Nhân giống vô tính invitro

THẢO LUẬN
THẢO LUẬN


CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT
CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT
Đề tài: Nhân giống vô tính invitro
Đề tài: Nhân giống vô tính invitro


GV hướng dẫn: Nguyễn Thị Lý Anh
GV hướng dẫn: Nguyễn Thị Lý Anh
I. Phần Mở Đầu
I. Phần Mở Đầu
•
Khái niệm về nhân giống invitro
Khái niệm về nhân giống invitro
•
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù
chung cho tất cả các loại nguyên liệu nuôi cấy
chung cho tất cả các loại nguyên liệu nuôi cấy
thực vật hoàn toàn sạch vi sinh vật trên môi
thực vật hoàn toàn sạch vi sinh vật trên môi
trường nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.
trường nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.
•
Nhân giống vô tính invitro là quá trình sản
Nhân giống vô tính invitro là quá trình sản
xuất một lượng lớn cây hoàn chỉnh từ các bộ
xuất một lượng lớn cây hoàn chỉnh từ các bộ

phận cơ quan như: Chồi, mắt ngủ, vảycủ,
phận cơ quan như: Chồi, mắt ngủ, vảycủ,
thân lá …của cây mẹ ban đầu thông qua kỹ
thân lá …của cây mẹ ban đầu thông qua kỹ
thuật nc in vitro.
thuật nc in vitro.
2.
2.
Tính cấp thiết của phương pháp nhân
Tính cấp thiết của phương pháp nhân
giống vô tính in vitro:
giống vô tính in vitro:
•
Từ xa xưa ông cha ta đã biết nhân giống
Từ xa xưa ông cha ta đã biết nhân giống
cây trồng bằng phương pháp vô tính
cây trồng bằng phương pháp vô tính
truyền thống giâm, chiết, ghép, …
truyền thống giâm, chiết, ghép, …
•
Nhưng các biện pháp đó ngày càng bộc lộ
Nhưng các biện pháp đó ngày càng bộc lộ
nhiều hạn chế : giống được nhân nhiều
nhiều hạn chế : giống được nhân nhiều
lần bị thoái hóa giống, mắc nhiều bệnh
lần bị thoái hóa giống, mắc nhiều bệnh
hơn, năng suất giảm, phân ly …
hơn, năng suất giảm, phân ly …
•
Bằng biện pháp nhân giống invitro, với

Bằng biện pháp nhân giống invitro, với
công nghệ vô trùng cao đã khắc phục
công nghệ vô trùng cao đã khắc phục
được những hạn chế trên, nâng cao năng
được những hạn chế trên, nâng cao năng
suất chất lượng của giống cây trồng cả về
suất chất lượng của giống cây trồng cả về
giá trị nông học và giá trị thương phẩm.
giá trị nông học và giá trị thương phẩm.
•
Vì vậy việc nghiên cứu, phát triển nhân
Vì vậy việc nghiên cứu, phát triển nhân
giống invitro ngày nay là rất quan trọng
giống invitro ngày nay là rất quan trọng
cần được chú trọng đầu tư.
cần được chú trọng đầu tư.

3. Ưu điểm của phương pháp nhân giống
3. Ưu điểm của phương pháp nhân giống
invitro
invitro
•
Có hệ số nhân rất cao
Có hệ số nhân rất cao
•
Có thể nhân giống ở quy mô công
Có thể nhân giống ở quy mô công
nghiệp, đặc biệt đối với các đối tượng
nghiệp, đặc biệt đối với các đối tượng
khó nhân bằng các phương pháp thông

khó nhân bằng các phương pháp thông
thường.
thường.
•
Chủ động giống trong sản xuất
Chủ động giống trong sản xuất
•
Tạo ra các giống cây trồng sạch bệnh
Tạo ra các giống cây trồng sạch bệnh
•
VD: khoai tây, dứa…
VD: khoai tây, dứa…
4. Nhược điểm của phương pháp invitro
4. Nhược điểm của phương pháp invitro
•
Chi phí cao hơn so với các phương pháp
Chi phí cao hơn so với các phương pháp
nhân giống vô tính khác nên khó cạnh
nhân giống vô tính khác nên khó cạnh
tranh.
tranh.
•
Một số cây rất dễ bị biến dị khi nhân
Một số cây rất dễ bị biến dị khi nhân
giống invitro.
giống invitro.
•
Nhân giống invitro không thể áp dụng
Nhân giống invitro không thể áp dụng
trên tất cả các đối tượng.

trên tất cả các đối tượng.
II. Cơ sở khoa học
II. Cơ sở khoa học
•
Dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật.
Dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật.
•
Theo quan điểm của sinh học hiện đại: tính
Theo quan điểm của sinh học hiện đại: tính
toàn năng của tế bào thực vật tế bào là tế bào
toàn năng của tế bào thực vật tế bào là tế bào
chứa đầy đủ lượng thông tin di truyền cần thiết
chứa đầy đủ lượng thông tin di truyền cần thiết
của cơ thể thực vật.
của cơ thể thực vật.
•
Sự hình thành và phát triển của phương pháp
Sự hình thành và phát triển của phương pháp
nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả của
nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả của
những phát hiện sau đây trong lĩnh vực sinh lý
những phát hiện sau đây trong lĩnh vực sinh lý
thực vật và di truyền học phân tử:
thực vật và di truyền học phân tử:
•
1. Tính toàn thể (potipotency) của mô và tế
1. Tính toàn thể (potipotency) của mô và tế
bào thực vật cho phép tái sinh được cây hoàn
bào thực vật cho phép tái sinh được cây hoàn
chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi tách

chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi tách
rời;
rời;
•
2. Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy
2. Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy
túi phấn, từ đó tạo các dòng đồng hợp tử
túi phấn, từ đó tạo các dòng đồng hợp tử
tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình
tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình
lai tạo;
lai tạo;
•
3. Khả năng hấp thu ADN ngoại lai vào tế
3. Khả năng hấp thu ADN ngoại lai vào tế
bào thực vật và khả năng chuyển gen để gây
bào thực vật và khả năng chuyển gen để gây
biến đổi (transformation) ở thực vật do ADN
biến đổi (transformation) ở thực vật do ADN
ngoại lai nhờ công nghệ gen (genetic
ngoại lai nhờ công nghệ gen (genetic
engineering).
engineering).
•
4. Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật như
4. Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật như
nuôi cấy vi sinh vật dẫn đến khả năng ứng
nuôi cấy vi sinh vật dẫn đến khả năng ứng
dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao
dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao

để phục vụ cho công tác tạo giống;
để phục vụ cho công tác tạo giống;
•
5. Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng
5. Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng
dung hợp protoplast, tái sinh cây hoàn chỉnh từ
dung hợp protoplast, tái sinh cây hoàn chỉnh từ
protoplast lai (cybrid);
protoplast lai (cybrid);
•
6. Khả năng loại trừ virus bằng phương pháp
6. Khả năng loại trừ virus bằng phương pháp
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô
tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính.
tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính.
•
7. Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi
7. Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi
protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ
protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ
cực nhanh một số cây trồng;
cực nhanh một số cây trồng;
•
8. Khả năng sử dụng phương pháp nuôi cấy
8. Khả năng sử dụng phương pháp nuôi cấy
phôi để khắc phục hiện tượng bất thụ khi lai
phôi để khắc phục hiện tượng bất thụ khi lai
xa;
xa;

•
9. Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng
9. Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng
nuôi cấy trong ống nghiệm;
nuôi cấy trong ống nghiệm;
•
10. Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống
10. Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống
trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp mà
trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp mà
không mất tính toàn thể của tế bào.
không mất tính toàn thể của tế bào.
•
III. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN
III. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN
Bước 1: Nuôi cấy khởi động
Bước 2: Nhân nhanh
Bước 3: Tạo cây invitro
Bước 4: chuyển ra môi trường
tự nhiên
Bước 0: Chọn lọc cây mẹ  Lấy
mẫu
Cây huấn luyện giai đoạn
đầu(vườn ươm)
Trồng cây ra đất
Khử trùng vào mẫu
Mt ra rễ
Chọn cây đạt y/c
Ngoại cảnh thích hợp
Gía thể trồng

Chăm sóc
Mt phát sinh h/t
Bước o:
Bước o:
chọn lọc và chuẩn bị cây
chọn lọc và chuẩn bị cây
mẹ
mẹ
•
Cây mẹ phải là cây sạch bệnh, đặc biệt là
Cây mẹ phải là cây sạch bệnh, đặc biệt là
bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng
bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng
mạnh.
mạnh.
•
Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi
Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi
trường thích hợp với chế độ chăm sóc và
trường thích hợp với chế độ chăm sóc và
phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy
phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy
mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm,
mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm,
tăng khả năng sống, sinh trưởng của mẫu
tăng khả năng sống, sinh trưởng của mẫu
nuôi cấy
nuôi cấy
Bước 1: nuôi cấy khởi động
Bước 1: nuôi cấy khởi động

•
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi
cấy in vitro.
cấy in vitro.
•
Yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống
Yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống
ccao, mô tồn tại, sinh trưởng phát triển
ccao, mô tồn tại, sinh trưởng phát triển
tốt.
tốt.
•
Cần chý ý chọn đúng loại mô, đúng giai
Cần chý ý chọn đúng loại mô, đúng giai
đoạn phát triển của cây: mô non, ít
đoạn phát triển của cây: mô non, ít
chuyên hóa (đỉnh chồi, mắt ngủ…)
chuyên hóa (đỉnh chồi, mắt ngủ…)
•
Cần xác định chế độ khử trùng mẫu thích
Cần xác định chế độ khử trùng mẫu thích
hợp. Thường dùng các chất: Hgcl2 0.1%
hợp. Thường dùng các chất: Hgcl2 0.1%
xử lý trong 5 – 10 phút.
xử lý trong 5 – 10 phút.
Bước 2: nhân nhanh
Bước 2: nhân nhanh

•
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát
sinh hình thái và tăng nhanh số lượng
sinh hình thái và tăng nhanh số lượng
thông qua: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi
thông qua: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi
bất định, và tạo phôi vô tính.
bất định, và tạo phôi vô tính.
•
Chú ý xác định điều kiện môi trường và
Chú ý xác định điều kiện môi trường và
điều kiện ngoại cảnh thích hợp để hiệu
điều kiện ngoại cảnh thích hợp để hiệu
quả là cao nhất: Theo nguyên tắc chung
quả là cao nhất: Theo nguyên tắc chung
môi trường có nhiều xytokinin sẽ kích
môi trường có nhiều xytokinin sẽ kích
thích tạo chồi, nhiều auxin sẽ kích thích ra
thích tạo chồi, nhiều auxin sẽ kích thích ra
rễ.
rễ.
Bước 3: tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Bước 3: tạo cây in vitro hoàn chỉnh
•
Để tạo rễ cho chồi phải cấy chuyển từ môi
Để tạo rễ cho chồi phải cấy chuyển từ môi
trường nhân nhanh sang môi trường ra rễ.
trường nhân nhanh sang môi trường ra rễ.
•

Môi trường ra rễ thường bổ sung 1 lượng
Môi trường ra rễ thường bổ sung 1 lượng
nhỏ auxin. Tuy nhiên có một số chồi có
nhỏ auxin. Tuy nhiên có một số chồi có
thể phát sinh rễ ngay chuyển từ môi
thể phát sinh rễ ngay chuyển từ môi
trường nhân nhanh sang môi trường
trường nhân nhanh sang môi trường
không chứa chất điều tiết sinh trưởng.
không chứa chất điều tiết sinh trưởng.
•
Đối với cac phôi vô tính thường chỉ gieo
Đối với cac phôi vô tính thường chỉ gieo
trên môi trường không chứa chất điều tiết
trên môi trường không chứa chất điều tiết
sinh trưởng hoặc có nồng độ xytokinin
sinh trưởng hoặc có nồng độ xytokinin
thấp để phôi phát triển thành cây.
thấp để phôi phát triển thành cây.
Bước 4: thích ứng cây in vitro ngoài
Bước 4: thích ứng cây in vitro ngoài
điều kiện tự nhiên
điều kiện tự nhiên
•
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm
có tỷ lệ sống cao cần phải chú ý một số
có tỷ lệ sống cao cần phải chú ý một số
điểm:
điểm:

•
Cây đạt tiêu chuẩn hình thái nhất định: số
Cây đạt tiêu chuẩn hình thái nhất định: số
lá, chiều cao cây, bộ rễ…)
lá, chiều cao cây, bộ rễ…)
•
Có giá thể sạch, tơi xốp, thích hợp để tiếp
Có giá thể sạch, tơi xốp, thích hợp để tiếp
nhận cây con in vitro.
nhận cây con in vitro.
•
Chủ động điều chỉnh hàm lượng dinh
Chủ động điều chỉnh hàm lượng dinh
dưỡng, ẩm độ, ánh sáng trong vườn ươm.
dưỡng, ẩm độ, ánh sáng trong vườn ươm.
THAO TÁC CẤY
THAO TÁC CẤY
IV. CÁC PHƯƠNG THỨC NHÂN
IV. CÁC PHƯƠNG THỨC NHÂN
GIỐNG VÔ TÍNH
GIỐNG VÔ TÍNH
1. Hoạt hoá chồi nách
1. Hoạt hoá chồi nách
+ Cây phát triển trực tiếp
+ Cây phát triển trực tiếp
từ chồi đỉnh hoặc chồi
từ chồi đỉnh hoặc chồi
nách, hay xảy ra khi nuôi
nách, hay xảy ra khi nuôi
cấy cây 2 lá mầm: khoai

cấy cây 2 lá mầm: khoai
tây, hoa cúc,…
tây, hoa cúc,…
- Tạo cụm chồi từ chồi
- Tạo cụm chồi từ chồi
đỉnh hoặc chồi nách, hay
đỉnh hoặc chồi nách, hay
gặp với cây 1 lá mầm: mía,
gặp với cây 1 lá mầm: mía,
lúa,…
lúa,…
2. Tạo chồi bất định
2. Tạo chồi bất định
•
- Thực hiện quá trình
- Thực hiện quá trình
phản phân hoá và tái
phản phân hoá và tái
phân hoá tế bào để
phân hoá tế bào để
bắt các tế bào soma
bắt các tế bào soma
hình thành chồi trực
hình thành chồi trực
tiếp hoặc gián tiếp
tiếp hoặc gián tiếp
thông qua giai đoạn
thông qua giai đoạn
phát triển mô sẹo.
phát triển mô sẹo.

•
-
-
Ở
Ở
cây 1 lá mầm: lan,
cây 1 lá mầm: lan,
dứa, hoa loa kèn,…
dứa, hoa loa kèn,…
3. Tạo phôi vô tính
3. Tạo phôi vô tính
•
Tương tự như tạo chồi bất định, nhưng
Tương tự như tạo chồi bất định, nhưng
phôi vô tính có cấu trúc lưỡng cực bao
phôi vô tính có cấu trúc lưỡng cực bao
gồm cả chồi mầm và rễ mầm.
gồm cả chồi mầm và rễ mầm.
•
Phôi vô tính có thể tái sinh thành cây
Phôi vô tính có thể tái sinh thành cây
hoàn chỉnh hoặc sử dụng làm nguyên liệu
hoàn chỉnh hoặc sử dụng làm nguyên liệu
sản xuất hạt giống nhân tạo.
sản xuất hạt giống nhân tạo.

Sự hình thành phôi vô tính có 2 bước:
Sự hình thành phôi vô tính có 2 bước:
Bước 1:
Bước 1:

phân hóa tế bào có khả năng phát
phân hóa tế bào có khả năng phát
sinh phôi ( thường là các tế bào nhỏ, nhân
sinh phôi ( thường là các tế bào nhỏ, nhân
lớn nhiều hạch nhân,không có không bào,
lớn nhiều hạch nhân,không có không bào,
tế bào chất đậm đặc, giàu protein và
tế bào chất đậm đặc, giàu protein và
mRNA. Cần môi trường giàu auxin.
mRNA. Cần môi trường giàu auxin.
Bước 2:
Bước 2:
sự phát triển của những tế bào phôi
sự phát triển của những tế bào phôi
mới hình thành. Môi trường nghèo hoặc
mới hình thành. Môi trường nghèo hoặc
không có auxin ( nồng độ auxin cao kích
không có auxin ( nồng độ auxin cao kích
thích hình thành phôi vô tính nhưng ức
thích hình thành phôi vô tính nhưng ức
chế quá trình phân hóa và phát triển tiếp
chế quá trình phân hóa và phát triển tiếp
theo của phôi.
theo của phôi.



Từ việc tạo phôi vô tính người ta đã sản
Từ việc tạo phôi vô tính người ta đã sản
xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính

xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính
•
Nguyên liệu:
Nguyên liệu:

Các Polyme sinh học
Các Polyme sinh học

Phôi vô tính
Phôi vô tính

Môi trường dinh dưỡng tạo hạt nhân tạo
Môi trường dinh dưỡng tạo hạt nhân tạo
Thường sử dụng polyme tự nhiên Alginate
Thường sử dụng polyme tự nhiên Alginate
để tạo hạt nhân tạo.
để tạo hạt nhân tạo.
•
Cách thực hiện:
Cách thực hiện:
•
+ Dùng polyme bao gói 1 phôi vô tính với
+ Dùng polyme bao gói 1 phôi vô tính với
1 thể tích nhất định chất dinh dưỡng để
1 thể tích nhất định chất dinh dưỡng để
tạo hạt.
tạo hạt.
•
Quy trình cụ thể như sau:
Quy trình cụ thể như sau:

•
Tạo huyền phù phôi vô tính trong môi
Tạo huyền phù phôi vô tính trong môi
trường dinh dưỡng với mật độ phù hợp và
trường dinh dưỡng với mật độ phù hợp và
bổ sung Na – alginate dược làm tan trong
bổ sung Na – alginate dược làm tan trong
nước với nồng độ 2-4%.
nước với nồng độ 2-4%.
•
Dùng pipet nhỏ 100 – 150
Dùng pipet nhỏ 100 – 150
µl
µl
huyền phù
huyền phù
nêu trên có chứa 1 phôi soma và dung
nêu trên có chứa 1 phôi soma và dung
dịch Cacl2 (2-5%). Khi đó sẽ sinh ra phản
dịch Cacl2 (2-5%). Khi đó sẽ sinh ra phản
ứng trao đổi ion Na – Ca và hạt nhân tạo
ứng trao đổi ion Na – Ca và hạt nhân tạo
được hình thành, có đủ độ cứng thích
được hình thành, có đủ độ cứng thích
hợp.
hợp.


ngâm trong nước làm cứng hạt.
ngâm trong nước làm cứng hạt.