thực hành kỹ thuật nhuộm ba màu của masson’s trên mô bệnh học bệnh nhân xơ gan và tìm hiểu một số yếu tố liên quan

B GIO DC V O TO B Y
T
TRNG I HC Y H NI
***.
NGUYN MNH TUN
THựC HàNH Kỹ THUậT NHUộM
MASSON S
TRÊN MÔ BệNH HọC BệNH NHÂN XƠ
GAN
Và TìM HIểU MộT Số YếU Tố LIÊN QUAN
KHểA LUN TT NGHIP C NHN Y KHOA
KHểA 2009- 2013
H Ni- 2013
B GIO DC V O TO B Y T
TRNG I HC Y H NI
***.
NGUYN MNH TUN
THựC HàNH Kỹ THUậT NHUộM
MASSON S
TRÊN MÔ BệNH HọC BệNH NHÂN XƠ
GAN
Và TìM HIểU MộT Số YếU Tố LIÊN QUAN
KHểA LUN TT NGHIP C NHN Y KHOA
KHểA 2009- 2013
Hng dn khoa hc:ThS. Nguyn Hu
Quc
ThS. Hong Trung Kiờn
H Ni- 2013
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn tới Ban Giám Hiệu, Phòng đào tạo Đại Học-
trường Đại Học Y Hà Nội đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em được học

tập, rèn luyện và tu dưỡng tại trường.
Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn
thầy giáo, Ths. Nguyễn Hữu Quốc - người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ
bảo tận tình và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để em có thể hoàn thành tốt
khóa luận này.
Em xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ths. Hoàng Trung Kiên, Ban
Tuyên giáo Thành ủy Hà Nội, thầy đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện thuận
lợi để em hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô và cán bộ trong Bộ môn Giải
phẫu bệnh - trường Đại Học Y Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt
quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, con xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, những người thân
trong gia đình đã tạo mọi điều kiện về tinh thần và vật chất cho con. Cảm ơn
những người bạn đã luôn ủng hộ và động viên tôi trong quá trình học tập và
thực hiện khóa luận.
Nguyễn Mạnh Tuấn
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết
quả nghiên cứu trình bày trong khóa luận là trung thực và chưa từng được công
bố trong bất kỳ công trình khoa học, khóa luận hay tài liệu tham khảo nào.
Hà Nội, ngày…… tháng… năm 2013
Sinh viên
Nguyễn Mạnh Tuấn
MỤC LỤC
TÀI LIỆU THAM KHẢO 8
DANH MỤC BẢNG 9
DANH MỤC BIỂU ĐỒ 9
DANH MỤC HÌNH 10
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giải phẫu, mô học và tế bào học bình thường của gan 3
1.1.1. Giải phẫu gan 3
1.1.2. Mô học gan bình thường 3
1.2. Bệnh xơ gan 4
1.3. Vài nét về mô liên kết 5
1.4. Sợi collagen 5
1.4.1. Collagen type 1 6
1.4.2. Collagen type 2 6
1.4.3. Collagen type 3 6
1.4.4. Collagen type 4 6
1.4.5. Collagen type 5 và 6 6
1.5. Phương pháp nhuộm ba màu của Masson 7
1.5.1. Lịch sử phương pháp nhuộm ba màu của Masson 7
1.5.2. Cơ chế nhuộm 7
1.5.3. Hóa chất dùng trong phương pháp nhuộm ba màu Masson 8
1.6. Pha hóa chất 12
1.6.1. Dung dịch Hematoxylin Ferric 12
1.6.2. Dung dịch Fuchsin – Ponceau 12
1.6.3. Dung dịch acid Phosphomolybdic 1% 12
- Nước cất 12
100ml 12
- Acid Phosphomolybdic 12
1g 12
1.6.4. Dung dịch Blue aniline 12
- Blue aniline 12
2,5g 12
- Acid aceJc 12
2,5ml 12
- Nước cất 12

100ml 12
1.6.5. Dung dịch acid aceJc 1% 12
- Nước cất 12
- Acid aceJc 12
1.6.6. Dung dịch cố định Bouin 12
- Dung dịch acid picric bão hòa 13
75ml 13
- Formol 13
20ml 13
- Acid aceJc lạnh, nguyên chất 13
5ml [8] 13
1.7. Tiến hành 13
1.8. Tiến hành quy trình nhuộm 15
1.8.1. Quy trình nhuộm 15
1.8.2. Kết quả chung 15
CHƯƠNG 2 17
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. Đối tượng nghiên cứu 17
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17
2.3. Mẫu và phương pháp chọn mẫu 17
2.3.1. Tiêu chuẩn chọn mẫu 17
2.3.2. Cỡ mẫu 17
2.4. Phương pháp nghiên cứu 17
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu 17
2.4.2. Phương pháp lấy mẫu 17
Các bloc chúng tôi nghiên cứu đều đã được cố định bằng formol 10% 18
2.4.3. Phương Jện nghiên cứu 18
2.5. Đánh giá kết quả nghiên cứu 18
2.5.1. Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng Jêu bản 19
2.5.2. Tiêu chuẩn đánh giá Jêu bản đạt yêu cầu 19

CHƯƠNG 3 20
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20
3.1. Đánh giá kết quả thực hành kỹ thuật 20
3.2. Các yếu tố liên quan ảnh hưởng tới kết quả thực hành 22
CHƯƠNG 4 32
BÀN LUẬN 32
4.1. Kết quả thực hành 32
4.2. Các yếu tố liên quan 34
KẾT LUẬN 37
Từ kết quả quá trình nghiên cứu, chúng tôi rút ra một số kết luận sau
đây: 37
KIẾN NGHỊ 38
Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi xin được đưa ra một vài kiến nghị với
hy vọng sẽ nâng cao được phần nào chất lượng của một tiêu bản nhuộm
Masson trong Labo Giải phẫu bệnh phục vụ cho công tác chẩn đoán mức
độ xơ gan: 38
1. Đối với phương pháp nhuộm Masson để có được một tiêu bản đẹp thì
yếu tố kỹ thuật của người kỹ thuật viên là yếu tố rất quan trọng. Các yếu
tố kỹ thuật bao gồm các bước liên hoàn: chuyển, đúc, cắt, nhuộm 39
2. Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi thấy rằng tiêu bản nên được cố
định bằng Bouin trước khi thực hiện nhuộm Masson. Nếu bệnh phẩm đã
được cố định từ trước bằng formol 10% thì mảnh cắt nên được cố định
lại bằng Bouin với thời gian là 1giờ ở nhiệt độ 56oC. Như thế, tiêu bản sẽ
rõ ràng hơn độ tương phản của các thành phần 39
Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy có thể thay thế Light green cho Blue
aniline. Mặc dù Light green nhuộm màu collagen kém tương phản và
kém rõ nét hơn Blue aniline nhưng vẫn có thể chấp nhận được nếu như
Labo không có Blue aniline 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng Jêu bản 19
Bảng 2.2. Bảng Jêu chuẩn Jêu bản đạt yêu cầu 19
Bảng 3.1: Kết quả thực hành tháng thứ nhất 20
Bảng 3.2: Kết quả thực hành tháng thứ hai 20
Bảng 3.3: Kết quả thực hành tháng thứ ba 21
Bảng 3.4: Kết quả thực hành tháng thứ tư 21
Bảng 3.5. Bảng kết quả chất lượng Jêu bản có và không cố định bằng Bouin 22
Bảng 3.6: Bảng kết quả nhuộm sợi collagen bằng Blue aniline và Light green 23
Bảng 3.7. Bảng kết quả khi biệt hóa bằng Acid aceJc 1% và 23
không biệt hóa bằng Acid aceJc 1% 23
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Đánh giá tổng quan chất lượng Jêu bản sau các tháng 22
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Gan và các bộ phận lân cận trong ổ bụng 3
Hình 1.2: Một phần Jểu thùy gan cổ điển 4
Hình 1.3: Hình thái bề mặt gan xơ 5
Hình 1.4: C.L Pierre Masson 7
Hình 1.5: Công thức của Hematoxylin 8
Hình 1.6: Cấu trúc acid Fuchsin 9
Hình 1.7: Cấu trúc Ponceau de xylindine 9
Hình 1.8: Cấu trúc acid Phosphomolybdic 10
Hình 1.9: Cấu trúc Blue aniline 10
Hình 1.10: Cấu trúc acid aceJc 11
Hình 1.11: Cấu trúc Light green 11
ĐẶT VẤN ĐỀ
Mô liên kết là loại mô phổ biến nhất có mặt ở hầu hết các bộ phận của
cơ thể, xen giữa các mô và gắn bó chúng với nhau. Mô liên kết được tạo
thành bởi các thành phần chính như: gian bào (còn gọi là dịch mô), các tế bào
liên kết nằm ở gian bào, các sợi liên kết vùi trong chất căn bản. Trong đó đặc
biệt chú ý đến là sợi collagen, đây là sợi liên kết có ở hầu hết các mô liên kết.

Xã hội càng phát triển, bệnh lý về mô liên kết gặp ngày càng nhiều. Xơ
gan là một minh chứng, thường gặp nhiều ở độ tuổi 40. Đây là một bệnh mạn
tính kéo dài có tiên lượng xấu và tỷ lệ tử vong cao. Đến nay, trên thế giới
cũng như ở Việt Nam vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu (kể cả Tây y và
Đông y). Bệnh gây tổn thương lan tỏa ở các thùy gan với xơ hóa, đảo lộn cấu
trúc bình thường của gan dẫn tới hình thành các u, cục tân tạo với các cấu trúc
không bình thường [9]. Nhiễm vius B, C là nguy cơ chính gây xơ gan. Kết
quả một số nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy, tỷ lệ lưu hành virus viêm gan B
tại cộng đồng chiếm khoảng 10- 25% dân số, trong đó tỷ lệ nhiễm virus viêm
gan B ở người khoẻ (8- 25%); tỷ lệ nhiễm virus viêm gan C (0,4- 4,1%) [2].
Một lý do khác gây xơ gan là do rượu, gặp nhiều ở các nước Châu Âu và các
nước có thói quen sử dụng rượu trong đó có Việt Nam.
Ngày nay, tiến bộ trong lĩnh vực khoa học đã giúp chẩn đoán sớm và
điều trị tốt cho bệnh nhân xơ gan nhưng tiên lượng của bệnh xơ gan vẫn rất dè
dặt. Việc đánh giá mức độ viêm gan và xơ hóa của nhu mô gan là thực sự cần
thiết, nhất là những trường hợp xơ gan nặng. Có nhiều kỹ thuật hiện đại giúp
chẩn đoán xơ gan như: siêu âm, CT scanner nhưng sinh thiết gan phục vụ
chẩn đoán giải phẫu bệnh mới là tiêu chẩn vàng để đánh giá tình trạng xơ gan.
Phương pháp nhuộm hai màu thông thường bằng Hematoxylin và Eosin
1
không cho phép quan sát, đánh giá phân biệt bệnh lý của mô liên kết. Năm
1951, phương pháp nhuộm ba màu của nhà giải phẫu bệnh P. Masson được
mô tả như là một bước ngoặt đột phá giúp cho các nhà lâm sàng trong chẩn
đoán bệnh học về mô liên kết. Phương pháp giúp phân biệt rõ được các thành
phần dựa trên sự tương phản màu sắc của mô: nhân, các hồng cầu, sợi huyết,
bào tương và đặc biệt là các sợi collagen.
Các đề tài nghiên cứu trong nước ứng dụng kỹ thuật nhuộm ba màu để
chẩn đoán, phân biệt bệnh lý về mô liên kết còn ít. Mặt khác, chưa có đề tài
nào nghiên cứu một cách toàn diện và cung cấp các thông tin đầy đủ về kỹ
thuật nhuộm ba màu, cũng như ưu, khuyết điểm, các yếu tố ảnh hưởng đến kĩ

thuật nhuộm ba màu và cách khắc phục. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài: “Thực hành kỹ thuật nhuộm ba màu của Masson’s trên
mô bệnh học bệnh nhân xơ gan và tìm hiểu một số yếu tố liên quan”, với
mục tiêu:
1. Thực hành thành thạo kỹ thuật chuyển, đúc, cắt, nhuộm.
2. Một số yếu tố liên quan ảnh hưởng tới kết quả thực hành.
2
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giải phẫu, mô học và tế bào học bình thường của gan
1.1.1. Giải phẫu gan
Gan là cơ quan lớn thứ hai trong cơ thể (sau da). Gan đóng nhiều vai
trò quan trọng khác nhau trong việc bảo tồn sức khỏe của chúng ta. Tùy
theo kích thước và trọng lượng của mỗi cá nhân, gan có sức nặng từ 1.100
đến 1.800 gram. Gan vừa là tuyến ngoại tiết (tiết mật vào tá tràng), vừa là
tuyến nội tiết (tổng hợp một số chất và những chất này được chuyển trực
tiếp vào máu) [7].
Hình 1.1. Gan và các bộ phận lân cận trong ổ bụng
1.1.2. Mô học gan bình thường
Gan được chia làm nhiều thùy. Các thùy gan được tạo thành bởi những
khối nhỏ với cấu trúc điển hình được gọi là tiểu thùy gan. Mỗi tiểu thùy là
một đơn vị cấu trúc và chức năng của gan [7].
3
Mỗi tiểu thùy gan là một khối đa diện có đường kính khoảng 1- 2mm.
Các tiểu thùy chỉ phân cách với nhau rõ rệt ở khoảng cửa (chỗ mô liên kết dày
lên ở góc giữa 3- 4 tiểu thùy).
Gan được tạo thành chủ yếu bởi các tế bào gan. Những tế bào đó hợp
thành những dây tế bào và nối với nhau tạo thành một đơn vị hình thái được
gọi là Kiernan hay còn gọi là tiểu thùy gan.
Hình 1.2: Một phần tiểu thùy gan cổ điển

1.2. Bệnh xơ gan
Xơ gan là bệnh mạn tính gây thương tổn nặng lan toả ở các thuỳ gan.
Đặc điểm thương tổn là mô xơ phát triển mạnh, đồng thời cấu trúc các tiểu
thuỳ và mạch máu của gan bị đảo lộn một cách không hồi phục được [1].
Hình thái học của xơ gan là kết quả của 3 quá trình đồng thời hoặc
nối tiếp:
- Tổn thương hoại tử của các tế bào nhu mô gan.
- Sự tăng sinh của mô xơ.
- Sự tạo thành những hòn, cục tái tạo và những tiểu thuỳ giả.
4
Hình 1.3: Hình thái bề mặt gan xơ
1.3. Vài nét về mô liên kết
Trong số các loại mô cơ bản thì mô liên kết là loại mô phổ biến nhất.
Mô liên kết có mặt ở hầu hết các bộ phận trong cơ thể, xen giữa các mô khác,
giúp chúng gắn bó với nhau [7].
Mô liên kết có nguồn gốc từ lá thai giữa, tức là trung mô. Trong cơ thể
có nhiều loại mô liên kết. Mỗi loại mô liên kết được tạo thành bởi:
- Thành phần gian bào: gồm phần lỏng gọi là dịch mô, phần đặc hơn
có đặc tính của một hệ keo gọi là chất căn bản.
- Các sợi liên kết vùi trong chất căn bản.
- Các tế bào liên kết nằm rải rác trong thành phần gian bào.
Mô liên kết là loại mô giàu thành phần gian bào (được coi như môi
trường bên trong cơ thể). Căn cứ vào sự khác nhau chủ yếu của chất căn bản
người ta phân mô liên kết thành ba loại lớn:
- Mô liên kết chính thức: có mật độ mềm và có mặt ở mọi nơi trong cơ thể.
- Mô sụn: chất căn bản nhiễm cartilagen (chất sụn) có mật độ rắn vừa phải.
- Mô xương: chất căn bản nhiễm ossein và muối canxi vì vậy mật độ rắn.
1.4. Sợi collagen
5
Sợi collagen là một trong ba loại sợi vùi trong chất căn bản liên kết

gồm: sợi collagen, sợi võng và sợi chun. Sợi collagen có mặt ở hầu hết các
mô liên kết, nhưng khác nhau đáng kể về số lượng.
Về nguồn gốc, sợi collagen được hình thành từ protein.
Sợi collagen bắt màu đỏ của thuốc nhuộm Eosin, bắt màu xanh của
Blue aniline.
Đơn vị cấu tạo hình thái của sợi collagen là xơ collagen, có đường kính
trung bình khoảng 50nm quan sát rõ ở kính hiển vi điện tử.
Về mặt sinh hóa, hiện nay đã xác định được trên 20 type collagen khác
nhau. Sự khác nhau này là do có các chuỗi α khác nhau, khi chúng kết hợp
thành bộ ba xuất hiện những hình thái phân tử collagen khác nhau. Một số
type collagen quan trọng:
1.4.1. Collagen type 1
Có trong chân bì da, gân, cân, xương, sụn xơ. Chúng tương tác mức độ
thấp với dermantan sulfat.
1.4.2. Collagen type 2
Có trong sụn trong và sụn chun. Chúng tương tác với chondroitin sulfat.
1.4.3. Collagen type 3
Có trong sợi võng của mô thần kinh đệm, ở mô kẽ của gan, thận, lách,
phổi. Chúng tương tác với heparin sulfat.
1.4.4. Collagen type 4
Có trong lá đáy của màng đáy. Chúng tương tác với heparin sulfat.
1.4.5. Collagen type 5 và 6
6
Collagen type 5 được sản xuất một lượng nhỏ bởi nhiều loại tế bào của
mô liên kết, bao gồm tế bào liên kết, tế bào nội mô và tế bào biểu mô.
Collagen type 6 là cấu trúc giàu cầu nối disunfit. Collagen type 6 được tìm
thấy trong khu vực ranh giới kẽ của sợi collagen type 1 và 2, có chức năng
liên kết các thành phần không phải collagen [6].
1.5. Phương pháp nhuộm ba màu của Masson
1.5.1. Lịch sử phương pháp nhuộm ba màu của Masson

Nhuộm ba màu là một trong những phương pháp nhuộm để phân biệt
các thành phần khác nhau của mô liên kết. Thuật ngữ nhuộm ba màu là tên
thường dùng của kỹ thuật nhuộm chọn lọc cho cơ, sợi collagen, sợi huyết
và hồng cầu.
C.L Pierre Masson (1880-1959)
là một nhà giải phẫu bệnh người
Canada nổi tiếng của thế kỉ 20. Ông
được biết đến như nhà nghiên cứu về u
não và hệ thống thần kinh và những kỹ
thuật mô học như phương pháp nhuộm ba
màu đã trở thành chuẩn trong tất cả các
phòng xét nghiệm bệnh học [13], [14].
Hình 1.4: C.L Pierre Masson
Phương pháp nhuộm mang tên ông được mô tả lần đầu năm 1951 với
nguyên tắc nhuộm: nhuộm phối hợp ba loại phẩm nhuộm, một phẩm nhuộm
nhân bởi Hematoxylin (tốt nhất là Hematoxylin ferric); nhuộm bào tương và
các thành phần khác bằng hỗn hợp phẩm nhuộm acid (Fuchsin acid và
Ponceau S) và nhuộm sợi collagen bằng một phẩm nhuộm acid khác đặc hiệu
là Blue aniline.
1.5.2. Cơ chế nhuộm
7
Các mô xốp được nhuộm màu của các phân tử cực nhỏ của thuốc
nhuộm. Đầu tiên mô được nhuộm màu bởi thuốc nhuộm acid. Sau đó, khi
được nhuộm với các acid Phosphomolybdic, các thành phần ít thấm giữ lại
màu đỏ, trong khi đó màu đỏ bị kéo ra khỏi mô có bản chất collagen. Đồng
thời, gây ra một liên kết với collagen giúp gắn màu xanh của Blue aniline.
1.5.3. Hóa chất dùng trong phương pháp nhuộm ba màu Masson
1.5.3.1. Hematoxylin
Hematoxylin: là một phẩm nhuộm tự nhiên, chiết xuất bằng ete từ lõi
cây Haematoxylon campechianum mọc trong vùng nhiệt đới Campeche ở

Mexico [8].
Hình 1.5: Công thức của Hematoxylin
Hematein bản thân ít ưa các tổ chức, vì vậy, phải dùng một chất gắn
màu. Khi pha với các muối nhôm, sắt crom, đồng hoặc tungsten nó bắt màu
vào nhân rất, nhất là các muối kim loại hóa trị III như nhôm, sắt dưới
dạng alum potassium, chlorua ferric hình thành một hợp chất tích điện
dương mạnh nên cố định các acid nucleic của nhân [8]. Chúng tôi tiến hành
nhuộm nhân trong dung dịch Hematoxylin ferric bởi khả năng bền màu
trong acid hơn so với Hematoxylin alum [6].
8
1.5.3.2. Acid Fuchsin
Acid Fuchsin (thuốc nhuộm gốc acid): là hỗn hợp của sulfonated fuchsins.
Công thức: C
20
H
17
N
3
Na
2
O
9
S
3
Hình 1.6: Cấu trúc acid Fuchsin
1.5.3.3. Ponceau de xylindine
Công thức: C
18
H
14

N
2
O
7
S
2
Hình 1.7: Cấu trúc Ponceau de xylindine
9
1.5.3.4. Acid Phosphomolybdic
Acid Phosphomolybdic, còn được gọi là acid molybdophosphoric
dodeca hoặc PMA là một thành phần của phương pháp nhuộm ba màu của
Masson. Nó là một hợp chất màu vàng- xanh, dễ tan trong nước và các dung
môi hữu cơ cực như ethanol.
Công thức: 12MoO
3
·H
3
PO
4
Hình 1.8: Cấu trúc acid Phosphomolybdic
1.5.3.5. Blue aniline
Công thức: C
37
H
27
N
3
Na
2
O

9
S
3.
-
S
3
O
-
S
3
O
+
HN
N
H
-
S
3
O
N
H
Hình 1.9: Cấu trúc Blue aniline
10
1.5.3.6. Acid acetic
Công thức: C
2
H
4
O
2

Hình 1.10: Cấu trúc acid acetic
Acid acetic là một acid yếu, thuộc nhóm acid 8 monoprotic. Nó tạo ra
gốc liên kết là acetat (CH
3
COO
−
). Dung dịch 1,0 M có pH là 2,4.
1.5.3.7. Light green
Công thức: C
37
H
34
N
2
Na
2
O
9
S
3
.
Hình 1.11: Cấu trúc Light green
11
1.6. Pha hóa chất
1.6.1. Dung dịch Hematoxylin Ferric
Dung dich A:
- Hematoxylin 1g
- Ethyl alchohol 95% 100ml
Dung dịch B:
- Nước cất 95ml

- FeCl
3
30% 1ml
- Acid HCl đậm đặc 1ml
Khi dùng, trộn 100ml dung dịch A vào 100ml dung dịch B. Trộn trước
khi dùng 10 phút, dùng được trong 2 tuần.
1.6.2. Dung dịch Fuchsin – Ponceau
Cách pha:
- Dung dịch Fuchsin acid 1%: 1 thể tích
- Dung dịch Ponceau de xylidine 1% trong dung dich acid acetic
1%: 2 thể tích.
Trộn đều 2 dung dịch trên.
1.6.3. Dung dịch acid Phosphomolybdic 1%
- Nước cất 100ml
- Acid Phosphomolybdic 1g
1.6.4. Dung dịch Blue aniline
- Blue aniline 2,5g
- Acid acetic 2,5ml
- Nước cất 100ml
Cách pha: Đun nóng 100ml nước cất, thêm vào đó 2,5g bột Blue
aniline. Lấy ra khỏi lửa, thêm 2,5ml acid acetic. Đậy bằng nút bông, làm
lạnh rồi lọc.
1.6.5. Dung dịch acid acetic 1%
- Nước cất 100ml
- Acid acetic 1ml
1.6.6. Dung dịch cố định Bouin
12
- Dung dch acid picric bóo hũa 75ml
- Formol 20ml
- Acid acetic lnh, nguyờn cht 5ml [8].

1.7. Tin hnh
* Bnh phm
Hai yêu cầu cơ bản trớc tiên của lấy bệnh phẩm là: phải lấy trúng và lấy
đủ. Những yêu cầu này dễ thực hiện đối với tử thiết hoặc bệnh phẩm phẫu
thuật hơn là với những sinh thiết bằng dụng cụ, nhất là khi tổn thơng ở sâu
hoặc trong các tạng [4], [8].
Bnh phm sau khi c ly s c c nh ngay. Mt bnh phm
c c nh tt phi m bo nhng nguyờn tc sau:
1. Bnh phm phi c c nh ngay sau khi ly.
2. Khụng c lm dp nỏt bnh phm.
3. Bnh phm khụng ct quỏ dy.
4. lng dung dch c nh cn thit.
5. Thi gian c nh dung dch thớch hp.
6. Khụng bnh phm dớnh vo thnh l.
Cỏc mu bnh phm dựng trong k thut mụ hc thng c ct dy
t 3 - 5 mm v c chuyn bng mỏy.
*Chuyn bnh phm
- p dng cho cỏc mnh sinh thit v cỏc mnh mụ nh [4], [5], [8].
Thi gian c nh ti thiu l 3 gi.
1) Ra nh trong nc chy.
2) Cn 80
o
- 10 phỳt.
3) Cn 95
o
x 3 ln x 15 - 20 phỳt.
4) Cn 100
o
x 3 ln x 15 phỳt/ ln.
5) Cn 100

o
/ Xylen t l 1:1 trong 15 phỳt.
13
6) Xylen x 2 lần x 15 phút/ lần.
7) Paraffin x 3 lần x 15 lần/ phút.
8) Paraffin hút chân không từ 15 - 20 phút. Nếu không có hút chân
không thì ở bước (7) tăng thêm mỗi lần 5 phút.
9) Đúc bloc.
- Áp dụng cho các mô thông thường [4], [5], [8].
1) Cồn 80
o
x 1 giờ.
2) Cồn 95
o
x 3 lần x 1 giờ/ lần.
3) Cồn 100
o
x 3 lần x 1 giờ/ lần.
4) Xylen x 3 lần x 1 giờ/ lần.
5) Paraffin x 3 lần x 1 giờ/ lần.
6) Paraffin hút chân không 1 giờ.
* Đúc bloc
Đúc bloc bằng máy AP 280.
* Cắt tiêu bản
Sau khi được chuyển bằng máy sẽ là bước cắt tiêu bản.
Trước khi cắt thì máy cắt cần được kiểm tra cả ốc vít và tra dầu bôi
trơn. Nhiệt độ trong phòng cắt không quá 25
o
C và tốt hơn là cắt trong phòng
có điều hòa. Nếu không có điều kiện thì bloc phải được ngâm vào nước đá để

đảm bảo đủ độ cứng mới cắt mảnh được. Độ nghiêng của lưỡi dao đặt và máy
cắt thích hợp là 45
o
. Chất lượng của mảnh cắt còn phụ thuộc vào nhiệt độ dàn
tiêu bản (nóng không quá 50
o
C) [5], [8].
Như vậy một tiêu bản cắt được coi là đạt yêu cầu nếu:
- Mỏng đều.
- Không xước, gấp hoặc rách.
- Còn nguyên khuôn paraffin quanh bệnh phẩm.
14
- Vị trí của mảnh cắt đặt ở 2/3 của lam từ dưới lên (1/3 của lam từ trên
xuống để ghi mã số bệnh nhân, phía 2/3 dùng để dán nhãn sau khi nhuộm) lúc
này bệnh phẩm nằm ở chính giữa lam kính.
1.8. Tiến hành quy trình nhuộm
1.8.1. Quy trình nhuộm
• Lấy tiêu bản ra khỏi tủ ấm, tẩy paraffin lần lượt bằng Xylen I, II, III.
Sau đó chuyển tiêu bản qua cồn có nồng độ khác nhau từ cồn 100
0
đến cồn
95
0
và rửa nước nhẹ trong 5 phút.
• Cố định lại trong Bouin 1h, nhiệt độ 50
o
C.
• Nhuộm nhân trong Hematoxylin ferric 2 phút.
• Rửa nước chảy 2- 5 phút.
• Nhuộm bào tương bằng hỗn hợp Fuchsin acid và Ponceau S trong 5

phút.
• Rửa nước cất.
• Biệt hóa trong acid Phosphomolybdic 1% trong 5 giây.
• Không rửa tiêu bản, nhuộm collagen trong dung dịch Blue aniline
trong 1 phút 15 giây.
• Biệt hóa trong acid acetic 1% trong 10 giây.
• Loại nước bằng cách nhúng tiêu bản vào cồn tuyệt đối.
• Làm trong tiêu bản bằng Xylen và gắn Baume [11].
1.8.2. Kết quả chung
Nhân tế bào đen nâu
Bào tương, sợi cơ, hồng cầu đỏ
Sợi collagen xanh
15