NHÂN GIỐNG vô TÍNH IN VITRO ở THỰC vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC-ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

BI TIU LUN
NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO
Ở THỰC VẬT
-Thái Nguyên, 9/2014-MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
Trước nhu cầu trồng trọt bằng các cây giống ngày càng lớn trong giai đoạn
hiện nay, việc nhân nhanh và đưa ra thị trường một số lượng lớn những cây giống
khỏe mạnh ngày càng trở nên cấp thiết. Một trong những giải pháp được đưa ra là
áp dụng phương pháp nhân giống vô tính in vitro, đây là một phương pháp nhân
giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm. Trong phương pháp này,
những bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ được sinh trưởng ở điều
kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc các loại bình nuôi cấy khác có bổ sung
thành phần dinh dưỡng phù hợp để phát triển thành một cây hoàn chỉnh. Với
những ưu điểm vượt trội của phương pháp nhân giống vô tính in vitro như: có thể
tạo ra được nguồn cây giống sạch bệnh trong thời gian ngắn, đồng đều về phẩm
chất và giữ được các đặc tính quý của nguyên liệu ban đầu,…mà kỹ thuật này đã
được ứng dụng rộng rãi để nhân giống nhiều loại cây trồng khác nhau như chuối,
dứa, khoai tây, lan, Ngoài ra, phương pháp này không phụ thuộc vào điều kiện
tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm. Áp dụng phương pháp nhân giống vô
tính in vitro đã, đang và sẽ là hướng đi để hiệu quả góp phần phát triển nền nông
nghiệp trồng trọt ở nước ta. Nhằm tìm hiểu về phương pháp nhân giống vô tính in
vitro trên đối tượng thực vật, em đã thực hiện bài tiểu luận: “Nhân giống vô tính in
vitro ở thực vật”. Trong quá trình thực hiện bài tiểu luận em không tránh khỏi
những sai sót, rất mong sẽ nhận được sự bổ sung, đóng góp ý kiến của thầy giáo để
bài tiểu luận của em được hoàn thiện.
Em xin chân thành cảm ơn!.
I. Lịch sử phát triển của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Năm 1902, Harberland là người đầu tiên đã quan niệm bất kỳ một tế bào nào

của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể
hoàn chỉnh.
Năm 1924, Kotte và Robbin đã nuôi cấy đỉnh sinh trưởng rễ của một loại cây
hòa thảo và đã thu được một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ nhưng chỉ duy trì được trong
thời gian ngắn
Năm 1930 White phát hiện Auxin
Năm 1934, White thành công trong việc duy trì mô rễ cây cà chua trong môi
trường dịch thể có chứa muối khoáng, đường saccarose và dịch chiết nấm men.
Năm 1939, Gautheret đã duy trì được sinh trưởng của mô sẹo cà rốt trong một
thời gian dài.
Năm 1941, Van Overbeek và cộng sự phát hiện nước dừa có ảnh hưởng tích
cực đến sự phát sinh phôi và tạo mô sẹo ở cây họ cà.
Năm 1954, Skoog bổ sung chế phẩm DNA chiết từ tinh dịch cá bẹ vào môi
trường nuôi cấy mô thân cây thuốc lá.
Năm 1957, Skoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ
kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự phát sinh hình thái của mô sẹo
cây thuốc lá.
Năm 1964, Guha và Maheswari phát hiện được cấu trúc giống phôi khi nuôi
cấy bao phấn ở cây cà độc dược.
Bắt đầu từ những năm 1960, Morel nhận thấy protocorm của cây địa lan khi
nuôi cấy đã hình thành nên các protocorm khác. Nếu trong môi trường thích hợp
thì các protocorm đó có thể phát triển thành cây con. Sự kiện này mở ra một hướng
mới cho nuôi cấy mô tế bào thực vật được ứng dụng rộng rãi để nhân giống và
phục hồi giống.
II. Mục đích của phương pháp nhân giống vô tính in vitro
Nhân giống vô tính in vitro là một trong bốn lĩnh vực ứng dụng chính của công
nghệ tế bào thực vật (bao gồm: làm sạch virus, nhân nhanh các giống cây trồng
quý, sản xuất và chuyển hóa sinh học các hợp chất tự nhiên và cải tạo về mặt di
truyền các giống cây trồng) và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất. Kỹ thuật
nhân nhanh giống cây trồng in vitro được ứng dụng trong nhân giống các cây

trồng nông nghiệp, lâm nghiệp nhằm phục vụ các mục đích sau:
Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác tạo
giống
Duy trì và nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống cho các
loại cây trồng khác nhau như: Cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây hoa,
cây cảnh, cây dược liệu
Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp
Bảo quản các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài cây giao phấn
trong ngân hàng gen
III. Ưu điểm, hạn chế của nhân giống vô tính in vitro
III.1. Ưu điểm
Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kỳ đều có thể tạo ra một
quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương
mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền
Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Từ 1 cây trong vòng 1 – 2 năm có thể
tạo thành hàng triệu cây
Sản phẩm cây giống đồng nhất: Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất
phát từ cây mẹ có kiểu gen đồng hợp hay dị hợp
Tiết kiệm không gian: Mật độ cây trên một đơn vị diện tích lớn hơn sản xuất
trên đồng ruộng và nhà kính theo phương pháp truyền thống
Nâng cao chất lượng cây giống: Để loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây
giống đã nhiễm bệnh. Cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng nên sạch bệnh, tăng
năng suất lên 15 – 30% so với giống gốc
Lợi thế về vận chuyển: Cây con kích thước nhỏ, có thể vận chuyển đi xa dễ
dàng và thuận lợi
Có tiềm năng công nghiệp hóa cao: Sản xuất cây giống theo một dây chuyền
sản xuất liên tục, bất kỳ thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ
Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác
nhau có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống như cây con in vitro (trong ống
nghiệm) hoặc trong bầu đất. Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay

là thân củ.
III.2. Hạn chế
Chi phí sản xuất cao: Đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo dẫn đến giá
sản phẩm cao so với các phương pháp truyền thống
Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: biến dị tế bào soma. Cây con
không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thấp ở giai đoạn đầu
nhân giống, tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích
sinh trưởng
Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Không phải tất cả các cây trồng hiện nay
đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống. Nhiều cây có giá trị kinh
tế hoặc quý hiếm vẫn chưa được nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc
bảo quản nguồn gen.
IV. Các phương thức nhân giống vô tính invitro
Phương pháp nhân giống vô tính in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân
giống vô tính cổ điển như: giâm cành, chiết, ghép,… một kỹ thuật tiến bộ. Sau
đây là một số phương thức nhân giống vô tính in vitro.
3.1.Nuôi cấy mô phân sinh hay đỉnh sinh trưởng
3.1.1. Đỉnh sinh trưởng
Mô phân sinh bao gồm các mô đỉnh chồi, đỉnh cành, đỉnh rễ có kích thước 0.1
– 1 cm tính từ chóp của đỉnh sinh trưởng. Mô phân sinh có một số đặc điểm sau:
Chứa các tế bào non trẻ, phân chia mạnh và sạch virus.
Mô phân sinh đỉnh chứa những tế bào đỉnh sinh trưởng và được bao bọc bởi
một lớp vỏ bề mặt có cấu tạo cutin hạn chế thấp nhất quá trình thoát nước, lớp
cutin này bao bọc cả chồi đỉnh
Mô phân sinh có sự phân hóa của những tế bào khởi sinh.Sự hình thành của
các cơ quan ở thực vật đều bắt đầu trong các mô phân sinh đỉnh
Mô phân sinh có thể tích tương đối ổn định. Các tế bào sinh ra từ tế bào khởi
sinh sau một vài lần phân chia sẽ rời khỏi mô phân sinh
Quá trình sinh trưởng của đỉnh sinh trưởng:
Bắt đầu là giai đoạn phôi sinh, trong các điểm sinh trưởng xảy ra sự hình

thành mầm cơ quan và sự phân chia đầu tiên của nó thành các mô riêng biệt. Sau
đó là giai đoạn dài ra do sự sinh trưởng nhanh chóng , mầm cơ quan đạt kích
thước tối đa và có hình dạng nhất định.
Kết thúc sự phân hóa tế bào, sự phân hóa gỗ sẽ bắt đầu. Thành tế bào không
có khả năng sinh trưởng, các u lồi dần được tạo thành gọi là u lá. Thể tích u lá
tăng lên nhanh và kéo theo một phần lớn của đỉnh sinh trưởng. Dần dần, u lồi
chuyển thành mầm lá, chúng phát triển nhanh theo chiêu dài. Sự sinh trưởng tiến
hành không đồng đều nên lá mầm cong dần lên phía đỉnh . Sau khi lá mới tách ra,
xảy ra sự phân chia tế bào kết quả là thể tích đỉnh sinh trưởng được phục hồi
nhanh chóng và sự hình thành lá lại bắt đầu.
Mô đỉnh sinh trưởng là mô duy nhất sạch virus, do đó đây là nguồn vật liệu
nuôi cấy mô tế bào được sử dụng trong tạo giống cây sạch bệnh. Do kích thước
quá nhỏ nên kỹ thuật nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng thường được tiến hành dưới
kính lúp hay bao gồm cả chồi đỉnh.
3.1.2. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Kết quả nuôi cấy đỉnh sinh trưởng phụ thuộc vào vật liệu khởi đầu, nguồn
gốc và kích thước của mẫu, điều kiện nuôi cấy, thời điểm lấy mẫu.
Để đạt hiệu quả cao, cần lấy mẫu nuôi cấy từ chồi đang sinh trưởng mạnh
hoặc chồi của cây mới ghép. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây non dễ dàng hơn cây
trưởng thành
Một số loài có ưu thế chồi đỉnh mạnh, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng từ chồi đỉnh
dễ dàng hơn chồi nách, đối với một số loài khác lại thu được kết quả ngược lại
Kích thước mẫu nuôi cấy càng lớn, tỷ lệ tái sinh và sống sót của mẫu càng
cao, tuy nhiên mẫu càng nhỏ khả năng sạch virus lại cao hơn. Do đó, kích thước
mẫu nuôi cấy cần phải xác định bằng thực nghiệm đối với mỗi loài. Mẫu nuôi cấy
nhỏ nhất chỉ có chóp sinh trưởng và 2 – 3 lá mầm là lí tưởng để tạo giống sạch
bệnh, tuy nhiên đôi khi kích thước mẫu lớn hơn vẫn đảm bảo sạch bệnh virus và
một số trường hợp lại đòi hỏi mẫu nhỏ hơn. Do gặp khó khăn lớn trong việc nuôi
thành công các mô phân sinh đỉnh riêng rẽ có kích thước nhỏ nên trong khuôn khổ
nhân giống invitro người ta thường nuôi cấy cả đỉnh chồi hoặc đỉnh sinh trưởng.

Phổ biến với các đối tượng như phong lan, dứa,…đỉnh sinh trưởng được tách với
kích thước từ 5 – 10 mm, nghĩa là toàn bộ mô phân sinh đỉnh và một phần mô
xung quanh
Tương quan giữa độ lớn của chồi nuôi cấy, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về
mặt di truyền của chồi được biểu hiện như sau: Nếu độ lớn tăng thì tỷ lệ sống và
tính ổn định tăng và ngược lại. Xét về hiệu quả kinh tế nuôi cấy (thể tích bình
nuôi, lượng dung dịch môi trường dinh dưỡng): Nếu độ lớn tăng thì hiệu quả kinh
tế giảm và ngược lại. Do đó, phải kết hợp được các yếu tố để tìm ra phương thức
lấy mẫu tối ưu
 Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo một hay nhiều chồi
và mỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh. Xét về nguồn gốc của các
cây đó có 3 khả năng sau:
− Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn)
− Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ
− Cây phát triển từ chồi mới phát sinh
 Các phương thức phát triển cây hoàn chỉnh
 Phát triển cây trực tiếp: Đối tượng là cây 2 lá mầm như: Khoai tây, thuốc lá, cam
chanh,…Ví dụ ở khoai tây: Đỉnh sinh trưởng  Chồi nách Cây
 Phát triển cây thông qua giai đoạn protocorm: Đối tượng là cây 1 lá mầm như:
Phong lan, dứa, huệ,…Đỉnh sinh trưởngProtocormCây hoàn chỉnh. Đỉnh sinh
trưởng tạo hàng loạt protocorm cùng một lúc, các protocorm này tiếp tục phân
chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh. Bằng phương
thức này, trong một thời gian ngắn có thể thu được hàng triệu cá thể. Ứng dụng
của phương thức này đã bắt đầu có kết quả trên các cây ăn quả và cây lâm nghiệp,
cây quý như: cà phê, táo, lê,… Vì rằng, các cây trồng rừng và các cây ăn quả là
những cây trồng lâu năm nên mọi chi phí ban đầu trong nhân giống invitro đều có
thể chấp nhận được.
3.2.Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây
Ở thực vật hầu hết các bộ phận có thể sử dụng để tái sinh cây hoàn chỉnh. Tùy
vào từng loại cây mà lựa chọn các bộ phận cho hệ số nhân giống cao.

Ưu điểm của các phương pháp này là nhanh chóng thu được cây, đồng nhất về
mặt di truyền. Bao gồm một số phương pháp nuôi cấy sau:
3.2.1. Nuôi cấy chồi bất định
Đỉnh chồi bất định mới có thể phát triển được hoặc trực tiếp trên mẫu vật
hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô callus này hình thành trên bề mặt vết cắt của
mẫu vật. Một số mẫu vật được dùng là: Đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, các bộ phận
của hoa, nhánh củ, đoạn mầm.
Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp bắt đầu bằng các tế bào nhu mô nằm ở
trong biểu bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân; một số tế bào này trở thành mô
phân sinh và các túi nhỏ gọi là thể phân sinh phát triển. Các thể phân sinh này rõ
ràng có nguồn gốc từ các tế bào đơn. Tuy nhiên, chiều hường phản ứng ở thực vật
cũng tùy thuộc vào nồng độ phytohoocmon
Sự phát triển của các chồi bất định gián tiếp đầu tiên qua giai đoạn hình thành
callus cơ sở từ các chồi được tách trong nuôi cấy. Các chồi sau đó phát triển từ
ngoại vi mô callus và không có quan hệ ban đầu với các mô có mạch dẫn của mẫu
vật
3.2.2. Nhân giống thông qua giai đoạn mô sẹo (callus )
Mô sẹo là một khối các tế bào phát sinh vô tổ chức có hình dạng không xác
định với các màu sắc khác nhau (vàng, trắng, xanh).
Nguyên liệu dùng tạo mô sẹo là các phần non của cây được nuôi cấy trên môi
trường giàu auxin và trong quá trình nuôi cấy mẫu phải để trong tối.
Khả năng tái sinh của tế bào mô sẹo phụ thuộc vào độ tuổi của mô sẹo, tế bào
callus khi cấy chuyển nhiều sẽ không ổn định về mặt di truyền. Do đó, sử dụng
callus sơ cấp hoặc cấy chuyển 1 – 2 lần để tái sinh cây thì thu được được cây tái
sinh đồng nhất.
Trong nhân giống thông qua giai đoạn mô sẹo, các loại môi trường được sử
dụng bao gồm: Môi trường tạo callus, môi trường nhân callus, môi trường tái sinh
chồi.
Ưu điểm của phương pháp nhân giống thông qua giai đoạn mô sẹo là hệ số
nhân giống thông qua giai đoạn mô sẹo lớn hơn hệ số nhân giống trực tiếp, đồng

thời thông qua giai đoạn callus còn có thể thu được những cá thể sạch virus.
3.2.3. Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính
Phôi vô tính là các cá thể nhân giống có cực tính bắt nguồn từ các tế bào
soma. Phôi vô tính giống phôi hữu tính ở hình thái, quá trình phát triển và sinh lý
nhưng không có quá trình tái tổ hợp di truyền giữa giao tử đực và cái, chúng có nội
dung di truyền giống hệt với các tế bào soma đã sinh ra chúng
Ở phôi hữu tính (có sự kết hợp giữa giao tử đực và giao tử cái để tạo thành
hợp tử) trải qua các bước phát sinh hình thái sau:
− Cây 1 lá mầm: Dạng cầu  dạng scutellar  dạng diệp tiêu
− Cây 2 lá mầm: Dạng cầu  dạng thủy lôi  dạng có lá mầm
Ở nhiều cây, người ta nhận thấy các tế bào đang phân chia vô tổ chức đã tạo
nên callus khi nuôi cấy. Có thể thay đổi hướng phát triển của chúng để tạo ra các
phôi vô tính với các bước phát sinh hình thái rất giống với trường hợp phôi hữu
tính: Callus  Phôi vô tính  Cây hoàn chỉnh.
Sự khác nhau cơ bản của phôi vô tính và phôi hữu tính là: Phôi hữu tính luôn
đi kèm với nội nhũ là cơ quan dự trữ năng lượng và chất dinh dưỡng phục vụ cho
quá trình nảy mầm, còn phôi vô tính không có nội nhũ.
Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô thực vật, ngoài các điều kiện vật
lý, hóa học thuận lợi cho sự tạo phôi còn phụ thuộc rất lớn vào loài, giống và dòng
trong cùng một loài.
3.2.4. Nhân giống trong các nồi phản ứng sinh học
Trên cơ sở các nồi phản ứng sinh học (hay nồi lên men), nhiều tác giả đã nhân
giống thành công nhiều loại phôi vô tính và các thể chồi, cụm chồi hoặc củ nhỏ.
 Hệ thống hình thành chồi
Sự hình thành chồi có tương quan với hàm lượng etylen và CO
2
. Khi 2 chất
này được phóng thích ra khỏi bình nuôi cấy thì quá trình biệt hóa bị ức chế. Trong
10 ngày đầu tiên C
2

H
4
và CO
2
ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa phù hợp với giai
đoạn tăng trưởng và phân chia tế bào dẫn đến sự hình thành vòm đỉnh sinh trưởng
Tỉ lệ tác động C
2
H
4
/CO
2
chỉ có hiệu quả khi có mặt của O
2
và CO
2
duy trì quá
trình trao đổi oxi hóa ở mô SF và NSF (SF: chồi mầm được nuôi cấy trên môi
trường không có BA, phát sinh chồi sau 3 ngày thì phân chia tế bào. NSF: chồi
mầm nuôi cấy trên môi trường có BA, sự hình thành chồi không xảy ra và không
phân chia tế bào)
Hình 3.1. Sơ đồ mẫu mô trực tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh (thông qua phương
thức tăng khả năng phát sinh chồi nách)
V. Quy trình nhân giống vô tính in vitro
Quy trình nhân giống vô tính in vitro được tiến hành thông qua 5 giai đoạn sau:
 Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc (3 – 6 tháng)
Để chuẩn bị nguồn vật liệu gốc cho quá trình nhân giống in vitro, cần lựa chọn các
nguồn vật liệu theo những chỉ tiêu sau:
 Chọn cây mẹ để lấy mẫu mang tính ưu việt, có giá trị kinh tế cao.
 Chọn cơ quan để lấy mẫu, có thể là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non

hoặc lá non.
 Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ
được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ và ổn định.
 Giai đoạn 2: Cấy gây (2 – 12 tháng)
Đầu tiên, cần khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị môi trường nuôi cấy.
Phương pháp khử trùng phải đảm bảo tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao. Các mẫu
vô trùng được cấy vào môi trường nhân tạo trong ống nghiệm hoặc bình nuôi.
Môi trường nuôi cấy cần được điều chỉnh một cách thích hợp giúp mẫu cấy có tốc
độ sinh trưởng nhanh.
Các mẫu nuôi cấy sau một thời gian nhất định, xuất hiện các cụm tế bào hoặc
cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính.
 Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi (10 – 36 tháng)
Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức
nhân nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích.
Thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu hóa như sau:
+ Phytohoocmon: Tăng cytokinin giảm auxin.
+ Tăng cường thời gian chiếu sáng khoảng 16 giờ/ngày, tối thiếu 1000 lux.
+ Đảm bảo chế độ nhiệt trong khoảng 20 – 30
o
C, những loài có nguồn gốc nhiệt
đới thì nhiệt độ nuôi cấy thích hợp khoảng 32 – 35
o
C.
Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi khoảng 1 – 2 tháng/lần, tùy loại
cây. Hệ số nhân nhanh là 2 – 8 lần/1 lần cấy chuyển.
 Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh (tạo rễ) (2 – 8 tuần)
Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát sinh rễ tự nhiên,
nhưng thông thường cần phải cấy chuyển sang 1 môi trường khác để kích thích tạo
rễ. Thành phần môi trường tạo rễ được bổ sung auxin . Chỉ tiêu sinh trưởng bao
gồm số lượng rễ, chiều dài,…

Huấn luyện cây thích nghi với các điều kiện tự nhiên: Làm cho cây in vitro
thay đổi dần các đặc điểm sinh lí và giải phẫu, thích nghi dần với các điều kiện tự
nhiên như: nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước
 Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng, vườn ươm (4 – 16 tuần)
Đây là giai đoạn đầu cây được chuyển từ điều kiện vô trùng trong phòng thí
nghiệm ra ngoài tự nhiên với những điều kiện khó khăn hơn nên vườn ươm phải
đáp ứng các yêu cầu sau:
Cây được che phủ bằng nilon, tưới phun sương đảm bảo cung cấp độ ẩm và
làm mát
Giá thể trồng cây có thể là đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa
đất, mùn cưa và bọt biển
Chỉ tiêu sinh trưởng: Kích thước, trọng lượng, hoàn thiện đặc điểm sinh lí và
giải phẫu.
Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi khoảng 2 – 3 tuần, thời gian này cây cần
được chăm sóc và bảo vệ tránh sự mất nước nhanh làm cây bị héo khô; cháy lá do
nắng; nhiễm vi khuẩn, nấm gây nên hiện tượng thối nhũn.
Một số hình ảnh về quy trình nhân giống in vitro cây chuối trên quy mô công
nghiệp:


VI. Thành tựu, ứng dụng của phương pháp nhân giống in vitro ở thực vật
VI.1. Thành tựu
Nhân giống nhiều loại cây trồng (cây hoa, cây ăn quả, cây công nghiệp, cây
lâm nghiệp), đặc biệt là những loại cây trồng quý hiếm và có giá trị kinh tế cao.
Cây hoa như: hoa cúc, hoa lan,…
Cây ăn quả như: táo, lê,…
Hình 5.2: Nhân chồi trong phòng sáng
dưới ánh sáng đèn
Hình 5.1: Tạo protocorm cây chuối
Hình 5.4: Cây chuối cấy mô lúc trồng

vào bầu được 10 ngày
Hình 5.3: Cây chuối cấy mô ươm trên
bột dừa
Hình 5.5: Cây chuối cấy mô khi xuất
khỏi vườn ươm
Cây lâm nghiệp như: thông, bồ đề,….
VI.2. Ứng dụng
Nhân giống vô tính in vitro là lĩnh vực mà nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã
mang lại hiệu quả kinh tế to lớn thực sự. Một trong những ưu việt của phương
pháp nhân giống in vitro là việc sử dụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ. Ở
kích thước nhỏ, sự tương tác giữa các tế bào trong mô sẽ đơn giản hơn. Tác động
của các phương pháp này sẽ hiệu quả hơn. Mô nuôi cấy dễ phân hóa và sau đó dễ
tái sinh hơn.
Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác
không có được đó là: có thể nhân nhanh cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả
trên đối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), phương pháp này có
hệ số nhân rất cao và cho ra các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền.
Các ứng dụng của phương pháp nhân giống vô tính in vitro có thể được liệt
kê như sau:
Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác chọn
tạo giống.
Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp cây giống của các
loại cây trồng khác nhau như: nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng
hạt; duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây
rau, cây hoa các loại cây trồng khác; nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus; bảo
quản các tập đoàn gen, đặc biệt với loại cây dễ bị nhiễm bệnh trong điều kiện tự
nhiên hoặc các cây dễ bị giao phấn.
Với phương pháp nhân giống vô tính in vitro nhiều giống cây lan (hoa lan,
cẩm chướng, đồng tiền,…), cây lương thực thực phẩm (khoai tây, súp lơ, cọ dầu,
…), cây ăn quả (chuối, dứa, dâu tây,…), cây lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai,…) đã

được phổ biến nhanh vào trong sản xuất.
VII. Một số vấn đề liên quan đến nhân giống in vitro
VII.1. Mẫu nuôi cấy
Các nhân tố khi chọn mẫu bao gồm: kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổi sinh
lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu.
 Kiểu gen: Ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy, số lượng chồi tạo được, sự
khác nhau về tăng sinh chồi, sự khác nhau về khả năng phát sinh phôi.
 Chọn cơ quan: Hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng nuôi cấy
invitro, mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác nhau có thể dùng chồi đỉnh để
nuôi cấy, chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nảy mầm từ hạt
 Tuổi và sinh lý: Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu
nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa tế bào và tuổi sinh lý. Thành
phần cơ quan có cấu tạo thấp không thể nuôi cấy invitro do không thể sử dụng
thành phần khoáng trong môi trường
 Nguồn mẫu: Mẫu invitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên
đồng ruộng hay trong vườn ươm. Nuôi cấy mẫu invitro cho thấy nâng cao khả
năng nhân giống cắt đốt. Nuôi cấy túi phấn đạt tỉ lệ thành công cao khi nuôi cấy
túi phấn trên đồng ruộng
 Sức sống của mẫu: Mẫu cây mẹ có ảnh hưởng quan trọng đến nuôi cấy invitro. Ví
dụ: nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo ra những cây sạch bệnh, tăng sức sống của cây
 Duy trì mẫu: Xử lý và vận dụng quản lý mẫu nuôi cấy cho phép nhà vi nhân
giống luôn có nguồn nguyên liệu để sử dụng trong nhân giống. Nguyên liệu cần
phải sạch bệnh, có nhiều nhân tố kiểm tra và cải thiện những điều kiện sinh lý và
vật lý mẫu cây mẹ như:
− Dinh dưỡng: Sử dụng vật liệu nuôi cấy khỏe và dinh dưỡng cây mẹ rất quan trọng
để có mẫu nuôi cấy khỏe. Ví dụ: Mức độ đạm trong lá có liên quan đến khả năng
phát sinh chồi từ lá invitro, do đó khả năng tái sinh chồi kém ở lá cây mẹ được
chăm bón đạm cao
− Nhiệt độ: Có sự ảnh hưởng trong nuôi cấy mô khi thể bulb mẹ được bảo quản ở
các nhiệt độ khác nhau và thời gian bảo quản khác nhau

− Ánh sáng: Khả năng nuôi cấy túi phấn cao khi cây mẹ sinh trưởng với cường độ
ánh sáng cao. Khả năng tạo protoplast cao ở cây lúa mạch khi cây mẹ sinh trưởng
ở cường độ ánh sáng thấp. Cường độ ánh sáng trung gian cho thấy số lượng chồi
phát sinh nhiều hơn và khả năng tạo rễ tốt. Khả năng tăng sinh chồi invitro khi
nuôi cấy chồi cây mẹ trong bóng râm cao hơn chồi ngoài trời. Sự tăng sinh chồi
qua nuôi cấy mẫu lá khi cây mẹ được xử lý dưới ánh sáng đỏ. Ánh sáng đỏ kích
thích tăng khả năng tổng hợp Cytokinin và làm giảm tổng hợp auxin
− Tác nhân vật lý, hóa học: Tiền xử lý mẫu nuôi cấy invitro có những ảnh hưởng đến
khả năng tăng sinh cơ quan invitro. Khi ngâm mẫu lá hay các bộ phận khác trong
dung dịch cytokinin như BA trước khi nuôi cấy, trong khi xử lý chồi tách rời với
ABA hay NAA cho thấy có ý nghĩa tạo phôi trong nuôi cấy protoplast. Sử dụng
dung dịch xử lý là phương pháp mới có hiệu quả trong nuôi cấy thân gỗ, bằng
cách ngâm đoạn chồi tách rời cây thân gỗ vào dung dịch. Dung dịch thường sử
dụng: 50 – 60 µm sucrose, 600 µm 8-hydroxyquiniline citrate có tác dụng trên
chồi tách rời và trong invitro có thể sử dụng thêm GA
3
và cytokinin hay auxin
trong phát sinh cơ quan.
VII.2. Ảnh hưởng của môi trường đến nhân giống invitro
Những loài khác nhau đòi hỏi môi trưởng nuôi cấy khác nhau. Môi trường
MS (Murashige và Skoog, 1962) được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy đỉnh
sinh trưởng. Một số nghiên cứu cho thấy môi trường MS cho tốc độ sinh trưởng
nhanh nhất khi thu mẫu từ cây non, tuy nhiên môi trường MS lại không thích hợp
cho mẫu lấy từ cây già (trong khi môi trường muối loãng cho kết quả ngược lại).
Tính độc của môi trường MS với tế bào invitro, nhất là protoplast cũng được
quan sát ở một số loài (do môi trường chứa hàm lượng muối đa lượng cao).
Phương pháp khắc phục đơn giảm là giảm nồng độ muối khoáng xuống 1/3 hoặc
1∕2.
Nguồn cacbon cũng rất quan trọng đối với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Nồng
độ đường 1 – 3% được sử dụng phổ biến. Nồng độ sucrose cao hơn 3% tỏ ra độc

với một số trường hợp.
Trạng thái vật lý của môi trường cũng có ý nghĩa quan trọng trong nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng. Đa số sử dụng môi trường agar, nhưng khi nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng ở 1 số loài môi trường lỏng tỏ ra tốt hơn.
Nồng độ chất kích thích sinh trưởng thấp trong môi trường có thể làm giảm
các biến dị tế bào soma. Tế bào mô sẹo phôi hóa ở cây có múi có thể nuôi cấy và
bảo quản lâu dài trong môi trường không có chất kích thích sinh trưởng
Nhiệt độ thích hợp nhất cho nuôi cấy mô từ 20 – 27
o
C. Nhiệt độ ảnh hưởng
sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây invitro qua những tiến trình sinh lý như
hô hấp hay hình thành tế bào và cơ quan (ở 24
o
C cytokinin kích thích hình thành
chồi bị ức chế). Xử lý nhiệt cây mẹ trước khi nuôi cấy invitro là phương pháp cơ
bản để tạo cây sạch bệnh (làm cho đỉnh sinh trưởng sạch virus).
Cường độ ánh sáng là nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến
khả năng nuôi cấy invitro cây có lá xanh. Ảnh hưởng đầu tiên đến sự quang hợp là
ảnh hưởng đến sinh lý. Ảnh hưởng quan trọng đến chồi nhưng lại tối cần thiết cho
sự tạo rễ. Cường độ ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự tăng sinh chồi.
Thời gian chiếu sáng ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây
trồng. Chất lượng ánh sáng ảnh hưởng trực tiếp đến cây invitro, ánh sáng cao hơn
ánh sáng đỏ hay ánh sáng đỏ có ảnh hưởng đến những biến đổi sinh lý trên cây
như: ra hoa, chế độ dinh dưỡng, khả năng rạo rễ của cành cắt invitro. Bước sóng
cũng ảnh hưởng đến phản ứng cây invitro và có mối tương tác với môi trường dinh
dưỡng.
Thành phần chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng của
cây invitro. Bình nuôi cấy giàu CO
2
và cường độ ánh sáng cao làm cho quang hợp

diễn ra nhanh hơn, nâng cao tốc độ vi nhân giống Nâng cao hàm lượng etylen làm
giảm sinh trưởng mô sẹo
Sự phối hợp của hai loại hoocmon 2,4D và NAA có ảnh hưởng đến sự hình
thành mô sẹo cũng như tái sinh cây. GA3 sử dụng trong môi trường nuôi cấy để
kích thích vươn thân, trong trường hợp có hàm lượng cytokinin cao dẫn đến hình
thành các cụm chồi có cấu trúc đặc.
VII.3. Tính bất định về mặt di truyền
Mặc dù kỹ thuật nhân giống vô tính được sử dụng nhằm mục đích tạo ra
quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra
những quần thể biến dị tế bào soma qua nuôi cấy mô sẹo và nuôi cấy tế bào.
Những biến dị này được nghiên cứu vận dụng vào cải thiện giống cây trồng nhưng
rất ít những biến dị có lợi được báo cáo.
Tần số biến dị hoàn toàn khác nhau và không lặp lại. Nuôi cấy mô sẹo và tế
bào đơn có sự biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh.
Cây trồng biến dị tế bào soma qua nuôi cấy thường là biến dị về chất lượng,
số lượng, năng suất, các biến bị này không di truyền.Những nguyên nhân gây biến
dị tế bào soma bao gồm:
+ Kiểu di truyền
+ Thể bội: Tần số biến dị ở cây đa bội thể cao hơn cây nhị bội
+ Số lần cấy truyền: Số lần cấy truyền càng cao thì tần số biến dị càng lớn
+ Loại mô
VII.4. Sự hoại mẫu
Có 2 tác nhân làm hư mẫu nuôi cấy invitro:
− Virus (hay thể giống như virus: chúng xâm nhiễm, không hoại mẫu nhưng có
ảnh hưởng về sau.Để giảm tác nhân gây nhiễm nên sử dụng mẫu nuôi cấy là
nhu mô phân sinh đỉnh.
− Vi sinh vật hủy hoại,những loại khi đưa vào môi trường nuôi cấy bị vi sinh vật
hoại mẫu nên đưa mẫu trồng trong môi trường mát và khô vài tuần trước khi
lấy mẫu nuôi cấy hoặc sử dụng thuốc kháng sinh.
VII.5. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy

Mẫu nuôi cấy có chứa nhiều tannin hay hydroxyphenol (mô già có nhiều hơn mô
sẹo) có thể làm mẫu nâu hóa hay bị đen làm chết mẫu hay giảm sự tăng trưởng
Để khắc phục sự hóa nâu mẫu có thể sử dụng các phương pháp sau:
 Tách các phần tử phenol ra khỏi môi trường
 Bổ sung các chất khử redox (oxidation-redution) phenol vào môi trường
 Ngăn chặn sự hoạt động của enzim phenolase
 Giảm lượng phenol có sẵn trong mẫu bằng môi trường lỏng giống môi trường rắn
 Mẫu chuẩn bị có vết cắt nhỏ để ngoài vài giờ trước khi cấy hay nơi cấy trong môi
trường không có ánh sáng
 Dùng than hoạt tính để hấp thụ chất kìm hãm phenol, ngăn chặn quá trình hóa nâu
hay đen, đặc biệt hiệu quả trên các loại phong lan, nồng độ thường 0.1-0.3%.
 Dùng các chất khử quá trình oxi hóa, ngăn chặn sự oxi hóa phenol. Trong đó quan
trọng là phương pháp phối hợp vitamin C và axit citric theo các bước sau:
+ Sử dụng mẫu cấy nhỏ từ mô sẹo
+ Gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng
+ Ngâm mẫu vào dung dịch vitamin C và axit citric vài giờ trước khi cấy
+ Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, O
2
thấp không có đèn, 1 – 2 tuần chuyển
mẫu từ môi trường có nồng độ chất kích thích sinh trưởng thấp sang môi trường có
nồng độ cao
VII.6. Hiện tượng thủy tinh thể
Cây invitro thủy tinh thể khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ dàng
bị mất nước và tỉ lệ sống thấp ( thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng
hay môi trường thạch có hàm lượng thạch thấp). Cây thủy tinh thể mang một số
đặc điểm sau:
+ Lượng sáp chứa trong cây invitro thấp hơn cây ngoài vườn ươm
+ Tế bào có chứa nhiều phân tử có cực dễ dàng nhận phân tử nước gắn trên nó,
gia tăng độ mất nước và tốc độ hô hấp của tế bào và dẫn đến sự chết của mô
trong nuôi cấy

Để ngăn chặn quá trình thủy tinh thể có thể sử dụng các biện pháp sau:
+ Giảm sự hút nước bằng cách tăng nồng độ đường
+ Giảm sự hút nước bằng cách tăng nồng độ đường kết hợp dùng các chất có áp
suất thẩm thấu cao
+ Giảm gây vết thương trên mẫu qua chất khử trùng và tiếp xúc với môi trường
cấy ít nhất
+ Giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy
+ Chuyển cây invitro thuần hóa ngoài vườn ươm không ảnh hưởng đến cây bị
thủy tinh thể
+ Giảm etylen trong bình nuôi cấy bằng cách thông khí tốt
+ Tăng cường độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy
VII.7. Khống chế điều kiện môi trường
Để nâng cao tối đa khả năng quang hợp invitro, cần cải thiện điều kiện vật lý
của môi trường nuôi cấy như: nhiệt độ, cường độ và thời gian chiếu sáng, sự trao
đổi khí,…
Nhân giống invitro trong điều kiện quang tự dưỡng có ưu thế hơn so với
phương pháp thông thường ở các đặc điểm sau:
− Sinh trưởng và phát triển của cây invitro được thúc đẩy. Sự thuần hóa cây con
invitro được thuận lợi, tăng tỷ lệ cây sống, tiết kiệm chi phí sản xuất cây con.
− Sử dụng môi trường nuôi cấy invitro không đường làm giảm đáng kể cây chết do
những nguyên nhân sinh học.
− Ngăn chặn hay tránh được các quá trình phát sinh hình thái hay hiện tượng sinh lý
không thuận lợi và sản xuất ra những cây invitro đồng nhất.
− Bình nuôi cấy invitro có thể sử dụng những bình có thể tích lớn, dễ dàng trong
kiểm soát môi trường nuôi cấy, thực hiện tự động hóa.
KẾT LUẬN
Nhân giống vô tính in vitro là một phương pháp hữu hiệu để giải quyết vấn
đề về số lượng và chất lượng nguồn giống cho ngành nông nghiệp trồng trọt ở
nước ta trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau, đặc biệt là các đối tượng là các
cây trồng quý hiếm và có giá trị kinh tế cao. Quá trình nhân giống in vitro chịu sự

ảnh hưởng của nhiều yếu tố, do đó cần phải xây dựng những quy trình nhân giống
in vitro phù hợp với từng đối tượng cây trồng để nâng cao hiệu quả của quá trình
nhân giống.
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình Nội dung
Hình 3.1 Sơ đồ mẫu mô trực tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh (thông qua
phương thức tăng khả năng phát sinh chồi nách)
Hình 5.1 Tạo protocorm cây chuối
Hình 5.2 Nhân chồi trong phòng sáng dưới ánh sáng đèn
Hình 5.3 Cây chuối cấy mô ươm trên bột dừa
Hình 5.4 Cây chuối cấy mô lúc trồng vào bầu được 10 ngày
Hình 5.5 Cây chuối cấy mô khi xuất khỏi vườn ươm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. PGS.TS Lê Trần Bình, PGS.PTS Hồ Hữu Nhị, PGS.TS Lê Thị Muội (1997)
“Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng”, NXB Nông
nghiệp Hà Nội.
2. Vũ Thị Lan (2013), “Bài giảng công nghệ tế bào thực vật”, Đại học Khoa học
Thái Nguyên.
3. TS. Lê Văn Sơn (2014), “ Bài giảng công nghệ sinh học thực vật”, Viện Hàn
lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam.
4. Trang web: www.nongsinh.com
5. Trang web: www.doc.edu.vn