xác định một số type hpv và các yếu tố liên quan trên các bệnh nhân ung thư cổ tử cung tại bệnh viện k trung ương

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư cổ tử cung (CTC) là loại ung thư phụ khoa gặp ở phụ nữ từ 20-
75 tuổi, tuy nhiên độ tuổi thường gặp nhất là từ 35-55, chiếm 60% [1]. Ở các
nước đang phát triển, ung thư CTC là loại ung thư đứng hàng thứ 2 sau ung
thư vú ở phụ nữ, với tỷ lệ khoảng 9,8% trong số tất cả các loại ung thư [2].
Theo ước tính, mỗi năm trên thế giới có gần 500.000 trường hợp mới mắc và
làm tử vong 270.000 người [3]. Khoảng 80% các trường hợp này tập trung ở
các nước đang phát triển [4]. Năm 2005, Việt Nam có 4.471 ca ung thư CTC
mới trong cả nước. Tỷ lệ ung thư CTC ở miền Nam vào khoảng 16/100.000
phụ nữ, ở miền Bắc vào khoảng 9,5/100.000 phụ nữ [3].
Từ thập niên 70 của thế kỷ trước, một số nhà khoa học đã tìm thấy mối
liên quan chặt chẽ giữa ung thư CTC với một số type của HPV (Human
Papilloma Virus) và các type này được mô tả như là một trong những tác
nhân gây biến đổi tế bào CTC (loạn sản tế bào CTC), tiền đề của ung thư
CTC. Nhiễm HPV thường gặp trong các bệnh nhân nữ bị viêm nhiễm cơ
quan sinh dục (do nhiều căn nguyên khác nhau trong đó có HPV). HPV lây
truyền qua tiếp xúc trực tiếp, đặc biệt quan hệ tình dục có gây tổn thương
da và niêm mạc. Biến chứng trầm trọng nhất của nhiễm HPV là các tổn
thương tiền ung thư và ung thư CTC. Theo một số tác giả gần như 100%
các trường hợp ung thư CTC đều có nhiễm một hoặc nhiều type HPV nguy
cơ cao [3]. Theo các nhà nghiên cứu, ung thư xâm lấn CTC có thể xảy ra
sau nhiễm HPV 15-20 năm [3]. Một số nghiên cứu trên thế giới đã phát
hiện HPV dương tính tại mô ung thư CTC 99%, 90% ở mô ung thư âm đạo
và 40% ở mô ung thư âm hộ [5].
2
Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ
thành phố Hồ Chí Minh, Hà Nội cũng như trong cộng đồng. Tuy nhiên chưa
có nhiều nghiên cứu về tình hình nhiễm HPV ở những phụ nữ có tổn thương u
sùi vùng CTC và đặc biệt là nhóm đã được xác định ung thư CTC thông qua
xét nghiệm giải phẫu bệnh (xét nghiệm mô bệnh học) và đây là lý do để

chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định một số type HPV và các yếu tố liên
quan trên các bệnh nhân ung thư cổ tử cung tại bệnh viện K Trung ương”.
Đề tài có 2 mục tiêu sau:
1. Xác định tỷ lệ nhiễm một số type virus HPV trên các bệnh nhân ung
thư cổ tử cung đến khám và điều trị tại bệnh viện K Trung ương từ
tháng 7/2013 - 3/2014.
2. Xác định một số yếu tố liên quan đến tình trạng nhiễm HPV ở các đối
tượng nghiên cứu.
3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Human papilloma virus
1.1.1. Cấu tạo virus
HPV là virus thuộc họ Papillomavirus, gồm các virus lây lan qua con
đường tiếp xúc trực tiếp, đặc biệt qua quan hệ tình dục. Papillomavirus có các
vật chủ khác nhau như chim (Avian papillomavirus-APV), bò (Bovin
papillomavirus-BPV). Human papilloma virus (HPV) là loại Papilloma virus
gây tổn thương biểu mô da và niêm mạc đường sinh dục, hậu môn – trực
tràng, hầu họng…của người [6].
Cũng như các Papilloma virus khác, HPV có cấu trúc là chuỗi xoắn kép
ADN, dài khoảng 8000bp, có vỏ capsid đối xứng xoắn, không có vỏ bao
ngoài. Hạt virion có đường kính 52-55nm, vỏ capsid gồm 72 đơn vị
capsomer. Mỗi capsomer là một pentamer được cấu tạo bởi 2 protein, protein
chính L1 và protein phụ L2, được mã hóa bởi 2 gen muộn L1, L2. Protein L1
chiếm 80%, L2 chiếm 20% tổng protein của HPV. Protein L1 có vai trò gắn
kết capsid với capsomer, tương tác với liên kết trên màng của tế bào chủ giúp
virus dễ dàng xâm nhập, đồng thời chúng đóng vai trò như một kháng nguyên
của virus [7].
Hình 1: Mô hình virus HPV
4

Chuỗi xoắn kép ADN có 10 khung đọc mở ORF, sự sao chép, phiên mã
xảy ra trên một mạch và theo một chiều duy nhất. Bộ gen được phân làm 3 vùng:
+ Vùng điều khiển dài LCR (Long Control Region) hay còn gọi là vùng
điều hòa thượng nguồn URR (Upstream Regulatory Region), chiếm khoảng
10% chiều dài bộ gene, không có gene mã hóa, có chức năng điều hòa sao
chép và sự nhân lên của virus. Vùng này có chứa promoter p97, là tiểu phần
khởi động các tiểu phần kích hoạt và một số vùng gene câm. Đây cũng là
vùng biến động nhất trong bộ gene HPV.
+ Vùng gene sớm: gồm 6 gene, ký hiệu là E1, E2, E4, E5, E6, E7, mã
hóa cho các protein thúc đẩy sự nhân lên của virus. Gene E1 mã hóa protein
nhận diện vùng bắt đầu nhân lên, protein E2 liên quan quá trình sao mã gene
E6, E7 của virus. Protein E4 liên quan đến giai đoạn cuối, E5 có lien quan đến
cả giai đoạn sớm và muộn của chu kỳ tế bào. E6 và E7 can thiệp vào chu trình
chết của tế bào.
+ Vùng gene muộn gồm 2 gene, ký hiệu là L1, L2 mã hóa cho các
protein L1, L2 của vỏ capsid [7].
1.1.2. Phân loại HPV
Virus HPV không phát triển trong điều kiện nuôi cấy ở phòng thí nghiệm
nên việc nghiên cứu chỉ có thể dựa trên nghiên cứu in vivo trên người hay
động vật bị nhiễm. những mẫu nhiễm này có thể lưu trữ ở -20
0
C trong thời
gian dài mà không làm giảm khả năng hoạt động của virus. Đến nay đã có gần
120 type được biết đến, trong đó 20-30% là những type chưa được phân loại
vì bộ gene chỉ mới được giải trình tự một phần.
Sự định type HPV không dựa vào huyết thanh như những loại virus khác
mà dựa trên sự tương đồng ADN. Gen L1 bền vững nhất trong bộ gen của
HPV, do đó, hơn 20 năm qua các nhà khoa học đã căn cứ vào sự tương đồng
5
nucleotide của gene L1 để định type HPV. HPV được gọi là type mới nếu

trình tự ADN L1 có sự khác biệt trên 10% so với type đã biết gần nhất, nếu
chỉ khác biệt từ 2-10% thì được gọi là phân type (subtype), nếu dưới 2%,
người ta coi đó như là biến thể hay các dạng đột biến [8].
Trên cơ sở tổn thương lành hay ác tính, HPV được chia thành 2 nhóm,
nhóm nguy cơ cao và nhóm nguy cơ thấp. HPV nhóm nguy cơ thấp chủ yếu
gây mụn cóc, u nhầy, u nhú ở da và niêm mạc. HPV nhóm nguy cơ cao gây
tổn thương da và niêm mạc ác tính như ung thư CTC, âm hộ, âm đạo, dương
vật, hậu môn, hầu họng [5]. Theo dịch tễ học HPV lại được chia thành 3
nhóm như sau [9]:
Nhóm Type HPV
Nguy cơ cao 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68,
73, 82.
Có khả năng gây UT 26, 53, 66.
Nguy cơ thấp 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 và
CP6108.
1.2. Cơ chế gây bệnh của virus HPV
Quá trình xâm nhập và nhân lên của virus được mô tả như sau: protein
L1 tương tác với liên kết màng tế bào chủ, giúp sợi ADN của virus dễ dàng
xâm nhập. Các gen sớm E biểu hiện ngay sau khi virus xâm nhập vào tế bào
đáy của da hoặc niêm mạc tế bào chủ. Đoạn gen E6, E7 tích hợp vào nhiễm
sắc thể như thể bổ sung, thoát khỏi sự điều hòa của gen E2, chúng được sao
mã, tổng hợp protein E6, E7. Thoạt tiên, protein E6 và E7 được biểu hiện, tế
bào phân chia mạnh mẽ mang theo ADN của virus [10]. Sau đó, protein E1 và
E2 đóng vai trò duy trì ADN của virus như thể bổ sung (episome), tạo thuận
lợi cho sự phân chia của hệ gene trong suốt quá trình phân bào [11]. Protein
6
E1, E2, E6, E7 được biểu hiện sớm trong quá trình virus nhân lên để đảm bảo
duy trì thể bổ sung với số bản copy bộ gen ít [12]. Khi tế bào mang virus phát
triển đến lớp thượng bì, protein L1 được biểu hiện cùng với L2 hình thành
capsid của virus và tại thời điểm đó, tế bào biểu mô bong sẽ mang theo virus

bắt đầu quá trình lây nhiễm [13].
Hơn nữa, cơ chế phân tử của gene gây ung thư bởi HPV 16 được Ishiji
T mô tả và nhấn mạnh đến vai trò biến nạp của gen E6 và E7. E6 và E7 được
sao chép từ promoter P97. P97 lại được điều hòa bởi sự tương tác phức hợp
giữa yếu tố đa chiều và sản phẩm E2 của tế bào virus. Phá vỡ cấu trúc E2 dẫn
đến biểu hiện quá mức E6 và E7. Protein p53 đóng vai trò như protein điều
hòa phát triển tế bào, có nghĩa sau khoảng 30- 50 lần phân bào, thể mút
telomere ngắn đi, làm cho nhiễm sắc thể co dúm lại, tế bào đi vào chu trình
chết có lập trình (opoprosis). Khi protein E6 gắn vào và giáng hóa protein
p53, tế bào thoát khỏi quá trình opoprosis, liên tục phân chia, đó là cơ sở hình
thành u. Protein Rb (riboblastoma) tham gia quá trình sửa chữa ADN trong
giai đoạn nghỉ G1 và G2 của quá trình phân bào. Nhưng, protein E7 làm thay
đổi hình thái và ức chế protein Rb, khiến cho ADN bị tổn thương không được
sửa chữa tiếp tục nhân lên không ngừng mà không có sự kiểm soát của
protein p53 [14] [15]. Đột biến gene p53 và Rb ở những bệnh nhân HPV âm
tính và không có dòng tế bào ung thư cổ tử cung do HPV. Như vậy vai trò bất
hoạt pRb và p53 của E6 và E7 rất quan trọng trong gene ung thư CTC [16].
Chính quá trình vô hiệu hóa protein ức chế khối u, protein E6 và E7 đã
đưa tế bào thoát khỏi chu trình chết có chương trình (optoprosis), tiếp tục
phân chia không kiểm soát. Đó là cơ sở của quá trình hình thành u.
7
Hình 2: Mô hình sự tiến triển của tổn thương CTC do HPV
1.3. Ung thư cổ tử cung
Ung thư CTC thường gặp ở lứa tuổi 35-55, triệu chứng hay gặp là ra
máu bất thường, ra máu sau giao hợp hay ra máu sau mãn kinh. Ở giai đoạn
muộn thì khí hư có lẫn máu, mủ hay mùi hôi. Khi đặt mỏ vịt quan sát có thể
thấy dạng sùi như hoa súp lơ, bở, dễ chảy máu [17].
Ung thư CTC thường xuất hiện ở vùng ranh giới vảy trụ, khoảng 90-
95% trường hợp là ung thư vảy, 5-10% là ung thư biểu mô tuyến [18]. Theo
phân loại mô học của Tổ chức y tế thế giới năm 2003[19], ung thư CTC được

chia như sau:
- Ung thư biểu mô vảy:
+ Ung thư biểu mô tế bào vảy không cần ghi chú thêm.
+ Ung thư biểu mô tế bào vảy vi xâm nhập.
8
- Ung thư biểu mô tuyến:
+ Ung thư biểu mô tuyến.
+ Ung thư biểu mô tuyến vi xâm nhập.
+ Ung thư biểu mô tuyến tại chỗ.
-Các tổn thương tiền ung thư:
+ Ung thư biểu mô vảy tại chỗ.
+ CIN III.
Tỷ lệ mắc và tử vong do ung thư CTC có xu hướng giảm dần ở các
nước phát triển nhờ các thành tựu đạt được trong phòng bệnh, phát hiện bệnh
sớm, cải thiện chất lượng chẩn đoán và điều trị, trong khi đó các tỷ lệ này lại
có xu hướng gia tăng ở các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam. Do
hầu hết phụ nữ ở các nước đang phát triển không được tiếp cận với các
chương trình y tế khám sàng lọc và điều trị. Việt Nam với 30.77 triệu phụ nữ
trên 15 tuổi trong độ tuổi nguy cơ mắc ung thư CTC, ước tính mỗi năm có
khoảng 5174 phụ nữ được chẩn đoán ung thư CTC và khoảng 2472 người
chết vì ung thư CTC. Ung thư CTC đứng thứ hai trong số các bệnh ung thư ở
phụ nữ và đứng đầu trong số ung thư ở phụ nữ từ 15-40 tuổi.
Tỷ lệ ung thư CTC ngày một gia tăng [20].
1.4. Các phương pháp phát hiện HPV
1.4.1. Phương pháp xét nghiệm tế bào âm đạo CTC (PAP).
Phát hiện HPV dựa trên xét nghiệm tế bào âm đạo, CTC (PAP) có thể
được coi là một phương pháp phát hiện HPV ra đời sớm nhất. Nguyên lý của
phương pháp này là khi HPV xâm nhập vào các tế bào vảy của CTC sẽ làm
biến đổi chúng với một số hình ảnh đặc trưng: Tế bào bóng (tế bào rỗng,
Koilocyte) và/hoặc tế bào loạn sừng và/hoặc đại bào. Về nguyên tắc, những

hình ảnh biến đổi này của các tế bào bị nhiễm HPV sẽ dễ dàng được nhận thấy
dưới kính hiển vi quang học khi các phiến đồ tế bào CTC được nhuộm bằng
các phẩm nhuộm Papanicolaou (PAP), Giemsa hay Hematoxxylin- Eosin. Đây
9
l phng phỏp phỏt hin HPV rt r tin, d lm do k thut n gin, d lp
li song cú nhc im nhy thp, ph thuc vo kh nng, trỡnh ngi
c tiờu bn [21].
1.4.2. Phng phỏp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phản ứng khuếch đại chuỗi PCR l phản ứng dây chuyền nhờ
polymerase do Kary Mullis phát minh năm 1983. Thực chất đây là một phơng
pháp nhân bản ADN in vitro, nghĩa là cũng nhằm mục đích thu nhận một lợng
lớn bản sao của một trình tự xác định vi chớnh xỏc cao.
Cơ sở của phơng pháp PCR là dựa vào đặc tính hoạt động của các ADN
polymerase: chúng chỉ có khả năng tổng hợp một mạch mới từ một mồi (là 1
trình tự ADN ngắn) đã bắt cặp sẵn với khuôn. Trong thực nghiệm, mồi là
những oligonuccleotide với chiều dài tối u là 15 25 base có khả năng bắt
cặp bổ sung với một đầu của khuôn và enzyme chu nhit ADN polymerase sẽ
nối dài mồi để hình thành mạch mới. Các đoạn ADN mới lại đợc sử dụng làm
khuôn, sau một chu kỳ thì số lợng đoạn ADN đợc nhân lên theo cấp số nhân.
Một gen trong một thời gian ngắn có thể đợc nhân lên hàng triệu lần.
Các giai đoạn cơ bản trong một chu kỳ của phản ứng PCR gồm:
+ Biến tính ADN: là giai đoạn hình thành đoạn ADN sợi đơn đóng vai
trò làm khuôn, giai đoạn này cần nhiệt độ từ 94
0
C đến 95
0
C, thời gian kéo dài
từ 30 giây đến 1 phút.
+ Bắt cặp: Là giai đoạn để mồi bắt cặp với khuôn, cần nhiệt độ từ 40
0

C
- 70
0
C, phụ thuộc vào độ dài và tỷ lệ G + C của mỗi mồi, thời gian kéo dài từ
30 giây đến vài phút.
+ Tổng hợp: Là giai đoạn ADN polymerase (Taq polymerase) sẽ tổng
hợp sợi ADN mới trên khuôn, thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Phng phỏp PCR c hiu theo nhúm (group-specific PCR)
Phng phỏp khỏc phỏt hin ADN ca HPV trong bnh phm bng
phng phỏp PCR da trờn s nhõn lờn ca chui ADN ca HPV vi mi
10
nucleotide đặc hiệu để tạo ra số lượng lớn sản phẩm ADN virút. Có nhiều mồi
đặc hiệu khác nhau cho phản ứng khuếch đại ADN HPV bằng phương pháp
PCR. Sau đó, các genotype HPV sẽ được phát hiện bằng phản ứng lai giữa
sản phẩm ADN đã được khuếch đại với mồi đặc hiệu cho từng genotype. Sản
phẩm được tạo ra có thể phát hiện bằng phương pháp trên giếng, điện di trên
gel hoặc bằng Southern-blot, dot-blot. Do PCR là xét nghiệm có độ nhạy nên
trong quá trình thực hiện cần kiểm soát hiện tượng tạp nhiễm, độ tinh sạch
của sản phẩm. Về lý thuyết, PCR có thể phát hiện được 1 đoạn gen sao chép,
nhưng trên thực tế có thể phát hiện 10 – 100 ng/µl của ADN, tương đương 10
– 100 đoạn gen sao chép. Kỹ thuật PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhưng
phức tạp hơn và cần nhiều bước hơn phương pháp lai bắt giữ.
Các mồi sử dụng trong phản ứng PCR thường để khuếch đại vùng gen
L1 HPV. Cặp mồi được sử dụng nhiều nhất là GPMY09/GPMY11 khuếch đại
450 bp trên đoạn L1 ORF và cặp mồi GP5+/GP6+ khuếch đại 140 bp vùng
L1. Đây là hai loại mồi có độ nhạy cao, có thể khuếch đại từ 10-200 bản copy
ADN. Khi so sánh giữa 2 loại cặp mồi trên, GPMY09/GPMY11 có thể xác
định sai lệch 7% UTCTC do sự vắng mặt của HPV ADN trong tế bào ung thư
và sản phẩm PCR sản phẩm HPV ADN đã bị đứt gãy và làm mất vùng L1
ORF trong tế bào ung thư. Trong phản ứng PCR lồng (nested PCR), nghiên

cứu có thể sử dụng cả hai loại mồi GPMY09/GPMY11 và GP5+/GP6+ sẽ cho
phản ứng có độ nhạy cao hơn.
Hiện nay, phương pháp PCR còn sử dụng loại cặp mồi mới ký hiệu là
SPF10 nhằm khuếch đại 65-bp trên vùng L1 ORF. Loại mồi này có độ đặc
hiệu rất cao và thực hiện được hầu hết các loại bệnh phẩm, kể cả những bệnh
phẩm đã có định bằng formalin. Với các loại mồi khác, phản ứng PCR khó
thành công với sản phẩm dài với ADN khuôn kém chất lượng, đặc biệt là
11
ADN tỏch t mu c nh trong formalin. Do ú, SPF10 cú li th hn khi
sng lc HPV trờn cỏc loi bnh phm khỏc nhau .
Phng phỏp PCR c hiu theo type (type-specific PCR)
Phng phỏp PCR c hiu theo type l phng phỏp PCR phỏt hin
riờng cho tng type HPV khỏc nhau. Vic xỏc nh cỏc type riờng bit ca
HPV da vo s khỏc nhau trờn vựng gen E6 v E7. Hai oncogen ny quyt
nh kh nng gõy bnh ca HPV.
Hin nay, ó cú khong 14 cp mi c hiu cho 14 genotype HPV
nhúm nguy c cao da trờn kh nng khuch i 100 bp trờn vựng gen E7
HPV. Cỏc genotype HPV cú cp mi c hiu c phỏt hin l HPV 16, 18,
31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68.
Phng phỏp PCR c hiu theo type cú nhy rt cao, cú th phỏt hin
vi 0,005 0,01ng ADN HPV/àl, tin hnh nhanh v xỏc nh c a nhim.
1.4.3. Phng phỏp real-time PCR
õy l phng phỏp cho phộp khuch i v xỏc nh s lng c
to ra trong tng chu k nhit. Sau mi chu k nhit, s lng cỏc bn sao
ADN c tng hp tng lờn s cho tớn hiu phỏt quang t l thun. Da vo
mt gam mu chun cú s lng ADN ớch xỏc nh tin hnh ng thi cựng
mu th để xây dựng một đờng chuẩn dựa trên số liệu bản sao ADN đích và
giá trị Ct của từng mẫu tơng ứng (Ct là thời điểm ở chu kỳ n của PCR cho tín
hiệu huỳnh quang tăng vọt so với tín hiệu nền). Nếu số lợng ADN bản đích
càng lớn thì Ct càng nhỏ. Có nhiều phơng pháp sử dụng phép phát quang để

xác định số lợng bản sao ADN đợc nhân lên. Thông thờng ngời ta thờng dùng:
SYBR Green 1 hoặc mẫu dò đặc hiệu.
Cỏc phng phỏp PCR thụng thng ch ỏnh giỏ nh tớnh m khụng
ỏnh giỏ nh lng vi rỳt. Phng phỏp real-time PCR thc hin nhanh, phự
12
hợp, không đắt, và định lượng được sản phẩm ADN và ARN. Real-time PCR
hoặc PCR sao chép ngược (reverse transcriptase-PCR, RT-PCR) có thể phát
hiện mức độ nhân lên của ADN dựa trên mức độ chất chỉ thị mầu được giải
phóng sau khi sản phẩm ADN được khuếch đại. Phương pháp này có thể phát
hiện được 10.000 chuỗi gen sao chép/phản ứng (khoảng 100 tế bào bị nhiễm).
Việc xác định số lượng vi rút cho phép xác định được mARN đánh giá
sự hoạt động của gen E6 và E7. Khi 2 vùng gen này hoạt động sẽ gây ra
những biến đổi cũng như cho các sản phẩm của các vùng gen này. Đây là
phương pháp có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 70%.
1.5. Một số yếu tố nguy cơ nhiễm HPV và ung thư CTC.
- Tuổi: Ung thư CTC thường gặp ở lứa tuổi 35-55, tuổi càng tăng thì tỉ
lệ nhiễm HPV sinh dục càng giảm. Nhiễm HPV cao nhất ở độ tuổi 15-25, sau
đó giảm dần khi tuổi tăng lên và ổn định sau 40 tuổi. Tuy nhiên ở một số quần
thể nghiên cứu có nguy cơ ung thư CTC cao, có thêm một đỉnh gia tăng tỷ lệ
nhiễm HPV ở phụ nữ hậu mãn kinh [21].
- Nhóm HPV nguy cơ cao, đặc biệt là các typ HPV 16, HPV 18 là hai
typ có khả năng sinh ung thư cao nhất.
- Hành vi quan hệ tình dục: nhiều bạn tình, bạn tình bị nhiễm HPV, các
bệnh lây truyền qua đường tình dục (HIV, Chlamydia, Neisseria,
Trichomonas, Herpes simplex virus typ 2…) làm tăng nguy cơ nhiễm HPV và
ung thư CTC [22], [23].
- Biện pháp tránh thai: theo nghiên cứu của Moreno năm 2002 cho thấy
nguy cơ ung thư CTC tại chỗ và xâm lấn tăng lên ở các phụ nữ nhiễm HPV
uống thuốc tránh thai liên tục trên 4 năm [24]. Kết quả nghiên cứu của Trần
Thị Lợi cho thấy những cặp vợ chồng sử dụng bao cao su tránh thai thường

xuyên có khả năng bảo vệ khỏi nhiễm HPV khoảng 2 lần so với những người
không sử dụng hoặc sử dụng không thường xuyên[3].
13
- Số lần sinh con: theo nghiên cứu của Munoz và cộng sự năm 2002 cho
thấy nguy cơ ung thư CTC tăng lên 3,8 lần ở những phụ nữ mang thai đủ
tháng từ 7 lần trở lên[9].
- Tình trạng miễn dịch: dễ bị nhiễm HPV đối với những người có HIV
(+), có thai, tiểu đường, người được ghép mô, điều trị Corticoids [24].
Phụ nữ hút thuốc lá hay cả hai vợ chồng cùng hút thì có nguy cơ nhiễm
HPV cao gấp 3 lần những phụ nữ hoàn toàn không tiếp xúc với khói thuốc[3].
1.6. Một số nghiên cứu trong nước và trên thế giới
Theo thống kê của trung tâm kiểm soát và phòng chống bệnh tật (CDC)
Hoa Kỳ, HPV là thủ phạm của hầu hết các trường hợp ung thư CTC (99%),
40% ung thư âm hộ, 90% ung thư âm đạo [25].
Theo nghiên cứu của Wu Y và cộng sự, 92.8% trường hợp nhiễm HPV
trong 223 bệnh phẩm ung thư CTC tại Trung Quốc. Trong đó HPV 16 chiếm
70.4% [26].
Từ những năm 1995, kết quả nghiên cứu 1000 mẫu bệnh phẩm
UTCTC ở 32 bệnh viện của 22 quốc gia trên thế giới của F. Xavier Bosch cho
thấy 93% mẫu bệnh phẩm có HPV dương tính, trong đó HPV 16 dương tính
50%, HPV 18 dương tính 14%, HPV 45 dương tính 8% và HPV 31 dương
tính 5%. [21].
Nghiên cứu trên 77 mẫu sinh thiết loạn sản cổ tử cung và ung thư tiết
niệu sinh dục của phụ nữ phía Tây Australia, HPV dương tính tại 43 trên 54 ca
ung thư xâm lấn. Trong đó, 24 trường hợp nhiễm HPV type 16, 5 trường hợp
nhiễm HPV 11 và chỉ có 1 trường hợp nhiễm HPV 18; 6 trường hợp ung thư tế
bào vảy đồng nhiễm HPV 11 và 16, 2 trường hợp đồng nhiễm HPV 16 và 18.
HPV 16 liên quan chặt chẽ với loạn sản nặng và ung thư cổ tử cung [23].
14
Theo nghiên cứu của Phạm Việt Thanh ở 488 trường hợp có kết quả tế

bào âm đạo, CTC bất thường tại bệnh viện Từ Dũ cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV
là 62.1%. Trong đó nhiễm HPV typ nguy cơ cao là 71.3% và nguy cơ thấp là
14.2%. Tỷ lệ nhiễm HPV tăng theo mức độ tổn thương CTC trên xét nghiệm
tế bào CTC [27].
Nghiên cứu của Lê Trung Thọ và cộng sự trên 1500 phụ nữ trong độ
tuổi 18-69 tại thành phố Hà Nội cho biết tỷ lệ nhiễm HPV trong cộng đồng là
5.13%. Trong đó nhóm nguy cơ cao chiếm 68.95% (hay gặp theo thứ tự là 18,
58, 16), nhóm nguy cơ thấp chiếm tỷ lệ 27.27% [28].
Năm 2005, nghiên cứu khảo sát tỷ lệ nhiễm HPV qua phiến đồ tế bào
CTC của 300 phụ nữ khám phụ khoa tại bệnh viện nhân dân Gia Định của
Trần Thị Lợi và Nguyễn Thị Mỹ Phượng cho thấy, tỷ lệ nhiễm HPV trong số
phụ nữ đến khám là 10.3% và trong nhóm có phiến đồ tế bào CTC bất thường
là 86.1%[29].
Trong nghiên cứu 106 trường hợp có tổn thương tế bào CTC từ
ASCUS trở lên của Vũ Thị Nhung, tỷ lệ nhiễm HPV là 73.6%. Bệnh nhân
đồng nhiễm type nguy cơ cao và nguy cơ thấp là 10.4%. Trong số các type
nguy cơ thấp, type 11 chiếm tỷ lệ cao nhất, type 16 chiếm tỷ lệ cao nhất trong
các type nguy cơ cao[30].
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
2.1. Đối tượng nghiên cứu:
- Các bệnh nhân ung thư cổ tử cung đến khám và điều trị tại bệnh viện
K Trung ương từ 1/7/2013-1/3/2014.
15
- Các thông tin được thu thập qua bộ câu hỏi phỏng vấn được thiết kế sẵn.
2.2. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân
- Các bệnh nhân khám sinh thiết CTC, xác định ung thư CTC bằng xét
nghiệm giải phẫu bệnh.
- Các bệnh nhân ung thư CTC được chỉ định điều trị phẫu thuật.
- Loại trừ những bệnh nhân ung thư CTC giai đoạn muộn phải điều trị

xạ trị.
Những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đồng ý làm xét nghiệm PCR xác định
HPV-AND và tham gia nghiên cứu.
2.3. Địa điểm nghiên cứu
- Bệnh viên K trung ương: Thu thập bệnh phẩm, thông tin phỏng vấn
bệnh nhân, kết quả xét nghiệm mô bệnh học của khoa GPB bệnh viện K
Trung ương.
- Các xét nghiệm xác định HPV-ADN và các genotype HPV được thực
hiện tại trường Đại học Kanazawa, Nhật Bản.
2.4. Vật liệu nghiên cứu:
- Các dụng cụ pippet, typ eppendof, cryotype, đầu typ các loại.
- PCR mix, primers GP5+/GP6 modified.
- Kít giải trình tự gen: Big Dye terminator (Applied biosystems)
- Máy ly tâm thường, ly tâm lạnh, tủ cấy vô trùng Bioclass II, tủ lạnh
bảo quản mẫu, cân điện tử, máy Vortex, máy Spidow, Block nhiệt.
- Máy quang phổ kế, tủ ấm. Hệ thống máy PCR.
- Hệ thống máy điện di Gel-XL Ultra V2 và chụp ảnh gel UPV.
- Hệ thống máy giải trình tự gen ABI PRISM
®
3130 Genetic Analyzer
2.5. Phương pháp nghiên cứu
16
Nghiên cứu mô tả cắt ngang nhằm xác định tỷ lệ nhiễm một số HPV
trên các bệnh nhân ung thư cổ tử cung.
Cách lấy mẫu: mẫu nghiên cứu được chọn trên cơ sở lấy mẫu có chủ
đích. Các mẫu nghiên cứu được thu thập liên tục cho đến khi đáp ứng đủ cỡ
mẫu nghiên cứu. Cỡ mẫu ước tính khoảng 200 mẫu.
Qui trình chấp thuận tham gia nghiên cứu và thu thập mẫu
- Cung cấp thông tin về nghiên cứu cho đối tượng nghiên cứu (Giới thiệu
về đề tài nghiên cứu, mục đích của nghiên cứu, giới thiệu về người nghiên

cứu, qui trình thực hiện nghiên cứu, những rủi ro có thể xảy ra, lợi ích của
người tham gia nghiên cứu, đảm bảo tính bí mật của người nghiên cứu, nghĩa
vụ của người tham gia nghiên cứu, sự tình nguyện tham gia hoặc rút ra khỏi
nghiên cứu).
- Lấy chấp thuận nghiên cứu.
- Phỏng vấn toàn bộ đối tượng nghiên cứu theo mẫu câu hỏi soạn sẵn.
17
TÓM TẮT QUI TRÌNH LẤY VÀ BẢO QUẢN BỆNH PHẨM
TẠI BV K TRUNG ƯƠNG
- Dùng ống ependof đã có 500µl dd
formaldehyd
- Ghi họ tên, ngày tháng năm sinh,
ngày lấy, loại mô
- Gửi lên khoa giải phẫu bệnh trong
ngày.
- Dùng cryotyp nắp vặn
- Ghi họ tên, ngày tháng
năm sinh, ngày lấy, loại mô
- Thả ngay vào bình nitơ
lỏng
2.5. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
2.5.1. Tách ADN của virus
Các mẫu mô bệnh học cổ tử cung sau sinh thiết được tiến hành tách chiết
ADN tổng số bằng kit Smitest EX-R&D (Genome science laboratories,
Fukushima, Japan).
Qui tr×nh nh sau:
1. Enzym Solution (I) 15l
Pricipitation (IV) 5l
Specimen Dilution (II) 380l
2. Huyền dịch mô K của bÖnh nh©n 100l

L¾c 20 lÇn/ñ 55
O
C/30 phót
Bệnh nhân đến khám và điều trị bệnh
Mô sinh thiết, mô phẫu thuật
2 Mẫu tươi
2 Mẫu đúcparafin Phỏng vấn bệnh

18
3. Protein Dissolvent (III) 250l
Lắc 10 lần/ủ 55
O
C/20 phút
4. Iso-propanol 600l
Lắc 10 lần/Đặt typ trong nớc đá nghiền/20 phút
5. Ly tâm 20.000 vòng/phút/4
O
C/10 phút.
Cẩn thận loại bỏ phần nớc nổi.
6. Thêm Ethanol 70% 500l
Lắc 20 lần/ly tâm 20.000 vòng/phút/ 4
O
C/3 phút
Cẩn thận loại bỏ phần nớc nổi.
7. Nhắc lại bớc 6 thêm một lần. Để khô phần cặn ở đáy typ.
8. Hoà tan phần cặn đã khô (ADN) với 30l nớc cất siêu sạch.
ADN này đợc làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR. ADN khuôn đợc bảo
quản trong tủ -80
0
C cho đến thời điểm tiến hành phản ứng.

2.5.2. Chy PCR khuch i vựng gen L1: Dựng k thut Realtime-PCR
khuych i vựng gen L1 ca HPV vi cp mi GP5+/GP6+ modifile vi chu
k nhit ó c chun húa.
2.5.3. K thut Dot-blot xỏc nh nhim v tỡnh trng ng nhim nhiu
genotype ca HPV
Sn phm PCR sau khuch i c chuyn trc tip sang mng v lai
húa trc tip vi u dũ c hiu. K thut ny khụng phi qua giai on in
di trờn gel v khụng qua giai on chuyn mng. Phng phỏp ny cho phộp
xỏc nh 10
5
10
6
bn ADN sao chộp ca HPV. Trong quỏ trỡnh lai ngc,
ADN c ỏnh du v c s dng nh mu dũ lai trờn mng cú nhit
cao.
19
2.5.4. Giải trình tự trực tiếp và sau clone với một số chủng khó xác định
được genotype và đồng nhiễm bằng kỹ thuật Dot-blot: Bằng kit Big Dye
terminator (Applied biosystems) trên máy phân tích trình tự ABI
PRISM
®
3130 Genetic Analyzer.
+ Khuếch đại ADN bằng các dideoxynucleotid đã đánh dấu huỳnh
quang. Seq-mix: (12µl DW; 3,5µl 5X buffer; 1,0µl BigDye; 1,5µl Primer
F/R), sản phẩm PCR: 2,0µl. Chu trình nhiệt: (96
o
C/10 giây; 50
o
C/5 giây;
60

o
C/4 phút) lặp 25 chu kỳ; 4
o
C/ dừng phản ứng.
+ Tinh sạch sản phẩm
• Bổ xung 2 µl dung dịch 125mM EDTA pH 8; 0, 2 µl dung dịch NaOAc và
50 µl Ethanol 99% vào mỗi ống chứa 20 µl sản phẩm ở phản ứng trên.
• Votex và để ở nhiệt độ phòng 15 phút.
• Ly tâm 14.000 vòng trong 20 phút, hút bỏ dịch nổi.
• Bổ xung 70 µl dung dịch Ethanol 70%, lắc đều.
• Ly tâm 14.000 vòng trong 10 phút, hút bỏ dịch nổi.
• Để khô AND ở nhiệt độ phòng trong buồng tối.
• Cho 25 µl Hi-Di formanide, votex.
• Biến tính trên máy ủ nhiệt 95
o
C trong 2 phút rồi cắm nhanh trên đá 15 phút.
• Đưa mẫu vào máy xác định trình tự tự động ABI 3100.
TÓM TẮT QUI TRÌNH XẾT NGHIỆM XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM
VÀ ĐỒNG NHIỄM CÁC GENOTYPE CỦA HPV
Bệnh phẩm
Tách ADN
Thực hiện phản ứng
Realtime PCR
Giải phẫu bệnh
Dot-blot xác định nhiễm và tình trạng
đồng nhiễm nhiều genotype của HPV
Giải trình tự trực tiếp và sau clone với
một số chủng khó xác định được genotype
và đồng nhiễm bằng kỹ thuật Dot-blot
20

2.6. Phân tích số liệu
- Sử dụng phương pháp thống kê y sinh học.
- Phân tích các kết quả thu được theo chương trình SPSS 16.0.
- Test 

và Fisher’s Exact Test được sử dụng để so sánh các kết quả.
- Sử dụng thuật toán OR để đánh giá mối liên quan giữa các yếu tố nguy cơ.
2.7. Đạo đức trong nghiên cứu
- Nghiên cứu được thực hiện với sự đồng ý của bệnh nhân.
- Người bệnh được tư vấn, theo dõi miễn phí.
- Các thông tin nghiên cứu được giữ bí mật cho bệnh nhân.
21
- Những bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu không bị phân
biệt trong chẩn đoán và điều trị.
- Nghiên cứu được Hội đồng xét duyệt đề cương cho phép.
22
CHƯƠNG 3
DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tỷ lệ nhiễm HPV chung ở đối tượng nghiên cứu.
Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm HPV ở bệnh nhân có tổn thương ung thư CTC
HPV ADN Bệnh nhân (n) Tỷ lệ phần trăm (%)
+
_
Tổng
Bảng 3.2. Tỷ lệ đồng nhiễm nhiều type HPV ở mô ung thư CTC.
HPV-ADN Bệnh nhân (n) Tỷ lệ phần trăm (%)
1 type
2 type
3 type
4 type

5 type
Tổng
23
Bảng 3.3. Tỷ lệ đồng nhiễm các type HPV nguy cơ cao và thấp ở mô ung
thư CTC
HPV-AND Bệnh nhân (n) Tỷ lệ phần trăm (%)
Type nguy cơ cao
Type nguy cơ thấp
3.2. Các yếu tố liên quan đến tỷ lệ nhiễm HPV trên các đối tượng
Bảng 3.4. Tỷ lệ nhiễm HPV theo địa dư
Địa dư HPV ADN (+) HPV ADN (-)
n % n %
Thành thị
Nông thôn
Bảng 3.5. Tỷ lệ nhiễm HPV theo nghề nghiệp
Nghề nghiệp
HPV ADN (+) HPV ADN (-)
n % n %
CNVC
Nội trợ
Làm ruộng
Buôn bán
Khác
Tổng
Bảng 3.6. Tỷ lệ nhiễm HPV theo trình độ học vấn
TĐ học vấn
HPV ADN (+) HPV ADN (-)
n % n %
Không biết chữ
Tiểu học

Cấp 2
24
Cấp 3
TC-CĐ
ĐH-SĐH
Tổng
Bảng 3.7. Tỷ lệ nhiễm HPV theo số lần sinh con.
Số lần sinh
HPV ADN (+) HPV ADN (-)
n % n %
<3
≥3
Tổng
Bảng 3.8. Tỷ lệ nhiễm HPV theo số bạn tình.
Số bạn tình HPV ADN (+) HPV ADN (-)
Vợ
1 n % n %
≥2
Tổng
Chồng 1 n % n %
≥2
Tổng
Bảng 3.9. Tỷ lệ nhiễm HPV theo các bệnh
Bệnh
HPV ADN (+) HPV ADN (-)
n % n %
Viêm phụ khoa
STD
HIV
Viêm gan VR

Tổng
Bảng 3.10. Tỷ lệ nhiễm HPV theo biện pháp tránh thai.
Biện pháp
HPV ADN (+) HPV ADN (-)
n % n %
25
Thuốc TT
TT tự nhiên
Thắt vòi trứng
DCTC
BCS
Tổng