Khảo sát thành phần hóa học của lá dâm bụt được thu hái tại huyện hương thủy, tỉnh thừa thiên huế

1



2



Cùng với sự phát triển không ngừng về mọi mặt của xã hội, con người
đang phải đối mặt với nguy cơ xuất hiện bệnh tật ngày càng nhiều hơn. Một trong
những giải pháp hiện nay là xu hướng quay về với thiên nhiên, dùng những sản
phẩm có nguồn gốc tự nhiên hơn là tổng hợp bằng con đường nhân tạo, nhất là
hợp chất thiên nhiên từ các thực vật xung quanh chúng ta.
Trong vô số các loài thực vật đang tồn tại và phát triển, dâm bụt là một
trong những loại hoa được trồng làm cây cảnh và hàng rào khá phổ biến ở Việt
Nam. Bên cạnh ứng dụng làm hàng rào, cây cảnh, cây dâm bụt còn được biết đến
với nhiều ứng dụng chữa bệnh khác trong các bài thuốc dân gian. Theo Đông y,
lá dâm bụt có vị nhạt, nhớt, tính bình, có tác dụng làm dịu, an thần, tẩy nhẹ,
nhuận tràng, chữa viêm niêm mạc dạ dày, ruột, đại tiện ra máu, kiết lỵ, mụn nhọt,
ghẻ lở, mộng tinh, đới hạ. Hoa dâm bụt vị ngọt, tính bình có tác dụng thanh nhiệt
giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, sát trùng, chữa kinh nguyệt không đều, khó ngủ, hồi
hộp, đái đỏ. Vỏ rễ dâm bụt vị ngọt, tính bình, có tác dụng điều kinh, chống ho
tiêu viêm, chữa viêm tuyến mang tai, viêm kết mạc, viêm khí quản, viêm đường
tiết niệu, viêm cổ tử cung, bạch đới, kinh nguyệt không đều, mất kinh. Mặt khác,
theo nghiên cứu mới nhất, hoa dâm bụt có tác dụng hạn chế lượng cholesterol
trong máu và giảm nguy cơ bệnh thấp tim.
Chính bởi công dụng chữa bệnh của cây dâm bụt như trên, có rất nhiều đề
tài nghiên cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
cây dâm bụt. Thế nhưng đa phần các đề tài đều tập trung vào hoa của cây dâm

bụt. Vẫn còn rất ít nghiên cứu về các bộ phận khác của cây dâm bụt, nhất là lá
cây dâm bụt.
Xuất phát từ thực tế trên, với mục đích góp phần nghiên cứu thành phần
hóa học loài cây này em xin chọn đề tài: “ 
- ”, nhằm
làm cơ sở cho việc nghiên cứu sâu hơn các hoạt tính sinh học cũng như việc sử


3

dụng cây dâm bụt trong tương lai. Qua đó, góp phần tăng thêm giá trị sử dụng
của loại cây này.

Lá dâm bụt được lấy từ vườn tại huyện Hương Thủy , tỉnh Thừa Thiên –
Huế.

- Xác định một số thông số hóa lý của lá dâm bụt.
- Xác định thành phần hóa học, công thức cấu tạo của một số hợp chất có
trong lá dâm bụt.

Để thực hiện đề tài này, tôi sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau:
4.1. Nghiên cứu lý thuyết
Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo trong và ngoài nước có
liên quan đến đề tài, trao đổi kinh nghiệm với các chuyên gia, thầy cô giáo và
đồng nghiệp.
4.2. Phương pháp thực nghiệm
- Phương pháp lấy mẫu, thu hái và xử lí mẫu.
- Phương pháp phân hủy mẫu phân tích để khảo sát hàm lượng hữu cơ.
- Phương pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử để xác định hàm lượng các
kim loại trong lá dâm bụt, phương pháp sắc ký khí – khối phổ liên hợp (GC–

MS), phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ liên hợp (LC–MS) nhằm phân tách và
xác định thành phần định tính và định lượng các hoạt chất chính trong các dịch
chiết.
- Phương pháp ngâm chiết mẫu.

5.1. Ý nghĩa khoa học
- Cung cấp những thông tin khoa học ban đầu về thành phần hóa học có
trong lá dâm bụt ở Thừa Thiên - Huế .


4

- Cung cấp những thông tin, tư liệu làm cơ sở cho việc nghiên cứu sau
này.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Giải thích một cách khoa học một số cách chữa bệnh trong dân gian bằng
cách sử dụng lá dâm bụt.
- Nhằm giúp cho việc ứng dụng lá dâm bụt ở phạm vi rộng một cách khoa
học hơn.
- Tổng hợp kiến thức về hợp chất thiên nhiên để giảng dạy bộ môn hóa
trong nhà trường được tốt hơn.

Luận văn gồm 69 trang. Trong đó:
Mở đầu: 3 trang
Tổng quan: 7 trang
Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu: 14 trang
Kết quả và thảo luận: 25 trang
Kết luận và kiến nghị: 2 trang
Tài liệu tham khảo: 3 trang
Phụ lục: 15 trang.

5

. 
1.1. 
Chi Dâm bụt, chi Râm bụt hay chi Phù dung (danh pháp khoa học:
Hibiscus) là một chi lớn chứa khoảng 200-220 loài thực vật có hoa trong họ Cẩm
quỳ (Malvaceae), có nguồn gốc ở khu vực ôn đới ấm, cận nhiệt đới và nhiệt đới
trên khắp thế giới.
Chi này bao gồm các loại cây thân thảo sống một đến nhiều năm giống
như các loại cây bụi thân gỗ và cây thân gỗ nhỏ. Lá mọc so le, loại lá đơn hình
trứng hay hình mũi mác, thông thường với mép lá dạng răng cưa hay dạng thùy.
Hoa lớn, dễ thấy, hình kèn, với 5 cánh hoa, có màu từ trắng tới hồng, đỏ, tía hay
vàng và rộng từ 4–15 cm. Quả là loại quả nang năm thùy khô, chứa vài hạt trong
mỗi thùy, được giải phóng khi quả nang tách ra khi chín [1, 3].
Nhiều loài trong chi này được trồng do có hoa sặc sỡ cũng như làm hàng
rào trong một số vườn hay công viên. Hibiscus syriacus là loài quốc hoa của Hàn
Quốc, trong khi Hibiscus rosa-sinensis là loài quốc hoa của Malaysia còn
Hibiscus brackenridgei là loài hoa của bang Hawai„i.

Hình 1.1. Loài Hibiscus rosa-sinensis
Malaysia)
Hình 1.2. Loài Hibiscus syriacus
)


6

Trong khu vực ôn đới, loài được trồng làm cảnh nhiều nhất có lẽ là
Hibiscus syriacus. Tại khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, Hibiscus rosa-sinensis
với nhiều giống lai có hoa sặc sỡ, là loại cây cảnh phổ biến [1, 3].
Trong chi dâm bụt có 200-220 loài đã được biết, các loài được đặt tên theo
đặc điểm riêng của chúng.
+ Phân loại theo đặc điểm của hoa:
 Hibiscus brackenridgei - dâm bụt hoa vàng, dâm bụt Hawaii
 Hibiscus hamabo - dâm bụt hoa vàng Nhật Bản
 Hibiscus tiliaceus - dâm bụt hoa vàng, hoàng cận, dâm bụt Hawaii
 Hibiscus clayi - dâm bụt Hawaii ( hoa đỏ)
 Hibiscus kokio - dâm bụt Hawaii (koki'o 'ula), dâm bụt hoa đỏ
 Hibiscus schizopetalus - dâm bụt hoa đỏ cánh nhỏ
+ Phân loại theo đặc điểm của lá
 Hibiscus dasycalyx - dâm bụt lá hẹp
 Hibiscus macrophyllus- dâm bụt lá to, đại diệp mộc cận.
 Hibiscus laevis hay Hibiscus militaris - dâm bụt lá kích
 Hibiscus acetosella - phù dung lá đỏ, phù dung châu Phi

+ Phân loại theo đặc điểm của thân cây
 Hibiscus mutabilis - phù dung thân gỗ, phù dung núi, hoa phù dung
 Hibiscus mutabilis versicolor
 Hibiscus rosa-sinensis - dâm bụt thân gỗ, mộc cận, đại hồng hoa,
phù tang (phật tang).
 Hibiscus rosa-sinensis L. 'Cooperi hay Hibiscus cooperi
 Hibiscus rosa-sinensis L. 'Hawaiano'
 Hibiscus syriacus - dâm bụt thân gỗ, mộc cận
+ Phân loại theo khu vực mọc:
 Hibiscus moscheutos - phù dung quỳ, dâm bụt đầm lầy


7

 Hibiscus coulteri - dâm bụt sa mạc
 Hibiscus taiwanensis - phù dung núi
+ Phân loại theo địa diểm phân bố
 Hibiscus furcellatus - dâm bụt Hawaii ('akiohala)
 Hibiscus coccineus hay Hibiscus semilobatus - dâm bụt Mỹ, Texas
Star
 Hibiscus splendens - dâm bụt Úc
 Hibiscus yunnanensis - phù dung Vân Nam
 Hibiscus trionum hay Hibiscus africanus, Hibiscus hispidus - cẩm
quỳ Venice, hoa một giờ
1.2. 
Tên thường gọi : Cây dâm bụt, Bông bụt.
Tên khác : Hồng bụt, Phù tang, Xuyên cân bì, Mộc cẩn, Bụp, Co
ngắn (Thái), Bioóc ngàn (Tày), Phầy quấy phiằng (Dao)…
Tên khoa học : Hibiscus rosa – sinensis L.







8


Phân loại khoa học
Giới : Thực vật ( Plantae)
Nghành : Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp : Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Bộ : Bông (Malvales)
Họ : Bông (Malvaceace)
Chi : Dâm bụt (Hibiscus L.)
Loài : Cây dâm bụt (Hibiscus rosa sinensis L.) [1,3]
Dâm bụt là loài cây thân gỗ, sống lâu năm, cây nhỏ, chiều cao trung bình
1,5- 2 m. Lá dâm bụt có hình bầu dục, nhọn đầu, tròn gốc, mép có răng to. Hoa ở
nách lá, lưỡng tính, khá lớn, 6-7 mảnh đài nhỏ (tiểu đài), hình sợi; đài hợp màu
lục dài gấp 2- 3 lần đài nhỏ; tràng 5 cánh hoa màu đỏ; nhị nhiều, tập hợp trên 1
trụ đài; bầu hình trụ hay hình nón, mùa hoa chủ yếu vào tháng 5-7.
Dâm bụt là 1 cây cảnh và cây hàng rào phổ biến nước ta và nhiều nước
nhiệt đới khác. Dâm bụt có nhiều loại:
+ Dâm bụt thường có dáng hoa cong, cánh hoa có răng cưa
+ Dâm bụt kép với hoa thẳng, nhiều cánh hoa
+ Dâm bụt xẻ hoa buông thõng, cánh hoa xe thùng và răng không đều.
+ Dâm bụt hoa nhỏ, hoa mọc rủ, cánh hoa nguyên không bao giờ nở xòe.

Hình 1.4.  Hình 1.5. 


9

Dâm bụt là loại thực vật được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới khí hậu ẩm.
Đặc biệt, dâm bụt là loại cây rất thông dụng tại Viêt Nam được trồng nhiều tại
các khu vực ven biển do cây có biên độ sinh thái rất lớn, có khả năng chịu đựng
được các điều kiện khí hậu khắc nghiệt rất cao: nắng nóng, mưa bão, đất cát…
Loài dâm bụt của Trung Quốc, Nhật Bản, được trồng làm hàng rào, làm cây
cảnh phổ biến ở nhiều nơi. Người ta thu hái rễ và lá quanh năm, thu hái hoa vào
mùa hè. Có thể dùng tươi hay phơi khô dùng dần.
1.3
Bên cạnh ứng dụng làm hàng rào, cây cảnh, cây dâm bụt được biết đến như
là một vị thuốc trong Đông y [2, 4].
+ Lá dâm bụt vị nhạt, nhớt, tính bình, có tác dụng làm dịu, an thần, tẩy nhẹ,
nhuận tràng, chữa viêm niêm mạc dạ dày, ruột, đại tiện ra máu, kiết lỵ, mụn nhọt,
ghẻ lở, mộng tinh, đới hạ.
+ Hoa dâm bụt vị ngọt, tính bình có tác dụng thanh nhiệt giải độc, lợi tiểu,
tiêu thũng, sát trùng, chữa kinh nguyệt không đều, khó ngủ, hồi hộp, đái đỏ…
+ Vỏ rễ dâm bụt vị ngọt, tính bình, có tác dụng điều kinh, chống ho tiêu
viêm, chữa viêm tuyến mang tai, viêm kết mạc, viêm khí quản, viêm đường tiết
niệu, viêm cổ tử cung, bạch đới, kinh nguyệt không đều, mất kinh.
Đặc biệt, y dược học hiện đại cũng chú ý nghiên cứu cây dâm bụt. Gần đây
Giáo sư Chau Jong Wang trường Đại học Y Chung San (Đài Loan) phát hiện hoa
dâm bụt có tác dụng hạn chế lượng cholesterol trong máu và giảm nguy cơ bệnh
thấp tim (The Guardian 9-2004) [23]. Nghiên cứu nước chiết xuất hoa dâm bụt
các nhà khoa học phát hiện nước chiết này làm hạ thấp đáng kể mức cholesterol
trong máu, ngăn ngừa có hiệu quả quá trình oxy hoá của lipoprotein, bảo vệ

thành động mạch thêm vững chắc (Science of Food and Agrriculture). Đây là
nghiên cứu đầu tiên cho thấy hiệu quả kỳ diệu của hoa dâm bụt. Các nhà khoa
học còn cho biết tác dụng chữa bệnh của hoa dâm bụt được nâng cao hơn nữa
nếu kết hợp với rượu vang đỏ và chè để làm giảm lượng cholesterol và lipid


10

trong máu. Như vậy cây dâm bụt vừa là cây cảnh đẹp vừa là cây thuốc quý, là
nguồn gen quý của nước ta.

Theo nghiên cứu của Shivananda Nayak và đồng nghiệp, loài dâm bụt
Hibiscus rosa sinensis có tác dụng thúc đẩy quá trình làm lành vết thương ở
chuột. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, dịch chiết của Hibiscus rosa sinensis L với
ethanol khi được hòa vào nước uống (120 mg/kg - 1 ngày) có tác dụng làm lành
vết thương trên nhóm chuột được thí nghiệm. Quá trình làm lành vết thương
được đánh giá bằng tỉ lệ co vết thương, độ bền kéo (tensile strength), trọng lượng
các mô hạt của vết thương. Kết quả, diện tích của vết thương giảm 86% trong khi
nhóm động vật chỉ cho uống nước giảm 75% . Độ bền kéo, trọng lượng khô và
ướt của mô hạt tăng lên đáng kể. Đồng thời, dịch chiết còn có tác dụng ức chế
hoạt động của các vi sinh vật gây nhiễm trùng vết thương [20].
Theo nghiên cứu của Khan Mohammed Junaid, Ajazuddin , Vyas Amber,
Singh Manju và Singh Deependra, dịch chiết của loài dâm bụt Hibiscus rosa
sinensis có ảnh hưởng đến sự lo lắng và vận động ở chuột. Cụ thể, dịch chiết của
loài dâm bụt này với rượu và chloroform có tác dụng làm giảm đáng kể hành vi
chạy nhảy của chuột khi bị hoảng loạn. Dịch chiết với ethanol cho kết quả tốt
hơn so với dịch chiết từ chloroform. Cả hai dịch chiết đã cho thấy không có sự
gia tăng đáng kể trong tiểu tiện và đại tiện của chuột [15].

`Theo nghiên cứu của A A Osuntoki, T A Oyede và A A Otunba, dịch

chiết của lá dâm bụt Hibiscus rosa-sinensis với dung dịch muối được xem là chất
chống viêm khớp và chống viêm. Kết quả cho thấy khi so sánh hiệu quả chống
viêm với acetylsalicylic acid và indomethacin, dịch chiết từ lá làm cho màng tế
bào hồng cầu của con người hoạt động ổn định hơn. Điều này được giải thích đó
là do trong lá có chứa các chất có hoạt tính sinh học: alkaloid, tannin, flavonoid,
steroid, saponin, các glycosides, steroid, triterpenic và leucoanthocyanydines
[10].


11

Theo nghiên cứu của Moqbel FS, Naik PR, Najma HM và Selvaraj S,
trong 5 phân đoạn chiết xuất lá Hibiscus rosa sinensis L. với ethanol, phân đoạn
3 và 5 đã được chọn để điều trị bệnh tiểu đường ở chuột không mắc bệnh béo
phì. Với liều lượng 100 mg phân đoạn 3 và 200 mg phân đoạn 5 cho 1 kg trọng
lượng cơ thể động vật, đã chứng minh lá dâm bụt có tác dụng hạ đường huyết ở
chuột [19].
Theo nghiên cứu của Olagbende-Dada SO , Ezeobika EN và Duru FI, dịch
chiết từ lá dâm bụt Hibiscus rosasinensis Linn với góp phần tăng cường giá trị
dinh dưỡng, nâng cao đời sống sức khỏe. Cụ thể, lá dâm bụt có tính chất đồng
hóa, hỗ trợ cho sự tổng hợp protein và tăng cường khả năng tình dục ở nam giới.
Kết quả cho thấy, ở nhóm chuột được thí nghiệm có sự gia tăng về trọng lượng
về bộ phận sinh dục (tinh hoàn, mào tinh hoàn, túi hội thảo và tuyến tiền liệt). Về
hiệu quả, dịch chiết của lá dâm bụt với rượu cho kết quả cao hơn dịch chiết với
nước nóng hoặc nước lạnh. Hiệu quả của lá dâm bụt xuất phát từ ảnh hưởng của
lá dâm bụt lên các hormon gonadotrophin điều hòa hoạt động của nội tiết tố
androgen ( nội tiết tố liên quan đến sự sinh tinh) [21].

Bên cạnh đó lá của loài dâm bụt Hibiscus mutabilis có tác dụng điều trị
bệnh lao viêm hạch bạch huyết cổ tử cung [22] và hoa có tác dụng điều trị ung

thư biểu mô mũi họng [12]. Dịch chiết từ loài Hibiscus esculentus giúp cải thiện
nếp nhăn bằng cách co cơ ức chế và loại bỏ các gốc oxy tự do [11]. Dịch chiết từ
dâm bụt giàu polyphenol có khả năng tiêu diệt tám loại dòng tế bào ung thư biểu
mô, hiệu quả nhất là ung thư biểu mô dạ dày của [16]. Mặt khác, protocatechuic
( một hợp chất phenolic acid), phân lập từ hoa khô của Hibiscus sabdariffa là một
chất chống oxy hóa, ức chế hoạt động khối u và cũng có hiệu quả chống lại bệnh
bạch cầu của con người [17].
Như vậy, hoạt tính dược lý của cây dâm bụt đã được nghiên cứu nhiều.
Tuy nhiên các công trình về thành phần hóa học của cây dâm bụt hầu như vẫn
còn rất ít.


12

. 



2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu nghiên cứu là lá dâm bụt thường lấy từ huyện Hương Thủy,
tỉnh Thừa Thiên – Huế vào tháng 8 năm 2011. Cây dâm bụt được chọn lấy lá cao
khoảng 1,5 m, có nhiều lá và hoa. Lá dâm bụt có hình bầu dục, nhọn đầu, mép có
răng to, mặt lá trơn bóng, mặt trên đậm hơn mặt dưới và không bị sâu. Cuống lá
hình trụ, màu xanh lục, có nhiều lông đa bào hình sao. Hoa có màu đỏ đậm, có
nhiều nhị.
.


2.1.2. Xử lí nguyên liệu
Lá dâm bụt sau khi được thu hái sẽ được rửa sạch, để ráo nước, phơi khô

rồi nghiền thành bột. Bột lá dâm bụt hơi thô, màu xanh đậm, được bảo quản trong
bình hút ẩm.



13




2.1.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.1.3.1. Thiết bị, dụng cụ
Các thiết bị sử dụng trong quá trình thí nghiệm gồm có:
- Tủ sấy, lò nung, bếp điện, cân phân tích.
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS ( phòng thí nghiệm khoa Hóa,
trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng)
- Sắc ký lỏng - khối phổ liên hợp (LC/MS) được thực hiện trên máy Xevo
TQ hãng Waters, Mỹ ( tại phòng nghiên cứu cấu trúc – Viện hóa học – Viện khoa
học và công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội). Hệ dung môi:
methanol - nước. Tốc độ dòng: 0,25ml/phút. Nguồn ion hoá của máy phổ khối:
phun mù điện tử.
- Sắc ký khí- khối phổ liên hợp (GC/MS) được thực hiện trên máy Agilent
7890A/5975C (tại trung tâm đo lường kỹ thuật chất lượng kỹ thuật , số 2, Ngô
Quyền, Quận 3, TP Đà Nẵng). Cột sắc ký HP5MS (dài 30m; đường kính trong
0,25mm; lớp phim dày 0,25μm). Khí mang Heli (7 psi), thể tích tiêm 1μl, split
10:1, nhiệt độ buồng tiêm mẫu :280
o
C. Chượng trình nhiệt độ lò: nhiệt độ đầu
80
o

C, giữ ở 0 phút, sau đó tăng lên 290
o
C với tốc độ gia nhiệt 10
o
C/phút, giữ ở
nhiệt độ này trong 20 phút. Điều kiện khối phổ : nguồn ion hoá (EI), năng lượng


14

ion hoá (70eV), nhiệt độ MS source (230
o
C), nhiệt độ MS Quad (150
o
C), nhiệt
độ giao diện sắc ký khí với detector khối phổ (280
o
C), chế độ quét Fullscan (
Thời gian trễ 0-3 phút; thời gian quét: 3-50 phút, khoảng khối quét: 35-600amu).
- Các dụng cụ thủy tinh dùng trong quá tình thí nghiệm gồm có: bình tam
giác 100 mL, 250 mL, cốc thủy tinh loại 100 mL, loại 250 mL, pipet, đũa thủy
tinh, lọ đựng mẫu, giá thí nghiệm, bình đựng mức 10 mL, 10 mL, nhãn hóa chất.
2.1.3.2. Hóa chất
Các dung môi: n–hexane, ethyl acetate, methanol, nước cất
Hóa chất vô cơ: dung dịch H
2
SO
4
98%, HNO
3

, các dung dịch chuẩn của
các muối: Pb
2+
, Mg
2+
, Cu
2+
, Zn
2+
, K
+
, Na
+
, Ca
2+
.
2.2. 
2.2.1. Các phương pháp xử lí mẫu
Xử lí mẫu phân tích là một quá trình phức tạp nhằm chuyển các chất cần
xác định có trong mẫu phân tích ban đầu về dạng tan trong một dung môi thích
hợp như nước hay dung môi hữu cơ,…để sau đó có thể xác định được nó theo
một phương pháp phân tích thích hợp. Có rất nhiều kĩ thuật xử lí mẫu phân tích,
nhưng phổ biến nhất là xử lí theo phương pháp khô, phương pháp ướt và phương
pháp khô ướt kết hợp [5].
* Xử lí theo phương pháp khô:
Cách này thường dùng và đơn giản nhất, ta không dùng dung môi mà
dùng nhiệt độ để phân hủy mẫu, đem nung mẫu ở 500-550
0
C trong chén plantin
hay thạch anh, các chất hữu cơ bị đốt cháy, trong tro còn lại các chất vô cơ khó

bay hơi. Cần chú ý rằng trong quá trình nung sẽ mất một số nguyên tố do bay hơi
như các halogen, thủy ngân, lưu huỳnh…Cũng có thể chỉ cần đốt cháy các chất
hữu cơ trong bình kín, dưới áp suất cao hoặc khi phân hủy bằng cách nung chảy
như đối với các chất vô cơ nhưng phải thêm chất oxi hóa: HNO
3
, H
2
O
2
.
Ưu điểm: - Không tốn dung môi.
- Tốn ít thời gian hơn so với phương pháp ướt.


15

Hạn chế: - Ở nhiệt độ cao nhiều chất bay hơi, ví dụ ở 500
0
C lượng Pb, Cd bay
hơi xấp xỉ 20% dẫn đến sai số kết quả lớn.
* Xử lý theo phương pháp ướt
Cách này rất ít được dùng vì không thuận tiên, nó chỉ dùng khi không
dùng phương pháp xủ lí khô được. Ta đưa mẫu về dạng dung dịch bằng các dung
môi như: H
2
SO
4
đặc, hỗn hợp H
2
SO

4
+ HNO
3
, HClO
4
…hoặc thêm H
2
O
2
,
KMnO
4
để làm tăng quá trình phân hủy.
Ưu điểm: - Hạn chế được việc bay hơi của các chất trong mâu phân tích, kết quả
phân tích gần với kết quả thực hơn.
Hạn chế: - Rất tốn dung môi, dung môi phải tinh khiết.
- Hàm lượng phân tích có khi lớn hơn lượng thực dẫn đến hiệu suất
thu hồi lớn hơn 100%.
* Xử lí theo phương pháp khô ướt kết hợp
Nguyên tắc của phương pháp này là mẫu được phân hủy trong cốc sứ.
Mẫu được xử lí ướt sơ bộ bằng lượng nhỏ axit, nhằm mục đích phá vỡ sơ bộ cấu
trúc ban đầu của các hợp chất mẫu và tạo điều kiện giữ một số nguyên tố có thể
bay hơi khi nung. Sau đó mới đem nung sẽ nhanh hơn và quá trình xử lý sẽ triệt
để hơn xử lý ướt và hạn chế bớt được sự mất của một số kim loại khi nung.
Ưu điểm: - Giảm bớt được các hóa chất tinh khiết cao khi tro hóa ướt.
- Dung dịch thu được là trong và sạch hơn tro hóa ướt.
2.2.2. Xác định độ ẩm
Cân chính xác một khối lượng bột lá dâm bụt cho vào cốc sứ đã sấy đến
khối lượng không đổi, cho cốc sứ đựng mẫu vào tủ sấy ở nhiệt độ 100
0

C trong
thời gian từ 4 đến 6 tiếng đến khi khối lượng chén và mẫu không đổi để xác định
độ ẩm.
2.2.3. Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu
Để xác định hàm lượng tro trong mẫu thực vật người ta dùng phương pháp
tro hóa mẫu [5].


16

Trong đề tài này tôi dùng phương pháp tro hóa mẫu bằng phương pháp
khô ướt kết hợp. Mẫu xử lí sơ bộ, có thể phân hủy các chất hữu cơ bằng H
2
SO
4
,
HNO
3
… Sau đó được nung ở 500 – 550
o
C trong chén thạch anh hay platin, các
chất hữu cơ bị đốt cháy, trong tro còn lại các chất vô cơ khó bay hơi.
2.2.4. Xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp quang phổ hấp
thụ nguyên tử (AAS)
 Nguyên tắc phép đo AAS
Phương pháp phân tích dựa trên cơ sở đo phổ hấp thụ nguyên tử của một
nguyên tố được gọi là phép đo phổ hấp thụ nguyên tử ( phép đo AAS). Cơ sở lý
thuyết của phép đo này là sự hấp thụ năng lượng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử
tự do ở trạng thái hơi (khí) khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của nguyên tố
ấy trong môi trường hấp thụ [7, 8].Vì thế muốn thực hiện được phép đo quang

phổ hấp thụ nguyên tử (phép đo AAS) cần thực hiện các quá trình sau:
- Quá trình nguyên tử hóa mẫu: chuyển mẫu phân tích từ trạng thái ban
đầu (rắn hay dung dịch) về trạng thái hơi của các nguyên tủ tự do. Mục đích của
quá trình này là tạo ra được đám hơi các nguyên tử tự do từ mẫu phân tích, làm
môi trường hấp thụ bức xạ và sinh ra phổ hấp thụ nguyên tử. Có thể nguyên tử
hóa mẫu phân tích bằng ngọn lửa hoặc kỹ thuật nguyện tử hóa không ngọn lửa.
Đây là giai đoạn quan trọng nhất và có ảnh hưởng đến phép đo AAS. Bởi vì chỉ
có các nguyên tử tự do ở trạng thái hơi mới cho phổ hấp thụ nguyên tử.
- Chọn nguồn tia sáng đơn sắc có bước sóng phù hợp với nguyên tố cần
phân tích, chiếu chùm tia sáng đơn sắc đó vào đám hơi của nguyên tố cần phân
tích. Các nguyên tử của nguyên tố cần xác định sẽ hấp thụ những tia bức xạ nhất
định và tạo ra phổ hấp thụ của nó. Phần cường độ của chùm tia sáng đã bị một
loại nguyên tử hấp thụ sẽ phụ thuộc vào nồng độ của nó trong môi trường hấp
thụ.
- Thu toàn bộ chùm tia sáng sau khi qua môi trường hấp thụ, phân li chúng
thành phổ và chọn vạch phổ cần đo của nguyên tố cần phân tích vào khe đó để đo


17

cường độ của chúng. Cường độ đó chính là tín hiệu hấp thụ của vạch phổ hấp
thụ.
- Ghi nhận tín hiệu và đo kết quả đo của cường độ vạch phổ hấp thụ bằng
thiết bị thích hợp.
 Các bộ phận trong máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS
* Nguồn đơn sắc
Nguồn đơn sắc là nguồn phát ra chùm bức xạ đơn sắc của nguyên tố cần
phân tích, nguồn này sẽ chiếu vào đám hơi nguyên tử tự do và nó phải thỏa mãn
các điều kiện sau:
- Nguồn phát ra tia bức xạ đơn sắc tạo ra phải là các tia bức xạ nhạy của

nguyên tố cần phân tích. Chùm tia phát xạ phải có cường độ ổn định, lặp lại được
nhiều lần đo khác nhau trong cùng một điều kiện và phải điều chỉnh được để có
cường độ cần thiết cho mỗi phép đo
- Phải tạo ra được chùm tia phát xạ thuần khiết, chỉ bao gồm một số vạch
nhạy của nguyên tố cần phân tích, phổ nền của nó không đáng kể
- Phải có cường độ cao nhưng bền với thời gian.
* Hệ thống nguyên tử hóa mẫu phân tích
Bộ phận nguyên tử hóa mẫu chuyển mẫu cần phân tích từ trạng thái ban
đầu thành dạng hơi của nguyên tử tự do dưới tác dụng của nhiệt độ. Đám hơi của
các nguyên tử tự do này chính là môi trường hấp thụ bức xạ và sinh ra phổ hấp
thụ nguyên tử.
* Hệ quang và detecter
Hệ thống trang thiết bị để thu, phân li chọn lọc một số vạch thích hợp của
nguyên tố cần phân tích và ghi nhớ lại nó.
* Bộ phận xử lí kết quả
Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử cho phép điều khiển hai chế độ. Một là
điều khiển trực tiếp bằng cách xử dụng bàn phím gắn trên máy tính. Hai là điều
khiển thông qua phần mềm được cài đặt trong máy vi tính kết nối với máy AAS.
 Những ưu điểm và nhược điểm của phép đo AAS


18

* Ưu điểm
- Độ nhạy và độ chọn lọc cao. Gần 60 nguyên tố hóa học có thể xác định
bằng phương pháp này với độ nhạy từ 1.10
-4
đến 10
-5
. Phương pháp nà áp dụng

rộng rãi trong nhiều lĩnh vực để xác định vết các kim loại.
- Không cần làm giàu nguyên tố cần xác định trước khi phân tích. Do đó
tốn ít nguyên liệu mẫu, tốn ít thời gian và không cần dùng nhiều hóa chất tinh
khiết cao khi làm giàu mẫu. Mặt khác cũng tránh được sự nhiễm bẩn mẫu khi xử
lí qua các giai đoạn phức tạp.
- Các động tác thực hiện nhẹ nhàng, các kết quả phân tích lại có thể ghi lại
trên băng giấy để lưu trữ lại sau này. Đồng thời có thể xác định liên tiếp nhiều
nguyên tố trong một mẫu. Các kết quả phân tích lại rất ổn định, sai số nhỏ.
* Nhược điểm
- Muốn thực hiện phép đo này cần phải có hệ thống máy đo tương đối đắt
tiền.
- Do phép đo có độ nhạy cao nên môi trường không khí phòng thí nghiệm
phải không có bụi, các dụng cụ, hóa chất dùng trong phép đo phải có độ tinh
khiết cao.
- Cần phải có kĩ sư có trình độ cao để bảo dưỡng và chăm sóc các trang
thiết bị máy móc khá là tinh vi và phức tạp.
- Chỉ cho biết thành phần nguyên tố của chất ở trong mẫu phân tích, mà
không chỉ ra trạng thái liên kết của nguyên tố ở trong mẫu.
2.3
Phương pháp ngâm chiết là phương pháp hoá học dùng để tách một hoặc
nhiều cấu tử ra khỏi một hỗn hợp bằng cách ngâm hỗn hợp vào một dung môi
thích hợp để hoà tan cấu tử định tách trước khi chiết [6]. Phương pháp này được
áp dụng rộng rãi trong hoá dược để tách các hợp chất từ các vị thuốc có nguồn
gốc từ động, thực vật.
2.4. 
-MS)


19

2.4.1. Phương pháp sắc ký khí (GC)
Sắc ký khí là một trong những phương pháp quan trọng nhất hiện nay để
tách, định lượng, xác định cấu trúc các chất, đặc biệt có ý nghĩa quan trọng trong
nghiên cứu các hợp chất hữu cơ [7, 8].
Pha động trong GC là chất khí nên chất phân tích cũng phải được hóa hơi
để đưa vào cột sắc ký, thường hóa hơi dưới 250
0
C. Pha tĩnh có thể là chất rắn
được nhồi vào cột hay một màng film mỏng bám lên trên bề mặt chất mang trơ,
hoặc có thể tạo thành một màng mỏng bám lên mặt trong của thành cột (cột mao
quản).
Sắc ký khí được dùng để chia tách các hỗn hợp của hóa chất ra các phần
riêng lẻ, mỗi phần có một giá trị riêng biệt. Trong sắc ký khí (GC) chia tách xuất
hiện khi mẫu bơm vào pha động, pha động là một khí trơ. Pha động mang hỗn
hợp mẫu đi qua pha tĩnh, pha tĩnh được sử dụng là các hóa chất, hóa chất này có
độ nhạy và hấp thụ thành phần hỗn hợp trong mẫu.
Thành phần hỗn hợp trong pha động tương tác với pha tĩnh, mỗi hợp chất
trong hỗn hợp tương tác với một tỷ lệ khác nhau, hợp chất tương tác nhanh sẽ
thoát ra khỏi cột trước và hợp chất tương tác chậm sẽ ra khỏi cột sau. Đó là đặc
trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh, hơn nữa quá trình chia tách có thể xảy ra
bởi sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc là áp suất của pha động.
Trong khi các thiết bị chạy, máy sẽ đưa ra các biểu đồ, được gọi là sắc ký
đồ. Mỗi peak trong sắc ký đồ mô tả một tín hiệu tạo nên khi chất giải hấp từ cột
sắc ký và đi vào đầu dò detector, trục hoành biểu diễn thời gian lưu và trục tung
biểu diễn cường độ của tín hiệu.
2.4.2. Phương pháp khối phổ (MS)
Khối phổ được dùng để xác định một chất hóa học dựa trên cấu trúc của
nó [7, 8]. Khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc ký, chúng đi vào đầu dò có
dòng điện ion hóa (mass spectrometry). Khi đó, chúng sẽ tấn công vào các luồng,
do đó chúng bị vỡ thành những mảnh vụn, những mảnh vụn này có thể lớn hoặc

nhỏ. Những mảnh vụn thực tế là các ion, tiêu điểm của các mảnh vụn đi xuyên


20

qua các khe hở và đi vào đầu dò detector, được thành lập bởi phần mềm chương
trình và hướng các mảnh vụn đi vào các khe của khối phổ.
Về việc phân tích kết quả máy tính sẽ ghi lại các biểu đồ của mỗi lần quét.
Trục hoành biểu diễn tỉ lệ m/z còn trục tung biểu diễn cường độ tín hiệu của mỗi
mảnh vụn được quét bởi đầu dò detector. Đây là đồ thị của số khối.
Các nhà nghiên cứu có thể so sánh khối phổ thu được trong thí nghiệm
của họ với một thư viện khối phổ của các chất đã được xác đinh trước. Việc này
có thể giúp họ định danh được chất đó (nếu phép so sánh tìm được kết quả tương
ứng) hoặc là cơ sở để đăng ký một chất mới (nếu phép so sánh không tìm được
kết quả tương ứng).
2.4.3. Sắc ký khí ghép khối phổ (GC - MS)

Hình 2.3
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) là một trong những phương pháp sắc
ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong
các nghiên cứu và phân tích kết hợp. Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành 2 phần:
phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân
tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối.
Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật này, các nhà hoá học có thể đánh giá, phân tích định
tính và định lượng và có cách giải quyết đối với một số hóa chất. Ngày nay,


21

người ta ứng dụng kỹ thuật GC/MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các

nghành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm…
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)có thể phân tích các hỗn hợp hóa chất
phức tạp như không khí, nước…Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối
phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó (giống như việc lấy dấu
vân tay). Cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc các
chất đã biết. Nếu không tìm ra được chất tương ứng trong thư viện thì nhà nghiên
cứu, có thể dựa trên cấu trúc mới tìm được để phát triển các ý tưởng về cấu trúc
hóa học. Nói cách khác, nhà nghiên cứu thu được 1 dữ liệu mới và có thể đóng
góp vào thư viện cấu trúc nói trên, sau khi tiến hành thêm các biện pháp để xác
định chính xác loại hợp chất mới này.
Khi GC kết hợp với MS, nó sẽ trở thành 1 máy phân tích đa năng, các nhà
nghiên cứu hóa học có thể hòa tan hỗn hợp các hợp chất hữu cơ, tách chiết và
bơm vào máy để nhận dạng chúng, hơn nữa các nhà nghiên cứu cũng xác định
nồng độ của mỗi thành phần hóa chất.
2.5           ký  
-MS)
2.5.1. Phương pháp sắc ký lỏng
- Pha động ở trạng thái lỏng có thể là hợp chất hữu cơ hoặc là hỗn hợp hợp
chất hữu cơ với nước.
- Pha tĩnh thường là các hạt nhỏ hoặc màng mỏng lỏng bám đều lên bề
mặt của chất mang trơ.
- Phân loại: có hai loại
+ Sắc ký lỏng áp suất thường.
+ Sắc ký lỏng áp suất cao (sắc ký lỏng cao áp ).
- Trước đây chủ yếu sử dụng sắc ký lỏng áp suất thường, tuy thiết bị rẻ
nhưng hiệu suất tách thấp, rất tốn dung môi để rửa giải, nên hiện nay dùng
HPLC.
- Kỹ thuật:

22

+ Giữ cho thành phần và tốc độ của pha động là không đổi: tách kém hiệu
quả.
+ Thay đổi cả thành phần, tốc độ của pha động: tách được hỗn hợp tương
đối phức tạp [7, 8].
2.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ (LC-MS)
Phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ (LC-MS) dựa trên cơ sở “ nối ghép”
máy sắc ký lỏng với máy phổ khối lượng.
Sắc ký lỏng phân giải cao là một phương pháp hữu hiệu để phân tách các
hỗn hợp phức tạp, đặc biệt là khi nhiều hợp phần trong hỗn hợp có độ phân cực
lớn [7, 8].
Phương pháp phổ khối lượng có độ nhạy tuyệt vời (10
-6
-10
-9
g) và tốc độ
ghi nhanh sẽ cho thông tin xác định cấu trúc từ những lượng tách ra được như
phương pháp sắc ký lỏng.
Việc liên kết hai kĩ thuật đó đã tạo ra một công cụ mạnh mẽ để tách biệt
và nhận biết các hợp phần của các hỗn hợp tự nhiên và tổng hợp. Nhờ có sự liên
kết chặc chẽ này người ta có thể thu được phổ khối lượng đủ chấp nhận đối với
tất cả các hợp phần mà sắc ký lỏng tách được, kể cả những hợp phần với khối
lượng chỉ cỡ picrogam và có mặt trong vài giây.
Ở hệ thống LC-MS người ta phải áp dụng những kĩ thuật đặc biệt để loại
những dung môi phân cực dùng cho sắc ký lỏng trước khi chuyển sang máy phổ
khối lượng. toàn bộ quá trình vận hành và ghi kết quả đều được tự động điều
khiển bởi computer.

23



Hình 2.4
2.6. T
2.6.1. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện theo phương pháp
pha loãng nồng độ của Hadacek F. và Greger H [14], tiến hành trên phiến vi
lượng 96 giếng theo hai bước.
Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm dịch chiết và các chất có hoạt tính.
Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất và của dịch chiết có
hoạt tính.
Chất đối chứng bao gồm: Ampixilin đối với vi khuẩn [Gram (+)].
Tetraxilin đối với vi khuẩn [Gram (–)], Nystasin đối với nấm sợi.
Các chủng vi sinh vật được chọn để thử gồm các vi khuẩn [Gram (–)],
Escherichia coli (E.C.) và Pseudomonas aeruginosa (P.A.).
E.C. thuộc nhóm trực khuẩn Gram (–) thường sống ở đường ruột và gây
một số bệnh ở người như tiêu chảy, viêm ruột thừa. P.A. là trực trùng mủ xanh
thường gây mủ nhiễm trùng, có thể gây sốt, viêm mủ thận, tiêu chảy, khó điều trị.
Các chủng vi sinh vật [Gram(+)] bao gồm: Bacillus subtilis (B.S.),
Staphylococcus aureus (S.A.), Candida albicans (C.A.).


24

Nấm và vi khuẩn được duy trì trong môi trường dinh dưỡng Saboraud
dextros broth và Trypcase soya broth (TSB). Các chủng kiểm định được hoạt hóa
trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối
với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm).

Mẫu thử được hòa tan trong dung dịch DMSO 100% với 4 – 10 thang
nồng độ được pha loãng từ dịch gốc rồi nhỏ trong phiến vi lượng 96 giếng. Vi
sinh vật kiểm định sau khi hoạt hóa được pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng
cho tới nồng độ tương đương 0,5 đơn vị MeLand (khoảng 10
8
vsv/ml). Để trong
tủ ấm 37
o
c trong 24 giờ đối với vi khuẩn và 30
o
C trong 48 giờ đối với nấm. Sau
đó đọc kết quả và tính giá trị ức chế tối thiểu (MIC).
Mẫu thô có giá trị MIC

200 μg/ml, mẫu tinh có MIC

50 μg/ml là có
hoạt tính.
2.6.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng oxi hóa
 Phương pháp kháng oxi hóa thông qua phản ứng bao vây gốc tự do
(DPPH)
Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela G., M.B., Elena, K
và cộng sự (2003). Dựa theo nguyên tắc chất 1,1–diphenyl–2–picrylhydratzyl
(DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch ethyl acetate bão
hòa. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng trung
hòa hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các
của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá thông qua giá trị
hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở
bước sóng 515nm.
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (SC


50) sẽ được thử nghiệm bước 2 để
tìm giá trị SC
50
.
Giá trị SC
50
(g/ml)
Mẫu được pha theo 5 thang nồng độ. Giá trị SC
50
được xác định bằng
chương trình table curve thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử
mà ở đó 50 % các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hòa chất thử.


25

 Phương pháp thử hoạt tính peroxydaza
Nguyên liệu: Máu tươi được chống đông bằng ADC (Adenine dextrose
citrate), pha loãng 10 – 20 lần bằng nước cất. Chia thành các ống nhỏ 0,5 – 1 ml.
Dùng cho thí nghiệm cất trong tủ lạnh – 80
o
C. Khi dùng pha loãng thêm 25 – 50
lần bằng RB. H
2
O
2
(0,2N hay 2%).
Indigo: chuẩn bị dung dịch stock – 80
o

C: 0,1N, pha loãng 100 lần sẽ thu
được dung dịch phản ứng 0,001N.
Chất thử:
– Pha loãng bằng DMSO: dịch gốc 20 mg/ml, tiếp theo pha loãng 1:4 tạo
thành 1 dãy 5 nồng độ.
– Pha loãng bằng dung dịch đệm: tạo một dãy 5 nồng độ mới từ dãy nồng
độ trên bằng cách pha loãng 7,8 lần với dung dịch đệm.
Phản ứng:
– 50 l dung dịch đệm axetat natri pH 4,7 0,1N
– 10l chất thử pha trong DMSO và RB
– 60 l enzyme pha loãng 500 lần
– 60 l H
2
O
2
0,2N hay 2%
– 20 l Indigocarmin 0,001N
– 50 l TCA 20%
– Giếng điều khiển âm không có enzym, không có chất thử, giếng điều
khiển dương enzym hoạt động 100%, không có chất thử.
– Để thời gian phản ứng ở nhiệt độ phòng trong vòng 20 – 25phút, dừng
phản ứng bằng TCA. Đọc kết quả ở bước sóng 610 nm.