Xây dựng các thử nghiệm miễn dịch phát hiện protein e7 của human papilloamvirus type 18

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
[\




BÙI HOÀNG BẢO NGỌC







XÂY DỰNG CÁC THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH
PHÁT HIỆN PROTEIN E7 CỦA
HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 18



CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN
MÃ SỐ: 60 42 70




LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG







THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2011
Lời cám ơn

LỜI CÁM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Hồ
Huỳnh Thùy Dương, người đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn
thành đề tài này.
Tôi chân thành cám ơn anh Trần Lê Sơn, chị Nguyễn Thái Hoàng Tâm, anh
Trần Quốc Vũ, bạn Nguyễn Thị Mỹ Nương, em Phạm Trần Đăng Thức ở Phòng thí
nghiệm Sinh học phân tử - Bộ môn Di truyền – Khoa sinh học – Đại học Khoa họ
c
tự nhiên đã luôn ủng hộ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài này.
Cám ơn các bạn Diễm Trang, Thanh Minh, Ngọc Thùy, Mỹ Anh, Thu Trang
đã luôn ở bên cạnh tôi những lúc tôi gặp khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài.
Và trên tất cả, con xin cám ơn ba mẹ và gia đình đã luôn yêu thương, tạo mọi
điều kiện cho con trong học tập cũng như trong cuộc sống.

Bùi Hoàng Bảo Ngọc
Lời mở đầu

viii

LỜI MỞ ĐẦU

Nếu như cứ mỗi 3 phút có 1 người trên thế giới chết vì ung thư phổi thì cứ
mỗi 2 phút có 1 phụ nữ chết vì ung thư cổ tử cung. Ở Mỹ, trong năm 2009 ước tính
có khoảng 12.000 phụ nữ mắc ung thư cổ tử cung. Với tỉ lệ 26 ca trên 100.000 phụ
nữ, ung thư cổ tử cung đã trở thành nguyên nhân ung thư gây tử vong hàng đầu cho
phụ nữ ở Việt Nam cũng như
các nước đang phát triển.
Khuyến cáo ung thư cổ tử cung năm 2009 đã xác định phòng ngừa là chìa
khóa then chốt trong cuộc chiến chống căn bệnh này. Do đó, một phương pháp tầm
soát hiệu quả căn bệnh này sẽ giúp ngăn ngừa và giảm tỉ lệ tử vong do nó gây ra.
Khoảng 95 % các trường hợp ung thư cổ tử cung là có liên quan đến Human
papillomavirus (HPV). Nhiều nghiên cứu đã cho thấy có mối liên hệ mật thiế
t giữa
việc nhiễm lâu dài một số chủng “có nguy cơ cao”, đặc biệt là HPV type 16 và HPV
type 18, với khả năng phát triển bệnh ung thư cổ tử cung. Do đó, dựa vào mối quan
hệ này, ta có thể phát triển các phương pháp chẩn đoán để phát hiện sớm khả năng
gây ung thư của HPV, từ đó đưa ra các phương pháp điều trị hiệu quả.
Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành xây dựng các công cụ
miễn dịch dựa trên
kháng thể đơn dòng nhằm phát hiện protein E7 HPV 18, là một protein gây ung thư
(oncoprotein) đóng vai trò quan trọng trong cơ chế phát sinh ung thư của HPV. Các
công cụ chẩn đoán này sẽ góp phần hoàn thiện công tác phòng ngừa và điều trị ung
thư cổ tử cung ở Việt Nam và trên thế giới.

Danh mục các bảng
vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 3.1. Kết quả realtime immuno-PCR với protein E7 HPV 18 tái tổ hợp. 62

Bảng 3.2. Kết quả phân tích đường cong nóng chảy 63
Bảng 3.3. Kết quả ELISA với protein E7 HPV 18 tái tổ hợp 63
Bảng 3.4. Kết quả realtime immuno-PCR trên protein E7 HPV 18/16/11/6 65


Danh mục chữ viết tắt
iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AP : Alkaline phosphatase
CHO : Chinese hamster ovary
CR : Consensus region
E’MEM : Eagle’s minimum essential media
EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid
EGFP : Enhanced green fluorescent protein
ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay
FBS : Fetal bovine serum
KTĐD : Kháng thể đơn dòng
HEPES : 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
HPV : Human papillomavirus
LCR : Long control region
mAb : Monoclonal antibody
OD : Optical density
PBS : Phosphate buffered saline

PCR : Polymerase chain reaction
PFA : Paraformaldehyde
PLL : Poly – L – lysine
pRB : Retinoblastoma tumor suppressor protein
STD : Standard deviation
URR : Upstream regulatory region
UTCTC : Ung thư cổ tử cung

Danh mục các hình và đồ thị
v

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
Trang

Hình 1.1. Cấu trúc bộ gene của HPV 3

Hình 1.2. Cấu trúc của protein E7 5
Hình 1.3. Tác động của protein E7 lên các quá trình nội bào 6
Hình 1.4. Hệ thống phát hiện trực tiếp 13
Hình 1.5. Hệ thống avidin-biotin. 13
Hình 1.6. Hệ thống polymer – kháng thể thứ cấp – enzyme 14
Hình 1.7. ELISA và immuno PCR. Nguyên lý và độ nhạy của hai phương pháp 15
Hình 1.8. Immuno-PCR cổ điển, sử dụng protein lai giữa protein A và streptavidin
17

Hình 1.9. Immuno-PCR phổ biến. 18
Hình 1.10. Sơ đồ mô tả đoạn DNA marker được gắn cộng hợp vào kháng thể. 19
Hình 1.11. Immuno-PCR trực tiếp. 20
Hình 1.12. Immuno-PCR sử dụng các hạt từ phủ kháng thể 21
Hình 1.13. Immuno-PCR sử dụng “bio-barcode” 21

Hình 1.14. Immuno-PCR sử dụng LG protein và hệ thống phát hiện Tus-Ter 22
Hình 2.1. Buồng đếm hồng cầu 31
Hình 2.2. Sơ đồ phương pháp ELISA 38
Hình 2.3. Sơ đồ phương pháp checkerboard 38
Hình 2.4. Sơ đồ phương pháp immuno-PCR 39
Hình 3.1. Mô hình phương pháp lai hóa tế bào miễn dịch sử dụng trong đề tài. 41
Hình 3.2. Lai hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD 1D5 trên dòng tế bào HeLa và
C33A với các nồng độ kháng thể 10 µg/ml (A1, A2), 5 µg/ml (B1, B2), 2,5 µg/ml
(C1, C2). 42

Hình 3.3. Lai hóa tế bào miễn dịch sử dụng KTĐD 4H5 trên dòng tế bào HeLa và
C33A với các nồng độ kháng thể 10 µg/ml (A1, A2), 5 µg/ml (B1, B2), 2,5 µg/ml
(C1, C2). 43

Danh mục các hình và đồ thị
vi

Hình 3.4. Lai hóa tế bào miễn dịch sử dụng kháng thể 1D5 (10 µg/ml) trên các dòng
tế bào HeLa (A), C33A (B), CHO-K1 chuyển vector pEGFP-E7HPV18 (C), CHO-
K1 chuyển vector pEGFP-C2 (D), CaSki (E) 44

Hình 3.5. Lai hóa tế bào miễn dịch sử dụng kháng thể 4H5 (10 µg/ml) trên các dòng
tế bào HeLa (A), C33A (B), CHO-K1 chuyển vector pEGFP-E7HPV18 (C), CHO-
K1 chuyển vector pEGFP-C2 (D), CaSki (E) 45

Hình 3.6. Lai hóa tế bào miễn dịch trên dòng tế bào HeLa với kháng thể 1D5 (10
µg/ml), sử dụng tác nhân bộc lộ kháng nguyên là citrate pH 6 10 mM (A), EDTA
pH 8 1 mM (B), không xử lý với tác nhân bộc lộ kháng nguyên (C). 46

Hình 3.7. Lai hóa tế bào miễn dịch trên mẫu tế bào HeLa (A), CaSki (B), C33A (C)

xử lý theo phương pháp ly tâm và trải lên. 47

Hình 3.8. Lai hóa tế bào miễn dịch trên các mẫu tế bào dịch phết cổ tử cung 49
Hình 3.9. Mô hình kĩ thuật immuno-PCR và ELISA sử dụng trong đề tài. 50
Hình 3.10. Đồ thị xác định hằng số ái lực của KTĐD 4H5-biotin với kháng nguyên
E7 HPV 18 tái tổ hợp tinh sạch. 53

Hình 3.11. PCR tạo DNA đánh dấu biotin. 54
Hình 3.12. Đồ thị khảo sát nồng độ kháng thể “bắt giữ” 1D5 55
Hình 3.13. Đồ thị khảo sát nồng độ kháng thể “phát hiện” 4H5-biotin 56
Hình 3.14. Đồ thị khảo sát nồng độ STV-AP 57
Hình 3.15. Tối ưu hóa nồng độ DNA đánh dấu biotin sử dụng cho immuno-PCR. . 58
Hình 3.16. Tối ưu hóa nồng độ streptavidin sử dụng cho immuno-PCR. 59
Hình 3.17. Tối ưu hóa tác nhân khóa giếng. 60
Hình 3.18. Kết quả immuno-PCR với protein E7 HPV 18 tái tổ hợp 61
Phần 1: Tổng quan tài liệu

1

1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. UNG THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMAVIRUS
1.1.1. Ung thư cổ tử cung
Trên thế giới, ung thư cổ tử cung (UTCTC) chiếm khoảng 12 % các ca ung
thư ở phụ nữ, trở thành căn bệnh phổ biến thứ hai ở phụ nữ sau ung thư vú và phổ
biến nhất ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam [67]. Theo thống kê của
tổ chức Y tế
thế giới (WHO), năm 2005 toàn cầu có khoảng 260.000 phụ nữ chết vì
căn bệnh này, 95 % trong số đó là ở các nước đang phát triển [68]. Tỉ lệ mắc bệnh
cao nhất là ở các vùng cận Sahara Châu Phi, quần đảo Melanesia, Mỹ Latinh,
Caribê, Nam Á và Đông Nam Á [49]. Việt Nam là một nước đang phát triển nên tỉ

lệ mắc UTCTC thuộc vào loại cao trên thế giới (chiếm 13,03 % các loại ung thư –
năm 2002). Tần suất ung thư có sự chênh lệ
ch lớn giữa hai miền Nam - Bắc, ở
thành phố Hồ Chí Minh là 28,8 trên 100.000 dân trong khi ở miền Bắc tần suất đó
là 6,8 [63].
Ung thư cổ tử cung phát triển khi các tế bào trong cổ tử cung bắt đầu tăng
sinh không kiểm soát và sau đó có thể xâm lấn đến các mô lân cận hoặc lan rộng
khắp cơ thể. Thông thường, UTCTC phát triển chậm và không có triệu chứng rõ rệt
mặc dù trong vài trường hợp nhất định nó có thể tăng sinh và lan r
ộng rất nhanh
[22].
Ung thư cổ tử cung được mô tả dựa vào nguồn gốc loại tế bào phát sinh nên
nó. Dạng phổ biến nhất của UTCTC là ung thư biểu mô tế bào vảy (chiếm khoảng
80 % các dạng UTCTC). Dạng phổ biến thứ hai là ung thư biểu mô tuyến. Có
khoảng 3-5 % các trường hợp UTCTC mắc phải cả hai dạng trên. Ngoài ra còn một
vài dạng hiếm gặp khác [22], [72].
Một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn
đến UTCTC là do nhiễm lâu dài
một loại virus rất phổ biến và dễ lây nhiễm là Human papillomavirus (HPV) [26].
Tuy nhiên, chỉ một vài type HPV là có khả năng gây nên ung thư. Thông thường,
việc nhiễm HPV không hề gây ra bất cứ triệu chứng nào cho đến khi xuất hiện các
tổn thương tiền ung thư ở cổ tử cung. Ngoài ra còn có rất nhiều yếu tố nguy cơ khác
Phần 1: Tổng quan tài liệu

2

như có nhiều bạn tình, quan hệ tình dục quá sớm, hút thuốc lá … cũng góp phần
làm gia tăng khả năng mắc bệnh [22].

1.1.2. Human papillomavirus (HPV)

1.1.2.2. Phân loại HPV
Human papillomavirus (HPV) thuộc họ Papillomaviridae, là nhóm virus gây
ra nhiều dạng tổn thương biểu mô khác nhau ở người. Hiện đã có hơn 200 type
HPV được xác định dựa trên phân tích trình tự DNA. Trong đó có hơn 96 type đã
được giải trình tự đầy đủ và ít nhất 100 type được giải trình t
ự một phần [23], [31].
Dựa vào sự liên quan của type HPV với mức độ tổn thương cổ tử cung và
khả năng phát triển thành ung thư người ta chia các type xâm nhiễm vào biểu mô cổ
tử cung thành ba nhóm nhỏ [14], [62], [69]:
- Nhóm “có nguy cơ thấp” (low risk HPV): gồm các type 6, 11, 40, 42, 43, 44,
54, 61, 70, 72, 81, 89; trong đó phổ biến nhất là HPV 6 và HPV 11. Nhóm HPV có
nguy cơ thấp thường liên quan tới các mụn nhọt sinh dục hoặc các tổn thương biểu
mô tế bào vảy mức độ nhẹ, nhưng hiếm khi gây ra ung thư xâm lấn.
- Nhóm “có nguy cơ cao” (high risk HPV): gồm các type 16, 18, 31, 33, 35,
39, 45, 51, 52, 56, 58, 59; lây truyền qua đường tiếp xúc tình dục. Nếu nhiễm lâu
dài các type HPV thuộc nhóm này sẽ có nguy cơ mắc UTCTC rất cao. HPV 16 và
HPV 18 chịu trách nhiệm cho hơn 70 % các ca UTCTC trên toàn thế giới.
- Nhóm “có nguy cơ trung gian” (intermediate HPV): gồm các type 26, 53, 66,
68, 73, 82. Nhóm này có liên quan đến các tổn thương biểu mô mức độ cao nhưng
hiếm khi tìm thấy trong các trường hợp ung thư xâm lấn. Trường hợp HPV 53 lại
thường xuyên được tìm thấ
y trong các phụ nữ không mắc ung thư.

1.1.2.3. Đặc điểm của HPV
HPV là dạng virus cổ, không có màng bao, đường kính khoảng 55 nm, có
DNA mạch đôi dạng vòng, kích thước khoảng 8.000 cặp base. HPV có 8 gene – hay
là khung đọc mở (open reading frame – ORF) – mã hóa cho các protein chức năng
Phần 1: Tổng quan tài liệu

3

của virus. Bộ gene của HPV được chia thành 3 phần: vùng gene sớm, vùng gene
muộn và vùng điều hòa dài.
Vùng gene sớm (early gene): nằm phía dưới vùng điều hòa dài; có chiều dài
khoảng 4.500 cặp base; chứa các gene cần thiết cho quá trình sao mã bộ gene virus,
quá trình điều hòa nhân tố phiên mã và hoạt động biến đổi tế bào gây ung thư, đồng
thời cũng có vai trò trong sự tăng sinh không kiểm soát của tế bào. Gồm 6 ORF mã
hóa cho các protein sớm là E1, E2, E4, E5, E6, và E7.
Vùng gene muộn (late gene): dài khoảng 2.500 cặp base, gồm 2 ORF mã hóa
cho 2 protein cấu trúc là protein vỏ
capsid chính (L1) và protein vỏ capsid phụ (L2),
được tạo ra trong giai đoạn muộn của chu trình sống của virus, dùng để đóng gói
virion.
Vùng điều hòa dài (long control region – LCR) hay còn gọi là vùng điều hòa
thượng nguồn (upstream regulatory region – URR): nằm kế bên vị trí khởi đầu sao
mã của virus, dài khoảng 1.000 cặp base, không mã hóa cho protein, gồm nhiều vị
trí gắn chồng lấp của các nhân tố điều hòa phiên mã như NF-1, AP1, KRF-1, Oct-l,
SP-1, YY-1 và thụ thể của glucocorticoid. Vùng URR này điều hòa quá trình sao
mã, phiên mã của các gene sớm, gene muộn c
ũng như quá trình xâm nhiễm của
virus [11], [14], [43], [71].

Hình 1.1. Cấu trúc bộ gene của HPV [43]
Phần 1: Tổng quan tài liệu

4

1.1.2.4. Cơ chế gây ung thư của HPV
Tất cả các type HPV đều phân chia trong nhân của tế bào chủ. Đối với nhóm
HPV chỉ gây ra các tổn thương lành tính thì DNA bộ gene của virus tồn tại độc lập

với DNA của tế bào chủ và nhân đôi như dạng episome hoặc plasmid. Ngược lại,
trong các tổn thương ác tính liên quan tới HPV 16 và HPV 18 thì DNA virus lại
thường sát nhập vào bộ gene của tế bào chủ.
Để có thể sáp nhập vào bộ gene tế bào ch
ủ thì phải xảy ra một sự đứt gãy
trên bộ gene virus, thường là ở vùng E1/E2. Sự đứt gãy này dẫn tới việc mất chức
năng của gene E1 và E2, từ đó mất kiểm soát sự biểu hiện của E6 và E7, làm cho tế
bào bị biến đổi. Vị trí sát nhập vào bộ gene tế bào chủ khá ngẫu nhiên và dường như
không có vai trò nhiều trong quá trình phát sinh ung thư.
Hoạt tính gây ung thư của E6 và E7 chủ yếu là do khả năng tương tác v
ới các
protein nội bào có vai trò điều hòa kiểm soát chu trình tế bào như p53 và pRB. Hai
protein này được biết như là các protein ức chế khối u vì nó ức chế sự phân chia và
tăng trưởng của tế bào. Việc E6 gắn lên p53 và E7 gắn lên pRB dẫn đến sự phân
hủy hai protein này, làm mất chức năng kiểm soát sự tăng trưởng tế bào của chúng
và gây phát sinh ung thư [11].

1.2. PROTEIN E7 CỦA HPV VÀ UTCTC
1.2.1. Cấu trúc
Protein E7 là một polypeptid nhỏ, có tính acid, gồm khoảng 100 amino acid.
E7 có 3 vùng bả
o tồn (CR) là vùng CR1 ở đầu NH
2
, vùng CR2 ở giữa và vùng CR3
ở đầu COOH [13].
Vùng CR1 và CR2 của E7 cho thấy sự tương đồng trình tự với một phần
vùng CR1 và toàn bộ vùng CR2 của adenovirus E1A. Cũng giống như ở E1A, hai
vùng bảo tồn này đóng vai trò rất quan trọng trong hoạt động gây ung thư của E7 ở
các type HPV có nguy cơ cao [40]. Vùng CR1 cần thiết cho hoạt động biến đổi tế
bào và phân hủy pRB (retinoblastoma tumor suppressor protein) nhưng lại không

tham gia trực tiếp vào quá trình gắn lên pRB của E7 [13]. Vùng CR2 có chứa motif
Phần 1: Tổng quan tài liệu

5

Leu-X-Cys-X-Glu (LXCXE) cần cho sự gắn kết giữa E7 và pRB. Kế motif
LXCXE là một vị trí phosphoryl hóa của kinase casein II (CK II) cần cho hoạt động
biến đổi tế bào của E7. Vùng CR3 chứa một cấu trúc gắn kẽm gồm hai motif
Cys-X-X-Cys có chức năng dimer hóa mặc dù vẫn chưa có bằng chứng thuyết phục
nào cho thấy rằng E7 tồn tại in vivo hay in vitro ở dạng dimer cũng như dạng dimer
này là cần thiết cho hoạt tính sinh học của E7. Cấu trúc motif này t
ương tự như
protein E6 của HPV, từ đó có thể suy ra hai protein này có một tổ tiên chung.
Các nghiên cứu cấu trúc của E7 chứng minh là vùng CR1 và CR2 của E7
không gấp cuộn trong khi vùng CR3 gấp cuộn thành dạng cấu trúc gắn kẽm đặc
trưng [40].



1.2.2. Vai trò của protein E7 trong UTCTC
Bên cạnh protein E6, E7 cũng là một nhân tố gây ung thư chính của các type
HPV có nguy cơ cao. E6 và E7 là hai protein virus duy trì sự biểu hiện và hoạt tính
của chúng trong suốt chu trình sống của virus cũng như quá trình phát sinh ung thư.
E7 có vai trò quan trọ
ng trong hoạt động làm bất tử hóa, chuyển dạng tế bào, cảm
ứng sự hình thành khối u ở các tế bào biểu mô thông qua 3 cơ chế chính.

1.2.2.1. Tác động lên sự tăng trưởng và phân chia của tế bào
Theo một số nghiên cứu, protein E7 được tìm thấy chủ yếu trong nhân, nơi
mà nó liên kết với pRB cũng như các protein thuộc họ “pocket protein” như p107

CR3
Hình 1.2. Cấu trúc của protein E7 [40]
Phần 1: Tổng quan tài liệu

6

và p130 thông qua motif LXCLE trên CR2, để kích thích tế bào tiến vào pha S.
Trong tế bào bình thường, các pRB được phosphoryl hóa vào giai đoạn sớm của pha
G1 và gắn với nhân tố phiên mã E2F - một tác nhân điều hòa quan trọng cho quá
trình tế bào thóat khỏi pha G1 và tiến vào pha S – hình thành một phức hợp ức chế
phiên mã. Bằng cách gắn vào và cảm ứng sự phân hủy pRB thông qua cơ chế hình
thành các phức hợp ly giải protein (proteosomal), E7 ngăn cản pRB liên kết với
E2F. E2F tự do sẽ hoạt động như một nhân tố
tăng cường phiên mã, kích thích tế
bào vượt qua pha G1 và tiến vào pha S, từ đó tăng sinh một cách không kiểm soát.
Protein E7 của các type HPV có nguy cơ thấp có khả năng gắn với pRB giảm gấp
10 lần so với E7 của các type HPV có nguy cơ cao. Điều này là do sai khác một
amino acid (ví dụ như aspartate ở vị trí thứ 21 trên E7 HPV 16 thay vì glycine ở vị
trí 22 trên E7 HPV 6) và amino acid này là vị trí quyết định cho việc gắn pRB và
khả năng làm biến đổi tế bào của E7 [13], [40].
Ngoài khả năng gắn và phân hủy pRB, các protein E7 của các type HPV có
nguy cơ cao còn can thiệp vào chu trình phân bào bình thường bằng nhiều cơ chế
khác như tương tác và làm dừng hoạt tính ức chế tăng trưởng của các chất ức chế
kinase phụ thuộc cyclin (cyclin-dependent kinase inhibitors – CKI) p21 và p27. Các
tương tác này làm gia tăng lượng cyclin E và A, từ đó dẫn đến tình trạng duy trì
tổng hợp DNA trong các tế bào biểu mô đã biệt hóa [40].
Hình 1.3. Tác động của protein E7 lên các quá trình nội bào [42]
Phần 1: Tổng quan tài liệu

7

1.2.2.2. Ức chế apoptosis
Protein E7 của HPV còn có khả năng kích thích tăng sinh tế bào thông qua
các cơ chế ức chế apoptosis. Việc protein pRB bị bất hoạt bởi E7 sẽ cảm ứng con
đường apoptosis phụ thuộc p53. Tuy nhiên, p53 lại là mục tiêu của E6, bị E6 cảm
ứng phân hủy theo con đường phụ thuộc ubiquitin.
Bên cạnh đó, HPV còn ức chế anoikis, một trong những con đường apoptosis
chính, được cảm ứng khi tế bào cố tiến vào pha S dù đã mất tính bám dính t
ế bào.
Việc kháng lại anoikis được xem như dấu ấn quan trọng cho sự chuyển dạng của tế
bào. Protein E7 ngăn chặn anoikis thông qua tương tác với protein p600, là một
protein ubiquitin ligase trong tế bào chất, liên kết với pRB. Các thí nghiệm cho thấy
tương tác giữ E7 và p600 có thể ức chế anoikis và bảo vệ các tế bào mất tính bám
khỏi apoptosis.
Ngoài ra, các protein E7 còn can thiệp vào tác động của rất nhiều cytokine
ức chế tăng trưởng như TGF-β và TNF-α. TGF-β là một chất ức chế quan trọng lên
sự tăng trưởng của tế bào biểu mô và sự kháng lại hoạt tính của TGF- β là dấu hiệu
của sự hình thành khối u ở biểu mô. Quá trình kháng lại TGF- β ở các tế bào nhiễm
HPV là một quá trình nhiều bước. Thêm vào đó, các tế bào UTCTC nhiễm HPV
cũng có khả năng kháng lại TNF-α, một chất cảm ứng quan trọng do tế bào T độc
tiết ra đáp
ứng lại sự nhiễm virus.
Interferon (IFN) là chất được tiết ra để đáp ứng lại sự nhiễm virus. Sự biểu
hiện các gene IFN được cảm ứng bởi các nhân tố điều hòa IFN (IRF). Protein E7 đã
cho thấy có khả năng tương tác và ức chế hoạt tính tăng cường phiên mã của nhân
tố IRF-1. Protein E6 cũng có thể gắn và ức chế hoạt động của nhân tố IRF-3. Ngoài
ra, protein E6 và E7 còn ức chế hoạt tính của STAT1, m
ột nhân tố điều hòa phiên
mã quan trọng cho các gene IFN [39], [40], [42].

1.2.2.3. Gây mất tính ổn định của bộ gene
Việc biểu hiện E7 trong tế bào chủ làm cho bộ gene bị mất tính bền vững.
Bằng cách gia tăng lượng trung thể, E7 còn gây ra tình trạng số nhiễm sắc thể của tế
Phần 1: Tổng quan tài liệu

8

bào không còn là bội số của bộ đơn bội, góp phần vào quá trình phát sinh ung thư
[13].
Protein E7 có thể làm mất sự ổn định của bộ gene thông qua việc cảm ứng sự
phá hủy DNA và hoạt hóa con đường ATM-ATR. Sự mất tính ổn định bộ gene do
E7 gây ra sẽ làm gia tăng khả năng sát nhập DNA virus vào bộ gene của tế bào chủ,
từ đó tăng khả năng chuyển dạng tế bào và phát sinh ung thư [42].

1.3. CÁC PH
ƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN UTCTC
1.3.1. Các phương pháp dựa trên cơ sở tế bào học
1.3.1.1. Xét nghiệm Pap (Pap smear)
Xét nghiệm Pap, hay còn được gọi là phết tế bào âm đạo - cổ tử cung, được
phát triển từ những năm 1930 bởi một bác sĩ người Hy Lạp là George Papanicolaou.
Đây là một xét nghiệm tế bào học dùng để phát hiện các bất thường trong tế bào cổ
tử cung [29].
Phương pháp này hiện nay vẫn là phương pháp đầu tiên dùng để
phát hiện
ung thư có liên quan đến các type HPV có nguy cơ cao. Các chương trình tầm soát
dựa trên phương pháp này đã góp phần làm giảm một nửa đến hai phần ba tỉ lệ mắc
UTCTC và tử vong do bệnh này và thậm chí giảm tới 90 % ở những nơi có các
chương trình tầm soát tốt [15].
Tuy nhiên, do tính chủ quan của các tiêu chuẩn xét nghiệm nên phương pháp

này vẫn còn nhiều hạn chế như:
- Kết quả phụ thuộc nhiều vào chất lượng thu và đọc mẫu tế bào [15].
- Cho tỉ lệ âm tính giả cao (15-25 %) do chưa đủ độ nhạy trong việc phát hiện
hết các bất thường tế bào, do đó cần kiểm tra lại nhiều lần [7], [49].
- Đòi hỏi thời gian, kĩ thuật viên có tay nghề cao, không thể tiến hành với số
lượng mẫu lớn [61].



Phần 1: Tổng quan tài liệu

9

1.3.1.2. Phương pháp Liquid based cytology
Phương pháp này còn gọi là phương pháp tế bào học bằng dung dịch được
phát triển dựa trên xét nghiệm Pap, sử dụng một bàn chải cổ tử cung để thu mẫu.
Sau đó mẫu sẽ được cố định trong một dung dịch bảo quản và sau đó được đem đi
phân tích. Mẫu chuẩn bị theo phương pháp này dễ đọc và phân tích hơn vì nó có
dạng lớp đơn tế bào nên hạn ch
ế được trường hợp độ dày mẫu không đều, không có
dịch nhầy, protein, hồng cầu, nấm men và vi khuẩn. Hơn nữa, với phương pháp này
sẽ giúp thu hoàn toàn lượng tế bào bong ra [15], [60].

1.3.2. Các nghiên cứu phát hiện HPV dựa trên tương tác miễn dịch
1.3.2.1. Phát hiện kháng thể kháng HPV
Có rất nhiều thử nghiệm huyết thanh học để phát hiện kháng thể kháng HPV
đã được nghiên cứu như ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (Radio
immuno assay), ELISA cạnh tranh … Trên thự
c tế, kháng thể kháng HPV chỉ được
tìm thấy trong huyết thanh của 50 – 60 % những người có mang DNA HPV. Ngoài

huyết thanh, kháng thể kháng HPV còn có thể được tìm thấy trong dịch âm đạo
hoặc buồng trứng.
Các phương pháp phát hiện kháng thể thường nhắm vào kháng thể kháng
protein vỏ capsid L1 như các nghiên cứu của Sehr và cộng sự (2002) [58]. Tuy
nhiên, thử nghiệm ELISA dựa trên VLP để phát hiện kháng thể kháng L1 không thể
giúp phân biệt được việc nhiễm HPV là hiện tại hay trong quá khứ. Các thử nghiệm
nhằm phát hiện kháng thể kháng E6 và E7 cũng đang được phát triển [48].

1.3.2.2. Phát hiện các protein virus
Các protein gây ung thư của HPV hầu hết đều đã được phát hiện bằng
phương pháp nhuộm miễn dịch mẫu tế bào hoặc mẫu mô bệnh phẩm bằng các
kháng thể đơn dòng và đa dòng. Các phương pháp hóa tế bào và hóa mô miễn dịch
dùng để phát hiện E6 và E7 trong giai đoạn đầu của ung thư đang được nghiên cứu
phát tri
ển để trở thành các xét nghiệm nhanh dùng trong chẩn đoán [48]. Ngoài ra,
Phần 1: Tổng quan tài liệu

10

có các công trình như của Selvey và cộng sự (1992) xây dựng quy trình ELISA phát
hiện E7 HPV 16 và 18 trong các dòng tế bào nuôi cấy [59], công trình của
Frazer và cộng sự (1995) xây dựng các thử nghiệm miễn dịch để phát hiện UTCTC
[25], công trình của Roger và cộng sự (2006) phát triển một que thử miễn dịch để
phát hiện E6 HPV 16 [55].

1.4. KĨ THUẬT HÓA TẾ BÀO MIỄN DỊCH (IMMUNOCYTOCHEMISTRY)
1.4.1. Khái niệm
Kĩ thuật hóa tế bào miễn dịch là sự kết hợp giữa phả
n ứng miễn dịch của
kháng nguyên – kháng thể và phản ứng hóa học để phát hiện một protein mục tiêu

in situ trong tế bào bằng cách tạo ra một tín hiệu màu ghi nhận được khi quan sát
dưới kính hiển vi quang học [16].
Về cơ bản, kĩ thuật hóa tế bào miễn dịch có thể chia thành 4 bước chính:
- Toàn bộ các bước tiền xử lý trước khi ủ mẫu với kháng thể sơ cấp, bao gồm:
cố đị
nh mẫu, khóa các vị trí không đặc hiệu, khóa tín hiệu enzyme nội sinh, bộc lộ
kháng nguyên.
- Toàn bộ các phản ứng miễn dịch xảy ra giữa kháng thể và kháng nguyên
mục tiêu trong mẫu, bao gồm: ủ kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp.
- Phát hiện tương tác giữa kháng nguyên – kháng thể thông qua phản ứng hiện
màu bằng cơ chất của eznyme.
- Phân tích kết quả [53].

1.4.2. Các bước cần lưu ý trong quy trình hóa t
ế bào miễn dịch
1.4.2.1. Cố định mẫu (Fixation)
Cố định mẫu là phương pháp dùng để bảo quản các thành phần nội bào, bao
gồm các protein hòa tan và protein cấu trúc; ngăn chặn quá trình tự phân giải của
các thành phần tế bào; ổn định cấu trúc của các thành phần nội bào khỏi tác động
phá hủy của các bước tiếp theo [51].
Phần 1: Tổng quan tài liệu

11

Có hai phương pháp cố định mẫu chủ yếu là phương pháp biến tính
(denaturing) và phương pháp tạo liên kết chéo (cross linking). Phương pháp biến
tính sử dụng nhiệt hoặc các dung môi hữu cơ. Dạng cố định này phá hủy cấu trúc
bậc 3 của protein bằng các phá vỡ các liên kết kị nước, làm cho các thành phần tế
bào bị rửa trôi trong suốt quá trình cố định. Phương pháp tạo liên kết chéo là
phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất hi

ện nay. Tác nhân hóa học sử dụng để cố
định sẽ tạo các liên kết chéo với các gốc hoạt động trên protein, lipid, giữ chúng ở
nguyên vị trí ban đầu trong tế bào. Tuy nhiên, quá trình cố định quá mức sẽ tạo nên
một mạng lưới liên kết phân tử, ngăn chặn sự thâm nhập của kháng thể vào tế bào.
Tác nhân cố định chủ yếu sử dụng nhất trong lĩnh vực mô học hiện nay là
paraformaldehyde [16].
Đối vớ
i các mẫu dịch phết tế bào, tác nhân cố định thường được sử dụng là
ethanol 95 %. Ethanol cho hiệu quả cố định tốt đối với hầu hết các loại kháng
nguyên khác nhau [12].

1.4.2.2. Bộc lộ kháng nguyên (Antigen retrieval)
Quá trình cố định mẫu làm thay đổi cấu trúc bậc bốn của kháng nguyên, có
thể làm mất đi khả năng nhận biết đặc hiệu của kháng thể đối với kháng nguyên.
Quá trình bộc lộ
kháng nguyên cho phép hồi phục lại các biến đổi xảy ra trong quá
trình cố định, giúp trả lại cấu hình ban đầu của kháng nguyên. Sự cần thiết của việc
tiến hành bộc lộ kháng nguyên không chỉ phụ thuộc vào loại kháng nguyên mục
tiêu mà còn phụ thuộc vào kháng thể sử dụng. Các kháng thể đa dòng thường vẫn
duy trì được khả năng nhận biết kháng nguyên mục tiêu mà không cần xử lý bộc lộ
kháng nguyên [51].
Có nhiều phươ
ng pháp bộc lộ kháng nguyên khác nhau:
- Sử dụng enzyme phân giải: các protease thường được sử dụng là trypsin,
proteinase K, pronase, ficin và pepsin. Phương pháp này làm phân giải các protein,
tuy nhiên hoạt tính này là không đặc hiệu và có thể làm ảnh hưởng tới kháng
Phần 1: Tổng quan tài liệu

12

nguyên mục tiêu. Tác động của phương pháp này phụ thuộc vào loại enzyme, thời
gian ủ, pH…
- Sử dụng nhiệt: phương pháp này dựa trên bằng chứng thực nghiệm là các
liên kết hóa học hình thành giữa protein nội bào và tác nhân cố định có thể được
phá vỡ bởi nhiệt độ cao. Cơ chế của quá trình này chưa được hiểu rõ, tuy nhiên nó
có thể khôi phục lại cấu hình của các protein sau quá trình cố định. Có nhiều dung
dịch và cách thứ
c khác nhau được sử dụng để bộc lộ kháng nguyên ở nhiệt độ cao
từ 95
o
C đến 100
o
C. Các dung dịch thường dùng nhất là citrate 10 mM pH 6,
Tris-HCl 10 mM pH 1-10, EDTA pH 8. Có thể gia nhiệt bằng bể nước, lò vi sóng,
nồi áp suất, nồi hấp… Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất và cho hiệu
quả tốt nhất đối với hầu hết các loại kháng nguyên.
- Sử dụng chất tẩy: các chất tẩy như triton X100, tween 20, saponin cũng có
thể được dùng để bộc lộ kháng nguyên [12], [35], [51], [53].

1.4.2.3. Lựa chọn h
ệ thống phát hiện
Tương tác kháng nguyên – kháng thể không thể quan sát được dưới kính
hiển vi quang học mà không thông qua các phân tử đánh dấu. Các phân tử đánh dấu
có thể được gắn vào kháng thể sơ cấp, kháng thể thứ cấp hay một hệ thống phát
hiện để giúp quan sát được phản ứng miễn dịch có xảy ra hay không. Rất nhiều loại
phân tử đánh dấu được sử dụng, phổ biến nh
ất là hai enzyme alkaline phosphatase
và peroxydase. Có hai loại hệ thống phát hiện là phát hiện trực tiếp và phát hiện
gián tiếp.

 Hệ thống phát hiện trực tiếp
Đây là dạng phát hiện đơn giản nhất được ứng dụng trong hóa tế bào miễn
dịch. Trong hệ thống phát hiện này, phân tử đánh dấu được gắn trực tiếp lên kháng
thể sơ cấp, phản ứng chỉ xảy ra một bước. Phươ
ng pháp này tiến hành nhanh chóng
nhưng độ nhạy không cao.
Phần 1: Tổng quan tài liệu

13

Hình 1.4. Hệ thống phát hiện trực tiếp [12]

 Hệ thống phát hiện gián tiếp
Hệ thống này cho phép tăng độ nhạy của phương pháp phát hiện, sử dụng
kháng thể sơ cấp không đánh dấu và kháng thể thứ cấp kháng kháng thể sơ cấp
đánh dấu. Có nhiều dạng biến đổi khác nhau của hệ thống gián tiếp:
- Hệ thống avidin – biotin: tận dụng tương tác
đặc hiệu giữa
avidin/streptavidin và biotin. Có hai hệ thống phổ biến nhất đang được sử dụng là
hệ thống ABC và LAB hoặc LSAB. Trong hệ thống ABC, kháng thể thứ cấp được
đánh dấu biotin và sẽ được phát hiện bởi avidin và phức hợp biotin gắn cộng hợp
với enzyme. Còn với hệ thống LAB hay LSAB thì kháng thể thứ cấp đánh dấu
biotin sẽ được phát hiện bởi phức hợp avidin/streptavidin gắn cộ
ng hợp với enzyme.
Hệ phát hiện này cho phép tăng độ nhạy của phản ứng nhưng lại có tín hiệu nền
cao.
Hình 1.5. Hệ thống avidin-biotin. (a) ABC, (b) LAB hoặc LSAB [12]

Phần 1: Tổng quan tài liệu

14

- Hệ thống sườn polymer – kháng thể thứ cấp – enzyme: đây là hệ thống sử
dụng một dạng sườn polymer gắn cộng gộp lên đó nhiều phân tử kháng thể thứ cấp
và enzyme, cho phép tăng hiệu quả khuyếch đại tín hiệu lên. Phương pháp này chỉ
gồm hai bước nên rất đơn giản, độ nhạy tương đương hoặc có khi tốt hơn hệ thống
ABC và LAB, hạn chế
được tín hiệu nền gây ra bởi biotin hay avidin nội sinh, tuy
nhiên lại khá đắt tiền. Hiện nay, có nhiều hệ thống polymer thương mại được sử
dụng rộng rãi như EnVision, PowerVision, Imm-PRESS… [12], [51].
Hình 1.6. Hệ thống polymer – kháng thể thứ cấp – enzyme [12]


1.4.3. Các nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật hóa tế bào miễn dịch phát hiện
UTCTC
Hiện nay, các nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật hóa tế bào và hóa mô miễn dịch
vào phát hiện UTCTC tập trung trên m
ột số protein marker chính của UTCTC như
protein E6, E7 của các type HPV nguy cơ cao, p16
ink4a
, Ki-67… Jeon và cộng sự
(2007) đã xây dựng quy trình hóa tế bào miễn dịch phát hiện protein E7 của HPV
16 trong dịch phết cổ tử cung [32]. Valkova và cộng sự (1984) cũng tiến hành phát
hiện các kháng nguyên màng của tế bào biểu mô trong dịch phết cổ tử cung [64].
Các nghiên cứu của Fiedler và cộng sự (2004), Ressler và cộng sự (2007) tiến hành
phát hiện protein E7 của HPV 16 trong mẫu sinh thiết cổ tử cung bằng phương pháp
hóa mô miễn dịch [24], [54]. Bên cạnh đó còn có rất nhiều công trình phát hiện
Phần 1: Tổng quan tài liệu

15

protein p16
ink4a
và Ki-67 trong dịch phết và mẫu sinh thiết cổ tử cung để phát triển
các phương pháp chẩn đoán UTCTC [34], [57], [66].

1.5. KĨ THUẬT IMMUNO-PCR
1.5.1. Khái niệm
Kĩ thuật immuo-PCR được giới thiệu đầu tiên bởi Sano và cộng sự vào năm
1992 [56]. Đây là kĩ thuật kết hợp giữa ELISA (Enzyme-linked immunosorbent
assay) và PCR (Polymerase chain reaction), tận dụng độ đặc hiệu của tương tác
kháng nguyên – kháng thể trong ELISA và độ nhạy của phản ứng PCR để t
ạo ra
một công cụ cho phép phát hiện các protein hiện diện ở nồng độ rất thấp trong mẫu.
Immuno-PCR có độ nhạy so với ELISA truyền thống hơn từ 100 – 10.000
lần. Từ khi ra đời đến nay, immuno-PCR ngày càng được phát triển thành một công
cụ có khả năng ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu miễn dịch cơ bản cũng như
ứng dụng [38], [44].

Hình 1.7. ELISA và immuno PCR. Nguyên lý và độ nhạy của hai phương pháp
[44]

1.5.2.
Nguyên lý
Immuno-PCR gồm 2 bước cơ bản:
- Phản ứng miễn dịch: cho phép phát hiện protein mục tiêu trong mẫu thông
qua tương tác kháng nguyên – kháng thể. Bước này tương tự như ELISA, có thể là
dạng trực tiếp (mẫu có kháng nguyên mục tiêu được phủ trực tiếp lên giếng) hoặc
Phần 1: Tổng quan tài liệu

16

gián tiếp (kháng nguyên mục tiêu trong mẫu được bắt giữ thông qua một kháng thể
phủ sẵn trên giếng).
- Phản ứng khuếch đại tín hiệu: cho phép nhận biết tương tác đặc hiệu giữa
kháng nguyên – kháng thể thông qua sự có mặt của các phân tử DNA marker liên
kết với kháng thể “phát hiện”. Các phân tử DNA này sẽ được nhân bản lên bằng
phản ứng PCR hoặc realtime PCR [5], [38].

1.5.3. Các dạng immuno-PCR
Sự phát triển của các dạ
ng immuno-PCR phụ thuộc vào hai yếu tố quan
trọng: (1) công nghệ gắn đoạn DNA marker vào kháng thể “phát hiện” sao cho tạo
được phức hợp bền vững đồng thời giảm công sức chuẩn bị cũng như thời gian thực
hiện; (2) sử dụng phương pháp phát hiện tín hiệu khuếch đại thông qua điện di hay
realtime PCR.
Hiện nay, có rất nhiều dạng immuno-PCR đã được phát triển và ứng dụng
rộng rãi trong rấ
t nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau. Nhưng nhìn chung có thể
chia thành 4 dạng chính: immuno-PCR cổ điển (original immuno-PCR), immuno-
PCR phổ biến (universal immuno-PCR), immuno-PCR trực tiếp (direct immuno-
PCR) và immuno-PCR kết hợp với các kĩ thuật hiện đại (advanced immuno-PCR)
[38].

1.5.3.1. Immuno-PCR cổ điển
Đây là dạng immuno-PCR đầu tiên được phát triển, sử dụng một protein lai
giữ protein A và avidin hoặc streptavidin (STV) để liên kết kháng thể “phát hiện”
và đoạn DNA marker đánh dấu biotin. Protein lai này được tạo ra bằng công ngh
ệ
tái tổ hợp gene, tận dụng khả năng gắn của protein A lên kháng thể và khả năng

tương tác của STV với biotin. Sano và cộng sự (1992) đã ứng dụng dạng immuno-
PCR này để phát hiện protein BSA (bovine serum albumin) cố định trực tiếp trên
giếng với độ nhạy đạt được là 9,6x10
-22
mol [56].
Phần 1: Tổng quan tài liệu

17

Tuy nhiên, phương pháp này bộc lộ một số nhược điểm: do khả năng tương
tác không đặc hiệu với tất cả kháng thể của protein A nên không thể ứng dụng trong
các dạng immuno-PCR “kẹp chả” sử dụng thêm một kháng thể “bắt giữ” phủ sẵn
trên giếng. Đồng thời, protein lai protein A – STV này không dễ dàng chế tạo được
nên rất khó được ứng dụng rộng rãi [4], [38].
Hình 1.8. Immuno-PCR cổ điển, s
ử dụng protein lai giữa protein A và
streptavidin [4]

1.5.3.2. Immuno-PCR phổ biến
Đây là dạng immuno-PCR được ứng dụng rộng rãi nhất trong các nghiên
cứu, được mô tả đầu tiên bởi Zhou và cộng sự (1993) [70], dựa trên khả năng tự
hình thành phức hợp giữa DNA đánh dấu biotin, STV và phức hợp kháng thể đánh
dấu biotin – kháng nguyên mục tiêu.
Dạng immuno-PCR này cho phép ứng dụng trong phát hiện trực tiếp và gián
tiếp. Các thành phần trong phản ứng có thể tiế
p cận dễ dàng. STV đã được chứng
minh là ít có ái lực không đặc hiệu với các protein ngoại lai hơn so với avidin, giúp
giảm tín hiệu nền của phản ứng. Các kháng thể đánh dấu biotin được thương mại
hóa khá nhiều, và cũng có thể được tự chuẩn bị một cách dễ dàng tại phòng thí
nghiệm bằng cách sử dụng các kit biotin hóa. Đoạn DNA marker đánh đánh dấu

biotin được tạo ra bằng phương pháp PCR đơ
n giản với cặp mồi có đánh dấu sẵn
Phần 1: Tổng quan tài liệu

18

biotin ở một đầu hoặc sử dụng phương pháp đánh dấu bằng đoạn Klenow hay
Sequenase polymerase. Một ưu điểm nữa của dạng immuno-PCR này là STV có thể
được thay thế bởi STV cộng hợp với enzyme để ứng dụng trong phương pháp
ELISA tương ứng, cho phép ELISA và immuno-PCR được thực hiện đồng thời. Tất
cả các ưu điểm này đã giúp cho immuno-PCR phổ biến trở thành dạng được s
ử
dụng nhiều nhất hiện nay trong các nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật immuno-PCR.
Hình 1.9. Immuno-PCR phổ biến. (i) gián tiếp, (ii) trực tiếp [38]

Tuy nhiên, dạng immuno-PCR này cũng có một số nhược điểm. Thứ nhất,
dạng này đòi hỏi nhiều bước ủ và rửa, làm gia tăng thời gian thực hiện cũng như
khả năng ngoại nhiễm, đồng thời cũng làm giảm hiệu quả phát hiệ
n. Thứ hai, dạng
immuno-PCR này không cho phép phát hiện đồng thời nhiều kháng nguyên mục
tiêu hiện diện trong mẫu [4], [38].

1.5.3.3. Immuno-PCR trực tiếp
Immuno-PCR trực tiếp là dùng để mô tả việc đoạn DNA marker được gắn
trực tiếp vào kháng thể “phát hiện” bằng liên kết hóa học, không thông qua tương
tác giữa STV và biotin. Phương pháp này được đề nghị bởi Joerger và cộng sự
(1995). Đoạn DNA gắn vào kháng thể có thể là mạch đơn hoặc m
ạch đôi. Tuy