Khảo sát thành phần và tỷ lệ loài ký sinh trùng sốt rét tại huyện bù đăng, tỉnh bình phước bằng kỹ thuật nhuộm giêm sa và NESTED – PCR

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



PHẠM GIANG ANH








KHẢO SÁT THÀNH PHẦN VÀ TỶ LỆ LOÀI KÝ SINH TRÙNG
SỐT RÉT TẠI HUYỆN BÙ ĐĂNG, TỈNH BÌNH PHƯỚC BẰNG
KỸ THUẬT NHUỘM GIÊM SA VÀ NESTED - PCR



Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số: 60 42 40





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. BS. HỒ VĂN HOÀNG






THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2012
LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. BS. Hồ Văn Hoàng, người đã định
hướng nghiên cứu và tận tình hướng dẫn trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh, đã giảng dạy và truyền đạt những kiến
thức quý báu cho chúng em.
Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng
TP. Hồ
Chí Minh, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện nghiên cứu tại
Viện và đóng góp những ý kiến quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh học phân tử - Miễn dịch, Viện Sốt rét -
Ký sinh trùng - Côn trùng TP. Hồ Chí Minh, đã hỗ trợ các phương tiện, máy móc,
hóa chất để thực hiện các thí nghiệm trong luận án; cán bộ trong khoa đã quan tâm
động viên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.



MỤC LỤC

Trang phụ bìa Trang
Lời cam đoan

Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Bệnh sốt rét 5
1.1.1. Định nghĩa 5
1.1.2. Ký sinh trùng sốt rét 5
1.1.3. Véc tơ truyền bệnh sốt rét 7
1.1.4. Vật chủ cảm thụ 8
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lây truyền bệnh sốt rét 9
1.2. Phân bố và cơ cấu KSTSR trên thế giới và Việt Nam 9
1.2.1. Phân bố và cơ cấu KSTSR trên thế giới 9
1.2.2. Phân bố và cơ cấu KSTSR ở Việt Nam 10
1.3. Tình hình sốt rét của Việt Nam và huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước 12
1.3.1. Tình hình sốt rét của Việt Nam 12
1.3.2. Tình hình sốt rét của huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước 14
1.4. Các kỹ thuật xét nghiệm phát hiện KSTSR 15
1.4.1. Kỹ thuật nhuộm Giêm sa 15
1.4.2. Các test chẩn đoán nhanh (rapid diagnostic test) 18
1.4.3. Phương pháp nhuộm nhanh AO (Acridine Orange) 20
1.4.4. Phương pháp QBC (Quantative Buffy Coat) 20
1.4.5. Phươ
ng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 20
1.5. Điều trị sốt rét 24
1.5.1. Nguyên tắc điều trị 24
1.5.2. Thuốc sốt rét theo nhóm người bệnh, chủng loại KSTSR 25
1.6. Các biện pháp phòng chống bệnh sốt rét 25
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 27
2.1.1. Đối tượng 27
2.1.2. Thời gian 27
2.1.3. Địa điểm 27
2.2. Vật liệu nghiên cứu 27
2.2.1. Mẫu chứng dương 27
2.2.2. Vật liệu của kỹ thuật nhuộm Giêm sa 27
2.2.3. Vật liệu của kỹ thuật PCR 28
2.2.3.1. Hóa chất dùng để tách chiết DNA 28
2.2.3.2. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR 28
2.2.3.3. Hóa chất dùng cho điện di 29
2.3. Các thiết bị chính 30
2.4. Phương pháp nghiên cứu 30
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu 30
2.4.2. Phương pháp thu thập số liệu 30
2.4.2.1. Cỡ mẫu 30
2.4.2.2. Thu thập mẫu máu ngoại vi trên lam kính 31
2.4.2.3. Thu thập mẫu máu trên giấy thấm Whatman 3MM 31
2.4.3. Kỹ thuật nghiên cứu 31
2.4.3.1. Kỹ thuật nhuộm Giêm sa 31
2.4.3.2. Kỹ thuật soi kính hiển vi phát hiện KSTSR 32
2.4.3.3. Kỹ thuật tách chiết DNA để thực hiện phản ứng PCR 33
2.4.3.4. Kỹ thuật Nested - PCR phát hiện KSTSR 34
2.4.3.5. Điện di trên gel agarose 35
2.5. Phương pháp giải trình tự 35
2.6. Các chỉ số đánh giá 36
2.7. Y đức 37
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38
3.1. Kết quả 39
3.1.1. Kết quả xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật

nhuộm Giêm sa 39
3.1.2. Kết quả xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật
Nested - PCR 45
3.1.3. So sánh kỹ thuật nhuộm Giêm sa và kỹ thuật Nested - PCR
trong việc phát hiện KSTSR 51
3.1.4. Kết quả giải trình tự 54
3.2. Bàn luận 55
3.2.1. Thành ph
ần, tỷ lệ loài KSTSR tại các điểm thu thập mẫu 55
3.2.2. Những trường hợp khác biệt kết quả giữa kỹ thuật Giêm sa
và kỹ thuật PCR 56
3.2.3. Phát hiện những ca nhiễm KSTSR hiếm gặp 59
3.2.4. Ký sinh trùng lạnh 60
3.2.5. Thay đổi về cơ cấu KSTSR của huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước 61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63
A. Kết luận 64
B. Kiến nghị 65
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC




DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA: Acid deoxyribonucleic
dNTPs: deoxynucleotide triphosphate
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid

KST: Ký sinh trùng
KSTSR: Ký sinh trùng sốt rét
Marker: Thang chuẩn
QBC: Quantative Buffy Coat
P.: Plasmodium
P.f: P. falciparum
P.v: P. vivax
P.m: P. malariae
P.o: P. ovale
PCR: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)
PCSR: Phòng chống sốt rét

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Tình hình sốt rét cả nước giai đoạn 2006 - 2010 13
Bảng 1.2. Các vùng dịch tễ sốt rét và can thiệp năm 2009 14
Bảng 1.3. Tình hình sốt rét tại huyện Bù Đăng 2008 - 2010 15
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi đặc hiệu cho Plasmodium 28
Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho 4 loài KSTSR 28
Bảng 2.3. Kích thước sản phẩm PCR của 4 loài KSTSR 35
Bảng 3.1. Số ca KST dương tính xác định bằng Giêm sa 41
Bảng 3.2. Cơ cấu KSTSR xác định bằng Giêm sa 42
Bảng 3.3. Các trường hợp nhiễm phối hợp phát hiện bằng Giêm sa 44
Bảng 3.4. Tần suất các loài KSTSR xác định bằng Giêm sa 44
Bảng 3.5. Số ca KST dương tính xác định bằng Nested - PCR 47
Bảng 3.6.Cơ cấu KSTSR xác định bằng Nested - PCR 48
Bảng 3.7. Các trường hợp nhiễm phối hợp phát hiện bằng Nested - PCR 50
Bảng 3.8. Tần suất các loài KSTSR xác định bằng Nested - PCR 50
Bảng 3.9. So sánh kết quả của kỹ thuật Giêm sa và Nested - PCR 51
Bảng 3.10. Những trường hợp khác biệt giữa 2 kỹ thuật 51

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Chu kỳ phát triển của KSTSR (Nguồn CDC) 7
Hình 1.2. Hình thể 4 loài KSTSR nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi 17
Hình 1.3. Hình thể KSTSR P. knowlesi nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi 17
Hình 1.4. Test chẩn đoánh nhanh 19
Hình 1.5. KSTSR phát hiện bằng phương pháp QBC 20
Hình 1.6. Chu trình phản ứng PCR 21
Hình 1.7. Sơ đồ kỹ thuật Nested - PCR xác định 4 loài KSTSR 22
Hình 1.8. Hình ảnh kết quả chạy điện di các loài KSTSR 23
Hình 3.1. Lam máu nhuộm Giêm sa 39
Hình 3.2. KSTSR P. falciparum trên lam máu nhuộm Giêm sa 40
Hình 3.3. KSTSR P. vivax trên lam máu nhuộm Giêm sa 40
Hình 3.4. KSTSR P. malariae trên lam máu nhuộm Giêm sa 41
Hình 3.5
. Biểu đồ số ca KSTSR dương tính xác định bằng Giêm sa 42
Hình 3.6. Biểu đồ cơ cấu KSTSR tại các điểm nghiên cứu xác định bằng Giêm sa 43
Hình 3.7. Biểu đồ cơ cấu KSTSR xác định bằng Giêm sa 43
Hình 3.8. Biểu đồ tần suất loài KSTSR xác định bằng Giêm sa 43
Hình 3.9. Hình ảnh kết quả PCR những mẫu nhiễm P. falciparum 45
Hình 3.10. Hình ảnh kết quả PCR ca nhiễm phối hợp P. falciparum, P. vivax
và P. ovale 46
Hình 3.11.
Hình ảnh kết quả PCR sản phẩm nhiễm đơn P. falciparum 46
Hình 3.12. Hình ảnh kết quả nhiễm phối hợp P. falciparum, P. vivax, P. malariae
và nhiễm đơn P. vivax 47
Hình 3.13. Biểu đồ số ca KSTSR dương tính xác định bằng Nested - PCR 48
Hình 3.14. Biểu đồ cơ cấu KSTSR tại các điểm nghiên cứu xác định
bằng Nested - PCR 49
Hình 3.15. Biểu đồ cơ cấu KSTSR xác định bằng kỹ thuật Nested - PCR 49

Hình 3.16. Biểu đồ t
ần suất các loài KSTSR xác định bằng Nested - PCR 50


1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Sốt rét là một bệnh lây qua đường máu, do ký sinh trùng sốt rét (KSTSR)
truyền từ người bệnh sang người lành bởi muỗi Anopheles (hay còn gọi là muỗi đòn
xóc). Sốt rét là một trong những căn bệnh gây tử vong hàng đầu thế giới. Theo Tổ
chức Y tế thế giới (WHO), hiện có 106 quốc gia và vùng lãnh thổ có sốt rét lưu
hành. Hàng năm, có khoảng 350 đến 500 triệu người mắc sốt rét và gần 1 triệu
ng
ười tử vong do sốt rét, đa số là phụ nữ và trẻ em ở châu Phi
[30]
.
Trước đây, được biết có 4 loài KSTSR gây bệnh cho người là Plasmodium
falciparum (P. falciparum), Plasmodium vivax (P. vivax), Plasmodium malariae (P.
malariae), Plasmodium ovale (P. ovale). Gần đây, một số báo cáo cho thấy
Plasmodium knowlesi (P. knowlesi), một ký sinh trùng (KST) của loài khỉ, cũng có
thể gây bệnh cho người.
Bệnh sốt rét thường dễ bị nhầm lẫn với các bệnh gây sốt khác như: cảm cúm,
sốt Dengue, sốt mò, thương hàn… Đồng thời, mỗi loài KSTSR có chu kỳ phát triển
và bệnh lý khác nhau. Đặc biệt, ký sinh trùng (KST) P. falciparum nếu không đượ
c
chẩn đoán và điều trị kịp thời có thể dẫn đến sốt rét ác tính với các triệu chứng sốt
rét não, đái huyết cầu tố, thiếu máu nặng, suy thận, suy gan, trụy tim mạch gây tử
vong. Do đó, chẩn đoán chính xác và kịp thời loài KSTSR gây bệnh là một khởi đầu
quan trọng đối với công tác điều trị.
Xác định thành phần, cơ cấu của KSTSR tại một khu vự

c góp phần cung cấp
số liệu cho việc hoạch định chính sách thuốc, cung cấp phác đồ điều trị cho từng
vùng, xây dựng bản đồ dịch tễ sốt rét và chiến lược phòng chống phù hợp.
Phương pháp soi lam máu nhuộm Giêm sa nhận biết hình thể đặc trưng của
các loài KSTSR dưới kính hiển vi là phương pháp xét nghiệm thường quy được áp
dụng rộng rãi trong mọi điều kiện thực địa cũng như
trong phòng thí nghiệm để
chẩn đoán, phát hiện KSTSR. Phương pháp này được xem như là “chuẩn vàng”


2
trong đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán sốt rét
mới.
Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, một số phương pháp mới đã được
nghiên cứu, triển khai đã cung cấp những hướng nghiên cứu mới về KSTSR. Đặc
biệt, phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) ngoài việc phát hiện được
KSTSR ở mật độ thấp (1KST/1μl máu) còn có khả
năng xác định các trường hợp
nhiễm phối hợp nhiều loài KSTSR giúp chẩn đoán, điều trị bệnh kịp thời; qua đó,
hạn chế tình trạng KST kháng thuốc sốt rét, cung cấp dẫn liệu về thành phần và tỷ lệ
loài KSTSR ứng dụng trong việc lập bản đồ dịch tễ sốt rét.
Tại Việt Nam, trong những thập niên qua, cùng với sự phát triển và những
thành tựu củ
a ngành y tế, công tác phòng chống sốt rét (PCSR) đã đạt được những
kết quả đáng kể, làm giảm số người mắc, số người chết và hạn chế bùng phát dịch
sốt rét, góp phần vào sự nghiệp chăm sóc và bảo vệ sức khỏe nhân dân. Tuy nhiên,
do nước ta có điều kiện thuận lợi về địa lý, khí hậu cho sự phát triển của muỗi
Anopheles, trung gian truyền bệnh; cơ cấu KSTSR tại những vùng sốt rét lưu hành
có sự thay đổi; đồng thời, trình độ dân trí và ý thức phòng chống bệnh một số nơi
chưa cao, cộng với hiện tượng di dân tự do làm cho tình hình bệnh sốt rét vẫn còn

diễn biến phức tạp.
Được sự quan tâm và đầu tư của Chính phủ, tỉnh Bình Phước nằm trong
vùng kinh tế trọng điểm phía Nam bao gồm các tỉnh, thành phố: TP. Hồ Chí Minh,
Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Dương, Bình Ph
ước, Tây Ninh, Long An và
Tiền Giang. Đây cũng là một trong những địa phương có tình hình sốt rét lưu hành
nặng. Tỉnh Bình Phước với dân số 894.941 người (năm 2010), toàn tỉnh có 856.477
người sống trong vùng sốt rét lưu hành (chiếm 95,7% dân số). Theo thống kê năm
2010, cả nước có 54.297 ca mắc sốt rét, riêng tỉnh Bình Phước có 3.566 ca (chiếm
tỷ lệ 6,7%)
[21]
.
Do đó, để thực hiện tốt công tác chăm sóc sức khoẻ nhân dân, việc nghiên
cứu thành phần, tỷ lệ loài KSTSR của tỉnh Bình Phước để có biện pháp can thiệp
đúng, hạn chế sự lây truyền và tiến đến loại trừ bệnh sốt rét là việc làm cần thiết.


3
Huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước là một trong hai nơi có lượng KST cao
nhất tỉnh Bình Phước. Tiến hành nghiên cứu tại đây sẽ cho biết cơ cấu và thành
phần KST chính xác nhất. Ngoài ra, đây là nơi đã có báo cáo hiện tượng giảm tác
dụng của thuốc sốt rét artesunat, chọn địa điểm này sẽ giúp hiểu biết sâu hơn về cơ
cấu, thành phần KST, giúp đề ra các biện pháp khắc phục.
2. Mụ
c tiêu nghiên cứu
Khảo sát thành phần và tỷ lệ loài KSTSR tại huyện Bù Đăng, tỉnh Bình
Phước bằng kỹ thuật nhuộm Giêm sa và Nested - PCR.
3. Nội dung thực hiện
+ Xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật nhuộm Giêm sa.
+ Xác định thành phần và tỷ lệ KSTSR bằng kỹ thuật Nested - PCR.

+ So sánh kỹ thuật nhuộm Giêm sa và kỹ thuật Nested - PCR trong việc
phát hiện KSTSR.











4






CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

5
1.1. BỆNH SỐT RÉT
1.1.1. Định nghĩa
Bệnh sốt rét là một bệnh truyền nhiễm do KST Plasmodium gây nên. Bệnh
sốt rét truyền từ người bệnh sang người lành chủ yếu do trung gian truyền bệnh là
muỗi Anopheles.
Biểu hiện điển hình của bệnh là các cơn sốt có chu kỳ với 3 triệu chứng cơ
bản: rét run, sốt và ra mồ hôi. Trong cơ thể người, bệnh phát triển có chu kỳ và có
hạ
n định, nếu không bị tái nhiễm. Bệnh gây miễn dịch đặc hiệu nhưng không bền
vững. Bệnh lưu hành địa phương, trong điều kiện thuận lợi có thể gây thành dịch.
Bệnh sốt rét có thuốc điều trị đặc hiệu và có thể phòng chống được; tuy nhiên, nếu
không được phát hiện và điều trị kịp thời có thể sẽ gây tử vong do sốt rét ác tính.
Vắc xin phòng sốt rét
đang được nghiên cứu tích cực.
Bệnh sốt rét phổ biến ở các quốc gia châu Phi, châu Á, Trung Mỹ và Nam
Mỹ. Môi trường thuận lợi về vị trí địa lý, nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa và sự tiếp xúc
giữa véc tơ truyền bệnh và người làm gia tăng sự lây lan của bệnh
[10]
.
1.1.2. Ký sinh trùng sốt rét
KSTSR thuộc giới đơn bào, lớp Protozoa, họ Plasmodidae, giống
Plasmodium. Có khoảng 120 loài trong đó có ít nhất 22 loài ký sinh ở động vật tứ

chi, 19 loài ký sinh ở động vật có vú, khoảng 70 loài ký sinh ở chim và bò sát. Có 4
loài Plasmodium ký sinh ở người là: Plasmodium malariae (P. malariae) (Laveran
mô tả năm 1881), Plasmodium vivax (P. vivax) (Grassi, Feletti mô tả năm 1890),
Plasmodium falciparum (P. falciparum) (Welch mô tả 1897) và Plasmodium ovale
(P. ovale) (Stephens mô tả năm 1922)
[2]
.
Hiện nay, đã có báo cáo về KSTSR thứ 5 gây bệnh cho người là Plasmodium
knowlesi (P. knowlesi). P. knowlesi là loài ký sinh trùng sốt rét chỉ ký sinh ở khỉ,
tuy nhiên nhiều thông tin trên thế giới cũng như trong nước thời gian gần đây cho
thấy P. knowlesi có khả năng nhiễm bệnh ở người, thậm chí còn có nguy cơ lan
rộng và đe dọa tử vong.



6
Chu kỳ sinh học của KSTSR gồm 2 giai đoạn: giai đoạn phát triển vô tính ở
người và giai đoạn phát triển hữu tính ở muỗi
[4], [13]
.
Giai đoạn phát triển vô tính
Thời kỳ trong gan hay còn gọi là giai đoạn tiền hồng cầu: Khi muỗi cái
Anopheles đốt người, tiêm thoa trùng vào da, thoa trùng chui qua mạch máu để luân
lưu trong máu. Sau 30 phút, toàn bộ thoa trùng chui vào gan, phát triển dần thành
thể phân liệt, thể phân liệt vỡ ra phóng thích các mảnh trùng trước khi xâm nhập
vào hồng cầu trong khoảng thời gian từ 7 - 12 ngày. Đối với P. vivax hoặc P. ovale,
ngoài sự phát triển tức thì của các thoa trùng, một số thoa trùng khác không phát
triển ngay thành th
ể phân liệt mà thành các thể ngủ (hypnozoites). Các thể này tiềm
tàng trong gan, có thể sau một vài tháng thậm chí có thể sau một hai năm mới phát

triển từng đợt thành phân liệt, vỡ ra, tung mảnh trùng vào máu, gây ra những cơn
sốt rét tái phát.
Thời kỳ trong máu (giai đoạn hồng cầu): Mảnh trùng xâm nhập hồng cầu
phát triển thành thể trưởng thành thực hiện quá trình phân chia vô tính. Nhân ký
sinh trùng chia thành nhiều nhân con và phân chia bào tương tạo thành thể phân liệt
(schizont). Thể phân liệt trưởng thành là những ký sinh trùng phát triển hoàn toàn.
Kết thúc quá trình phân chia vô tính, hồng cầu nứt vỡ ra và ký sinh trùng tiếp tục
xâm nhập vào các hồng cầu mới. Chu kỳ phân chia vô tính hồng cầu được lặp đi lặp
lại trong suốt quá trình nhiễm bệnh. Sau nhiều thế hệ, một số mảnh trùng khi xâm
nhập hồng cầu tiếp tục phát triển thành các thể vô tính, một số khác lại phát triển
thành giao bào. Thời gian hoàn thành chu trình hồng cầu đối với P. falciparum là 36
- 48 giờ, đối vớ
i P. vivax và P. ovale là 48 giờ, với P. malariae là 72 giờ.
Giai đoạn phát triển hữu tính
Khi muỗi Anopheles hút máu người bệnh, chúng hút KSTSR vào dạ dày, các
thể vô tính dần dần sẽ chết đi, các thể hữu tính (giao bào) tiếp tục phát triển. Giao
bào đực xuất roi cho ra nhiều giao tử đực, giao bào cái phát triển thành giao tử cái.
Giao tử đực chui vào giao tử cái thụ tinh tạo ra hợp tử không di động (zygot); hợp
tử biến dạng dài ra và chuyển động thành tr
ứng di động (ookinet). Trứng di động di


7
chuyển đến thành dạ dày muỗi và chui qua giữa lớp tế bào bên ngoài bề mặt dạ dày
rồi định cư ở đó phát triển thành noãn bào (oocyst). Khi noãn bào phát triển đủ độ,
bên trong có khoảng 1.000 thoa trùng. Thoa trùng (sporozoit) di động phá vỡ màng
noãn bào, bơi trong xoang cơ thể đến tuyến nước bọt. Khi muỗi đốt người khác,
thoa trùng lại xâm nhập vào máu và tiếp tục chu trình sinh sản vô tính.
Thời gian cần thiết cho sự phát triển của thoa trùng thay đổi tùy theo nhiệt độ
c

ủa môi trường bên ngoài. Nhiệt độ thích hợp nhất là 28
o
C - 30
o
C. Khi nhiệt độ bên
ngoài thấp hơn 16
o
C và cao hơn 45
o
C thì chu trình hữu tính không xảy ra.

Hình 1.1. Chu kỳ phát triển của KSTSR (Nguồn CDC)

1.1.3. Véc tơ truyền bệnh sốt rét

Véc tơ truyền bệnh sốt rét cho người là muỗi cái Anopheles, họ Culicidae, có
khoảng 3.200 loài. Trên thế giới có khoảng trên 420 loài Anopheles khác nhau,
trong đó có khoảng 70 loài là véc tơ truyền bệnh cho người trong điều kiện tự
nhiên. Do các đặc điểm về địa lý, khí hậu và sinh thái môi trường mà ở mỗi vùng,
mỗi nước có các loài truyền bệnh sốt rét chính khác nhau
[10]
.


8
Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về Anopheles trong những năm gần
đây cho thấy có 62 loài Anopheles
[15]
.
Trong đó, những véc tơ truyền bệnh chính ở Việt Nam là:

- An. minimus: sống trong rừng, bìa rừng, savan. Bọ gậy sống ở ven suối
quang, nước chảy chậm, muỗi phân bố ở khu vực rừng núi trên toàn quốc.
- An. dirus: sống ở rừng rậm, bìa rừng, rừng thưa. Bọ gậy sống ở vũng nước
đọng, dưới bóng râm trong rừng, muỗi phân bố từ 20 vĩ độ bắc trở vào.
- An. epiroticus: sống ở vùng ven biển nước lợ.
1.1.4. Vật chủ cảm thụ
Vật chủ cảm thụ là con người - người khỏe mạnh, người chưa có miễn dịch
hoặc đã có miễn dịch với sốt rét nhưng đã giảm thấp. Khi muỗi Anopheles đưa thoa
trùng vào máu thì sự phát triển tiếp theo của ký sinh trùng sốt rét tùy thuộc vào tình
trạng cảm thụ hoặc miễn dịch của ng
ười đó.
- Miễn dịch tự nhiên: Một số nhóm người, chủng người có miễn dịch tự
nhiên đối với KSTSR. Một số nghiên cứu cho thấy những người gốc Phi có nhóm
máu âm tính với kháng nguyên Duffy hầu như không bị nhiễm P. vivax
[10]
.
- Miễn dịch thu được: Miễn dịch tạo thành trong bệnh sốt rét. Miễn dịch
trong sốt rét là miễn dịch không bền vững, độ miễn dịch này sẽ giảm và mất đi khi
người đó ra khỏi vùng sốt rét. Thời gian tồn tại của miễn dịch khoảng 6 tháng.
Chính vì có miễn dịch này mà những người sống lâu trong vùng sốt rét trở thành
người mang ký sinh trùng lạnh. Ký sinh trùng lạnh (Asymtomatic Malaria): “Một
người hiện không có sốt ho
ặc không có tiền sử sốt gần đây có xét nghiệm ký sinh
trùng sốt rét dương tính”. Về dịch tễ học, những người mang KST lạnh là nguồn
bệnh sốt rét quan trọng cần phải được nghiên cứu và quản lý đầy đủ
[14]
.
Tùy theo loài KSTSR trong người mà bệnh nhân sốt mỗi ngày một cơn (P.
falciparum), hai ngày một cơn (P. vivax) và ba ngày một cơn (P. malariae). Cơn sốt
thường xuất hiện đúng giờ, có tính chu kỳ rõ rệt, trùng khớp với những đợt phát

triển KSTSR trong cơ thể người.


9
Tất cả mọi người đều có thể mắc bệnh sốt rét nếu bị muỗi nhiễm KSTSR đốt.
Một số ngành nghề liên quan đến rừng núi (làm việc trong rừng, ngủ lại trong rừng)
thường có tỷ lệ mắc sốt rét cao.
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lây truyền bệnh sốt rét
[10]

Có 2 yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lây truyền bệnh sốt rét:
- Yếu tố tự nhiên như khí hậu, sinh cảnh, môi trường… có tác động rất lớn
đến sự phát triển của bệnh sốt rét. Nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh sản của Anopheles,
ảnh hưởng đến tiếp xúc giữa người và muỗi, đến quá trình phát triển của KSTSR
trong cơ thể muỗi. Các nghiên cứu cho thấy ở mỗ
i vùng địa lý có sự vượt trội của
từng loài KSTSR. Vùng nhiệt đới thuận lợi cho cả 4 loài P. falciparum, P. vivax, P.
malariae, P. ovale. Vùng ôn đới P. vivax chiếm ưu thế. Địa hình, thời tiết, khí hậu,
lượng mưa, nhiệt độ, độ ẩm tác động lên quá trình phát triển, tới tuổi thọ và khả
năng hoạt động của muỗi, qua đó, ảnh hưởng đến mức độ lây truyền.
- Yếu tố về
kinh tế xã hội như biến động dân cư, chiến tranh, nghèo đói, cơ
sở hạ tầng thấp kém, nhà cửa tồi tàn có tác động trực tiếp đến lan truyền sốt rét, có
thể làm xảy ra dịch sốt rét, ảnh hưởng đến công tác PCSR.
Trình độ văn hóa thấp, nhận thức về bệnh sốt rét hạn chế, tập quán du canh
du cư, thói quen không ngủ màn cũng tác động lớn đến tình hình sốt rét của các địa
phương.
1.2. PHÂN BỐ VÀ CƠ CẤU KSTSR TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
1.2.1. Phân bố và cơ cấu KSTSR trên thế giới
Có 4 loài KSTSR gây bệnh cho người: P. falciparum, P. vivax, P. malariae,

P. ovale. Trong đó, P. ovale có mặt ở một số nơi trên thế giới. Tuy nhiên theo
Lysenko và Bejaev, phân bố tự nhiên của P. ovale tập trung ở sa mạc Sahara châu
Phi và một số quần đảo Tây Thái Bình Dương. Theo Bruce - Chwatt (1963), Gill và
Warell (3rd Essential Malariology, 1993) muỗi sốt rét lan truyền ký sinh trùng P.
ovale xảy ra chủ yếu ở Tây Phi. Các tài liệ
u y văn và báo cáo cho thấy rất hiếm gặp


10
ở Philippines, Việt Nam, Thailand, New Guinea, Indonesia, Myanmar, Malaysia và
India
[10]
.
Theo GS. Vũ Thị Phan
[15]
thành phần và tỷ lệ loài KSTSR phân bố trên thế
giới như sau:
- Khu vực châu Phi nhiệt đới: Vùng sốt rét chiếm 88,6% dân số. Có đủ 4 loài
KSTSR, trong đó P. falciparum chiếm 70 - 80%.
- Bắc Mỹ: có 3 loài KSTSR P. falciparum, P. malariae, P. vivax, trong đó P.
vivax 60%, P. falciparum 30%, P. malariae 10%.
- Nam Mỹ: P. faciparum chiếm 50%.
- Khu vực Trung Á: Bangladesh còn lưu hành sốt rét. P. falciparum 65%, P.
vivax 30%, P. malariae 5%.
- Khu vực Tây Á: chủ yếu là P. falciparum và P. vivax.
- Khu vực Đông Á:
+ Trung Quốc: P. vivax chiếm 96%, P. falciparum 3% và P. malariae 1%.
+ Myanma: P. faciparum chiếm 52%, P. vivax 38,5%, P. malariae 9,5%.
+ Thái Lan: P. faciparum 51- 69%, P. vivax 30 - 41%, P. malariae khoảng
1%, một số nơi phát hiện có P. ovale.

+ Lào: có 3 loài. P. falciparum 70 - 80%, P. vivax 19 - 25%, P. malariae
0,5 - 1%.
+ Campuchia: P. falciparum 88%, P. vivax 12%.
+ Malaysia: P. falciparum 75%, P. vivax 24%, P. malariae 1%.
+ Indonesia: phát hiện được cả 4 loài trong đó P. falciparum 84%, P. vivax
14%, P. malariae 2% và đã phát hiện được P. ovale.
+ Philippines: có đủ 4 loài, P. falciparum 85%, P. vivax 14%, P. malariae
1%, P. ovalae hiếm gặp.
1.2.2. Phân bố và cơ cấu KSTSR
ở Việt Nam
Qua các cuộc điều tra sốt rét trước đây thì ở Việt Nam có 3 loại Plasmodium
là P. falciparum, P. vivax, P. malariae. Hiện nay, với kỹ thuật sinh học phân tử


11
PCR đã nghiên cứu, phát hiện P. ovale ở Việt Nam. Nhưng chủ yếu vẫn là 2 loại P.
falciparum và P. vivax, trong đó, P. falciparum chiếm 70 - 80%
[10]
.
Cơ cấu của các loài KSTSR thay đổi tùy theo từng vùng, từng mùa và cũng
thay đổi dưới sức ép của các biện pháp PCSR.
P. falciparum hiện diện nhiều ở vùng sốt rét lưu hành nặng (rừng núi, cao
nguyên, ven biển miền Nam từ Phan Thiết trở vào). Ở những vùng này, P.
falciparum thường chiếm từ 70% - 80% số KST.
P. vivax chiếm từ 18% - 27%, P. malariae từ 1% - 3%. P. vivax phân bố
nhiều hơn ở các vùng Duyên Hải miền Bắc, miền Trung và Nam Bộ.
Trong quá trình tiêu diệt sốt rét với các tác động của các biện pháp PCSR
quy mô thì P. falciparum giảm nhanh, P. vivax giảm chậm hơn, tương quan giữa 2
loại KST này có thay đổi. Sự giảm nhanh của P. falciparum vừa là kết quả, vừa là
tín hiệu nói lên công tác PCSR tiến triển tốt. Ngược lại, P. falciparum giảm chậm

hoặc tăng lên thì các biện pháp PCSR hiệu quả kém (P. falciparum kháng thuốc,
muỗi kháng hóa chất…) hoặc có nguy cơ sốt rét quay trở lạ
i.
Từ năm 1962 - 1972 tỷ lệ KSTSR thay đổi, tỷ lệ P. falciparum giảm còn 50 -
60%, tỷ lệ P. vivax tăng lên. Một số nơi khu vực miền Trung (Ninh Thuận, Quảng
Nam) P. vivax có lúc có chiều hướng vượt trội hơn P. falciparum. Ngoài ra, P.
malariae vẫn được xem là hiếm ở Việt Nam với tỷ lệ rất thấp, tuy nhiên trong một
số nghiên cứu và điều tra gần đây tại Ninh Thuận thì tỷ
lệ loài này chiếm tới 15 -
29%
[15]
.
P. ovale là loài ký sinh trùng sốt rét được mô tả bởi Stephen năm 1922. Phân
bố của P. ovale chủ yếu ở Châu Phi, chiếm một tỷ lệ rất thấp ở các nước Tây Thái
Bình Dương. Ở Việt Nam, nhiễm P. ovale rất hiếm gặp. Một số nghiên cứu tại Việt
Nam đã xác nhận có 4 trường hợp nhiễm P. ovale trong số lính Mỹ đóng quân ở
một vị trí tại Nam Việt Nam vào gi
ữa tháng 1/1966 đến tháng 3/1969 (Gleason
N.N.). Riêng tại miền Trung - Tây Nguyên, theo hệ thống báo cáo từ 1976 - 2010
chỉ có 1 trường hợp nhiễm P. ovale được ghi nhận từ tỉnh Đắk Lắk (1995). Gần đây,
các nghiên cứu và khảo sát sốt rét thực địa của Kawamoto. F được thực hiện ở 4


12
tỉnh (Sông Bé, Lâm Đồng, Đắk Lắk và Khánh Hòa) từ 1994 - 1995 với kỹ thuật
nhuộm AO để chẩn đoán nhanh và kỹ thuật lai dựa trên thử nghiệm khuyếch đại
chuỗi gen để chẩn đoán chính xác. Kết quả có 3 trường hợp nhiễm P. ovale được
phát hiện. Nghiên cứu của Lê Đức Đào (1996) thông báo có sự hiện diện của P.
ovale (kỹ thuật PCR) tại huyện Khánh Vĩnh, Khánh Hòa
[7], [8]

.

Tại khu vực Nam Bộ - Lâm Đồng, năm 2001, Lê Đức Đào và cộng sự áp
dụng kỹ thuật PCR khảo sát thành phần 4 loài KSTSR ở 3 tỉnh: Lâm Đồng, Bình
Phước và Đắk Lắk. Kết quả cho thấy sự tồn tại của cả 4 loài KSTSR và tỷ lệ nhiễm
phối hợp 2, 3 loài rất cao. Tại Lâm Đồng tỷ lệ nhiễm phối hợp là 41%, Bình Phước
22%, Đắk Lắk 36,5%.
- Tại Lâm Đồng: P. falciparum chiế
m 57,9%, P. vivax 33,7%, P. malariae
6,3%, P. ovale 2,1%.
- Tại Đắk Lắk: P. falciparum chiếm 52,4%, P. vivax 38,5%, P. malariae
6,3%, P. ovale 2,8%
[5]
.
1.3. TÌNH HÌNH SỐT RÉT CỦA VIỆT NAM VÀ HUYỆN BÙ ĐĂNG, TỈNH
BÌNH PHƯỚC
1.3.1. Tình hình sốt rét của Việt Nam
Việt Nam nằm trong vùng sốt rét lưu hành, là một trong những nước có nguy
cơ cao về bệnh sốt rét. Chương trình quốc gia “Tiêu diệt sốt rét” đã đạt được thành
tựu to lớn ở miền Bắc trong thời kỳ 1958 - 1975 và trên phạm vi cả nước từ sau
ngày giải phóng 1976 - 1980. Nhưng từ năm 1980 trở đi bệnh số
t rét đã quay trở lại
và ngày càng nghiêm trọng mà đỉnh cao là năm 1991, có hơn 1 triệu người mắc,
4.646 người chết, hơn 114 vụ dịch lớn xảy ra ở nhiều địa phương trong cả nước.
Cũng từ năm 1991, Việt Nam chuyển hẳn sang chiến lược “Phòng chống sốt rét” và
chính phủ đã đưa chương trình “Phòng chống sốt rét” thành một trong các chương
trình y tế quốc gia ưu tiên
[22]
.

13
Bảng 1.1. Tình hình sốt rét cả nước giai đoạn 2006 - 2010
Chỉ số 2006 2007 2008 2009 2010
% giảm
2006/2010
Số chết SR 41 20 25 27 21
-48,78
Tỷ lệ chết
SR/100.000
dân
0,05 0,02 0,03 0,03 0,02
-60,00
Số bệnh
nhân SR
91635 70910 60547 60867 54297
-40,75
Tỷ lệ mắc
SR/1000 dân
1,08 0,83 0,70 0,69 0,62
-42,59
Số KSTSR 22637 16389 11355 16130 17515
-22,63
Tỷ lệ
KSTSR/1000
0,27 0,19 0,13 0,18 0,20
-25,93
Số vụ dịch

SR
1 1 1 0 1


Trong 5 năm 2006 - 2010 đã có 59/63 tỉnh, thành (93,65%) không có dịch sốt
rét; 39/63 tỉnh, thành (61,9%) không có chết do sốt rét; 56/63 tỉnh, thành 5 năm liên
tiếp có tỷ lệ BNSR < 1,15/1000 dân (đạt 88,88%); 30/63 tỉnh, thành 5 năm liên tiếp
có tỷ lệ chết do SR < 0,3/100000 dân (đạt 47,61%) (Phụ lục 2).
Tình hình sốt rét hiện nay tương đối ổn định nhưng vẫn còn là mối đe dọa
sức khỏe đối với những người dân ở vùng sâu, vùng xa, vùng biên giới và đối với
dân di cư.
Tại Vi
ệt Nam, từ năm 2003, Chương trình quốc gia PCSR đã phân vùng dịch
tễ và can thiệp dựa vào các yếu tố về vùng địa lý, sinh cảnh, thảm thực vật rừng, khí
hậu, chỉ số bệnh nhân sốt rét, KSTSR và sự có mặt của muỗi truyền bệnh sốt rét.
Kết quả phân vùng dịch tễ sốt rét và can thiệp năm 2009 ở Việt Nam có 5 vùng như
sau: vùng không có sốt rét lưu hành, vùng nguy cơ sốt rét quay trở lại, vùng sốt rét
l
ưu hành nhẹ, vùng sốt rét lưu hành vừa, vùng sốt rét lưu hành nặng
[10], [18]
.




14
Bảng 1.2. Các vùng dịch tễ sốt rét và can thiệp năm 2009
Vùng dịch tễ sốt rét Số xã Dân số Tỉ lệ % dân số
Vùng I:
Không có SRLH

5.636 54.530.178 62,5
Vùng II:
Nguy cơ SR quay lại
2.798 17.393.146 19,9
Vùng III:
SRLH nhẹ
1.527 10.537.391 4,1
Vùng IV:
SRLH vừa
810 3.538.473 4,1
Vùng V:
SRLH nặng
341 1.203.661 1,3

1.3.2. Tình hình sốt rét của huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước
Bình Phước là tỉnh thuộc miền Đông Nam Bộ, là trọng điểm sốt rét của cả
nước và của khu vực Nam Bộ - Lâm Đồng. Dân số 894.941 người trong đó có
856.477 người sống trong vùng sốt rét lưu hành (chiếm tỷ lệ 95,7%). Theo thống kê
năm 2010, toàn tỉnh có 3.566 ca mắc sốt rét, trong đó có 52 ca sốt rét ác tính và 5 ca
tử vong
[21]
.
Tại tỉnh Bình Phước, sốt rét lưu hành quanh năm, đỉnh bệnh là vào tháng 10 -
11 năm trước cho đến tháng 2 - 3 năm sau. Địa hình sinh cảnh phù hợp cho véc tơ
tồn tại, phát triển quanh năm. Diện tích rừng là chủ yếu.
Các nhóm dân tộc ít người chiếm tỷ lệ cao (M’nông, S’tiêng, Tày, Dao,
Nùng, Mường…). Dân sống bằng nghề nông nghiệp là chủ yếu: điều, cao su và cây
sắn Phong tục, tập quán lạc hậu, thói quen ngủ rừng ngủ rẫ
y, ý thức PCSR còn
hạn chế. Đặc biệt, tỉnh Bình Phước có 03 huyện giáp biên giới Campuchia, chiều

dài biên giới là 240km, tình trạng di biến động dân, giao lưu biên giới khó kiểm
soát.


15
Tỷ lệ KSTSR tại Bình Phước năm 2010 tổng số là 2.781, trong đó P.
falciparum có 1.869 ca (chiếm 67,2%), P. vivax có 873 ca (chiếm 31,4%) và nhiễm
phối hợp có 96 ca (chiếm 1,4%)
[20]
.
Huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước với địa hình thuộc vùng đồi cao nguyên.
Nông nghiệp chủ yếu trồng cây sắn, cây cao su và cây điều. Khí hậu chia làm 2 mùa
rõ rệt mùa mưa và mùa khô. Mùa mưa từ tháng 8 đến tháng 11, mùa khô từ tháng
12 đến tháng 8 năm sau. Nhiệt độ trung bình trên 20
o
C.
Huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước là một trong những “điểm nóng” về sốt rét
của khu vực. Nên mặc dù được nhà nước quan tâm đầu tư cho công tác PCSR
nhưng bệnh sốt rét vẫn diễn biến phức tạp và có chiều hướng gia tăng trong những
năm gần đây.
Bảng 1.3. Tình hình sốt rét tại huyện Bù Đăng giai đoạn 2008 - 2010
Năm
Bệnh
nhân sốt
rét
Chết do
sốt rét
Ký sinh trùng
Tổng số P. falciparum P. vivax Phối hợp
2008 468 1 389 326 (83,8%) 62 1

2009 435 0 404 288 (71,3%) 113 3
2010 547 0 532 342 (64,3%) 186 4
KST của huyện chiếm tỷ lệ tương đối cao so với toàn tỉnh: 22,2% năm 2008;
20,9% năm 2009. Tỷ lệ P. falciparum chiếm đa số trong cơ cấu KST
[20]
.
Ngoài ra, năm 2009, đã phát hiện KSTSR kháng artesunat đầu tiên tại Việt
Nam là tại xã Đak Nhau, huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước với tỷ lệ điều trị thất bại
là 14,6% càng gây khó khăn cho công tác PCSR.
1.4. CÁC KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN KSTSR
[4], [11], [13], [29]

1.4.1. Kỹ thuật nhuộm Giêm sa
Kỹ thuật nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi quang học là kỹ thuật cổ điển
được sử dụng để phát hiện KSTSR trong máu. Kỹ thuật này do Ronald Ross đưa ra


16
năm 1903 giúp tập trung được 20 - 30 lớp hồng cầu trên một diện tích nhỏ, cho
phép phát hiện nhanh KSTSR. Hiện nay, kỹ thuật soi lam máu nhuộm Giêm sa
được xem như là “chuẩn vàng” trong đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của các kỹ thuật
xét nghiệm chẩn đoán sốt rét mới.
Nguyên lý
:
Khi nhuộm dung dịch Giêm sa, nguyên sinh chất của ký sinh trùng sẽ bắt
màu xanh còn nhân bắt màu đỏ, sắc tố màu đen ánh vàng hay đen tùy thuộc vào
chủng loại KST. Dựa vào đặc điểm và màu sắc đó ta có thể nhận dạng và phân biệt
được hình thể ký sinh trùng.
Một lam máu (giọt dày và giọt mỏng) được nhuộm với dung dịch Giêm sa
5% và soi ở kính hiển vi quang học với độ phóng đại 700 - 1000 lần. Soi ở giọt dày

để phát hiện và định loạ
i KSTSR, giọt mỏng dùng để xác định chủng loại KST khi
có nghi ngờ. Kết quả trả lời bao gồm: chủng loại KST, các thể KST tìm thấy trong
máu cùng với mật độ của chúng.




17

Hình 1.2. Hình thể 4 loài KSTSR nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi


Hình 1.3. Hình thể KSTSR P. knowlesi nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi
Đặc điểm hình thể hồng cầu bị ký sinh

Hồng cầu bị P. falciparum ký sinh kích thước gần như bình thường, không
trương to. Hồng cầu màu hơi nhạt, ở rìa hồng cầu sẫm màu hơn. Trên hồng cầu có
thể thấy những hạt Maurer: hạt to, thưa thớt bắt màu đỏ (kích thước khoảng 1µm)
hoặc có thể thấy vết Maurer.
Hồng cầu bị P. vivax ký sinh trương to, hình bầu dục hoặc méo mó, nhạt màu
và có nhiều hạt Schuffner: là những h
ạt nhỏ, nhiều lấm tấm bắt màu đỏ, rải rác khắp
hồng cầu.
Hồng cầu bị P. malariae ký sinh không thay đổi kích thước, đôi khi còn nhỏ
hơn hồng cầu bình thường và có xuất hiện các chấm hồng nhạt Zieman.