nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ duchenne

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
***
ĐỖ THỊ MAI
NGHI£N CøU PH¸T HIÖN §éT BIÕN XãA §O¹N GEN
DYSTROPIN G¢Y BÖNH LO¹N D¦ìNG C¥ DUCHENE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
Khãa 2009-2013
Hà Nội – 2013
1
1
2
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
***
ĐỖ THỊ MAI
NGHI£N CøU PH¸T HIÖN §éT BIÕN XãA §O¹N GEN
DYSTROPIN G¢Y BÖNH LO¹N D¦ìNG C¥ DUCHENE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KhÓa 2009-2013
Giáo viên hướng dẫn:TS. Trần Vân Khánh
Hà Nội – 2013
2
2
3
LỜI CẢM ƠN
Việc được tiến hành nghiên cứu làm đề tài, khóa luận đã giúp tôi học
hỏi được rất nhiều, đó không chỉ là những kiến thức mà còn là tác phong và
kinh nghiệm làm việc.
Với tất cả tấm lòng trân trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

TS. Trần Vân Khánh, trưởng bộ môn Bệnh học phân tử, phó giám đốc
trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, người đã
giúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa khóa
luận cho tôi.
PGS. TS. Tạ Thành Văn, PGS. TS. Nguyễn Thị Hà, những người
thầy tuy không trực tiếp hướng dẫn tôi làm khóa luân nhưng đã nhắc nhở,
động viên không chỉ tôi mà tất cả các sinh viên, học viên đang tiến hành khóa
luận tại trung tâm, tạo mọi thuận lợi cho chúng tôi thực hiện và hoàn thành
khóa luận một cách tốt nhất.
ThS. Đỗ Ngọc Hải, khoa Hóa Sinh, bệnh viện Việt-Tiệp Hải Phòng,
cùng tập thể labo nghiên cứu gen-protein Trường Đại Học Y Hà Nội đã
dành cho tôi sự giúp đỡ quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện
đề tài
Ban giám hiệu, phòng quản lí và đào tạo đại học, bộ môn bệnh học
phân tử và các phòng ban trong trường Đại học y Hà Nội
Những người than trong gia đình, bạn bè, các anh chị đã động viên,
chia sẻ khó khăn với tôi trong quá trình làm khóa luận.
Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2013.
Đỗ Thị Mai
3
3
4
Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
***
LỜI CAM ĐOAN
Kính gửi: Phòng Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội
Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, tất cả các

số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất
cứ công trình nghiên cứu nào khác.
Hà nội, ngày 16 tháng 05 năm 2013
Người viết khóa luận
Đỗ Thị Mai
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DMD
BMD
DNA
Duchene muscular dystropy
Becker muscular dystrophy
Deoxyribonucleic Acid
cDNA Complimentary Deoxyribonucleic Acid
4
4
5
CARRIER Người lành mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử
CK Creatine kinase
Kb
PCR
Kilo base
Polymerase chain reaction
MLPA Multiplex Ligation - Dependent Probe Amplification
NST Nhiễm sắc thể
RNA
dNTP
ddNTP
BN
Ribo Nucleic Acid
Deoxyribonucleoside triphosphate

Dideoxyribonucleoside triphosphate
Bệnh nhân
5
5
6
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne có tên tiếng anh là Duchenne Muscular
Dystrophy ( DMD) hay còn gọi là bệnh teo cơ giả phì đại được phát hiện trên
nhiều chủng tộc khác nhau trên thế giới là một bệnh di truyền lặn liên kết với
giới tính thường gặp với tần suất mắc bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai
Bệnh DMD là bệnh cơ rất nặng, tiến triển mang tính chất tuần tiến, hầu
hết những trẻ trai mắc bệnh đều có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng suy yếu
cơ: biểu hiện là khó đi lại, dễ ngã, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khi
leo cầu thang; triệu chứng yếu cơ tiến triển ngày càng nặng, cuối cùng dẫn tới
tàn phế, mất khả năng đi lại ở lứa tuổi 12 và chết ở lứa tuổi 20 – 25 do tổn
thương cơ tim và rối loạn hô hấp
Nguyên nhân gây bệnh là do đột biến gen dystrophin, gen này nằm ở vị
trí Xp21 trên NST X, có chiều dài hơn 3000 Kb, bao gồm 79 exon với 7
promoter khác nhau. Gen sao mã tạo ra mRNA dài 14kb và tổng hợp protein
dystrophin. Protein dystropin nằm ở màng bào tương của tế bào cơ và được
cho là có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định của màng, bảo vệ cơ
khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ. Gen dystropin bị đột biến, quá trình
tổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu quả là tế bào cơ của bệnh nhân bị thoái
hóa dần và gây nên bệnh DMD. Một thể nhẹ hơn của DMD là Becker
Muscular Dystrophin (BMD), bệnh được phân biệt với DMD bởi lứa tuổi xuất
hiện muộn hơn, triệu chứng lâm sàng nhẹ hơn và có cuộc sống kéo dài hơn.
Các đột biến gây bệnh DMD bao gồm: Đột biến xóa đoạn (khoảng 60%),
đột biến điểm ( 25-30%), đột biến lặp ( 10-15%)
6
6

7
Như có thể thấy dạng đột biến xóa đoạn là phổ biến nhất, thường gặp nhất
chiếm tỉ lệ trên một nửa số ca bệnh. Đột biến này thường xảy ra ở hai vùng
trọng điểm (gọi là vùng hotspot) là vùng trung tâm và vùng tận cùng 5’.
Cho đến nay DMD vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu. Bởi
vậy, việc chẩn đoán sớm, chính xác nhằm phát hiện đột biến gen trên bệnh
nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne và sớm có những can thiệp, hỗ trợ
làm chậm lại các biến chứng, tiến triển của bệnh nâng cao chất lượng cuộc
sống cho người bệnh là một việc làm hết sức cần thiết và có giá trị. Ngoài
ra,việc phát hiện đột biến còngiúp xác định người lành mang gen bệnh, có ý
nghĩa quan trọng trong chẩn đoán trước sinh đối với những đối tượng có nguy
cơ cao sinh con bị bệnh. Có nhiều phương pháp xác định đột biến xóa đoạn
gen này nhưng do gen dystropin quá lớn với 79 exon, nên nhiều phương pháp
gặp phải trở ngại về mặt thời gian. MLPA (Multiplex Ligation-dependent
Probe Amplification) là phương pháp xác định đột biến xóa đoạn và lặp đoạn
nhanh chóng, chính xác và đang được ứng dụng rộng rãi.
Với những ý nghĩa trên đề tài: “Nghiên cứu phát hiện đột biến mất
đoạn gen Dystrophin trên bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne”
được thực hiệnnhằm mục tiêu:
Nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân
loạn dưỡng cơ Duchenen bằng kỹ thuật MLPA
7
7
8
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1 Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu bệnh DMD.
1.1.1. Trên thế giới.
- Tháng 12-1851, Edward-Meryon, một thầy thuốc người Anh đã mô tả
chi tiết về 8 trẻ trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà về sau này được gọi

là bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne .
- Năm 1861, Duchenne de Boulogne, một nhà thần kinh học người Pháp
đã có công mô tả dạng giả phì đại của bệnh loạn dưỡng cơ thường gặp ở trẻ
trai, phân biệt các bệnh cơ khác nhau và sau đó bệnh đã được mang tên ông
- Năm 1879, Gowers đã thu thập 220 bệnh nhân và mô tả một cách kỹ
càng bệnh này với những hình ảnh lâm sàng điển hình và rất chi tiết.
- Bệnh DMD đã được biết hơn 100 năm, trong suốt một thời gian dài
bệnh chủ yếu chỉ được đánh giá ở mức độ lâm sàng và những chăm sóc hỗ trợ
trong quá trình của bệnh đối với bệnh nhân.
- Trước và sau năm 1980, các nghiên cứu tập trung vào chẩn đoán và đặc
biệt là chẩn đoán sớm bệnh DMD khi chưa có biểu hiện lâm sàng, phát hiện
dị hợp tử bệnh DMD bằng đo hoạt độ enzym Creatin Kinase (CK), phục vụ
cho điều trị và tư vấn di truyền.
- Cho đến năm 1981, Zatz và cộng sự đã phát hiện ra gen dystrophin nằm
ở vị trí Xp21.
- Từ năm 1984 – 1987, Hoffman và các cộng sự của ông đã phát hiện ra
gen dystrophin và sản phẩm protein tương ứng của gen.
8
8
9
- Sau những năm 1987, ở một số nước tiên tiến, các phương pháp di
truyền phân tử đã phát triển mạnh nhằm phát hiện đột biến gen dystrophin,
tiến tới chẩn đoán trước sinh và phát hiện người nữ lành mang gen bệnh để tư
vấn di truyền nhằm hạn chế tới mức thấp nhất sự sinh ra những đứa trẻ bị
bệnh DMD .
- Năm 1987 - 1988, các nhà nghiên cứu mới chỉ biết gen dystrophin gồm
60 exon.
- Năm 1989, gen dystrophin được phát hiện với kích thước 2300 kb
- Năm 1993, thành phần và cấu trúc gen dystrophin đã được phát hiện
đầy đủ gồm 79 exon với kích thước 3200 kb.

Từ năm 1993 trở lại đây, cơ chế sinh học phân tử của bệnh ngày càng
được làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen đã và đang được các nhà khoa học nỗ
lực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt nhất khắc phục hậu quả nặng
nề của bệnh gây ra. Một hướng mà hiện nay được nhiều nhà khoa học trên thế
giới tập trung nghiên cứu là chuyển từ thể bệnh nặng DMD sang thể bệnh nhẹ
BMD bằng cách dùng một đoạn trình tự oligonucleotid đặc hiệu bám vào vị
trí tăng cường quá trình ghép nối của exon, một vị trí quan trọng cho quá trình
hoàn thiện mRNA để ngăn cản quá trình này, gây mất đoạn trực tiếp exon có
chứa điểm đột biến, hoặc gây mất đoạn thêm một hoặc hai exon kề với vùng
đột biến nhằm khôi phục lại khung dịch mã. Hướng nghiên cứu này trên tế
bào đã đem lại nhiều kết quả rất đáng khích lệ, hiện nay đang được thử
nghiệm trên động vật và bước đầu đã được ứng dụng trên người. Ngày nay,
liệu pháp gen được coi là một trong các hướng nghiên cứu ưu tiên nhất đối
với DMD.
9
9
10
1.1.2. Ở Việt Nam.
DMD là một bệnh di truyền khá phổ biến trên thế giới và tại Việt Nam
do đó đã có rất nhiều các đề tài, dự án nghiên cứu được tiến hành mang lại gía
trị to lớn và nâng cao tầm hiểu biết về căn bệnh này. Cụ thể:
- Năm 1991, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Hoàn và CS đã nghiên
cứu xác định số lượng bệnh nhân DMD trong vòng 10 năm (1981-1990) tại
Viện BVSKTE Hà nội, kết quả cho thấy có 131 bệnh nhân trong tổng số 107
gia đình, trong đó có gia đình có tới 2, 3 hoặc 4 người con đều mắc bệnh.
- Năm 1996, Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Phượng và CS đã nghiên
cứu giá trị của xét nghiệm CK trong chẩn đoán người mang gen gây bệnh và
đã nhận thấy khả năng phát hiện dị hợp tử của CK là 54%.
- Năm 1998, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang đã sử dụng một
cặp mồi đặc hiệu cho exon 48 để tiến hành phản ứng PCR thăm dò ở mức độ

gen cho hai bệnh nhân DMD trong gia đình có 2 thế hệ bị bệnh.
- Năm 2000, Nguyễn Đình Lương và CS đã tiến hành xác định đột biến
xoá đoạn ở bệnh nhân DMD sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR. Tuy nhiên tác
giả mới chỉ phân tích được một vài exon điển hình.
- Năm 2001, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Trang, Vũ Chí Dũng đã
công bố tình hình bệnh DMD ở trẻ em Việt Nam tại hội nghị Nhi khoa quốc
tế lần thứ 23.
- Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng năm 2002 đã nghiên cứu đột biến
gen gây bệnh DMD bằng phương pháp Multiplex PCR và đã phát hiện 6
trường hợp xóa đoạn trong 11 bệnh nhân được nghiên cứu.
10
10
11
- Năm 2004, Trần Vân Khánh và cộng sự đã chẩn đoán 85 bệnh nhân
Việt Nam mắc bệnh DMD/BMD bằng phương pháp PCR và phát hiện 38%
có đột biến xóa đoạn gen dystrophin.
- Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Hoàn vào năm 2005 đã phát hiện
13 bệnh nhân có đột biến xóa đoạn gen trong 21 bệnh nhân được chẩn đoán
là DMD.
- Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang năm 2006 đã nghiên cứu 58
bệnh nhân DMD và đã phát hiện tỉ lệ xóa đoạn exon 46, 51 và cả hai exon là
23/58, chiếm tỷ lệ 39,7%.
1.2. Đặc điểm bệnh DMD
1.2.1 Đặc điểm lâm sàng của bệnh DMD
Hình 1.1 Người bình thường và bệnh nhân DMD
11
11
12
Bệnh DMD được biểu hiện qua 3 giai đoạn sau:
Giai đoạn 1 (khi trẻ được 3-5 tuổi) Trẻ có dấu hiệu chậm biết đi hoặc đi

lại hay vấp ngã, trẻ chưa có biểu hiện
teo cơ.
Giai đoạn 2 (khi trẻ được 6-7 tuổi) Trẻ có biểu hiện yếu cơ và xuất hiện
dấu hiệu Gowers rõ, trẻ đang ngồi
xổm phải đứng thẳng lên hoặc đang
nằm phải ngồi dậy, trẻ phải quay
người sang một bên, gấp đầu gối vào
mông, hai tay chống nạng đỡ lấy thân
để giữ một tư thế như quỳ bắn, sau
đó, bằng cách tỳ hai tay lần lượt lên
cẳng chân, đầu gối và đùi, trẻ đẩy cho
thân thẳng dậy. Sự tiếp nối các động
tác như vậy được xem là đặc hiệu cho
bệnh loạn dưỡng cơ tuần tiến.
Giai đoạn 3 (khi trẻ được12-15 tuổi) Trẻ thường mất khả năng đi lại lúc 12
tuổi, sau đó dấu hiệu teo cơ xuất hiện
do trẻ không đi lại được, cuối cùng trẻ
bị tử vong ở lứa tuổi 20-25 do tổn
thương cơ tim và rối loạn hô hấp
12
12
13
1.2.2. Xét nghiệm cận lâm sàng
1.2.2.1. Định lượng hoạt độ enzym Creatine Kinase (CK) trong huyết thanh
Creatine Kinase (CK) là enzym xúc tác phản ứng tạo hợp chất giàu
năng lượng giúp quá trình co, duỗi cơ và quá trình chuyển hóa chất trong tế
bào cơ.
Creatine + ATP
→←
CK

phosphocreatine + ADP
Phosphocreatine là dạng dự trữ năng lượng cho hoạt động của cơ và
vận chuyển chất trong tế bào cơ.
Có ba dạng isoenzym của CK, đó là CK-MM; CK-MB và CK-BB.
Dạng đồng phân CK-MM chiếm 95% của CK toàn phần và tập trung chủ yếu
ở tổ chức cơ vân. Dạng CK-MB chiếm khoảng 5% và tập trung chủ yếu ở mô
cơ tim. Dạng CK-BB chiếm tỷ lệ không đáng kể và khu trú chủ yếu ở tổ chức
não, nó không qua được hàng rào mạch máu não, do đó CK-BB không xuất
hiện trong huyết thanh.
Chẩn đoán bệnh DMD thường dựa vào nồng độ enzym CK trong máu.
Ở bệnh nhân DMD, gen dystrophin bị đột biến làm thay đổi cấu trúc potein
dystrophin trên màng tế bào, dẫn đến tổn thương màng tế bào cơ và giải
phóng một lượng lớn enzym CK vào máu. Trong DMD, enzym CK tăng cao
ít nhất 40 lần so với bình thường (bình thường <200 UI/l); tuy nhiên, ở giai
đoạn muộn của quá trình bệnh, hoạt độ enzym này giảm thấp, lý do của hiện
tượng trên là vào giai đoạn cuối, khối cơ còn lại quá ít và lượng cơ thoái hóa
cũng ít.
13
13
14
1.2.2.3. Sinh thiết cơ
Sinh thiết cơ là một tiêu chuẩn để chẩn đoán chính xác nhất. Bằng phản
ứng miễn dịch huỳnh quang khi nhuộm tiêu bản sinh thiết cơ cho thấy sự
vắng mặt hoàn toàn của protein Dystrophin trên bề mặt tế bào cơ. Các sợi cơ
với đường kính không đều và có dấu hiệu của sự thoái hóa hoại tử, thâm
nhiễm mô mỡ, mô liên kết và những tế bào đơn nhân.
Người bình thường Bệnh nhân DMD
Hình 1.2. Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang của protein Dystrophin khi
nhuộm tiêu bản sinh thiết cơ.
1.2.3. Điều trị bệnh DMD

DMD là một trong các bệnh di truyền có tiên lượng xấu vì chưa có
phương pháp điều trị hiệu quả. Bệnh nhân dần dần bị tàn phế và thường chết
do suy hô hấp, tổn thương cơ tim hoặc ở lứa tuổi thiếu niên hoặc trước 20 tuổi
Hiện nay phối hợp điều trị nội khoa và phục hồi chức năng nhằm trì
hoãn sự tiến triển của bệnh. Các thuốc điều trị nội khoa cho bệnh nhân DMD
như: prednison, prednisolon và deflazacort (thuộc nhóm steroid) hoặc
aminoglycoside (kháng sinh) có thể làm chậm mức độ phá hủy tế bào cơ.
Vật lý trị liệu có tác dụng giúp cho trẻ hạn chế bớt mức độ co kéo cơ.
Hiện nay, liệu pháp gen trong điều trị căn bệnh này đang được thực
hiện với mục đích đưa vào trong tế bào một hoặc nhiều gen có khả năng tổng
14
14
15
hợp ra protein dytrophin và làm cho protein biểu hiện được ở màng tế bào cơ.
Hai phương pháp đã được thử nghiệm trên động vật là tiêm vào cơ những
plasmid và sử dụng vật truyền trung gian virut. Nhưng phương pháp này còn
nhiều hạn chế do gặp phải trở ngại khi tiến hành đưa một gen lớn vào vật
truyền trung gian, đưa vào bộ máy di truyền ở bên trong tế bào cơ sau phân
bào, sự tồn tại của gen đưa vào cơ thể và sự thải ghép của hệ thống miễn dịch
nên chưa được áp dụng để điều trị bệnh trên người. Trong vài năm trở lại đây,
một hướng điều trị gen mới, sau khi xác định được dạng đột biến của bệnh
nhân, các nhà khoa học đã chọn lọc, xóa thêm một, hai hoặc nhiều exon của
đoạn gen bị đột biến tạo ra một cắt đoạn lớn bên trong gen mà vẫn duy trì
được khung dịch mã và protein vẫn được sản xuất bán phần giúp cho người
bệnh chuyển từ thể bệnh nặng (DMD) sang thể bệnh nhẹ (BMD) và giúp kéo
dài thời gian sống.
1.2.4. Phòng bệnh DMD
DMD là bệnh di truyền tiên lượng nặng, có thể dẫn đến tàn phế, mất khả
năng đi lại và chết trước tuổi trưởng thành. Hiện nay, chưa có phương pháp
điều trị bệnh hiệu quả, các tác giả quan tâm đến bệnh DMD đều nhận định

rằng, trong khi chưa tìm được phương pháp điều trị có hiệu quả cho bệnh
DMD thì biện pháp cơ bản để hạn chế bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne đó là
việc phát hiện người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái trong gia đình bệnh
nhân) và chẩn đoán trước sinh cho những những phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ
và đang mang thai có nguy cơ cao. Phương pháp để phát hiện bệnh được đánh
giá có độ chính xác cao đang được sử dụng là kỹ thuật MLPA (Multiplex
ligation dependent probe amplification) và cách sàng lọc trước sinh cho phụ
nữ mang thai là chọc hút dịch ối, tách DNA của thai nhi và phân tích gen
dytrophin đột biến (trước khi phân tích DNA của thai nhi phải loại trừ khả
năng nhiễm DNA của người mẹ trong quá trình chọc hút dịch
15
15
16
1.3 Cơ chế di truyền của bệnh
DMD là bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính không có alen tương
ứng trên NST Y. Do đặc điểm di truyền nên bệnh chỉ gặp ở trẻ trai mà rất
hiếm gặp ở trẻ gái. Ở trẻ trai chỉ cần nhận một gen bệnh trên NST X của
người mẹ mang gen ( X
d
X - carrier) là có biểu hiện bệnh, trong khi đó trẻ cần
phải nhận 2 gen X mang bệnh, một từ mẹ một từ bố thì mới có khả năng biểu
hiện bệnh. Trẻ trai bị DMD thường chết sớm ở lứa tuổi 20 đến 25 nên không
có khả năng kết hôn và sinh con.
Bảng 1.1. Kiểu gen bố mẹ và tỷ lệ bị bệnh ở thế hệ con
Genotyp và phenotyp của
cha mẹ
Tần số con với các genotype khác nhau
Trai Gái
Cha Mẹ X
D

Y
Lành
X
d
Y
bệnh
X
D
X
D
lành
X
D
X
d
lành mang
gen bệnh
X
d
X
d
bệnh
X
D
Y lành X
D
X
D
Lành
1 0 1 0 0

X
D
Y lành X
D
X
d
lành mang gen
bệnh
½ ½ ½ ½ 0
X
D
Y lành X
d
X
d
bệnh
0 1 0 1 0
X
d
Y bệnh X
D
X
D
Lành
1 0 0 1 0
X
d
Y bệnh X
D
X

d
lành mang gen
bệnh
½ ½ 0 ½ ½
X
d
Y bệnh X
d
X
d
bệnh
0 1 0 0 1
Trong một vài trường hợp nữmang gen có biểu hiện bệnh khi NST X
không mang gen bệnh bị bất hoạt và dẫn đến NST X còn lại mang gen bệnh sẽ
biểu hiện bệnh. Francke 1989) đã phát hiện ra một vài trường hợp nữ mang gen
16
16
17
có biểu hiện rõ ràng của bệnh DMD với một NST X bị bất hoạt. Có khoảng 30%
bệnh nhân DMD có nguyên nhân không phải di truyền từ bố mẹ mà do quá trình
đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử ở bố hoặc mẹ .
1.4. Vị trí cấu trúc chức năng của gen Dystrophin
1.4.1 Vị trí của gen Dystrophin
Gen Dystrophin nằm ở vị trí Xp21 trên NST giới tính X.
Hình 1.3: Vị trí của gen Dystrophin.
1.4.2. Cấu trúc gen Dystrophin
Hình 1.4: Cấu trúc gen Dystrophin.
Gen Dystrophin là một trong những gen lớn nhất của người đã được
biết tới, gen có kích thước khoảng gần 3000kb, trong đó hơn 99% chiều dài
gen là intron .

17
17
18
Cấu trúc gen như sau:
1. Bộ phận khởi động (Promoter): Điều khiển hoạt động của gen để sản
xuất ra các sản phẩm protein đặc hiệu. Gen Dystrophin gồm 7 promoter:
Promoter não, promotor cơ, promotor tiểu não, promoter Dp 260, Dp 140, Dp
116, Dp 71.
2. Exon: Gen Dystrophin gồm 79 exon, là vùng gen mã hoá để phiên mã
thành mRNA, chứa đựng thông tin di truyền cho sự tổng hợp protein
Dystrophin.
3. Intron: Là vùng không mã hoá của gen nằm xen kẽ giữa những exon,
vùng intron đóng vai trò quan trọng cho quá trình hoàn thiện mRNA và nó
được loại bỏ khi quá trình hoàn thiện mRNA kết thúc [20].
1.5. Cấu trúc và chức năng của protein Dystrophin
Protein Dystrophin gồm 3685 acid amin, dài 427 kD, nằm ở màng bào
tương của tế bào cơ, có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định màng,
bảo vệ cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ.
Dystrophin được phân chia làm 4 vùng khác nhau bao gồm: Vùng gắn
với actin, vùng cấu trúc xoắn bậc 3, vùng giàu cystein và vùng C-tận . Bốn
vùng này có chức năng rất khác nhau, một số tác giả đã chứng minh rằng
vùng N-tận, vùng giàu cystein và vùng C-tận có vai trò rất quan trọng với
chức năng của dystrophin, bệnh nhân có đột biến vùng này biểu hiện triệu
chứng lâm sàng rất nặng nề.
Dystrophin liên kết với phức hợp Dystrophin- glycoprotein-complex
(DGC) thông qua sự sự tương tác của vùng C-tận với phức hợp Dystroglycan và
Syntrophin. DGC có vai trò quan trọng đối với chức năng của Dystrophin trong
sự ổn định màng bào tương và là cầu nối tế bào cơ với vùng ngoại bào [8, 36].
18
18

19
Hình 1.5: Cấu trúc mô phỏng của Dystrophin và một số protein tương tác
với nó
1.6.Đột biến xóa đoạn gen Dystrophin
Các đột biến gây bệnh DMD bao gồm: Đột biến xóa đoạn, lặp đoạn và
đột biến điểm. Trong đó tỉ lệ các dạng đột biến:
Đột biến xóa đoạn chiếm khoảng 60%
Đột biến điểm chiếm 25-30%
Đột biến lặp đoạn chiếm khoảng 10-15%
Đột biến mất đoạn là dạng đột biến thường gặp nhất ở bệnh nhân
DMD/BMD. Đột biến này chiếm khoảng 60÷65% tổng số các dạng đột biến.
Đột biến gặp chủ yếu ở 2 vùng trọng điểm (hotspot regions): vùng tận cùng 5’
(exon 1÷19) và vùng trung tâm (exon 43÷60). Hai phương pháp đang được
dùng phổ biến trong chẩn đoán mất đoạn gen là PCR và MLPA. Trong đó
MLPA là phương án tối ưu hơn do chính xác và nhanh chóng.
19
19
20
Hình 1.6. Vị trí đột biến mất đoạn thường gặp trên gen Dystrophin(theo
Thomas Prior, 2005).
Foster (2006) đã xác định đột biến mất đoạn gen ở mức độ mRNA của
80 bệnh nhân DMD và ông đã xác định được tỷ lệ mất đoạn gen Dystrophin
chiếm 63% bệnh nhân được chẩn đoán DMD. Kết quả này phù hợp với
nghiên cứu của Prior (2005) đã phát hiện tỷ lệ đột biến xóa đoạn gen
Dystrophin là 60 ÷ 65% ở các bệnh nhân DMD. Năm 2004, TS.BS
Trần Vân Khánh đưa ra bảng tổng kết so sánh tỉ lệ đột biến xóa đoạn gen trên
bệnh nhân DMD giữa các dân tộc khác nhau ở châu Mỹ, châu Âu và châu Á;
tỉ lệ đột biến xóa đoạn gen Dystrophin dao động trong khoảng 33 ÷ 65%; tại
châu Mỹ và châu Âu bệnh nhân DMD của Hoa Kỳ và Hy Lạp có tỉ lệ đột biến
xóa đoạn gen khá cao 60 ÷ 65%, tiếp sau là tỉ lệ xóa đoạn gen ở bệnh nhân

DMD của Anh, thấp hơn là tỉ lệ xóa đoạn gen ở bệnh nhân DMD tại Đức,
Argentina và Venezuela dao động từ 30% đến 40%; tại châu Á, bệnh nhân
DMD ở Thái Lan, Ấn Độ, Singapore và Nhật Bản có tỉ lệ đột biến xóa
đoạn gen cũng khá cao tương tự như một số nước ở châu Mỹ và châu Âu,
20
20
21
khoảng 60 ÷ 65%, bệnh nhân DMD ở các nước châu Á còn lại có tỉ lệ đột
biến xóa đoạn gen thấp hơn, dao động trong khoảng 33 ÷ 46%, Việt Nam
với tỉ lệ 40% và Philippin có tỉ lệ thấp nhất với 33% . Như vậy, sự khác
biệt về yếu tố chủng tộc cũng ảnh hưởng đến quá trình đột biến và loại đột
biến gen Dystrophin.
TS.BS Trần Vân Khánh (2004) đã chẩn đoán 85 bệnh nhân Việt Nam
mắc bệnh DMD/BMD bằng phương pháp PCR ở mức độ DNA, với 19 cặp
mồi đặc hiệu khuyếch đại 19 exon thuộc hai vùng hotspot đã phát hiện được
32 trường hợp (chiếm tỉ lệ 38%) có đột biến mất đoạn gen; hầu hết các đột
biến này đều tập trung ở vùng trung tâm của gen, chiếm tỉ lệ 66%; 22%
trường hợp xuất hiện đột biến xóa đoạn ở vùng đầu tận 5’ và 4 bệnh nhân
(chiếm tỉ lệ 12%) có đột biến xóa đoạn kéo dài từ vùng tận 5’ đến vùng trung
tâm của gen. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoàn (2005) cho thấy
62,5% các đột biến mất đoạn của bệnh nhân DMD nằm ở vùng trung tâm (từ
exon 42 đến exon 60) của gen Dystrophin và 21,9% đột biến gen xảy ra ở
vùng tận 5’ (từ exon 1 đến exon 19). Năm 2002, Poh-San Lai đã tiến hành
nghiên cứu, so sánh đột biến mất đoạn gen Dystrophin của các bệnh nhân
DMD thuộc 3 dân tộc ở Sigapore, Nhật Bản, Việt Nam và kết luận rằng
không có sự khác biệt về phân bố vùng exon đột biến của 3 dân tộc này, các
đột biến mất đoạn gen chủ yếu tập trung ở vùng trung tâm (chiếm tỉ lệ 62 –
70%), và 25 – 33% đột biến xảy ra ở vùng đầu tận 5’
1.7. Các kỹ thuật sinh học phân tử được dùng trong chẩn đoán mất đoạn
gen dystropin.

DMD, như đã biết, có ba dạng đột biến. Có nhiều các phương pháp khác
nhau để xác định những đột biến này như PCR, RT- PCR, Multiplex PCR,
21
21
22
MLPA…Hai kỹ thuật chính đang được sử dụng phổ biến hiện nay là PCR và
MLPA.
1.7.1. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR):
PCR là kỹ thuật nhân bản gen trong ống nghiệm. Từ một khuôn ban
đầu sẽ cho ra sản phẩm là một lượng lớn các đoạn gen đích cần nghiên cứu.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ
gồm ba bước được điều hòa bởi nhiệt độ
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Phân tử DNA được biến
tính ở nhiệt độ cao, thường là 94
o
C - 95
o
C trong vòng 30 – 60 giây. Bước này
DNA sợi kép tách ra thành hai mạch đơn.
- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho phép
các mồi cặp với khuôn là các DNA mạch đơn, dao động trong khoảng 40
o
C –
70
o
C tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài 30 – 60 giây.
- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extennsion) Nhiệt độ tăng lên
72
0
C là nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme Taq polymerase hoạt động tổng

hợp sợi DNA mới bằng cách kéo dài sợi mồi sử dụng 4 loại nucleotid (dATP,
dCTP, dGTP, dCTP). Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần
khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
22
22
23
Hình 1.7. Các giai đoạn trong phản ứng PCR
Sau mỗi chu kỳ, các đoạn DNA được tổng hợp sẽ được dùng làm
khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Như vậy sản
phẩm của phản ứng sẽ tăng theo cấp số nhân sau mỗi chu kỳ. Vậy sau n chu
kỳ số lượng DNA thu được là 2
n
bản copy. Tuy nhiên, thông thường hiệu suất
của phản ứng sẽ không đạt 100% và chúng ta tiến hành 25-40 chu kỳ tùy theo
nồng độ sản phẩm của DNA.
Kết quả là từ một lượng nhỏ chất khuôn ban đầu, chúng ta có thể thu
được một lượng lớn DNA. Song điều đó cũng có nghĩa là, trong quá trình tiến
hành PCR việc nhiễm một lượng nhỏ DNA ngoại lai cũng có thể đưa tới sự
thất bại của phản ứng, khiến chúng ta không thu được hoặc chỉ thu được một
lượng nhỏ sản phẩm DNA mong muốn
23
23
24
1.7.2. Phương pháp khuếch đại DNA dò – MLPA (Multiplex Ligation-
Dependent Probe Amplification)
Kỹ thuật MLPA là một phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đoán
đột biến mất đoạn, lặp đoạn gen, cho phép phát hiện các tổn thương gen một
cách nhanh chóng.
• Nguyên lý: Đột biến được phát hiện bằng các đoạn dò ( probe). Mỗi
probe gồm hai chuỗi oligonucleotid, các probe này lai đặc hiệu với

79 exon của đoạn gen đích. Mỗi chuỗi đều có vị trí gắn đặc hiệu với exon
đích và có gắn sẵn mồi, khi hai chuỗi này đã gắn được vào vị trí exon
đích, enzym ligase sẽ gắn 2 chuỗi thành probe hoàn chỉnh. Nếu gen bị
đột biến, probe tương ứng với exon bị xóa không được hình thành do 2
chuỗi không gắn được vào exon này. Mồi gắn sẵn trên probe ( tác dụng
khuếch đại probe)có trình tự giống hệt nhau, nên chỉ cần một cặp mồi
duy nhất để khuếch đại tất cả probe. Riêng ở chuỗi dài có thêm một
đoạn đệm gồm số nucleotid khác nhau, nhờ đó các probe có sự khác
biệt về kích thước, giúp phân tách khi điện di mao quản sau khuếch đại
probe. Kết quả phân tích sẽ cho 79 đỉnh có kích thước tương ứng với
79 probe đặc hiệu với 79 exon, khi không thấy xuất hiện đỉnh có nghĩa
đã xảy ra đột biến mất đoạn trên exon
Cấu trúc probe:
Hình 1.8: Cấu trúc của probe
24
Vị trí gắn
đặc hiệu
trên gen
đích
Thuốc
nhuộm
huỳnh
quang
Đoạn
đệm
Mồi
xuôi
X
Mồi
ngược Y

24
25
Mỗi probe này gồm nhánh
• Nhánh X : Là chuỗi oligonucleotid dài chứa mồi X
• Nhánh Y: là chuỗi oligonucleotid ngắn chứa mồi Y
Hai nhánh này đều có vị trí gắn đặc hiệu trên vị trí gen đích
- Phân tử oligonucleotid ngắn( chuỗi ngắn ) gồm 2 đoạn:
+ Đoạn 1 có trình tự nucleotid đặc hiệu với đoạn DNA đích và sẽ lai
với DNA đích khi tiến hành phản ứng lai. Đoạn này có khoảng 21-30
nucleotid nằm ở đầu 3’ của probe.
+ Đoạn 2 chứa khoảng 19 nucleotid. Trình tự nucleotid của đoạn này
giống nhau cho tất cả các probe. Đây là vị trí gắn với mồi Y để khuếch đại
probe khi tiến hành phản ứng PCR.
- Phân tử oligonucleotid dài ( chuỗi dài) gồm 3 đoạn:
+ Đoạn 1’ chứa 25-43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ở đầu tận 5’,
+ Đoạn 2’ gồm 36 nucleotid ở đầu 3’, trình tự nucleotid giống nhau cho
tất cả các probe. Đây là vị trí gắn với mồi X đặc hiệu để khuếch đại probe,
+ Đoạn 3’ còn gọi là đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm giữa hai đoạn 1’
và 2’, cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid. Trình tự nucleotid không đặc hiệu
với DNA đích nên nó không gắn vào DNA đích. Chiều dài đoạn stuffer khác
nhau ở các probe, vì vậy các probe khác nhau sẽ có chiều dài khác nhau. Do
đó, sản phẩm khuếch đại của các probe sẽ được phân tách bằng điện di.
25
25