GIÁO TRÌNH NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT PHẦN 1

CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.1. Giới thiệu
• Việc nuôi cấy in vitro mô và tế bào động vật đã được tiến hành hơn
100 năm nay. Việc này được sử dụng như là 1 phương pháp NC về
đặc tính của TB động vật một cách độc lập, tách khỏi những biến
đổi của hệ thống in vivo. Kỹ thuật này được thực hiện đầu tiên với
các mẫu mô.
•
Từ những năm 1950 trở đi, các tế bào nuôi cấy tách rời bắt đầu được
•
Từ những năm 1950 trở đi, các tế bào nuôi cấy tách rời bắt đầu được
sử dụng.
• Các kiểu nuôi cấy:
– Nuôi cấy cơ quan
– Nuôi cấy mô
– Nuôi cấy tế bào
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.1. Giới thiệu
• Nuôi cấy cơ quan
Nuôi cấy phôi hay cơ quan tách khỏi cơ thể
+/ Thuận lợi
– Chức năng sinh lí bình thường được duy trì
–
Tế
bào
giữ
trạng
thái
biệt
hóa
hoàn

toàn
–
Tế
bào
giữ
trạng
thái
biệt
hóa
hoàn
toàn
+/ Bất lợi
– Khó có thể nuôi cấy quy mô lớn
– Phát triển chậm
– Fresh explantation is required for every experiment.
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.1. Giới thiệu
• Nuôi cấy mô
Các mảnh của mô được phát triển trong môi trường nuôi cấy
+/ Thuận lợi
– Một số chức năng bình thường được duy trì
–
Có thể nuôi cấy quy mô lớn (nhưng khó tiến hành)
–
Có thể nuôi cấy quy mô lớn (nhưng khó tiến hành)
+/ Bất lợi
– Tổ chức ban đầu của mô mất
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.1. Giới thiệu
• Nuôi cấy tế bào

Mô được tách thành tế bào đơn, hầu hết là bằng enzyme, thành
huyền phù tế bào được nuôi cấy in vitro như monolayer hay nuôi
cấy huyền phù
+/ Thuận lợi
– Phát triển một dòng tế bào thuần chủng qua nhiều thế hệ
– Có thể nuôi cấy quy mô lớn
+/ Bất lợi
– Tế bào mất một số đặc tính đã biệt hóa trong mô
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.1. Giới thiệu
• Nuôi cấy tế bào
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.1. Giới thiệu
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.1. Giới thiệu
• Tại sao cần nuôi cấy mô?
+/ Nghiên cứu
– Vượt qua các vấn đề trong nghiên cứu như:
- Các tác động của các mô xung quanh
-
Các biến đổi mà do các điều kiện của động vật
-
Các biến đổi mà do các điều kiện của động vật
– Giảm các động vật sử dụng
+/ Sản xuất các sản phẩm thương mại
– vaccine, antibody, hormone
– Tế bào sử dụng cho cấy ghép
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.1. Giới thiệu
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

3.2. Các kiểu nuôi cấy tế bào
a/ Nuôi cấy sơ cấp (Primary Culture)
– Thu nhận trực tiếp từ các mô và nuôi cấy theo kiểu như
• Sự phát triển ra của các mô trong nuôi cấy
• Tách thành tế bào đơn (bằng enzyme hay cơ học)
–
Thuận
lợi
:
–
Thuận
lợi
:
• Thường giữ được nhiều các đặc tính đã được biệt hóa của tế bào in
vivo.
– Bất lợi:
•Ban đầu hỗn tạp nhưng sau đó trở nên nổi trội ở các fibroblast
•Các nuôi cấy sơ cấp thường tốn công sức
•Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.2. Các kiểu nuôi cấy tế bào
a/ Nuôi cấy sơ cấp (Primary Culture)
– Thu nhận trực tiếp từ các mô và nuôi cấy theo kiểu như
• Sự phát triển ra của các mô trong nuôi cấy
• Tách thành tế bào đơn (bằng enzyme hay cơ học)
–
Thuận
lợi
:
–

Thuận
lợi
:
• Thường giữ được nhiều các đặc tính đã được biệt hóa của tế bào in
vivo.
– Bất lợi:
•Ban đầu hỗn tạp nhưng sau đó trở nên nổi trội ở các fibroblast
•Các nuôi cấy sơ cấp thường tốn công sức
•Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.2. Các kiểu nuôi cấy tế bào
b/ Nuôi cấy thứ cấp
– Cấy chuyền (or passage, or transfer) từ nuôi cấy sơ cấp
Cấy chuyền = quá trình thu nhận và tái nuôi cấy tế bào sau khi
chúng gia tăng số lượng bản sao trong nuôi cấy
–
Thường chứa kiểu
t
ế bào đơn
–
Thường chứa kiểu
t
ế bào đơn
– Có thể tăng sinh liên tục trong nhiều thế hệ
– Có hai kiểu dòng tế bào khi nuôi cấy:
• Dòng tế bào
• Dòng tế bào liên tục
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.2. Các kiểu nuôi cấy tế bào
+/ Dòng tế bào

• Thường có đời sống hạn định, lão hóa sau một số lần cấy chuyền
nhất định (chừng 30 lần phần chia)
• Thường là lưỡng bội và duy trì một số mức độ biệt hóa
•
Cần thiết để thiết lập một hệ thống ngân hàng Master và ngân hàng
•
Cần thiết để thiết lập một hệ thống ngân hàng Master và ngân hàng
làm việc để duy trì những dòng này trong thời gian dài
+/ Dòng tế bào liên tục
• Có thể tăng sinh không hạn định
• Chúng thường là những tế bào chuyển dạng:
– Tế bào từ khối u.
– Nhiễm với các viral oncogenes
– Xử lí hóa chất (chemical treatments).
• Bất lợi của những dòng này là giữ lại rất ít các đặc tính in vivo.
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.2. Các kiểu nuôi cấy tế bào
Chuyển dạng (Transformation) và Chuyển nhiễm (Transfection)
• Chuyển dạng
– Cảm ứng thay đổi kiểu hình ban đầu thông qua sự thay đổi DNA và
sự biểu hiện gen
-
Tốc độ phát triển
-
Tốc độ phát triển
- Kiểu phát triển (loss of contact inhibition)
- Hình thành sản phẩm chuyên biệt
- Kéo dài tuổi thọ
- Mất khả năng bám dính
• Chuyển nhiễm

– Đưa DNA vào trong tế bào (like viral DNA)
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.2. Các kiểu nuôi cấy tế bào
• Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở 2 dạng chính:
–Phát triển huyền phù (như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào):
Dòng tế bào thu từ máu (leukaemia, lymphoma)
– Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ nuôi: tế bào thu
từ các mô rắn (lungs, kidney), endothelial, epithelial, neuronal,
từ các mô rắn (lungs, kidney), endothelial, epithelial, neuronal,
fibroblast,…
BAE1-Endothelial
Hela-Epithelial
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.2. Các kiểu nuôi cấy tế bào
• Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở 2 dạng chính:
SHSY5Y-Neuronal
MRC5-Fibroblast
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.3. Sinh học của tế bào nuôi cấy
• Sự phát triển và tăng trưởng của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc:
–Trạng thái tự nhiên của tế bào
– Môi trường nuôi cấy:
- Cơ chất tế bào bám
-
Thành sinh lí và sinh lí của môi trường nuôi
-
Thành sinh lí và sinh lí của môi trường nuôi
- Thành phần của phase khí
- Nhiệt độ nuôi
- Tương tác tế bào-tế bào và tế bào-chất nền

CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.3. Sinh học của tế bào nuôi cấy
• Các nhân tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh tế bào:
+/ Kích thích sự tăng sinh
– Mật độ thấp (leaves the cell with free edge)
– Các tín hiệu từ môi trường: các nhân tố phát triển
+/
Ức chế sự tăng sinh
+/
Ức chế sự tăng sinh
– Giới hạn mật độ: mật độ tế bào cao
– Kìm hãm tiếp xúc: tương tác tế bào
– Các tín hiệu từ môi trường: p53 gene product
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.3. Sinh học của tế bào nuôi cấy
• Nhân tố ảnh hưởng đến sự biệt hóa
+/ Sự biệt hóa tế bào là quan trọng cho các chức năng tế bào bình
thường
+/ Nhân tố kích thích sự biệt hóa tế bào:
–
Mật độ tế bào cao
–
Mật độ tế bào cao
– Tương tác tế bào-tế bào và tương tác tế bào-chất nền
– Chất cảm ứng: hydrocortisone, retinoid, matrix
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.3. Sinh học của tế bào nuôi cấy
• Các nhân tố ảnh hưởng đến tính bám dính
+/ Sự bám dính tế bào là cần thiết cho sự tăng sinh và biệt hóa
(signaling through cytoskeleton)

+/ Các phân tử bám dính tế bào:
–
Tương tác tế bào
-
tế bào: CAMs, cadherins
–
Tương tác tế bào
-
tế bào: CAMs, cadherins
–Tương tác tế bào-chất nền: integrin, transmembrame proteoglycan
+/ Phức hợp nối chặt (Tight junctional complex) trong tế bào biểu mô
cho sự tương tác tế bào-tế bào.
+/ Sự phân tách bằng enzyme tiêu hủy các phân tử bám dính và chất
nền ngoại bào
+/ Hầu hết tế bào từ mô rắn phát triển dạng monolayer
+/ Bề mặt bao phủ với Matrix kích thích sự tăng sinh và biệt hóa
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.3. Sinh học của tế bào nuôi cấy
• Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của nuôi cấy tế bào
+/ Tế bào thích hợp
+/ Điều kiện thích hợp
– Phase rắn: Cơ chất hay phase mà tế bào phát triển eg. glass,
plastic, collagen, agar
plastic, collagen, agar
–Phase lỏng: Các đặc tính sinh lí và lí hóa của thành phần môi
trường nuôi
– Phase khí
– Nhiệt độ
– Độ vô trùng của môi trường
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

3.3. Sinh học của tế bào nuôi cấy
• Pha rắn:
+/ Tế bào cần bám dính vào một giá thể để sinh trưởng và di chuyển
+/ Dụng cụ phổ biến nâất là polystyrene plastic; những cơ chất khác
như glass, filter wells
+/
Bề mặt có
t
h
ể
được xử lí với:
+/
Bề mặt có
t
h
ể
được xử lí với:
- Phủ với cơ chất nền như Collagen, poly-l-lysine, matrigel
- Lớp feeder: monolayer of supporting cells, perhaps promote cell
growth and differentiation by cell contact and substance secreted
Neurons on glial cell feeder layers
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.3. Sinh học của tế bào nuôi cấy
• Phase lỏng
+/ Thành phần của môi trường:
–Muối vô cơ: Cân bằng áp suất thẩm thấu; Điều hòa điện thế màng:
sodium, potassium và calcium ions; Cần thiết cho sự bám dính như
enzyme cofactor.
– Carbohydrate: hầu hết chứa 4-20 mM glucose; nguồn năng lượng:
glycolysis

– Proteins and Peptides: được sử dụng để thay thế hiện diện trong
huyết thanh eg. transferrin, fibronectin
– Amino acids: quan trọng cho sự tăng sinh và biệt hóa; glutamine
có thể đi vào chu trình Kreb’s cycle
– Fatty Acids and Lipid: quan trọng trong môi trường serum free
media e.g. cholesterol and steroids cần thiết cho các tế bào đặc biệt.
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.3. Sinh học của tế bào nuôi cấy
• Phase lỏng
+/ Thành phần của môi trường:
– Vitamin: vitamins B cần thiết cho sự phát triển và sự tăng sinh;
tiền chất cho các co-factors; Vitamins thường sử dụng là thiamine,
riboflavin and biotin
–Trace Element : zinc, copper, selenium và tricarboxylic acid
intermediates; Selenium is a detoxifier và giúp tách các gốc O2 tự
do.
– Hệ đệm: hầu hết các tế bào cần pH tối ưu: 7.2 - 7.4. Kiểm soát pH
cần thiết cho nuôi cấy tối ưu: hệ thống đệm bicarbonate/CO2; hệ
đệm hóa chất: HEPES
– Môi trường nuôi cấy thương mại như pH indicator : vàng (acid)
hay hồng (alkali)
–Áp suất thẩm thấu: tương tự áp suất thẩm thấu 290 mOsm
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.3. Sinh học của tế bào nuôi cấy
• Phase lỏng
+/ Thành phần của môi trường:
– Huyết thanh
- Nhân tố không xác định: albumins, growth factors và growth
inhibitors
inhibitors

- Gia tăng khả năng đệm
- Tăng khả năng bám dính và trung hòa chất độc
- Quan trọng cho các tế bào phát triển chậm hay khi nuôi mật độ
thấp
- Biến thiến từng mẻ
- Huyết thanh bất họat nhiệt (incubation at 56ºC for 30 minutes)
có thể giúp giảm rủi ro nhiễm
CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
3.3. Sinh học của tế bào nuôi cấy
• Phase khí
– Carbondioxide: quan trọng cho hệ đệm;
5-10% CO2 ; Sản xuất sản phẩm: pyruvate
– Oxy:
-
Hầu hết tế bào cần thiết phân áp oxy thấp
-
Hầu hết tế bào cần thiết phân áp oxy thấp
- anaerobic glycolysis
-Nồng độ oxy cao có thể gia tăng gốc O2 tự do
• Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào loài
- Nhiệt độ cơ thể mà tế bào được thu nhận
- Nhiệt độ của của vùng mô thu nhận tế bào (skin temperature may be
lower than the rest of the body)