Xây dựng quy trình thử nghiệm hoạt tính rhg CSF (recombinant humangranulocyte colony stimulating factor) và mô hình khảo sát tác động của rhg CSF theo phác đồ điều trị

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


VƯƠNG CÁT KHÁNH


XÂY DỰNG QUY TRÌNH THỬ NGHIỆM HOẠT
TÍNH rhG-CSF (Recombinant Human
GRANULOCYTE COLONY STIMULATING
FACTOR) VÀ MÔ HÌNH KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG
CỦA rhG-CSF THEO PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ


Chuyên ngành: DI TRUYỀN
Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. ĐẶNG THỊ PHƯƠNG THẢO


TP. Hồ Chí Minh – Năm 2011


i

MỤC LỤC
MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC HÌNH iii
DANH MỤC CÁC BẢNG v
LỜI MỞ ĐẦU 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Nhân tố kích thích tạo dòng bạch cầu hạt G-CSF 4
1.1.1. Giới thiệu 4
1.1.2. Chức năng của protein G-CSF 4
1.1.3. Ứng dụng của protein G-CSF trong trị liệu 6
1.1.4. Một số sản phẩm G-CSF thương mại 8
1.2. Thử nghiệm sinh học G-CSF 10
1.2.1. Thử nghiệm sinh học in vitro 10
1.2.2. Thử nghiệm sinh học in vivo 11
1.3. Phương pháp thử nghiệm sinh học G-CSF in vitro 13
1.3.1. Các dòng tế bào được sử dụng cho thử nghiệm sinh học G-CSF in vitro 13
1.3.2. Phương pháp phân tích kết quả thử nghiệm in vitro 14
1.3.3. Ưu - khuyết điểm của thử nghiệm hoạt tính in vitro 18
1.4. Phương pháp thử nghiệm sinh học G-CSF in vivo 18
1.4.1. Các mô hình động vật được sử dụng 18
1.4.2. Các thử nghiệm tác động của G-CSF trên mô hình động vật 20
1.4.3. Phương pháp phân tích kết quả thử nghiệm G-CSF in vivo 21
1.4.4. Ưu - khuyết điểm của thử nghiệm hoạt tính in vivo 22
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23
2.1. Vật liệu 24
2.1.1. Dụng cụ và thiết bị 24
2.1.2. Hóa chất 24
2.1.3. Môi trường 28
2.1.4. Nguyên vật liệu 30
2.2. Phương pháp 31

ii

2.2.1. Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF in vitro 31
2.2.2. Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF in vivo 35
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 40
3.1. Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF in vitro 41
3.1.1. Quan sát hình thái và mật độ tế bào M-NFS-60 dưới tác động của protein
G-CSF 41
3.1.2. Khảo sát mối tuơng quan giữa khả năng tăng trưởng của tế bào và nồng
độ G-CSF 42
3.1.3. Khảo sát mật độ tế bào tiến hành thử nghiệm sinh học 43
3.1.4. Khảo sát thời gian tiến hành thử nghiệm sinh học 45
3.1.4. Đề xuất quy trình xác định hoạt tính G-CSF 47
3.1.5. Đánh giá quy trình xác định hoạt tính G-CSF 50
3.2. Áp dụng quy trình để xác định hoạt tính G-CSF tái tổ hợp 52
3.2.1. Mẫu protein trước tinh chế 53
3.2.2. Mẫu protein sau tinh chế 57
3.2.3. Mẫu protein đông khô 58
3.3. Khảo sát xây dựng quy trình thử nghiệm hoạt tính G-CSF in vivo 60
3.3.1. Khảo sát xây dựng mô hình chuột suy giảm miễn dịch bằng thuốc
Cyclophosphamide (CPA) 60
3.3.2. Khảo sát nồng độ G-CSF tối ưu dùng cho thử nghiệm hoạt tính in vivo . 64
3.3.3. Xây dựng mô hình đánh giá tác động của G-CSF theo phác đồ điều trị . 67
3.4. Áp dụng quy trình để đánh giá hoạt tính G-CSF tái tổ hợp in vivo 69
3.4.1. Đánh giá hoạt tính G-CSF tái tổ hợp 69
3.4.2. Đánh giá tác động G-CSF tái tổ hợp theo phác đồ điều trị 71
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 73
4.1. Kết luận 74
4.2. Đề nghị 75
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77
PHỤ LỤC 81


v

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Chế độ điều chỉnh liều G-CSF 7
Bảng 3.2. Giá trị Hill slope và biên độ dao động của các mẫu 44
Bảng 3.3. Giá trị Hill slope và biên độ dao động của các mẫu 46
Bảng 3.4. Kết quả tính LU và IU mẫu G-CSF chuẩn và mẫu G-CSF kiểm tra 51
Bảng 3.5. Kết quả đo OD450 –OD595 các mẫu thử nghiệm 55
Bảng 3.6. Kết quả tính LU và IU mẫu G-CSF chuẩn và mẫu trước tinh chế 57
Bảng 3.7. Kết quả tính LU và IU mẫu G-CSF chuẩn và mẫu sau tinh chế 58
Bảng 3.8. Kết quả tính LU và IU mẫu G-CSF chuẩn và mẫu đông khô 60
Bảng 3.9. Tương quan giữa lượng bạch cầu tổng (%) và nồng độ CPA 61
Bảng 3.10. Tương quan giữa lượng bạch cầu tổng (%) và chế độ tiêm CPA 63
Bảng 3.11. Tương quan giữa % tăng bạch cầu trung tính và nồng độ G-CSF 65
Bảng 3.12. Sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính (%) sau khi tiêm Leukocim theo
phác đồ điều trị 68
Bảng 3.13. Lượng bạch cầu trung tính (%) ở các mẫu thử nghiệm 70
Bảng 3.14. Lượng bạch cầu trung tính (%) tương ứng với các mẫu thử nghiệm sau
khi tiêm theo phác đồ điều trị. 71

iii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Vai trò kích thích tạo máu của các nhân tố tăng trưởng 5
Hình 1.2. Một số sản phẩm G-CSF thương mại 8
Hình 1.3. Nguyên tắc chung của phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro 11
Hình 1.4. Quy trình phát triển thuốc tại Mỹ 12
Hình 1.5. Giá trị Hill slope chuẩn trong thử nghiệm sinh học kích thích 15
Hình 1.6. Đường cong tương quan giữa nồng độ mẫu và mức đáp ứng của tế bào .16
Hình 1.7. Giá trị ED99, ED90, ED50 biểu thị trên đường cong tương quan giữa sự
tăng trưởng tế bào và nồng độ mẫu 17
Hình 1.8. Các động vật được sử dụng làm mô hình thí nghiệm 19
Hình 2.9. Phản ứng dehydrogenase ở tế bào sống biến đổi WTS-8 thành sản phẩm
màu (formazan) 27
Hình 2.10. Đường cong tăng trưởng tế bào trong nuôi cấy in vitro 33
Hình 2.11. Quy trình tiêm thuốc và khảo sát số lượng bạch cầu ở chế độ tiêm một
lần. 36
Hình 2.12. Quy trình tiêm thuốc và khảo sát số lượng bạch cầu ở chế độ tiêm liên
tục. 37
Hình 2.13. Quy trình tiêm thuốc và khảo sát số lượng bạch cầu ở chế độ tiêm không
liên tục 37
Hình 3.14. Tác động kích thích tăng sinh dòng tế bào M-NFS-60 của các mẫu 41
Hình 3.15. Xác định mật độ tế bào bằng CCK-8 42
Hình 3.16. Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa khả năng tăng trưởng tế bào và
nồng độ G-CSF 43
Hình 3.17. Đồ thị thể hiện sự tăng trưởng của dòng tế bào M-NFS-60 tương ứng
dãy nồng độ G-CSF với mật độ tế bào ban đầu là 5.10
4

, 10
5
, và 5.10
5
tế bào/ml 44
Hình 3.18. Đồ thị thể hiện tác động của thời gian tiến hành thử nghiệm sinh học lên
dòng tế bào M-NFS-60 46


iv

Hình 3.6. Tác động của các mẫu đến hình thái và mật độ tế bào 50
Hình 3.7.A. Đường cong tương quan giữa mức độ tăng sinh tế bào và nồng độ mẫu
protein 51
Hình 3.7.B. So sánh tác động kích thích tăng sinh tế bào giữa các mẫu BSA,
Neupogen và mẫu chuẩn Leukocim 51
Hình 3.8. Tác động của các mẫu G-CSF đến hình thái và mật độ tế bào 54
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra mẫu D 54
Hình 3.10. Kết quả định tính mẫu G-CSF 55
Hình 3.11. Đường cong tương quan giữa mức độ tăng sinh tế bào và nồng độ mẫu
G-CSF 56
Hình 3.12. Đường cong tương quan giữa mức độ tăng sinh tế bào và nồng độ mẫu
G-CSF chuẩn và nồng độ mẫu sau tinh chế 58
Hình 3.13. Đường cong tương quan giữa mức độ tăng sinh tế bào với nồng độ mẫu
G-CSF chuẩn và mẫu đông khô 59
Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu tổng theo nồng độ CPA 62
Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn sự thay đ ổi sốlượng bạch cầu tổng theo chế độ tiêm
CPA 64
Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính tương ứng với
nồng độ G-CSF 66

Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính sau khi tiêm
Leukocim theo phác đồ điều trị 68
Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính tương ứng với
các mẫu thử nghiệm 70
Hình 3.19. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính sau khi tiêm theo
phác đồ điều trị tương ứng với các mẫu thử nghiệm 72







Trang 1
Lời mở đầu Luận văn Thạc sĩ Sinh học

LỜI MỞ ĐẦU
Neutropenia là hiện tượng suy giảm bạch cầu trung tính, gây suy yếu hệ
thống miễn dịch của cơ thể. Trong số các nguyên nhân gây neutropenia, hóa trị và
xạ trị ung thư là nguyên nhân chủ yếu nhất. Hiện nay, ung thư là một trong những
nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Tỷ lệ mắc bệnh ung thư đang có xu
hướng gia tăng dẫn đến con số bệnh nhân mắc phải neutropenia sẽ tăng cao đột biến
trong tương lai sắp tới. Ngoài những tác hại chủ yếu như làm suy giảm hệ thống
miễn dịch của cơ thể, khiến cho bệnh nhân dễ dàng bị nhiễm khuẩn, mắc phải các
căn bệnh cơ hội, neutropenia còn gây ảnh hưởng không nhỏ đến việc điều trị ung
thư. Trước tiên neutropenia làm gián đoạn phác đồ trị liệu ung thư, kéo dài thời gian
bệnh. Sau đó, sẽ làm tăng chi phí chữa trị, nhất là chi phí nằm viện.
Trong các phương pháp điều trị neutropenia như cấy ghép tủy, sử dụng
kháng sinh…, việc sử dụng nhân tố kích thích tạo dòng bạch cầu hạt G-CSF đang là
một liệu pháp hữu hiệu và phổ biến với các ưu điểm: chi phí thấp, tác dụng tốt, thời

gian trị bệnh ngắn. G-CSF là một cytokine có bản chất glycoprotein có chức năng
chính trong sự điều hoà sản xuất bạch cầu hạt trung tính thông qua kích thích tăng
sinh và biệt hoá của các tế bào tiền thân bạch cầu hạt trung tính. Vì thế, việc sử
dụng G-CSF trong phòng bệnh cũng như trị liệu neutropenia đang được phát triển
mạnh. Các sản phẩm thuốc G-CSF có khả năng làm giảm nguy cơ bệnh neutropenia
đến 50%. Ngoài khả năng kích thích sản xuất giúp phục hồi số lượng bạch cầu hạt
trung tính, G-CSF còn tác động lên chức năng của bạch cầu hạt trung tính như tăng
cường hoạt tính thực bào, khả năng diệt vi khuẩn do đó gián tiếp giúp cơ thể
chống lại nguy cơ nhiễm. Các chế phẩm G-CSF sẽ là triển vọng cho điều trị
neutropenia, đặc biệt là kết hợp trong hoá trị liệu ung thư.
Hiện nay thuốc G-CSF được lưu hành tại Việt Nam chủ yếu là nhập từ nước
ngoài có giá khá cao so với thu nhập của người dân nên gây hạn chế trong việc sử
dụng điều trị rộng rãi. Việc bản quyền sản xuất G-CSF của công ty Amgen đã hết
hạn vào tháng 3/2006 đã mở ra cơ hội lớn cho các nước đang phát triển trong đó có


Trang 2
Lời mở đầu Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Việt Nam tiếp cận và nghiên cứu sản xuất G-CSF phục vụ cho nhu cầu trong nước
với giá thành thấp. Trước tình hình thực tiễn này, Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh
học phân tử A, trường ĐH Khoa học Tự nhiên đã tiến hành đề tài nghiên cứu sản
xuất protein G-CSF tái tổ hợp. Với đặc tính là một protein trị liệu sử dụng trên
người, theo các quy định của dược điển, sản phẩm tạo ra phải đáp ứng các chỉ tiêu
như: hàm lượng, cấu trúc, độ tinh sạch, hoạt tính sinh học… Trong đó hoạt tính sinh
học là một chỉ tiêu quan trọng đảm bảo chất lượng sản phẩm trước khi thương mại
hóa. Đây là điều kiện tiên quyết trong các quá trình sản xuất thuốc cho người.
Nằm trong khuôn khổ của đề tài, luận văn này được thực hiện với mục đích
xây dựng các quy trình thử nghiệm hoạt tính G-CSF tái tổ hợp nhằm phục vụ cho
việc kiểm soát chất lượng sản phẩm G-CSF trong các giai đoạn của quy trình sản

xuất thuốc.
Với mục tiêu trên, chúng tôi thực hiện luận văn gồm các nội dung sau:
- Khảo sát xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF in vitro.
- Áp dụng quy trình để đánh giá hoạt tính G-CSF tái tổ hợp trong các giai
đoạn sản xuất.
- Khảo sát xây dựng mô hình chuột suy giảm miễn dịch dùng cho thử
nghiệm in vivo.
- Khảo xát xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF in vivo và mô
hình đánh giá tác dụng điều trị bệnh của G-CSF.
- Áp dụng quy trình để đánh giá hoạt tính và tác dụng điều trị bệnh của
thuốc trên cơ thể động vật.















CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trang 4
Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học

1.1. Nhân tố kích thích tạo dòng bạch cầu hạt G-CSF
1.1.1. Giới thiệu
Tất cả các tế bào máu trong cơ thể đều được hình thành từ tế bào gốc tạo
máu ở tủy xương thông qua quá trình tạo máu. Quá trình này được điều hòa chặt
chẽ bởi nhiều loại cytokine như interleukin, erythropoietin và các CSF (Colony
stimulating factors) [11].
Các CSF có bản chất là glycoprotein, có vai trò tương tác với các thụ thể
chuyên biệt trên các tế bào gốc tạo máu để điều hòa sự tồn tại, tăng sinh, biệt hóa và
hoạt hóa chức năng của các tế bào này. Các CSF được chia thành ba loại:
- G-CSF (Granulocyte-colony stimulating factor)
- GM-CSF (Granulocyte macrophage-colony stimulating factor)
- M-CSF (Macrophage-colony stimulating factor)
Trong đó, G-CSF là một cytokine được sản xuất bởi các bạch cầu đơn nhân,
đại thực bào, nguyên bào sợi và các tế bào nội mô. G-CSF đảm nhận nhiều chức
năng trong quá trình kích thích tạo máu như điều hòa sản xuất bạch cầu trung tính
và giải phóng chúng từ tủy xương, tăng sinh và biệt hóa các tế bào tiền thân của
bạch cầu trung tính cũng như hoạt hóa chức năng của chúng [10].
1.1.2. Chức năng của protein G-CSF
G-CSF là nhân tố duy nhất có khả năng kích thích sự tăng sinh và trưởng
thành cuối cùng của các tế bào tủy tiền thân. Đối tượng tác động của G-CSF gồm
nhiều tế bào khác nhau như các tế bào tiền thân tạo máu, tế bào bạch cầu tủy, tế bào
bạch cầu hạt trung tính, và một số loại tế bào không tạo máu khác.
Trong quá trình kích thích tạo máu
Thành phần tế bào của máu gồm 3 nhóm: hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu, bắt
nguồn từ tế bào gốc trải qua các quá trình biệt hoá để tạo thành các tế bào máu. G-
CSF được xác định là nhân tố kích thích sự tăng trưởng của dòng bạch cầu hạt trung
tính, giúp cho sự tồn tại, kích thích sự phát triển và đẩy mạnh sự biệt hóa của các tế

bào tiền thân thành tế bào bạch cầu hạt trung tính (Hình 1.1).


Trang 5
Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học


Hình 1.1. Vai trò kích thích tạo máu của các nhân tố tăng trưởng [36]
Trong phản ứng viêm nhiễm
Những bạch cầu trung tính là nhân tố chính trong phản ứng kháng vi khuẩn.
G-CSF giúp giải phóng các tế bào bạch cầu trung tính tiền trưởng thành từ tủy
xương và tăng cường khả năng thực bào, sản sinh các anion superoxide và tiêu diệt
vi khuẩn của các tế bào này. Do đó G-CSF đóng vai trò gián tiếp trong quá trình bảo
vệ cơ thể chống lại nhiễm khuẩn [19].
Bảo vệ tế bào thần kinh
Thụ thể G-CSFR có ở nhiều vùng của não bộ như ở các tế bào hình chóp của
lớp vỏ não, tế bào purkkinje của tiểu não, vùng phụ cận não thất SVZ. Các chức


Trang 6
Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học

năng chính của G-CSF trong quá trình bảo vệ thần kinh bao gồm kháng viêm, kích
thích biệt hóa thần kinh, huy động các tế bào gốc tạo máu, bảo vệ tế bào thần kinh
chống lại sự chết theo chương trình [18].
1.1.3. Ứng dụng của protein G-CSF trong trị liệu
Đầu những năm 1990, các nhà khoa học và các bác sĩ đã chấp nhận sử dụng
G-CSF trên người, giúp chữa trị các bệnh liên quan đến giảm số lượng bạch cầu
trung tính. G-CSF dùng trong trị liệu dưới nhiều dạng khác nhau, có thể được tiêm
dưới da hay vào tĩnh mạch. Khi tiêm dưới da, G-CSF sẽ giúp kích thích sự tăng sinh

của các tế bào tạo máu gồm nguyên bào sợi tủy, tiền tủy bào, và tế bào tủy; đồng
thời huy động các tế bào tiền thân vào máu. Tác động này được ứng dụng vào việc
thu nhận các tế bào tiền thân máu ngoại vi cho sự ghép tạo máu [6].
Để có hiệu quả chữa trị cao, các bệnh nhân cần được chẩn đoán lâm sàng để
đưa ra phác đồ điều trị tối ưu. Hiện nay, một số phác đồ điều trị cho các bệnh phổ
biến liên quan đến sự giảm số lượng bạch cầu trung tính đã được công bố và được
các nhà sản xuất G-CSF thương mại khuyên dùng.
Bệnh nhân ung thư được chữa trị bằng phương pháp hóa trị liệu
Liều ban đầu của G-CSF được khuyến cáo nên dùng khoảng 4 – 8
µg/kg/ngày, được tiêm một lần trong ngày và bằng cách tiêm dưới da, hoặc truyền
dưới tĩnh mạch trong 15 phút đến 30 phút. Tùy theo giai đoạn điều trị ung thư và
mức độ nghiêm trọng của sự giảm số lượng bạch cầu trung tính, liều G-CSF có thể
tăng lên.
Thuốc được tiêm sau 24 giờ khi kết thúc quá trình hóa trị liệu. Ngoài ra, G-
CSF có thể được sử dụng hàng ngày trong 2 tuần cho đến khi lượng bạch cầu trung
tính đạt được 10.000/µl máu. Thời gian điều trị của G-CSF còn phụ thuộc vào tác
dụng ức chế miễn dịch của thuốc dùng trong hóa trị liệu ung thư.
Bệnh nhân ung thư được chữa trị bằng liệu pháp ghép tủy xương.
Liều G-CSF được khuyến cáo sử dụng sau khi ghép tủy xương là
10µg/kg/ngày, được truyền tĩnh mạch trong khoảng từ 4 – 24 giờ. Trong thời gian
phục hồi số lượng bạch cầu trung tính, liều G-CSF được điều chỉnh như sau:


Trang 7
Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Bảng 1.1. Chế độ điều chỉnh liều G-CSF
Số lượng bạch cầu hạt trung tính Điều chỉnh liều G-CSF
-
Khi số lượng bạch cầu trung tính

> 1000/µl trong 3 ngày liên tục
- Khi số lượng bạch cầu vẫn >
1000 /µl trong hơn 3 ngày liên tiếp
- Khi số lượng bạch cầu < 1000/
µl.
-
Giảm liều xuống 5 µg/kg

- Ngưng không dùng

- Tiếp tục tiêm ở liều 5 µg/kg/ngày
Nếu số lượng bạch cầu trung tính giảm dưới 1000/µl máu trong quá trình
điều trị ở liều 5 µg/kg/ngày, phải tiến hành tăng liều lên 10µg/kg/ngày, quá trình
điều trị tiếp theo thực hiện như bảng trên.
Bệnh nhân ung thư được chữa trị bằng liệu pháp ghép tự thân các tế
bào tiền thân tạo máu trong nguồn máu ngoại vi
Liều G-CSF được khuyến cáo nên sử dụng là 10µg/kg/ngày, được tiêm dưới
da hoặc truyền liên tục. Sử dụng G-CSF vào 4 ngày trước khi bắt đầu quá trình lọc
máu đến khi kết thúc quá trình lọc máu. Có thể thay đổi liều G-CSF đến khi lượng
bạch cầu tổng trong máu nhiều hơn 10.000/µl.
Bệnh nhân giảm bạch cầu mãn tính nặng
Liều khởi đầu :
- Giảm bạch cầu bẩm sinh: 12µg/kg/ngày, chia làm một hoặc nhiều lần.
- Giảm bạch cầu tự phát hoặc có chu kỳ: 5µg/kg/ngày, chia làm một hoặc
nhiều lần.
Điều chỉnh liều :
- Liều phải được xác định cho từng bệnh nhân và đảm bảo duy trì số lượng
bạch cầu đa nhân trung tính tối thiểu là 1000/µl.
Dùng liều hàng ngày trong thời gian dài được chỉ định để đạt được số lượng
bạch cầu đa nhân trung tính ở mức cần thiết. Có thể tăng liều gấp đôi nếu sau 2 tuần

điều trị mà số lượng bạch cầu đa nhân trung tính vẫn không đạt đến 1000/µl, và
phải giảm nửa liều nếu số lượng bạch cầu hạt tăng quá 10.000/l. Cần phải tăng


Trang 8
Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học

nhanh liều ở những bệnh nhân có những nhiễm trùng nặng. Những liều vượt quá
145µg/kg/ngày chỉ dùng khi đã biết chắc chắn rằng bệnh nhân có thể dung nạp
được.
1.1.4. Một số sản phẩm G-CSF thương mại
Có 3 loại sản phẩm G-CSF phổ biến trên thị trường (Hình 1.2)
 Filgrastim với tên thương mại Neupogen®
 Lenograstim: Granocyte®
 Pegfilgrastim: Neulasta®


Filgrastim là sản phẩm G-CSF được sản xuất từ vi khuẩn E. coli. So với G-
CSF tự nhiên, phân tử protein này có thêm một axít amin methionine ở đầu N và
không được O-glycosyl hóa. Tuy nhiên, filgrastim vẫn giữ được hoạt tính sinh học
[15], [30].
Lenograstim là G-CSF tái tổ hợp được O-glycosyl hoá sản xuất từ tế bào
buồng trứng chuột. Lenograstim được sử dụng trong điều trị sau hoá trị liệu cũng
như ghép tủy, đặc biệt có hoạt tính tốt trong quá trình kích thích huy động các tế
bào CD34+.
Pegfilgrastim chính là protein filgrastim dung hợp với phân tử
polyethylenglycol (PEG), là một polymer trơ, tan trong nước. Filgrastim có thời
gian tồn tại ngắn chỉ khoảng 3,5 giờ nhưng Pegfilgrastim (Neulasta) lại tồn tại lâu
hơn, do đó làm giảm khả năng bị thải loại trong quá trình lọc ở thận, giúp tăng thời
gian hoạt động. Khi bạch cầu hạt trung tính ở mức thấp thì sự thải loại pegfilgrastim

cũng thấp và sẽ tăng ngay khi bạch cầu hạt trung tính phục hồi [25].

Hình
1.
2
.
Một số sản phẩm G-CSF thương mại[31], [37]


Trang 9
Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Các tính chất đặc trưng của G-CSF thương mại
1.1.4.1. Tính chất vật lý và hóa học
G-CSF có tính acid, kị nước và dạng có hoạt tính là dạng monomer.
Điểm đẳng điện của G-CSF nằm trong khoảng từ 5,5 đến 6,1. G-CSF bền ở
pH acid, do đó để bảo quản, G-CSF thường được giữ trong các dung dịch đệm có
pH thấp. Ở pH bằng 4, G-CSF đạt được trạng thái ổn định cao nhất về cấu hình và
thời gian tồn tại.
Trong phân tử G-CSF có năm cystein, trong đó bốn cystein tạo thành hai cầu
nối disulfide là Cys36-Cys42 và Cys64-Cys74 làm cho G-CSF có hoạt tính. Cys thứ
17 còn lại ở dạng tự do liên quan đến sự kết tụ protein, hình thành dạng dimer hay
polymer. Ở điều kiện sinh lý bình thường, G-CSF dễ bị kết tụ do đó sẽ gây cản trở
nếu sử dụng làm tác nhân điều trị. Tỷ lệ kết tụ phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhưng
quan trọng nhất là nồng độ G-CSF và số cầu nối disulfide liên phân tử. Người ta
nhận thấy rằng nếu nồng độ G-CSF ít hơn 1mg/ml thì sự kết tụ giảm đáng kể. Ngoài
ra, còn có một số yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến sự kết tụ như nhiệt độ, pH bảo
quản [26].
Độ tan của G-CSF chịu ảnh hưởng bởi nồng độ muối và nhiệt độ. Nhiệt độ
thấp làm tăng tính ổn định của protein nhưng làm giảm độ tan. Ngược lại, nhiệt độ

cao làm tăng độ tan, nhưng nếu nhiệt độ quá cao sẽ làm biến tính protein do làm đứt
gãy các liên kết hydrogen và liên kết ester trong phân tử.
1.1.4.2. Tác động dược học và tác động dược động học
Các loại G-CSF thương mại có các thông số về tác động dược học và tác
động dược động học tương đương nhau, tuy nhiên tốc độ hấp thu và tốc độ đào thải
thì khác nhau, phụ thuộc vào cấu trúc và thành phần tá dược bổ trợ.
Tác động dược học
G-CSF làm gia tăng rõ rệt số lượng bạch cầu đa nhân trung tính trong máu
ngoại vi trong 24 giờ. Sau khi ngưng điều trị bằng G-CSF, số lượng bạch cầu đa
nhân trung tính trong máu giảm đi 50% trong vòng 1-2 ngày và trở về mức bình
thường trong vòng 1-7 ngày.


Trang 10
Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Điều trị bằng G-CSF làm giảm đáng kể tần suất, mức độ và thời gian của
bệnh Neutropenia.
Tác động dược động học
Giữa liều lượng và nồng độ G-CSF trong huyết thanh có mối tương quan tỉ lệ
thuận với nhau. Thời gian bán hủy trung bình trong huyết thanh của Filgrastim vào
khoảng 3,5 giờ, với độ thanh thải vào khoảng 0,6 ml/phút/kg. Pegfilgrastim do được
gắn thêm phân tử Polyethylene glycol (PEG) ở đầu N của protein G-CSF nên có
thời gian bán hủy trong huyết thanh lâu hơn, khoảng 15 giờ - 80 giờ.
1.2. Thử nghiệm sinh học G-CSF
Thử nghiệm sinh học là kỹ thuật xác định bản chất, cấu trúc, nồng độ, độ tinh
sạch và hoạt tính sinh học của 1 chất bằng cách đo tác động của chất đó lên 1 cơ thể
sống, mô hay tế bào. Tác động này được so sánh với mẫu chuẩn nhằm đánh giá hiệu
quả sinh học của 1 chất được gọi là thử nghiệm sinh học định tính hoặc đo đạc khả
năng đáp ứng sinh học, so sánh và ước tính nồng độ, hoạt độ của chất gọi là thử

nghiệm sinh học định lượng.
Thử nghiệm sinh học có thể được phân loại dựa trên điều kiện thực hiện thử
nghiệm. Thử nghiệm sinh học in vitro thực hiện ở phòng thí nghiệm, cô lập và nuôi
cấy tế bào không nằm trong điều kiện và vi môi trường tự nhiên của nó và thử
nghiệm sinh học in vivo thực hiện trực tiếp trên cơ thể sống [21].
1.2.1. Thử nghiệm sinh học in vitro
Trong các nghiên cứu cytokine mới hoặc để chuẩn bị cho các thử nghiệm
lâm sàng, người ta sử dụng phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro để đánh giá
hoạt tính của thuốc. Đây là phương pháp hiệu quả để đo đạc mức độ đáp ứng của
dòng tế bào chuyên biệt đối với cytokine. Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên
việc sử dụng dòng tế bào có các receptor đáp ứng hiệu quả với cytokine, từ đó gây
ra chuỗi truyền tín hiệu nội bào, kết quả là một số gen quan trọng được hoạt hóa dẫn
đến các đáp ứng có thể đo đạc được [28].


Trang 11
Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Tế bào Hoạt hóa
receptor
Tín hiệu
nội bào
Gen
biểu hiện Đáp ứng
Tế bào Hoạt hóa
receptor
Tín hiệu
nội bào
Gen
biểu hiện Đáp ứng

Hình 1.3. Nguyên tắc chung của phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro [28]
Dựa trên cách thức tác động của cytokine với tế bào đích, thử nghiệm sinh
học in vitro được chia thành 4 nhóm bao gồm: Thử nghiệm sinh học đo mức độ tăng
sinh hoặc ức chế tăng trưởng, thử nghiệm sinh học đánh giá mức gây độc, thử
nghiệm sinh học đánh giá một chức năng đặc biệt nào đó của tế bào chẳng hạn kiểm
tra tính hướng hóa (chemotaxis), và thử nghiệm sinh học định lượng protein tạo ra
bởi tế bào đích. Do chức năng của G-CSF là kích thích tăng sinh và biệt hóa tế bào
tiền thân bạch cầu trung tính nên phương pháp thử nghiệm sinh học đánh giá hoạt
tính G-CSF thuôc nhóm thử nghiệm đo mức độ tăng sinh hoặc ức chế tăng trưởng
[28].
Trong phương pháp thử nghiệm sinh học tăng sinh hay ức chế tăng trưởng,
lượng cytokine có hoạt tính được xác định dựa trên khả năng kích thích hoặc ức chế
tăng sinh dòng tế bào đáp ứng chuyên biệt cytokine đó. Nồng độ cytokine tăng sẽ
làm tăng mức độ tăng trưởng hoặc dẫn đến cái chết của tế bào. Cuối quá trình thử
nghiệm, số lượng tế bào tăng (hoặc giảm) được ghi nhận bằng các phương pháp
đếm tế bào hoặc sử dụng thuốc thử, các chất đồng vị phóng xạ [28].
1.2.2. Thử nghiệm sinh học in vivo
Để thu được thông tin cụ thể và chính xác về tác động cytokine đối với cơ
thể, người ta thực hiện thử nghiệm sinh học in vivo. Trong phương pháp này, người
ta thực hiện tiêm trực tiếp cytokine vào cơ thể người hay động vật thí nghiệm và
khảo sát tác động sinh học của nó. Thử nghiệm hoạt tính G-CSF trong điều kiện in
vivo chính là bước thử nghiệm tiền lâm sàng trước khi G-CSF được sử dụng chính


Trang 12
Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học

thức trên cơ thể người. Đây được xem là bước thử nghiệm bắt buộc đối với các
công ty sản xuất thuốc nói chung và sản xuất G-CSF nói riêng [28].

Hình 1.4. Quy trình phát triển thuốc tại Mỹ [1]
Có nhiều nguyên nhân cho việc bắt buộc này:
- Quá trình tạo máu là quá trình xảy ra trong cơ thể sống và được kiểm soát
bởi nhiều tác nhân khác nhau. Chính vì vậy, các mô hình thử nghiệm in vitro vẫn
không đáp ứng được yêu cầu mô phỏng cơ chế chính xác như trong cơ thể.
- G-CSF là một cytokine kích thích tạo máu, với bản chất là glycoprotein
nên G-CSF chịu nhiều ảnh hưởng của lực động học trong cơ thể cũng như các quá
trình biến dưỡng của cơ thể sống.
Chính vì vậy, thử nghiệm in vivo nhằm vào hai mục đích chính là: (1) khảo
sát hoạt tính G-CSF và (2) khảo sát khả năng tương tác sinh học của G-CSF đối với
cơ thể.
→ Thử nghiệm sinh học



Trang 13
Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Mặc dù cung cấp nhiều thông tin về hoạt tính sinh học cytokine, phương
pháp thử nghiệm này khá đắt tiền, sử dụng số lượng lớn động vật, và đòi hỏi các
công cụ hỗ trợ đặc biệt cũng như chuyên môn cao.
Nhìn chung, thử nghiệm sinh học được coi là “tiêu chuẩn vàng” để đánh giá
hoạt tính cytokine.
1.3. Phương pháp thử nghiệm sinh học G-CSF in vitro
1.3.1. Các dòng tế bào được sử dụng cho thử nghiệm sinh học G-CSF in vitro
Dạng tái tổ hợp G-CSF có khả năng cảm ứng sự biệt hóa đến tận cùng dòng
tế bào bệnh bạch cầu ở chuột như WEHI 3B (D+), cảm ứng biệt hóa dòng tế bào
bệnh bạch cầu ở người như HL-60, và cảm ứng sự tăng sinh dòng NFS-60 ở chuột.
1.3.1.1. Dòng WEHI-3B

Dòng WEHI-3B D
+
được phân lập đầu tiên từ chuột BALB/c bị bệnh bạch
cầu dòng tủy và bạch cầu đơn nhân do tiêm paraffin màng trong ổ bụng. WEHI-3B
D
+
được cảm ứng trở thành tế bào bạch cầu nhờ G-CSF trong môi trường bán rắn.
Dòng tế bào này biệt hóa dưới sự kích thích của G-CSF chủ yếu thông qua con
đường JAK-STAT, và điều hòa quá trình biệt hóa thông qua các phân tử tín hiệu
JAK-STAT khác nhau [3], [17].
1.3.1.2. Dòng HL-60
Dòng HL-60 là dòng tế bào tiền thân bệnh bạch cầu dòng tủy ở người đầu
tiên được phát triển trong nghiên cứu quá trình biệt hóa. Tế bào HL-60 thu được từ
máu bệnh nhân bị bạch cầu dòng tủy cấp tính. Trong điều kiện in vitro, chúng tăng
sinh liên tục trong môi trường huyền phù ở dạng tiền tủy bào. Dưới tác động của
một số hợp chất phân cực, các nhân tố kích thích tạo dòng (CSFs) … chúng biệt hóa
tận cùng thành các tế bào bạch cầu trưởng thành.
Các thử nghiệm cho thấy G-CSF không cản trở sự tăng sinh các tế bào dòng
HL-60, số lượng tế bào tăng liên tục trong 5 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, G-CSF
không có khả năng cảm ứng sự biệt hóa đến tận cùng các tế bào này. Khoảng 4% tế
bào HL-60 biệt hóa thành dạng trung gian nhưng không có khả năng đi vào giai
đoạn trưởng thành, có khả năng thực bào [6], [29].


Trang 14
Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học

1.3.1.3. Dòng NFS-60
Sau phát hiện của Nicola và Metcalf về dòng WEHI 3B (D
+

) có khả năng
đáp ứng G-CSF, năm 1986, Weistein và đồng nghiệp đã phát hiện một dòng nguyên
tủy bào ở chuột, dòng NFS-60 cũng có khả năng tương tự. Dòng tế bào này được
thiết lập sau khi cho xâm nhiễm chuột trưởng thành (NFS X DBA/2) với virus bệnh
bạch cầu dòng tủy Cas Br-M. Các tế bào NFS-60 có sự tái sắp xếp locus c-myb do
sự sát nhập một vùng gen từ retrovirus vào exon thứ 6 của locus này; từ đó, sản xuất
protein myb với đầu C bị cắt một đoạn và đầu N bình thường. Đây là dòng tế bào
phát triển và tồn tại phụ thuộc G-CSF và có thể đáp ứng biệt hóa với IL-3 [23].
Theo các nghiên cứu, cơ chế G-CSF kích hoạt các quá trình truyền tín hiệu ở
dòng tế bào NFS-60 thông qua nồng độ cAMP, tyrosine kinase và protein kinase C.
Trên mỗi tế bào NFS-60 có khoảng 400 vị trí gắn G-CSF với hằng số gắn kết
khoảng 100pmol/l. Khả năng đáp ứng của tế bào NFS-60 phụ thuộc vào yếu tố thời
gian, sự đáp ứng diễn ra từ 2-5 phút sau khi thêm G-CSF vào môi trường, mạnh
nhất ở phút thứ 10-15 và tiếp tục tăng đến phút 60 khi ủ ở 37
0
C. Bên cạnh đó, khả
năng hoạt hóa con đường p21Ras MAP kinase nhờ G-CSF ở dòng NFS-60 cũng
phụ thuộc vào nồng độ G-CSF với ngưỡng nồng độ thấp nhất từ 10-50U/ml và kích
thích mạnh nhất ở khoảng 100-500U/ml.
Trong các dòng tế bào ưa chuộng cho thử nghiệm sinh học G-CSF, dòng
NFS-60 được sử dụng phổ biến và hiệu quả nhất để xác định hoạt tính G-CSF do có
độ nhạy cao. Một số dòng tế bào con của NFS-60 cũng được thiết lập. Dòng M-
NFS-60 là các tế bào dạng nửa bám dính, phát triển nhanh và liên tục khi có mặt M-
CSF, tuy nhiên cũng có khả năng đáp ứng G-CSF [30].
1.3.2. Phương pháp phân tích kết quả thử nghiệm in vitro
Trong thử nghiệm sinh học in vitro, phương pháp phân tích dữ liệu dựa vào
đường hồi quy không tuyến tính, đường cong biểu thị mối tương quan giữa mức độ
tăng trưởng tế bào và nồng độ G-CSF.

Trang 15
Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học

1.3.2.1. Đường cong tương quan giữa nồng độ mẫu và khả năng đáp ứng của
tế bào
Là dạng biểu đồ mô tả mối tương quan giữa nồng độ G-CSF với mật độ
quang của tế bào. Trong đó, trục X là nồng độ hay liều lượng của thuốc hay
cytokine cần khảo sát và trục Y chỉ mức độ đáp ứng của tế bào (giá trị OD).
Đường cong tương quan tiêu chuẩn còn được gọi là phương trình logarit 4
tham số bao gồm: giới hạn dưới, giới hạn trên của đường cong, giá trị ED50, và giá
trị độ nghiêng (Hill slope). Giới hạn dưới và giới hạn trên biểu thị đáp ứng mạnh
nhất và yếu nhất của tế bào. Logarit ED50 là nồng độ tại đó khả năng đáp ứng bằng
một nửa đáp ứng mạnh nhất. Một số đường cong tương quan có thể dốc hơn hoặc
thoải hơn đường tương quan chuẩn. Độ dốc này được xác định bằng giá trị Hill
slope với quy định bằng 1 (thử nghiệm sinh học kích thích) hoặc bằng -1 (thử
nghiệm sinh học ức chế). Do G-CSF có chức năng kích thích tăng sinh nên đường
cong chuẩn sẽ có giá trị Hill slope bằng 1 (Hình 1.5).









Hình 1.5. Giá trị Hill slope chuẩn trong thử nghiệm sinh học kích thích [20]
Đối với thí nghiệm G-CSF, mẫu G-CSF có hoạt tính phải tạo ra đáp ứng
khác biệt rõ ràng so với mẫu âm đồng thời phải hình thành dạng đường cong dốc

mô tả mối tương quan hợp lý khi tăng nồng độ dẫn đến tăng số lượng tế bào. Khi
các đáp ứng không tạo ra dạng đường cong dốc, các bước phân tích về sau không
được tiến hành.


Trang 16
Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học

1.3.2.2. Phân loại thử nghiệm sinh học G-CSF in vitro theo phương pháp phân
tích
Dựa theo phương pháp phân tích kết quả, thử nghiệm sinh học G-CSF in
vitro có thể phân thành một số loại như sau:
- Phương pháp thử nghiệm trực tiếp: Mỗi đối tượng thực hiện thử nghiệm
(dòng tế bào sử dụng) được khảo sát với dãy nồng độ thuốc tăng liên tục cho đến
khi đạt đến nồng độ thích hợp có thể tạo ra đáp ứng. Nồng độ thích hợp này được
đo một cách trực tiếp và lặp lại thí nghiệm nhiều lần để tìm giá trị ED50 và độ chính
xác. Đây là phương pháp ít có tính thực tế và khó khăn cho việc áp dụng.
- Phương pháp thử nghiệm định lượng: Đối tượng thực hiện thử nghiệm
được khảo sát với dãy nồng độ chất chuẩn và chất cần định lượng, sau đó so sánh
mức độ tăng trưởng giữa hai lô thí nghiệm, tìm ra giá trị ED50 và sai số chuẩn.
Phương pháp thử nghiệm định lượng giúp loại trừ các sai số và chênh lệch thường
gặp khi thực hiện assay đối với hai mẫu khác nhau do điều kiện thí nghiệm. Để thực
hiện điều này, ta dựa vào đường cong tương quan giữa nồng độ và khả năng đáp
ứng của cả hai mẫu: mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra. Về cơ bản, cơ chế tác động sinh
học của hai mẫu này là giống nhau, do đó đường cong của hai mẫu là tương tự, có
đoạn tuyến tính song song hoặc trùng với nhau (Hình 1.6).

Hình 1.6. Đường cong tương quan
giữa nồng độ mẫu và mức độ đáp ứng của tế bào [20]


Trang 17
Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Sau khi kiểm tra độ song song của hai đường, ta có thể tính được giá trị hoạt
độ của mẫu. Tại cùng một mức độ đáp ứng, giá trị này bằng với giá trị của mẫu
chuẩn mà ta đã biết. Theo hướng nằm ngang, khoảng cách giữa hai đoạn tuyến tính
của đường chuẩn (B-C) và đường mẫu kiểm tra (b-c) đặc trưng cho sự khác biệt về
hoạt tính sinh học giữa hai mẫu. Đây là phương pháp được dùng rất phổ biến do
cung cấp nhiều thông tin về hoạt độ của cả mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra [20].
1.3.2.3. Giá trị ED50 và hoạt tính riêng
ED50 (Effective dose 50%) là giá trị tại đó lượng G-CSF kích thích sự tăng
trưởng tế bào đạt 50%, giá trị này tỷ lệ nghịch với hoạt tính. Ngoài giá trị ED50,
người ta còn tính các giá trị ED99, ED90, ED80…

Hình 1.7. Giá trị ED99, ED90, ED50 biểu thị trên đường cong tương quan giữa sự
tăng trưởng tế bào và nồng độ mẫu
Từ giá trị ED50 ta có thể tính được độ hoạt tính riêng (Specific Activity).
Theo định nghĩa, một đơn vị hoạt tính là lượng cytokine trên 1 millilit tạo ra đáp
ứng bằng 50% đáp ứng tăng sinh mạnh nhất. Do đó, đơn vị hoạt tính được tính theo
công thức:

Việc định lượng hoạt tính sinh học một cytokine có thể thay đổi ở từng hệ
thống thử nghiệm sinh học và từng điều kiện nuôi cấy khác nhau ở các phòng thí


Trang 18
Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học

nghiệm. Do đó, để chuẩn hóa quá trình định lượng các cytokine cũng như chất kích
thích tăng trưởng sinh học, Tổ Chức Y Tế Thế Giới (WHO) và Viện Quốc gia về
Tiêu chuẩn và Kiểm soát Sinh học Vương Quốc Anh (NIBSC) tạo các mẫu protein
với hoạt tính định sẵn, nhờ đó các phòng thí nghiệm có thể xác định nhiều mẫu
protein khác nhau. Mục đích của việc này nhằm cung cấp một tiêu chuẩn quốc tế
cho việc kiểm tra và trong sản xuất các dược phẩm sinh học. Theo định nghĩa của
WHO, mẫu chuẩn quốc tế (IS - International Standard) là mẫu của một hợp chất
sinh học, công nghệ sinh học hoặc được tổng hợp, có hoạt tính được xác định bởi
WHO theo đơn vị hoạt tính quốc tế (IU - International Unit). Dựa vào mẫu IS, các
phòng thí nghiệm xác định đơn vị hoạt tính LU (LU - Laboratory Unit) và sử dụng
các tính toán đơn giản để suy ra giá trị IU của mẫu cần kiểm tra [20].
1.3.3. Ưu - khuyết điểm của thử nghiệm hoạt tính in vitro
1.3.3.1. Ưu điểm
Thử nghiệm hoạt tính in vitro là một phương pháp đơn giản, ít tốn kém và
hiệu quả để xác định hoạt tính của thuốc. Điều kiện tiến hành thử nghiệm dễ dàng,
nhanh chóng, có thể tiến hành cùng lúc một số lượng mẫu lớn.
Do tiến hành trên từng dòng tế bào nên thuận lợi trong việc phân tích đánh
giá kết quả thử nghiệm cũng như kiểm soát và điều chỉnh quy trình.
1.3.3.2. Khuyết điểm
Đối tượng thử nghiệm là dòng tế bào nên không thể đánh giá được tác động
của thuốc bên trong cơ thể cũng như hiệu quả điều trị, các tác dụng phụ của thuốc.
Chỉ có thể xác định thông số duy nhất là đơn vị hoạt tính mà không thể xác
định được các đặc tính sinh học khác của thuốc như các thông số dược động học,

tính gây độc.
1.4. Phương pháp thử nghiệm sinh học G-CSF in vivo
1.4.1. Các mô hình động vật được sử dụng
Phương pháp thử nghiệm hoạt tính G-CSF in vivo được tiến hành trên cơ thể
các động vật thí nghiệm dựa trên cơ sở chính là chức năng của G-CSF, trong đó
chức năng quan trọng nhất là kích thích tăng sinh số lượng bạch cầu trung tính.


Trang 19
Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Do đó, bước đầu tiên trong quá trình thử nghiệm chính là xây dựng mô hình
động vật bị bệnh Neutropenia hoặc mô hình động vật bị suy giảm miễn dịch. Đây
được xem như “nguyên liệu” cho việc thử nghiệm hoạt tính.










Hình 1.8. Các động vật được sử dụng làm mô hình thí nghiệm
Có nhiều loài động vật được sử dụng trong quá trình thử nghiệm G-CSF in
vivo như: chuột nhắt trắng, chuột hamster, thỏ trắng, chó và khỉ. Trong các động vật
trên, chuột nhắt trắng được sử dụng nhiều nhất vì các lý do sau:
- Có kích thước nhỏ, dễ bố trí khu vực nuôi và chăm sóc
- Thời gian sinh sản nhanh (khoảng 21 ngày), số lượng con trong một

lần sinh tương đối nhiều (khoảng 7 con), chính vì vậy có thể khảo sát ảnh hưởng
của thuốc qua các thế hệ khác nhau.
- Bộ gen của chuột và người có mức độ tương đồng cao, khoảng 85%,
tương ứng với 20.000 – 25.000 gen.
- Có nhiều vị trí khác nhau trên cơ thể để thu nhận nguồn máu, thực
hiện các xét nghiệm khác nhau.
Việc lựa chọn mô hình động vật thử nghiệm còn phụ thuộc vào mục đích của
thử nghiệm. Quá trình thử nghiệm thuốc trong điều kiện in vivo phải tuân theo một
quy tắc chung là thử nghiệm từ những động vật đơn giản đến các động vật phức tạp.
Những thử nghiệm ban đầu thường được thực hiện trên chuột. Tiếp đến là các động
vật lớn hơn, ví dụ như sử dụng thỏ hoặc chó để khảo sát dược động học của thuốc.