính giữa SEB tự nhiên (SEB1) và SEB đột biến
(SEB2) ở liều tiêm 1xLD50 51
3.4.2. Đánh giá độc tính giữa SEB tự nhiên (SEB1) và SEB đột biến
(SEB2) ở liều tiêm 3xLD50 và 10xLD50 51
3.5.Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên chuột của kháng
nguyên Staphylococcal enterotoxin B 54
3.5.1.Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột Balb/C 54
3.5.2.Kết quả kiểm tra khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên chuột của
kháng nguyên 54
KẾT LUẬN 58
KIẾN NGHỊ 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 60
Tài liệu Tiếng Việt 60

Tài liệu Tiếng Anh 61
Tài liệu internet 65


Số hóa bởi trung tâm học liệu
vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
µg
Microgram
µl
Microlit
APS
Ammonium persulphate
ATVSTP
An toàn vệ sinh thực phẩm
Bp
Base pair
BSA
Bovine serum albumin
Cs
Cộng sự
dH
2
O
Nước khử ion
DNA
Deoxyribonucleic acid
dNTPs
deoxyribonucleotide triphosphates
E. coli

Escherichia coli
EDTA
Ethylene Diamine Tetraacetace Axit
Epp
Eppendorf
HRP
Horseradish peroxidase
IPTG
Isopropyl- -D-thiogalactoside
kDa
Kilodalton
Kb
Kilobase
LB
Luria and Bertani
Mg
Miligam
Ml
Mililít
MRSA
Methicilline-resistant Staphylococcus aureus


Số hóa bởi trung tâm học liệu
vii
NBB
Native Binding buffer
Ng
Nanogram
Nm

Nanomet
PBS
Phosphate buffer saline
S. aureus
Staphylococcus aureus
SDS
Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel
electrophoresis
SE
Staphylococcal enterotoxin
SEB
Staphylococcal enterotoxin B
TB
Trung bình
TBS
Tris Bloting solution
TTBS
Tris Tween Blotting solution
v/p
vòng / phút



Số hóa bởi trung tâm học liệu
viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng
Tên bảng

Trang
1.1
Phân loại khoa học Staphylococcus aureus
10
2.1
Công thức pha gel tách (12%)
30
2.2
Công thức pha gel cô (5%)
30
2.3
Pha Nồng độ pha dung dịch BSA
34
2.4
Kí hiệu tên các eppendorf ở các nồng độ
35
3.1
Kết quả đo độ hấp thụ BSA ở bước sóng 595 nm
50
3.2
Nồng độ protein SEB sau tinh sạch
51
3.3
So sánh số chuột chết sau tiêm SEB1 và SEB2 ở liều
1xLD50

52
3.4
So sánh số chuột chết sau tiêm SEB1 và SEB2 ở liều
3xLD50 và 10xLD50

53



Số hóa bởi trung tâm học liệu
ix
DANH MỤC HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
1.1
Cầu khuẩn S. aureus dưới kính hiển vi
9
1.2
Các độc tố quyết định của S. aureus
13
1.3
Cấu trúc tinh thể của protein SEB
17
1.4
Siêu kháng nguyên và miễn dịch không thụ động của tế bào T
19
2.1
Sơ đồ các bước nghiên cứu
24
2.2
Mô hình nghiên cứu độc tính protein SEB đột biến trên
chuột
36

3.1
Khuẩn lạc E.coli BL21mang plasmid tái tổ hợp

42
3.2
Điện di đồ sản phẩm tách DNA plasmid
43
3.3
Điện di đồ DNA plasmid tái tổ hợp cắt bằng enzym EcoRI,
HindIII
44
3.4
Điện di đồ protein SEB dạng tan trước khi tinh sạch
46
3.5
Điện di đồ sản phẩm protein SEB tái tổ hợp tinh sạch.
48
3.6
Đồ thị đường chuẩn định lượng protein bằng BSA có
phương trình tuyến tính: Y = 0,185X
50
3.7
Theo dõi biến động số chuột theo ngày của các nhóm
nghiên cứu
53
3.8
Hình dõi biến động số chuột theo ngày của các nhóm
nghiên cứu
54
3.9

Phản ứng Western blot của protein tái tổ hợp SEB với
kháng huyết thanh chuột
57
3.10
Phản ứng Western bot của các nồng độ kháng nguyên SEB
khác nhau với tỉ lệ kháng thể pha loãng 1/300 lần
58


Số hóa bởi trung tâm học liệu
1
MỞ ĐẦU
Khái niệm “vệ sinh an toàn thực phẩm” được định nghĩa là các điều kiện
và biện pháp cần thiết để đảm bảo thực phẩm không gây hại cho sức khỏe,
tính mạng con người. Mặc dù được Nhà nước và các cơ quan liên quan nỗ lực
kiểm soát tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm song vấn đề này vẫn đang diễn
biến phức tạp.
Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có chừng 250 - 500 vụ ngộ độc thực
phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Đặc biệt là những
trường hợp ngộ độc thực phẩm do mầm bệnh vi sinh vật đóng vai trò rất quan
trọng, chiếm khoảng 50% trên tổng số ca ngộ độc thực phẩm.
Ngộ độc thực phẩm là bệnh cấp tính xảy ra khi ăn, uống phải thức ăn, đồ
uống bị nhiễm vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn hoặc có chứa các chất có tính
chất độc hại đối với con người. Trong số các vi sinh vật sinh độc tố gây bệnh
đó có tụ cầu vàng Staphyloccoccus aureus (S. aureus) là một trong những
nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm. Ngộ độc thức ăn do tụ cầu vàng
có thể do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột
chiếm ưu thế về số lượng. Điều đáng chú ý là một số độc tố của chúng bền
với nhiệt và khó bị phân hủy ở nhiệt độ cao, một trong số đó phải kể tới là
độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B (SEB) bền với nhiệt là tác nhân

chính thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus gây ra.
Hiện nay, việc phòng bệnh và điều trị bệnh ngộ độc do tụ cầu gặp rất nhiều
khó khăn vì không phát hiện kịp thời tác nhân gây bệnh. Đứng trước tình hình
này, bên cạnh việc khảo sát thực trạng nhiễm mầm bệnh S. aureus trong thực
phẩm, việc chế tạo và ứng dụng các bộ kít phát hiện nhanh các mầm bệnh chủ
yếu gây nhiễm trùng nhiễm độc thực phẩm ở Việt Nam nói chung và mầm
bệnh S. aureus nói riêng là vô cùng cần thiết.
Hiện nay trên thế giới và Việt Nam cũng đã phát triển một số phương
pháp phát hiện độc tố SEB dựa trên nguyên tắc liên kết miễn dịch như:


Số hóa bởi trung tâm học liệu
2
ELISA, huỳnh quang miễn dịch, cảm biến sinh học… Tuy nhiên các phương
pháp này chỉ được thực hiện tại những phòng thí nghiệm có điều kiện về cơ
sở vật chất, trang thiết bị hiện đại và kỹ thuật viên có trình độ cao. Trước tình
hình vệ sinh an toàn thực phẩm đang ở mức báo động cao như ở nước ta hiện
nay, việc nghiên cứu chế tạo thành công bộ kit dưới dạng que nhúng với
nhiều lợi thế hơn như cho kết quả trong thời gian ngắn, đơn giản, dễ sử dụng
và áp dụng ở nhiều nơi như bệnh viện, nhà hàng, các vùng quê; phương pháp
này đòi hỏi cần có kháng thể đặc hiệu.
Do vậy việc biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên SEB tái tổ hợp không
có độc tính, có khả năng gây phản ứng miễn dịch tạo các kháng thể IgG đặc
hiệu là cấp thiết.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Biểu hiện, tinh
sạch kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) phục vụ
chế tạo kít phát hiện nhanh độc tố SEB trong thực phẩm và môi trường”
Mục tiêu nghiên cứu:
Tạo được kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB)
đặc hiệu làm nguyên liệu phục vụ cho việc tạo kháng thể đa và đơn dòng

phục vụ chế tạo que thử nhanh phát hiện độc tố ruột SEB do vi khuẩn tụ cầu
vàng (S. aureus) gây ra trong thực phẩm và môi trường.
Nội dung nghiên cứu:
- Biểu hiện gen seb đột biến
- Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB đột biến.
- Định lượng protein SEB đột biến theo phương pháp Bradford.
- Kiểm tra độc tính của protein SEB đột biến
- Gây miễn dịch thực nghiệm trên chuột
- Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên SEB
bằng kỹ thuật Western blot.


Số hóa bởi trung tâm học liệu
3
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm
1.1.1. Tình hình nhiễm độc thực phẩm chung
Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm đang là vấn đề nổi cộm đối với tất
cả các nước trên thế giới. Sự hiểu biết của con người về căn nguyên, tác hại
và hậu quả của bệnh truyền qua thực phẩm ngày càng sâu sắc hơn. Tuy nhiên
những biện pháp, kĩ thuật nhằm kiểm soát chúng lại chưa đem lại hiệu quả
tích cực như mong đợi. Những nguyên tắc phòng chống, các kĩ thuật vệ sinh
đã được nghiên cứu và áp dụng, tuy nhiên ngay cả những nước công nghiệp
như Hoa Kì và Nhật Bản lại thường xuyên thông báo về bệnh do thực phẩm bị
nhiễm khuẩn nhiễm độc [31].
Ngộ độc thực phẩm là hội chứng cấp tính xảy ra do ăn phải thức ăn có
chất độc đối với người ăn. Bệnh thường xảy ra có tính chất đột ngột, nhiều
người cùng mắc do ăn cùng một loại thức ăn, có những triệu chứng của một
bệnh cấp tính biểu hiện bằng nôn mửa, ỉa chảy… kèm theo các triệu chứng
khác tùy theo từng loại ngộ độc. Ngộ độc có thể do:

+ Thực phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật và độc tố của vi sinh vật
+ Thực phẩm bị nhiễm các hoá chất
+ Bản thân thực phẩm có chứa các chất độc ví dụ như nấm độc, khoai
tây mọc mầm, sắn, một số loài nhiễm thể, cá nóc, cóc, v.v [43].
Thực phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật và độc tố của vi sinh vật là một trong
những nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, xảy ra ở các nước có
nền khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu, kém phát triển
[37]. Tình trạng nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm diễn ra khá phổ biến trên
cả nước. Tại Hà Nội, tỷ lệ thức ăn đường phố nhiễm vi khuẩn tương đối cao
với tỷ lệ 46,7%, trong đó chủ yếu do nhiễm Coliform [4]. Điều tra tại thành
phố Hồ Chí Minh cho thấy 100% các mẫu thực phẩm được kiểm tra gồm


Số hóa bởi trung tâm học liệu
4
bánh mỳ, thịt nguội, thịt quay và dưa muối không đảm bảo vệ sinh thực phẩm
về mặt vi sinh [8]. Tại Hải Phòng, có 76,4% thực phẩm không đạt tiêu chuẩn
vệ sinh, trong đó tỷ lệ không đạt vệ sinh của thức ăn đường phố là 92,9%
[11]. Với thực phẩm ăn liền tại các chợ, có tới 85% mẫu thử nghiệm không
đạt tiêu chuẩn về vi sinh, với số lượng vi khuẩn có trong thực phẩm vượt mức
cho phép nhiều lần, kể cả các vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm [6]. Không chỉ ở
các thành phố lớn, tình trạng nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm còn
diễn ra phổ biến ở rất nhiều địa phương khác trên cả nước [10]. Tuy chưa
được nghiên cứu đầy đủ, kết quả điều tra sơ bộ tại thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm
Đồng cho thấy có 73,7% số thực phẩm không đạt tiêu chuẩn vệ sinh, trong đó
cao nhất là các sản phẩm từ sữa (97,5%), các loại kem (77,5%), nước giải
khát (67,5%) và cuối cùng là nhóm thực phẩm chế biến từ thịt (40%) [1].
Khảo sát tình hình vệ sinh an toàn thức ăn đường phố tại 137 cơ sở kinh
doanh thức ăn đường phố tại Thị xã Kon Tum cho kết quả 100% cơ sở không
đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thức ăn tỷ lệ nhiễm vi sinh vật ở rau sống từ 88

- 100% , thực phẩm chín từ 29 - 66% và bàn tay người chế biến 1%; 100%
dụng cụ chứa đựng thực phẩm không nhiễm vi sinh [3]. Hiện nay, loài người
đang phải đối mặt với nguy cơ nhiễm hơn 200 bệnh truyền nhiễm thông qua
thực phẩm. Trong số đó có khoảng 40 mầm bệnh vi sinh vật đã được xác định
vai trò gây bệnh. Trong số hơn 200 bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm có
khoảng 40 mầm bệnh vi sinh vật đã được xác định vai trò gây bệnh. Các mầm
bệnh vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, kí sinh trùng và virus. Trong đó các
loại vi khuẩn gây ra tới 90% ca bệnh tử vong ở người. Trong số các nguyên
nhân đã được xác định, một số vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc cấp tính rất
nguy hiểm, với tỷ lệ tử vong cao như: Staphylococcus aureus, Salmonella,
Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Vibro chlorea, Campylobacter,
Yersinia enterocolitica .v.v [15].


Số hóa bởi trung tâm học liệu
5
Ở các nước châu Á, tụ cầu vàng (S. aureus) là nguyên nhân hàng đầu
gây ra ngộ độc [9].
Staphylococcus aureus: thường có trong kem, thịt tươi, cá bảo quản lâu
ngày, xúc xích, lạp xường, đôi khi có trong phomat. Vi khuẩn có độc tố ruột
gây buồn nôn và nôn, đau bụng và ỉa chảy cấp. Độc tố tụ cầu bao gồm các
enzym: hyaluronidase gây phá hủy tổ chức, hemolysine và leukocidine gây
phá hủy hồng cầu và gây chết các tế bào hạt cũng như đại thực bào,
exfoliatine: là các men phá hủy lớp thượng bì. Men này gây tổn thương da tạo
các bọng nước. Điển hình là hội chứng Lyell do tụ cầu. Độc tố gây hội chứng
sốc nhiễm độc: là nguyên nhân gây nên hội chứng sốc nhiễm độc, một hội
chứng sốc trầm trọng.
Các enterotoxin mà quan trọng nhất là enterotoxin B (SEB) là một độc
tố ruột được sinh ra bởi chủng S. aureus, nó là một trong những độc tố liên
quan đến nhiễm độc thức ăn ở người do vi khuẩn tụ cầu và độc tố còn được

sử dụng như một tác nhân sinh học nguy hiểm trong chiến tranh sinh học.
SEB là một siêu kháng nguyên, nó có tác động kích thích viêm và tăng tiết
sytokin ở tất cả các mô, cơ quan. SEB gây độc cho đường tiêu hóa, đường hô
hấp, các vết thương thậm chí có thể xâm nhập qua da lành, trong tấn công
sinh học nó có thể được phân tán vào thức ăn, nguồn nước hoặc phun trong
không khí.
1.1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố
ruột Staphylococal enterotoxin B trên thế giới và Việt Nam
Thực phẩm bị ô nhiễm do các vi sinh vật và các độc tố của chúng là một
trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, xảy ra ở các nước
có nền khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu, kém phát
triển [38] .
Tụ cầu S. aureus là một trong những loại vi khuẩn gây bệnh được ghi
nhận sớm nhất vào đầu những năm 1880. Sự liên quan của tụ cầu tới nhiễm


Số hóa bởi trung tâm học liệu
6
trùng, nhiễm độc thức ăn được biết đến từ những năm 1914, nhưng mãi đến
năm 1930, Dack và cs mới xác định được nhiễm trùng, nhiễm độc tụ cầu có
thể gây ra bởi các độc tố ruột có trong dịch nuôi cấy tụ cầu vàng [2].
Từ giữa những năm 1969 và 1990, tại Anh, 53% trường hợp ngộ độc
thực phẩm do S. aureus được ghi nhận là do tiêu thụ các sản phẩm từ thịt (đặc
biệt là ruốc); 22% các trường hợp từ thịt gia cầm, 8% từ các sản phẩm liên
quan tới sữa, 7% từ cá, sò, ốc… và 3,5% từ trứng [41].
Tại Pháp, trong số các thực phẩm nhiễm S. aureus được ghi nhận trong
hai năm (1999 – 2000) có các sản phẩm từ sữa (đặc biệt là phomat) (32%),
thịt (22%), xúc xích (15%), cá và hải sản (11%), trứng và các sản phẩm từ
trứng (11%) hoặc các sản phẩm khác từ gia cầm (9,5%) [19].
Tại Hoa Kì, trong số các trường hợp ngộ độc thực phẩm do S. aureus

được báo cáo giữa các năm 1975 và 1982 thì 36% là do tiêu thụ thịt đỏ nhiễm
khuẩn, 12,3% từ sa lát, 11,3% từ gia cầm, từ bánh ngọt 5,1%, còn lại là từ các
sản phẩm liên quan tới sữa và hải sản [41]. Như vậy, giữa các nước khác nhau
loại thực phẩm dễ nhiễm tụ cầu nhất cũng khác nhau.
Trung tâm Phòng và Kiểm soát bệnh Hoa Kì (CDC) công bố vi khuẩn tụ
cầu vàng kháng methicilline MRSA (methicilline-resistant Staphylococcus
aureus) đang lây lan mạnh ở quốc gia này với tỷ lệ nhiễm là 32/100.000
người và số người chết vì MRSA đã vượt quá số người chết vì bệnh AIDS.
(trong tạp chí chuyên đề của Hiệp hội Y học Mỹ số ra ngày 18/10/2012).
Theo ước tính của Trung tâm Phòng và Kiểm soát bệnh Hoa Kì, mỗi năm trên
thế giới có ít nhất 100.000 người đã vô tình bị lây nhiễm MRSA sau khi nhập
viện. Trung bình cứ 10 trẻ em Mỹ đã từng vào viện thì có một trẻ bị lây nhiễm
loại vi khuẩn đặc biệt nguy hiểm này và đến nay đã có gần 19.000 người bị
chết ở Mỹ vì nhiễm MRSA. Các ghi nhận y tế khác cũng cho thấy, MRSA
hiện có mặt và ẩn nấp vô số trong mọi ngóc ngách của các bệnh viện và đang
là mối đe dọa lớn với ngành y tế Mỹ [50].


Số hóa bởi trung tâm học liệu
7
Tại Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn và các độc tố của S. aureus rất
đa dạng, thường gặp nhất là các thực phẩm đường phố ăn ngay (46,6%), thịt
hun khói (100%), xúc xích (96,6%), bánh gato (85%), pate (83,3%) .v.v.
Đáng chú ý là vi khuẩn S. aureus thường được tìm thấy trong các thực phẩm
bị nhiễm khuẩn [4].
Ở nước ta, trong nhiều năm trở lại đây xảy ra nhiều vụ ngộ độc thực
phẩm ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ
của Cục ATVSTP khoảng tháng 4, tháng 5/2012, cả nước xảy ra 10 vụ ngộ
độc thực phẩm làm 927 người mắc, trong đó có 726 người nhập viện và đã có
4 trường hợp tử vong. Phần lớn các vụ ngộ độc xảy ra với quy mô nhiều

người mắc, nguyên nhân ngộ độc chủ yếu do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật.
Điển hình là vụ ngộ độc tập thể tại một đám cưới tại tại bản Hùn, xã Chiềng
Cọ, thành phố Sơn La là do thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn S.aureus làm 300
người mắc phải nhập viện cấp cứu. Một vụ ngộ độc tập thể khác xảy ra ngày
16/4/2012 khiến hơn 200 công nhân của Công ty Dream MeKong thuộc xã
An Cư, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang bị ngộ độc [45].
Ngoài ra, kết quả kiểm nghiệm giám sát mối nguy ô nhiễm thức ăn của
Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm tỉnh Quảng Trị từ tháng 4/2010 đến nay
cho thấy nhóm thức ăn chế biến ăn ngay (nộm, rau sống, nước chấm các loại)
có tỷ lệ nhiễm vi khuẩn cao nhất 72 - 88% với các vi khuẩn chủ yếu: E.coli
88%; Staphylococcus aureus 72,2%. Trong tháng 3/2013 vừa qua, hàng chục
người bị ngộ độc, phải nhập viện do ăn phải bánh mì sốt trứng gà với chả bò
nhiễm vi khuẩn tụ cầu vàng vượt quá giới hạn cho phép 6 đến 10 lần tại một
của hàng bánh mì ở Đà Nẵng [42]. Có nhiều nguyên nhân gây khó khăn cho
quá trình thống kê tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do SEB:
1) Bệnh nhẹ nên người bệnh không chủ động tìm kiếm sự điều trị tại các
cơ sở chuyên khoa.


Số hóa bởi trung tâm học liệu
8
2) Chẩn đoán tại khoa cấp cứu các bệnh viện thường có nhiều bệnh có
biểu hiện gần giống bệnh do SEB gây ra, nên chưa kết luận đúng bệnh.
3) Việc tiến hành các nghiên cứu phục vụ cho chẩn đoán nhanh ngộ độc
thực phẩm do độc tố ruột SEB của tụ cầu vàng ở Việt Nam hiện nay còn khá
mới mẻ, chủ yếu vẫn dựa vào các phương pháp truyền thống nên tốn nhiều
công sức và thời gian dài. Do đó, khi bệnh nhân ăn phải thức ăn bị nhiễm độc
tố của tụ cầu như SEB sẽ gặp nguy hiểm gấp bội vì SEB là một siêu kháng
nguyên có độc tính mạnh, tác động nhanh, có thể dẫn tới tử vong ở người.
Trong các vụ ngộ độc thức ăn tập thể, ngộ độc do độc tố ruột của tụ cầu

S. aureus (Enterotoxin) được cho là phổ biến nhất do tụ cầu phát triển nhanh
trong môi trường thực phẩm ở điều kiện khí hậu nóng ẩm và tiết ra độc tố
Enterotoxin. Trong các loại độc tố của tụ cầu thì Enterotoxin B (SEB) là một
độc tố mạnh, gây tử vong cao và lại bền với nhiệt và môi trường nên còn được
tổ chức y tế thế giới (WHO) và CDC cảnh báo có thể là một trong những tác
nhân bị lợi dụng trong khủng bố sinh học.
Việc tìm ra phương pháp phát hiện sớm S. aureus và độc tố SEB gây
nhiễm trùng nhiễm độc trực tiếp trên thực phẩm mang ý nghĩa quan trọng và
cấp thiết, nhằm loại bỏ và có biện pháp xử lý sớm đối với các thực phẩm
đang nhiễm độc, nhiễm trùng.
Chính vì vậy, việc tiến hành đề tài này sẽ là một nhu cầu cấp thiết và
thực tiễn.
1.2. Một vài nét về tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
1.2.1. Đặc điểm hình thái
Tụ cầu (“Staphylococcus” bắt nguồn từ tiếng Hy lạp, với „staphyle” có
nghĩa là chùm nho) là vi khuẩn gram dương, có hình cầu, đường kính khoảng
0,8 - 1 µm, có thể đứng riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm
không đều giống như chùm nho (hình 1.1). Đây là loại vi khuẩn không di


Số hóa bởi trung tâm học liệu
9
động, không có lông, cầu khuẩn Staphylococcus aureus (S. aureus) không có
khả năng tạo bào tử như các vi khuẩn Chlammydomonas perfringens,
Chlamydomonas botulinum, và Bacillus cereus cũng thường được tìm thấy
trong các thực phẩm nhiễm khuẩn, và thường không có vỏ [41].
Năm 1871, Recklinghausen thu được cầu khuẩn trong thận của bệnh
nhân chết do bệnh nhiễm khuẩn huyết. Năm 1880, Alexander Ogston chứng
minh được abcess sinh mủ là do cầu khuẩn dạng chùm. Vào năm 1982,
Ogson được công nhận là người khám phá và đặt tên cho tụ cầu –

Staphylococcus aureus.

Hình 1.1 Cầu khuẩn S. aureus dưới kính hiển vi (ảnh Sanger) [49]
1.2.2. Đặc điểm phân loại
Đặc điểm phân loại của Staphylococcus aureus được trình bày trong
bảng 1.1


Số hóa bởi trung tâm học liệu
10
Bảng 1.1. Phân loại khoa học Staphylococcus aureus
Phân loại khoa học
Giới
Eubacteria
Ngành
Firmicutes
Lớp
Cocci
Bộ
Bacillales
Họ
Staphylococcaceae
Chi
Staphylococcus
Loài
Staphylococcus aureus

Trên lâm sàng việc phân biệt các chủng tụ cầu có khả năng gây bệnh và
không gây bệnh thường dựa vào sự hiện diện của men coagulase. Men này
gắn với prothrombin trong huyết tương và hoạt hóa quá trình sinh fibrin từ

tiền chất fibrinogen. Enzym này cùng với yếu tố kết cụm (một enzym vách tế
bào vi khuẩn) giúp tụ cầu vàng tạo kết tủa fibrin trên bề mặt của nó.
Tụ cầu có men coagulase:
Nhờ men coagulase này mà trên môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn
tạo nên các khuẩn lạc màu vàng. Do vậy vi khuẩn này còn gọi là tụ cầu vàng.
Các vi khuẩn quan trọng của nhóm này là: Staphylococcus aureus (hay còn
gọi là tụ cầu vàng); Staphylococcus intermedius.
Tụ cầu không có men coagulase:
Do không có men coagulase nên trên môi trường nuôi cấy có máu, khuẩn
lạc có màu trắng ngà. Trên lâm sàng thường gọi các vi khuẩn này là tụ cầu
trắng. Các vi khuẩn nhóm này có thể kể đến: Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus


Số hóa bởi trung tâm học liệu
11
capitis, Staphylococcus simulans, Staphylococcus hominis, Staphylococcus
warneri, cùng 16 chủng tụ cầu khuẩn khác không hiện diện ở người.
Phân loại tụ cầu dựa trên kháng nguyên: Các tụ cầu có nhiều loại kháng
nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic của vách tế bào vi khuẩn. Nhưng
dựa vào kháng nguyên, việc định loại vi khuẩn rất khó khăn.
Phân loại tụ cầu dựa trên phage (phage type): tụ cầu được phân vào các
nhóm I, II, III, IV. Đây là phương pháp sử dụng nhiều trong phân loại
Staphylococcus aureus. Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men
penicillinase (beta-lactamase). Men này phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc
cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và
Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng [2].
1.2.3. Tính chất và phân bố
Staphylococcus aureus là những vi khuẩn kị khí tùy ý, có cả sự trao đổi
chất, hô hấp và lên men. Chúng cho phản ứng catalase dương tính và có thể

sử dụng nhiều loại carbonhidrat khác nhau tạo acid lactic nhưng không sinh
hơi. Khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc như Trypticase soy agar
thường có màu kem đến màu cam.
Thành tế bào chứa peptidoglican hình thành một hàng rào cứng chắc
xung quanh tế bào và acid teichoic giúp duy trì môi trường ion thích hợp cho
màng cytoplasma, đồng thời góp phần bảo vệ bề mặt tế bào tụ cầu. S. aureus
có thể mọc ở nhiều điều kiện, môi trường khác nhau, nhưng tốt nhất ở nhiệt
độ từ 30 - 37
o
C và pH: 7 - 7,2. Chúng kháng được các chất diệt trùng, độ khô
nóng và có khả năng tăng trưởng trong môi trường có chứa đến 15% NaCl .
Sắc tố carotenoid Sataphyloxanthin làm nên tính chất màu vàng của S.
aureus. Sắc tố đóng vai trò là một tác nhân độc hại có tính chất chống oxy
hóa giúp cho vi khuẩn không bị chết bởi các chủng oxy gây phản ứng được sử
dụng bởi hệ thống miễn dịch.


Số hóa bởi trung tâm học liệu
12
S. aureus cư trú trên người và động vật máu nóng, có trong sữa bò bị
bệnh, thịt heo tươi, có trong đất, vết thương mưng mủ… Đầu tiên chúng phát
triển với số lượng thấp, sau đó phát triển lên số lượng lớn nếu không có bước
gia nhiệt hợp lý để phá hủy chúng hoàn toàn. S. aureus dễ dàng phát triển ở
những thực phẩm không qua xử lý nhiệt hoặc các sản phẩm làm bằng tay và
làm lạnh không hợp lý. Nguồn thực phẩm chủ yếu gây bệnh: thịt heo, bánh
kem, trứng, thịt bò, thịt gà tây, shusi…
1.2.4. Đặc điểm hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
Hiện nay người ta cũng đã thành công trong giai đoạn giải trình tự gen
của các chủng tụ cầu vàng được kí hiệu: Newman, COL, UMRSA 252,
MW2, MSSA476, N315, Mu50, RF122 [12, 18, 20]. Điển hình như Steven và

cs đã thành công trong việc giải trình tự bộ gen dài 2809422 bp của chủng S.
aureus COL. Kết quả giải trình tự đã được ghi nhận trên Genbank với mã số:
CP000046.1 cho hệ gen nhân và CP000045 cho hệ gen plasmid. Theo đó,
trình tự gen của tụ cầu vàng có chứa ít các cặp G-C, điều này gây ra mối quan
ngại về sự chuyển gen từ các chủng tụ cầu vàng tới các tác nhân gây bệnh
Gram dương khác [33].
Trong số các chủng S. aureus phân lập từ các mẫu thực phẩm, tỷ lệ
giống enterotoxigenic được ước tính khoảng 25%. Ở Pháp, trong số 332
chủng S. aureus được phân lập từ nhiều loại thức ăn có 57% chủng chứa các
gen seg, seh, sei và sej xuất hiện với tần số cao hơn hẳn chủng chứa các gen
sea và see trước đây vốn được xem là chiếm ưu thế [41].
1.2.5. Độc tố và khả năng gây bệnh
Các loại độc tố: Dựa theo các cuộc nghiên cứu và các báo cáo khoa học:
Tụ cầu S. aureus sản sinh ra 11 độc tố (hình 1.2): độc tố gây hội chứng nhiễm
độc (TSST-Toxic shock syndrome toxin); độc tố exfoliatin hay độc tố
epidermolitic; độc tố alpha; độc tố bạch cầu (leucocidin); ngoại độc tố sinh
mủ (pyrogenic); dung huyết tố (hemolysin hay staphylolysin); fribrinolysin


Số hóa bởi trung tâm học liệu
13
(staphylokinase); coagulase; hyaluronidase; β-lactamase và độc tố ruột
(enterotoxin) – trong đó có SEB là một trong những nhóm độc tố được liệt kê
trong danh mục vũ khí sinh học dùng để tấn công khủng bố sinh học và chiến
tranh sinh học [2].


Hình 1.2. Các độc tố quyết định của S. aureus [44]

Độc tố ruột (enterotoxin )

* Cấu trúc:
Các độc tố này là những protein tương đối bền với nhiệt, nên khó bị phá
hủy bởi sự đun nấu, có trọng lượng phân tử từ 28000 - 30000 Dalton, mỗi
chuỗi có vị trí kháng nguyên chuyên biệt. Đặc điểm chính là có vòng cystein
ở giữa giúp ổn định cấu trúc phân tử và kháng sự phân giải protein. Có các
chuỗi acid amin, trong đó nhiều nhất là aspartic, glutamic. lysine, tyrosine.
* Phân loại:
Do số lượng SE khá lớn nên rất cần thiết phải phân loại và sắp xếp
chúng. Năm 1962, người ta đã đưa ra hệ thống sắp xếp các độc tố theo bảng
chữ cái [25]. Đầu tiên 5 loại SE được tìm thấy và phân loại dựa vào tính


Số hóa bởi trung tâm học liệu
14
kháng nguyên của chúng, đó là độc tố A (SEA), độc tố B (SEB), độc tố C
(SEC), độc tố D (SED) và độc tố E (SEE). Trong đó, SEC được chia thành
SEC, SEC2, SEC3. Ngoài ra, các độc tố này bao gồm 6 loại type được kí hiệu
từ A tới F [2]. Ono và cs (2008), đã phát hiện ra 2 loại độc tố mới là SES và
SET cũng nằm trong những độc tố ruột do S. aureus tạo ra [27]. Trong số các
dạng độc tố ruột do S. aureus sinh ra thì các độc tố SEA, SEB, SEC, SED là
những độc tố thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm.
* Cơ chế gây bệnh:
Bước quan trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây
bệnh và vật chủ là sự bám dính (adherence) của tác nhân gây bệnh vào các bề
mặt của vật chủ. Các bề mặt này bao gồm da, niêm mạc (khoang miệng, mũi
hầu, đường tiết niệu) và các tổ chức sâu hơn (tổ chức lympho, biểu mô dạ dày
ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô). Giống như các vi khuẩn Gram dương
khác là Streptococcus và Mycobacteria, S. aureus bám dính vào bề mặt tế bào
vật chủ nhờ các adhensin có bản chất polypeptide. Một khi đã bám dính vào
tế bào vật chủ, tác nhân gây bệnh như S. aureus mới có khả năng khởi động

các quá trình hóa sinh đặc hiệu gây bệnh như tăng sinh, bài tiết độc tố, xâm
nhập và hoạt hóa các chuỗi tín hiệu của tế bào vật chủ. S. aureus sẽ tiếp tục
tiến sâu vào trong cơ thể vật chủ để tiếp tục chu trình xâm nhập (invasion). S.
aureus xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một số enzym như: hyaluronidase;
hemolysine; leukocidin; exfoliatine… phá hủy các thành phần cấu tạo tế bào
vật chủ [46].

Ước tính khoảng 0,1 µg S. aureus đã đủ gây ngộ độc thực phẩm
ở người. Tuy nhiên, lượng này cũng có thể thay đổi tùy thuộc nhạy cảm với
tác nhân ở mỗi bệnh nhân [41].

Triệu chứng gây bệnh của Staphylococcus aureus:
- Triệu chứng ngộ độc thức ăn do nhiễm tụ cầu vàng Staphylococcus
aureus: Ngộ độc thức ăn do tụ cầu S. aureus và độc tố của nó thường có các
triệu chứng cấp tính. Thời gian ủ bệnh của tụ cầu vàng ngắn hơn (chỉ 1 - 6