Khảo sát đáp ứng miễn dịch ở cá tra (pangasianodon hypophthalmus) đối với protein màng ompn tái tổ hợp của vi khuẩn edwardsiella ictaluri

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



LÊ LƯU PHƯƠNG HẠNH





KHẢO SÁT ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ TRA
(PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) ĐỐI VỚI
PROTEIN MÀNG OmpN TÁI TỔ HỢP CỦA VI KHUẨN
EDWARDSIELLA ICTALURI


Chuyên ngành: Hóa sinh
Mã số chuyên ngành: 60 42 30 1



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC



NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN QUỐC BÌNH

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012
LỜI CÁM ƠN

Hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của rất
nhiều người.
Trước hết, con xin cảm ơn Ba Mẹ, O Chú, anh chị em trong gia
đình và người thân đã luôn bên cạnh ủng hộ, lo lắng và động viên con
trong suốt quá trình học tập.
Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy giáo - TS. Nguyễn Quốc Bình
đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện.
Tôi xin gởi lời cảm ơn đến Trung tâm Công nghệ Sinh học
TP.HCM đã cung cấp toàn bộ kinh phí và hỗ trợ máy móc, trang thiết bị
để tôi có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Ngô Huỳnh Phương Thảo, ThS.
Lâm Vỹ Nguyên, ThS. Vũ Thị Thanh Hương, ThS. Dương Vân Anh cùng
các anh chị em bạn bè trong phòng CNSH Thủy Sản, CNSH Y Dược,
CNSH Vi Sinh, CNSH Thực Vật … đã có những giúp đỡ quý báu, tạo
điều kiện thuận lợi cũng như chia sẻ với tôi những khó khăn trong quá
trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn đến bạn bè của tôi, những người
đã luôn bên cạnh, quan tâm, cổ vũ, và giúp tôi vượt qua những khó khăn
trong suốt thời gian thực hiện.

Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
i

MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
DANH MỤC SƠ ĐỒ viii
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tình hình nuôi cá tra và bệnh gan thận mủ 3
1.2. Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mũ
trên cá Tra. 5

1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 5
1.2.2. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 6
1.3. Sơ lược về protein màng và vai trò của protein màng OmpN
(outer membrane protein N) trong vi khuẩn Edwarsiella ictaluri 8
1.3.1. Sơ lược về protein màng 8
1.3.2. Protein màng OmpN của vi khuẩn E. ictaluri 9
1.4. Tình hình nghiên cứu vaccine kháng khuẩn Edwardsiella ictaluri
cho cá Tra 13
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 14
1.5. Sơ l
ược về các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp 16
1.5.1. Hệ thống vi khuẩn E. coli 16

1.5.2. Hệ thống nấm men Pichia pastoris 17
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. Thiết bị, hóa chất và dụng cụ 20
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ 20
2.1.2 Hóa chất và môi trường 21
Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
ii

2.1.2.1. Hóa chất và môi trường dùng để biểu hiện OmpN trong hệ thống E.
coli 21
2.1.2.2. Hóa chất dùng trong tinh sạch OmpN tái tổ hợp từ E. coli 21
2.1.3. Chủng vi sinh vật 26
2.1.3.1. Chủng vi khuẩn Escherichia coli: 26
2.1.3.2. Chủng nấm men Pichia pastoris 26
2.1.4. Các plasmid 26
2.1.5.1. Plasmid pET 28 26
2.1.5.2. Plasmid pPIC9K 28
2.2. Phương pháp nghiên cứu 30
2.2.1. Thu nhận và khảo sát gây đáp ứng miễn dịch ở cá tra
của OmpN tái tổ hợ
p trên hệ thống E.coli 30
2.2.1.1. Biểu hiện protein OmpN trong E. coli 30
2.2.1.2. Thu nhận protein OmpN từ hệ thống biểu hiện E. coli 31
2.2.1.3. Đánh giá đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN 32
2.2.2. Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN 35
2.2.2.1. Tạo dòng E. coli DH5α mang đoạn gen OmpN 36
2.2.2.2. Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN 38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 40
3.1. Kết quả thu nhận OmpN tái tổ hợp trên h
ệ thống E. coli 40

3.1.1. Biểu hiện protein OmpN trong E. coli 40
3.1.2. Tinh sạch protein OmpN từ hệ thống biểu hiện E. coli 42
3.1.2.1. Mức độ hòa tan của protein OmpN ở dạng thể vùi với urea 42
3.1.2.2. Tinh sạch protein OmpN bằng sắc ký ái lực 43
3.1.2.3. Loại muối dung dịch protein OmpN tinh sạch bằng sắc lý lọc gel
Superfine Sephadex G-25 50
3.1.3. Khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN 51
3.1.3.1. Kiểm tra kháng thể
kháng OmpN từ thỏ bằng phương pháp Western
blot 51
Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
iii

3.1.3.2. Kết quả khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN 52
3.2. Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN 55
3.2.1. Tạo dòng E. coli DH5α mang plasmid PIC9K nối với đoạn gen
OmpN. 55
3.2.1.1. Thu nhận đoạn gen OmpN và pPIC9K từ chủng E. coli DH5α 55
3.2.1.2. Tạo dòng chủng E. coli DH5α mang đoạn gen OmpN nối với
pPIC9K 57
3.2.2. Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN 59
3.2.3. Kết quả sàn lọc dòng tế bào nấm men P. pastoris có khả năng biểu
hiện ompN cao 63
CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65
4.1. Kết luận 65
4.2. Kiến nghị 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Amp Ampiciline
ELISA Enzymee-Linked Immunosorbent Assay
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalacyopyranoside
Kana Kanamycine
LB Luria bertani

MCS Multi cloning site
MD Minimal dextrose medium
OD Optical density
PBS Phosphate buffered saline
PCR Polymerase chain reaction
TBS Tris-Buffered Saline
TBS/T Tris-Buffered Saline/Tween 20
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
YNB
Yeast nitrogen base
YPD Yeast extract peptone medium

















Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng PCR. 24

Bảng 2.2. Thành phần gel SDS-PAGE 25
Bảng 2.3. Thành phần các dung dịch dùng trong điện di SDS-PAGE 25
Bảng 2.4. Đặc điểm của plasmid pET28 a+ 28
Bảng 2.5. Đặc điểm của pPIC9K 29
Bảng 2.6. Thí nghiệm khảo sát độc tính của protein OmpN tinh sạch đối với cá Tra
34

Bảng 2.7. Thành phẩn phản ứng cắt plasmid 37
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng nối pPIC9K và OmpN 38
Bảng 3.2. Các chất hỗ trợ cho quá trình tái gấp cuộn [28] 46
Bảng 3.3 Tóm tắt kết quả quá trình loại muối từ 6M đến 0M bằng sắc ký lọc gel
trên cột gel sephadex G25 51

Bảng 3.4. Kết quả đo OD của phản ứng tạo màu trong ELISA 54


Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Trang
Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 5

Hình 1.2. Cá Tra khỏe mạnh và cá Tra bị bệnh gan thận mủ 7
Hình 1.3 Màng ngoài của vi khuẩn Gram âm 8
Hình 1.4. So sánh amino acid của OmpN1, OmpN2 và ompN3 12
Hình 1.5. Cấu trúc mẫu tương đồng của OmpN1, OmpN2, OmpN3 13
Hình 1.6. Hình ảnh của cấu trúc OmpN1, OmpN2 và OmpN3 xếp chồng lên
nhau13

Hình 1.7. Hình thái vi khuẩn Escherichia coli 16
Hình 1.8. Hình thái nấm men Pichia pastoris 17
Hình 2.1. Vector pET28 a+ 26
Hình 2.2. Vùng MCS của vector pET28 a+ 27
Hình 2.3. Vector pPIC9K 28
Hình 2.4. Vùng MSC của vector pPIC9K 29
Hình 3.1. Kết quả điện di trên gel SDS PAGE 12.5% protein OmpN được biểu

hiện trong E. coli 40

Hình 3.2. Kết quả điện di trên gel SDS PAGE 12.5% protein OmpN sau khi phá vỡ
tế bào E. coli bằng sonicator 41

Hình 3.3. Kết quả hòa tan OmpN với Urea ở các nồng độ khác nhau 42
Hình 3.4. Kết quả lượng protein không bám trong cột sắc ký ở các điều kiện khác
nhau 43

Hình 3.5. Kết quả tinh sạch OmpN tái tổ hợp trong điều kiện tái gấp cuộn 45
Hình 3.6. Kết quả điện di trên gel SDS PAGE 12.5% quá trình tinh sạch protein His
tag-OmpN trong điều kiện tái gấp cuộn 47

Hình 3.7. Kết quả tinh sạch OmpN-His tag trong điều kiện biến tính 48
Hình 3.8. Kết quả điện di trên gel SDS PAGE 12.5% quá trình tinh sạch OmpN-His
tag trong điều kiện biến tính 49

Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
vii

Hình 3.9. Kết quả điện di trên gel SDS PAGE qua trình loại muối protein sau tinh
sạch 50

Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của protein OmpN-His tag trong huyết
thanh của cá Tra bằng SDS-PAGE12.5% (A) và Western Blot(B) 52

Hình 3.11. Kết quả điện di trên gel agarose1% plasmid pGEX4T1::OmpN 56
Hình 3.12. Kết quả điện di trên gel agarose 1% đoạn gen OmpN đã được tinh sạch
57


Hình 3.13. Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp
mồi 3’AOX1 và 5’AOX1 58

Hình 3.14. pPIC9k được tách từ các chủng E. coli DH5α đã kiểm tra bằng PCR
khuẩn lạc 59

Hình 3.15. Kết quả cắt pPIC9K::OmpN bằng SalI và BglII được điện di trên gel
agarose 1% 60

Hình 3.16. Kết quả tinh sạch sản phẩm cắt pPIC9k:: OmpN được điện di trên gel
agarose 1% 61

Hình 3.17. Các khuẩn lạc Pichia pastoris mọc trên đĩa môi trường MD
sau khi biến nạp pPIC9K::OmpN 61

Hình 3. 18. Kết quả PCR kiểm tra kết quả tạo dòng P. pastoris mang đoạn gen
OmpN 62

Hình 3.19. Kết quả chọn các chủng P. pastoris có số copy cao nhât. 63
Hình 3.20. Các dòng P. pastoris đã tạo dòng thành công 64

Đồ thị 3.1 Số lượng trung bình cá chết ở mỗi nghiệm thức đánh giá độc lực của
OmpN trên cá tra …………………………………………………………………. 53






Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học

viii


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 2.1. Tổng quát quá trình thu nhận protein OmpN tái tổ hợp trên hệ thống E.
coli và khảo sát đáp ứng miễn dịch ở cá Tra đối với protein OmpN tái tổ hợp 30

Sơ đồ 2.2. Tổng quát quá trình tạo dòng P. pastoris mang đoạn gen OmpN 35

Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
1

LỜI MỞ ĐẦU

Trong nền kinh tế Việt Nam, thủy sản là thế mạnh và là ngành kinh tế mũi
nhọn. Với hơn 3260 km bờ biển, 112 cửa sông, lạch, hơn 2 triệu km
2
thềm lục địa,
hơn 1triệu km
2
mặt nước, sự phong phú về các loại thủy sản nên ngành thủy sản của
nước ta có điều kiện rất thuận lợi để phát triển và thực tế nó đã trở thành một bộ
phận quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Trong những năm qua, ngành thủy sản
đã đạt được tốc độ phát triển cao, ổn định và mức tăng tổng bình quân hàng năm về

tổng sả
n lượng thủy sản trên 4% năm, giá trị kim ngạch xuất khẩu bình quân chiếm
10-15% trong tổng kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam hàng năm.
Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá da trơn nước ngọt có giá trị
kinh tế cao, phân bố tự nhiên tập trung chủ yếu ở vùng hạ lưu sông Mekong. Ở Việt
Nam đối tượng này được nuôi với quy mô công nghiệp ở một số tỉnh Đồng bằng
Sông Cửu Long (ĐBSCL) như: An Giang, Đồng Tháp, Cầ
n Thơ, Bến Tre, Tiền
Giang [2].
Từ năm 1996 – 2006, diện tích nuôi cá tra, basa tăng gấp 7 lần, sản lượng tăng
36,2 lần. Hiện nay, cá tra đã được xuất khẩu sang 80 quốc gia và vùng lãnh thổ,
chiếm 29% giá trị xuất khẩu thủy sản của cả nước [13].
Để có sản lượng cao cung cấp cho xuất khẩu, bên cạnh việc tăng diện tích nuôi
trồng thì người dân còn nuôi cá tra ở mật độ cao và nuôi thâm canh, làm xuất hiện
nhiều lo
ại bệnh trên cá. Trong đó, bệnh gan thận mủ gây thiệt hại nghiêm trọng nhất
cho người nuôi [4].
Bệnh gan thận mủ xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào năm
1998. Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết cao khoảng 10-90%, và có thể lên tới 100% tùy
thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi [2]. Khi cá bệnh, người nuôi thường dùng
thuốc hóa học và thuốc kháng sinh để chữa trị. Tuy nhiên, vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri gây bệnh cho cá kháng với một số loạ
i thuốc kháng sinh như Oxytetracylin,
Oxolinic acid, Sulphonamid … Hơn thế, các sản phẩm thủy sản sau đó thường
Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
2

không được ưa chuộng do sự tích lũy thuốc, hóa chất trong thịt, tạo chủng kháng
thuốc.
Việc tìm kiếm các loại vaccine cho cá tra kháng lại bệnh gan thận mủ là vấn

đề cấp bách cho công nghiệp nuôi cá ở Việt Nam. Một trong những hướng nghiên
cứu để sản xuất vaccine là sản xuất vaccine tiểu phần bằng cách sử dụng protein
màng (outer membrane protein - Omp) của vi khuẩn E. ictaluri. Sản xuất vaccine
tiểu phần từ OmpN để phòng ng
ừa bệnh trên cá da trơn là một hướng phát triển có
nhiều tiềm năng. Protein OmpN là một tiểu phần của E. ictaluri, trợ giúp cho quá
trình bám dính, là một kháng nguyên quan trọng kích thích đáp ứng miễn dịch [5].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ dừng ở bước đánh giá đáp ứng miễn dịch của
cá Tra đối với protein màng ompN nhằm tạo tiền đề cho việc sản xuất vaccine tiểu
phần ngừa bệnh gan thận mủ cho cá tra.
Từ
những thực tế trên, chúng tôi mạnh dạn tiến hành đề tài “Khảo sát đáp
ứng miễn dịch ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) đối với protein màng
OmpN tái tổ hợp của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri”
Mục tiêu của đề tài
Khảo sát đáp ứng miễn dịch ở cá Tra đối với protein màng OmpN tái tổ hợp
của vi khuẩn E. ictaluri
Nội dung đề tài bao gồm
- Tinh sạch protein OmpN tái tổ hợp từ hệ thống biể
u hiện E. coli
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN
- Tạo dòng nấm men Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN

Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình nuôi cá tra và bệnh gan thận mủ
Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá nước ngọt, không vảy,
giống cá trê nhưng không có ngạnh. Cá tra được nuôi chủ yếu ở khu vực ĐBSCL.
Đi sâu vào hình thức và mô hình nuôi, nghề nuôi cá tra đã có sự chuyển đổi rất lớn
từ mô hình nuôi nước chảy trong lồng bè, đăng quần trên sông vùng thượng nguồn
sông Tiền và sông Hậu sang mô hình nuôi ao dọc cồn bãi ven sông và dịch chuyển
về phía hạ lưu với chất lượng cá tốt hơn, chi phí giá thành rẻ hơn do khả năng thay
nước dựa vào thủy triều tốt hơn. Điều này tạo ra triển vọng phát triển nghề nuôi cá
tra ít chịu ảnh hưởng của việc biến đổi khí hậu toàn cầu và sự nhiễm mặn sâu hơn ở
ĐBSCL.
Cá tra hiện là mặt hàng xuất khẩu chủ lực của ngành Thủy sản Việt Nam,
chiếm đến 32,4% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả n
ước vào năm 2008,
với giá trị hơn 1480 tỷ đô la Mỹ. Thị trường nuôi cá tra bắt đầu khởi sắc từ khoảng
năm 1999, sau 10 năm sản lượng cá tra Việt Nam đã tăng hơn 50 lần, giá trị xuất
khẩu tăng 65 lần [4]. Năm 2009, cả nước có khoảng 100 nhà máy chế biến cá, có
công suất 1,5 triệu tấn sản phẩm mỗi năm. Năm 2010, dự kiến sản lượng cá tra củ
a
vùng đồng bằng sông Cửu Long sẽ đạt đến mục tiêu là 1,5 triệu tấn, kim ngạch xuất
khẩu đạt 1,5 tỷ đô la Mỹ, và tạo được việc làm cho hơn 20 vạn lao động [1].

Ngày 4/10/2011, tại Hội thảo Cá tra Việt Nam- Tầm nhìn 2015 –Xu hướng
xuất khẩu, phân tích lợi thế cạnh tranh và giải pháp phát triển bền vững được trung
tâm nghiên cứu và phân tích dữ liệu Gafin tổ chức tại thành phố Hồ Chí Minh, Tiến
s
ĩ Nguyễn Thị Hồng Minh nguyên thứ trưởng bộ Thủy sản cũ cho biết “Thủy sản là
mỏ vàng của Việt Nam” trong đó tôm và cá tra là 2 sản phẩm chủ lực. Theo dự báo
của Gafin, kim ngạch xuất khẩu thủy sản năm 2011 của Việt Nam sẽ đạt 5,3 tỷ đô la
Mỹ, trong đó xuất khẩu cá Tra đạt 1,8 tỷ đô la Mỹ.
Tuy nhiên, theo hiệp hội chế biến và xuất khẩ
u thủy sản Việt Nam (VASEP)
đây là mức phát triển không bền vững. Việc mở rộng ồ ạt vùng nuôi trồng, chất
Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
4

lượng con giống không đảm bảo, thiếu kiểm soát chất lượng nguồn nước, sử dụng
hóa chất cấm … đang làm cho nguồn nước ngày càng ô nhiễm, khó kiểm soát khi
có dịch bệnh lây lan. Đặc biệt, việc lạm dụng thuốc kháng sinh và thuốc thú y thủy
sản đang làm cho sản phẩm cá tra và cá basa Việt Nam gặp nhiếu bất lợi khi xuất
khẩu sang các thị trường khó tính. Một số hàng thủy sản Việt Nam bị các n
ước nhập
khẩu trả lại do nhiễm các hóa chất cấm [1].
Tại hội thảo về phát triển bền vững nghề nuôi cá tra và basa tại thành phố Cần
Thơ năm 2007 do bộ Thủy sản đã phối hợp với Đại sứ quán Hà Lan tổ chức đã cho
biết đa số các mặt hàng này đều nhiễm Malachite Green, Oxytetracyline,
Leucomalachite Green, Chloramphenicol, Nitrofurans, CuSO
4
, β-lactam,
Quinolone, Aminosid, các phụ gia giữ nước có nhóm phosphate … và nhiều loại
kháng sinh khác [1].
Hằng năm, số lượng cá nuôi bị thiệt hại bởi các bệnh truyền nhiễm do vi

khuẩn, ký sinh trùng, nấm gây nên không ngừng gia tăng. Chính vì dịch bệnh phát
sinh, bà con ngư dân đã lạm dụng không ít loại kháng sinh và thuốc thú y thủy sản
để cứu lấy đàn cá. Giải pháp thiết thực nhất cho vấn đề này là hạn chế sự lây nhiễm
của các vi khuẩn gây b
ệnh bằng cách sử dụng vaccine phòng bệnh [1].
Feguson và cộng sự (2001) đã có công trình nghiên cứu đầu tiên mô tả về
bệnh gan thận mủ ở cá tra, cá basa nuôi tại Việt Nam [14]. Tuy nhiên, phải sau đó
một năm, nguyên nhân gây bệnh gan thân mủ trên cá tra do vi khuẩn E. ictaluri mới
được xác định bởi Crumlish và cộng sự (2002) [11].
Năm 2006, cá Tra chết hàng loạt chủ yếu là do bệnh gan thận mủ trên sông
Tiền và sông Hậu, cụ thể là khu vực Cao Lãnh (Đồng Tháp), An Giang, Cần Thơ,
… Tốc độ lây lan của dịch bệnh rất nhanh, xác cá và các cơ quan nội tạng không
được xử lí tiếp tục gây nhiễm theo môi trường nước. Trước tình hình dịch bệnh gây
ra trên diện rộng, vào năm 2008, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn Việt Nam
đã có quyết định phê duyệt các đề án nghiên cứu vaccine để phòng bệnh do vi
khuẩn E. ictaluri gây ra [1].
Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
5

Vaccine phòng bệnh do nhiễm khuẩn E. ictaluri được đánh giá là có hiệu quả,
an toàn và có lợi ích kinh tế do hạn chế sử dụng thuốc kháng sinh. Đây là xu thế cần
hướng đến khi các thị trường Mỹ, EU, Nhật, Nga … đang dần thắt chặt các quy
định về các mặt hàng thủy sản nhập khẩu.
1.2. Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá
tra.
1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩ
n Edwardsiella ictaluri
Edwardsiella ictaluri thuộc giống Edwardsiella, họ Enterobacteriaceae, bộ
Enterobacteriales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria.

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri [43]
E. ictaluri là tác nhân gây ra bệnh nhiễm trùng máu đường ruột (ESC) trên cá
Nheo ở Mỹ và bệnh gan thận mủ trên cá tra ở Việt Nam. E. ictaluri được mô tả và
công bố đầu tiên vào năm 1976 tại Southern Cooperative Fish Disease Laboratory
of Auburn University trên cá da trơn (Hawke 1979) [38].
E. ictaluri là vi khuẩn gram âm, hình que, ở dạng đơn hoặc đôi và một ít ở
dạng chuỗi, kích thước 1x2-3 µm, yếm khí không bắt buộc [16],[29],[38],[40].
E. ictaluri sinh sản vô tình [3], chuyển động nhờ tiêm mao, phát triển thuận lợi
ở nhiệt độ
25-30
0
C [10],[40].
E. ictaluri được phân lập từ cá nhiễm lâm sàn trên môi trường thạch BHI hoặc
TSA. Chúng phát triển chậm trên môi trường nuôi cấy, cần 36-48h để hình thành
những khuẩn lạc nhỏ li ti. Sau 48h, trên môi trường EIM - môi trường giúp tăng
Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
6

cường sự phân lập và định danh E. ictaluri – khuẩn lạc E. ictaluri và E. tarda có
đường kính 0,5 – 1,0 mm, màu xanh mờ.
Vi khuẩn E. ictaluri kén chọn vật chủ hơn so với E. tarda và gây thiệt hại
nặng hơn.
Quá trình phân tích sự phát sinh loài dựa trên rRNA 16S-23S ở vùng ISR
(intergenic spacer region ) đã cho thấy một sự tương đồng hơn 96% giữa E. ictaluri
và E. tarda (tác nhân gây ra bệnh làm thối rữa khí thũng ở cá da trơn và nhiễm
trùng cơ hội ở người ) [38].
Bộ gen của E. ictaluri bao gồm một nhiễm sắc thể đơn dạng vòng. Những
nghiên cứu bằng cách cho lai DNA lại một lần nữa xác nhận rằng E. ictaluri có liên
quan mật thiết nhất với E. tarda, với tỷ lệ giống nhau tương đối 56-60% ở 60
0

C. E.
ictaluri đã có tỷ lệ tương đồng khoảng 31% với E. coli ở 60
0
C. Số lượng G+C của
E. ictaluri được ước lượng khoảng 53% bằng cách ly tâm mật độ nổi. Hai plasmid
(5.6 kb và 4.8 kb) có mặt phù hợp với nhữnh phân tích ở cá da trơn [13], [40].
Về mặt sinh hóa, nó âm tính với cytochrome oxidase, citrate, phenyl alanine
deaminase, indole và H
2
S. Vi khuẩn này có khả năng lên men và oxi hóa glucose
giải phóng khí và giảm khả năng chịu mức độ cao hơn NaCl 1.5% [16], [38].
1.2.2. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Vi khuẩn E. ictaluri xâm nhập vào cá theo 2 hướng:
- Vi khuẩn có trong nước xâm nhập vào cá qua cơ quan khứu giác và di
chuyển vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não. Từ đó, bệnh lan rộng từ màng
não đến sọ và da [38].
- Cá còn có thể nhiễm khuẩn qua đường tiêu hóa, thức ăn qua đường miệ
ng sẽ
gây nhiễm khuẩn ruột hoặc qua niêm mạc ruột vào máu và gây nhiễm trùng máu.
Bằng con đường này thì vi khuẩn đi vào các mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và
mất sắc tố của da [38].
Ngoài ra, vi khuẩn cũng có thể xâm nhập qua những vết thương ở da, di
chuyển trực tiếp vào máu hay những tế bào bạch huyết để gây bệnh [40].
Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
7

Bệnh này nếu nhẹ thường khó được phát hiện sớm do cá bệnh ít có biểu hiện
bên ngoài. Cá bị nhiễm bệnh gan thận mủ thường ăn kém hoặc bỏ ăn tùy theo mức
độ bệnh. Quan sát bên ngoài có thể thấy bụng hơi sưng to, mắt bị đục. Cá bệnh
thường bơi lờ đờ gần bề mặt ao. Khi mổ bụng cá thường thấy những đốm trắng nhỏ

(như đố
m mủ) trên bề mặt một số cơ quan nội tạng như gan, thận và lách.
Trường hợp bệnh nặng, cá bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước, thường nhào lộn và
xoay vòng tròn, và không phản ứng với tiếng động. Những tổn thương ở gan lan
rộng khiến cho gan không còn giữ đươc chức năng khử độc và lọc máu, lúc này
chất độc tích tụ trong cơ thể kết hợ
p với những yếu tố khác làm cho cá chết. Một số
cá xuất huyết ở tất cả các vi hoặc xuất huyết toàn thân, và nếu xuất huyết trầm trọng
thì khi nhấc cá ra khỏi mặt nước máu sẽ chảy ra từ da và mang cá. Ngoài ra, khi mổ
một số cá mới chết sẽ thấy túi mật bị vỡ, dịch mật lan tràn khắp các nội tạng do ống
dẫn mật và túi mật bị hoại t
ử. Một số cá biểu hiện màu sắc nhợt nhạt, có nhiều đốm
nhỏ lớn trên da. Số lượng cá chết hằng ngày tăng cao và theo tỷ lệ tăng dần. Tốc độ
lây lan của bệnh rất nhanh. Do đó, việc điều trị phải triệt để và đồng bộ.

Hình 1.2. Cá Tra khỏe mạnh (A) và cá Tra bị bệnh gan thận mủ (B)
Những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra những nhân tố có tính độc ở E. ictaluri
gồm lông roi, polysaccharide vỏ ngoại bào, lipopolysaccharide (LPS), outer
membrane protein (OMP), hemolysins (chất tiêu hồng cầu) và chondroitinase [12].
Những kháng nguyên của E. ictaluri được nghiên cứu trước đây đã sử dụng phép
phân tích SDS PAGE hay Western blot. Những protein sinh kháng nguyên hay
không sinh kháng nguyên của E. ictaluri cũng đã được nghiên cứu bằng phép phân
tích 2-D SDS PAGE [12].
A
B
Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
8

Sự phát sinh bệnh từ E.ictaluri dựa vào khả năng kiểm soát hệ protein của nó
để tránh sự phòng ngừa của vật chủ, và như vậy, sự nghiên cứu hệ protein là quan

trọng đối với việc hiểu được cơ chế gây bệnh của vi khuẩn [12].
1.3. Sơ lược về protein màng và vai trò của protein màng OmpN (outer
membrane protein N) trong vi khuẩn Edwarsiella ictaluri
1.3.1. Sơ lược về protein màng
Thành của vi khuẩn Gram âm gồm lớp peptidoglycan vững chắc và lớp màng
ngoài. Cấu trúc của lớp màng ngoài là protein, phospholipids và lipopolisaccharide
(LPS). Màng ngoài giúp bảo vệ vi khuẩn chống lại các tác động bất lợi của môi
trường như: sự tấn công của các vi khuẩn khác, sự xâm nhập của các chất có hại cho
tế bào [31]. Protein chiếm khoảng 50% khối lượng lớp màng ngoài của vi khuẩn
gram âm. Protein màng ngoài (OmpN) đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì
tính toàn vẹn và chọn lọc tính thấm của màng vi khuẩn [7],[34]. Có hai loại protein
chính trên màng tế bào là protein xuyên màng và protein ngoại biên không xuyên
màng. Protein ngoại biên không xuyên màng còn được g
ọi là protein bề mặt màng.
Các protein này thường liên kết với lớp đôi lipid và nằm ở bề mặt ngoài màng.
Protein xuyên màng đã được nghiên cứu là không tan trong nước, có bề mặt
ngoài của protein là phần kị nước. Màng ngoài của vi khuẩn gram âm thực hiện
nhiệm vụ sàn lọc phân tử, cho phép các phân tử có kích thước xác định đi qua, cản
trở các phân tử lớn, các thành phần gây hại khác, vì vậy các protein vận chuyển
xuyên màng còn được gọi là Porin [15].
Hình 1.3 Màng ngoài của vi khuẩ
n Gram âm [44]
Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
9

Protein xuyên màng có hai dạng cấu trúc là α và β-barrel. Bên trong của cấu
trúc β-barrel là các gốc ưa nước với các liên kết hydro bền chặt, bên ngoài là các
gốc kị nước để liên kết với đuôi kị nước của lớp đôi lipid. Ngược lại, cấu trúc α
thường không có khu vực ưa nước [21].
Một số chức năng sinh học của protein màng:

- Chức năng cấu trúc: protein màng giúp cho màng có được tính ổn định
-
Chức năng vận chuyển qua màng: phần lớn các protein màng đóng vai trò là
các kênh vận chuyển vật chất giữa môi trường bên trong và bên ngoài. Protein vận
chuyển là nhịp cầu của màng sinh học.
- Chức năng thu nhận và truyền tín hiệu giữa các tế bào và trong nội bộ tế bào
- Chức năng miễn dịch: protein màng đóng vai trò là các kháng nguyên trên về
mặt và là thụ quan của tế bào, tham gia vào quá trình miễn dịch.
- Đóng vai trò là các protein dung hợp màng
- Liên kết với bộ khung của tế bào, giúp tế bào có được hình dạng bền vững và
ổn định
Một số protein màng có khả năng gây độc. Khả năng gây độc của protein được
biểu hiện ở các vi khuẩn gram âm, và chúng cần thiết cho sự sinh tồn của vi khuẩn
chống lại sự xâm nhập của các đại thực bào và các tế bào eukaryote [3].
Protein màng ngoài của E. ictaluri hay các vi khuẩn gram âm gây bệnh nói
chung có vai trò quan trọng trong việc tươ
ng tác với tế bào chủ trong quá trình bám,
hấp thu chất dinh dưỡng từ tế bào chủ và loại bỏ cơ chế bảo vệ của tế bào chủ. Nó
cũng có tính kháng nguyên vì thành phần của màng ngoài được dễ dàng nhận ra như
cơ chất lạ bởi hệ thống phòng thủ miễn dịch của tế bào chủ.
1.3.2. Protein màng OmpN của vi khuẩn E. ictaluri
Cơ chế gây độc thật sự rõ ràng ở E. ictaluri v
ẫn chưa được làm sáng tỏ. Trong
phạm vi họ Enterobacteriaceae, tác nhân giúp vi khuẩn bám dính và xâm nhập vào
tế bào chủ là protein màng. Các protein này cùng với các tác nhận gây độc khác kết
hợp với cơ chế hoạt động của tế bào chủ để xâm nhập vào [22].
Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
10

OmpN liên quan đến quá trình vận chuyển chất tan qua màng tế bào, chúng

tham gia vào quá trình bám dính và xâm nhập vào tế bào vật chủ. Chúng cũng có
chức năng như một thụ quan đối với thể thực khuẩn và các bacteriocin (thuốc kháng
sinh làm bằng vi khuẩn). Từ khi những protein này được xác định có trên bề mặt
ngoài của của màng tế bào, chúng có thể hoạt động như những nhân tố quyết định
kháng nguyên và vì thế chúng được xem như những ứng cử viên vaccine tiềm nă
ng
để phòng bệnh cho cá. Do đó những hiểu biết về cấu trúc và chức năng của OmpN
là rất quan trọng [27].
Trong trình tự bộ gen của E. ictaluri có 3 gen khác nhau mã hóa cho OmpN.
Gen OmpN1 được tìm thấy trên một sợi bổ trợ của DNA E. ictaluri và được chặn
bởi một protein liên kết peniciline ở một đầu và một protein mang tính giả thuyết ở
đầu kia. Gen OmpN2 cũng được tìm thấy trên một sợi bổ trợ của E. ictaluri và
đã
được chặn bởi β-ketoadipate enol-lactone hydrolase ở một đầu và phosphofructose
kinase ở đầu còn lại. Khác với gen OmpN1 và OmpN2, gen OmpN3 đã được tìm
thấy trên một sợi thực của DNA và bị chặn bởi một protein họ HAD và một tRNA
giả định (uracil-5-) methyltransferase [27].

OmpN1 có 402 amino acid, với khối lượng phân tử là 4.41 kDa và điểm đẳng
điện là 5.3. OmpN2 có 373 amino acid với khối lượng phân tử 4.10 kDa và điểm
đẳng điện là 5.39. Và OmpN3 có 376 amino acid với khối lượng phân tử là 4.2 kDa
và điểm đẳng điện là 8.95 [27].
Những đặc tính hóa lý của OMPs này đã được xác định. Đoạn petide tín hiệu
và những vùng chuyển màng của protein cũng được xác định. Một liên kết gồm
nhiều trình tự
đã được thực hiện để xác định vị trí các khu bảo tồn trong protein.
Cấu trúc này đã có được thông qua một mô hình tương đồng. Đoạn peptide tín hiệu
của OmpN1 là “MKYKYLAVAIPVLLAAGMANS” , nằm giữa alanine thứ 21 và
alanine thứ 22. Đoạn peptide tín hiệu của OmpN2 nằm giữa alanine 21 và alanine
22; chuỗi tín nhiệu là “MKRNLLAAVIPALLVAGAANA”. Chuỗi tín hiệu của

OmpN3 là “MNTIRSLVALSTIGCIGIFPLISHA” và nằm giữa alanine 25 và
alanine 26 [27].
Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
11

Nghiên cứu đã cho thấy rằng OmpN của vi khuẩn E. ictaluri là Porin và có 16
sợi xuyên màng di chuyển thông qua màng tế bào bên trong và bên ngoài.
Đối với OmpN1, sự hiện diện của họ Galactokinase đã chỉ ra rằng protein này
tham gia vào quá trình vận chuyển đường, phosphoryl hóa hay truyền tín hiệu.
OmpN1 là một Porin. Dấu hiệu của protein Flagellar R-ring trong OmpN1 cho thấy
rằng protein tham gia vào quá trình níu giữ lông roi trong lớp peptidoglycan giữa
lớp màng trong và ngoài. Ngoài ra, sự hiện diện của EDG-6 sphingosine 1-
phosphate đã cho thấy sự tham gia của protein vào quá trình truyền tải tín hiệu và
nhận diện tế bào.
OmpN2 là một Porin và có liên quan đến tính độc của tế bào. Những thụ quan
orphan GPR6 đưa ra vai trò của protein này trong con đường truyền tín hiệu và bắt
đầu phản ứng với tế bào [27].
Sự có mặt của những dấu hiệu protein màng biểu mô trong OmpN3 cho thấy
vai trò của protein này trong quá trình kiểm soát sự phát triển của tế bào Protein này
cũng tham gia vào quá trình thu nhận sắt như đó là sự hiện diện dấu hiệu
transferring trong protein. OmpN3 cũng là một Porin
Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi chú ý nghiên cứu protein màng OmpN1.

Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
12



Hình 1.4. So sánh amino acid của OmpN1, OmpN2 và ompN3 [27]
‘*’: Những phần giống hệt nhau trong tất cả các trình tự
‘:’ thay thế bảo tồn
‘.’: thay thế bán bảo tồn
Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
13


Hình 1.5. Cấu trúc mẫu tương đồng của OmpN1, OmpN2, OmpN3[27]

Hình 1.6. Hình ảnh của cấu trúc OmpN1 (xanh da trời), OmpN2 (vàng) và OmpN3
(xanh lam) xếp chồng lên nhau [27]
1.4. Tình hình nghiên cứu vaccine kháng khuẩn Edwardsiella ictaluri cho cá tra
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới cũng chưa có nghiên cứu cụ thể nào về vaccine cho cá tra kháng
vi khuẩn, nhưng đã có rất nhiều nghiên cứu về việc sử dụng vaccine phòng một số
bệnh cho các loại cá da trơn khác như cá Nheo Mỹ, cá Hồi …
Năm 1976, vaccine ngâm cho cá hồi để phòng bệnh vibriosis (do vi khuẩn
Vibrio anguillarum) và Yersiniosis (do vi khuẩ
n thuộc chi Yersinia gây ra) mới
được sản xuất thành công.

Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
14

Theo nghiên cứu của J.A Plumb và cộng sự năm 1995, việc sử dụng vaccine
E. ictaluri đã được giết chết bằng formalin cấp cho cá theo con đường: ngâm 1 lần,
ngâm 2 lần, ngâm kết hợp với cho ăn lần lượt cho tỉ lệ sống như sau: 56,7%; 64,2%
và 68,8%, còn đối chứng có tỷ lệ sống sót là 43.% [31].
Bên cạnh đó, vaccine E. ictaluri ngăn ngừa bệnh nhiễm trùng máu đường ruột
cho cá Nheo Mỹ của công ty dược phẩm Biomed (Mỹ) đã
được sản xuất và đưa ra
thị trường. Tuy nhiên, vaccine vi khuẩn đã được giết chết cấp cho cá Nheo mỹ
chống lại bệnh nhiễm trùng máu đường ruột không cho kết quả đáp ứng miễn dịch
trong thời gian dài và hiệu quả không rõ ràng [33],[36],[39].
Vaccin phòng bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra đã được nghiên cứu từ các
kháng nguyên màng dễ nhận biết nhất để phát triển. Omp đã được thử nghiệm đáp
ứng miễn d
ịch trên cá da trơn, với tỉ lệ sống sót là 65%. Nghiên cứu cũng cho thấy
một lượng nhỏ OmpN cũng có khả năng kháng bệnh trên cá [6].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Việc nghiên cứu và ứng dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản ở nước ta vẫn
đang ở giai đoạn đầu. Đã có một số công trình nghiên cứu và phát triển vaccine tại
Việt Nam trong những năm gần đây, tuy nhiên vẫn chưa có sản phẩm thích hợ
p, đáp
ứng được nhu cầu.
Công trình nghiên cứu của giáo sư Peter Coloe, Trưởng khoa ngành Khoa học
Ứng dụng tại Đại học RMIT và Phan Ngọc Thuỷ đang nghiên cứu tạo vaccine vi
khuẩn sống làm tăng khả năng miễn dịch cho cá. Đây là vaccine sống nhược độc
không gây bệnh và có thể kích thích toàn bộ hệ thống miễn dịch [42].
Năm 2008, viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản II đã kết hợp với công ty
thuố

c Thú Y TW (Navetco) thực hiện đề tài cấp nhà nước “ Nghiên cứu vaccine
phòng bệnh nhiễm khuẩn cho cá tra, cá basa, cá mú, cá giò, cá hồng mỹ nuôi công
nghiệp”, trong đó đối tượng được quan tâm đặc biệt là cá Tra. Sau 2 năm thực hiện,
nghiên cứu sử dụng vaccine phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra đã đạt đựơc một số
kết quả khả quan và có triển vọng áp dụng vào thực tế [41].
Lê Lưu Phương Hạnh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
15

Từ cuối năm 2009, những thử nghiệm bước đầu trong việc tiêm vaccine phòng
bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi của Đại học Cần Thơ đã được tiến hành ở 3 điểm
thí nghiệm thuộc Đồng Tháp, An Giang và Bến Tre. Thử nghiệm đã đạt kết quả rất
hứa hẹn và cho phép ứng dụng thực tiễn rộng rãi trong thời gian không xa. Việc ứng
dụng này sẽ giúp ngăn ngừa d
ịch bệnh, giảm tổn thất cho người nuôi, loại trừ việc
sử dụng thuốc kháng sinh trong nuôi cá và ngăn chặn nguy cơ ảnh hưởng xấu đến
môi trường, bảo đảm sự phát triển bền vững của ngành sản xuất loài thủy sản chiến
lược này của Việt Nam.
Tại trung tâm công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh cũng đã có nhiều đề
tài nghiên cứu vaccine phòng bệnh cho cá Tra. Vào năm 2008, Thạc s
ĩ Nguyễn
Trọng Bình đã hoàn thành xong đề tài “tạo chủng Edwardsiella ictaluri đột biến
bằng phương pháp tái tổ hợp gen sử dụng làm vaccine ngừa bệnh mủ gan cho cá
tra”.
Vào năm 2010, đề tài “Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa cho protein màng
OmpN (outer membrane protein N) của Edwarsiella ictaluri trong hệ thống E. coli”
được thực hiện xong, và đã thu được chủng E. coli mang plasmid pGEX4T1::
OmpN.
Đến đầu năm 2011, Trung tâm Công nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh
đã nghiên cứu thành công 5 chủng vaccine nhược
độc và đang tiến hành nghiên cứu

việc sửng dụng 2 protein màng OmpA, OmpN làm vaccine tiểu phần giúp kháng
bệnh gan thận mủ cho cá tra Việt Nam. Hiện các sản phẩm trên của Trung tâm
CNSH TP HCM với những thử nghiệm bước đầu ở mức độ phòng thí nghiệm
Sản xuất vaccine từ protein Omp để phòng ngừa bệnh trên cá da trơn là một
hướng phát triển mới. Protein OmpN có vai trò trong việc tương tác với tế bào chủ,
loại bỏ cơ chế bả
o vệ của tế bào để gây bệnh. Do đó, nghiên cứu protein OmpN để
sản xuất vaccine tiểu phần phòng ngừa bệnh gan thận mủ từ E. ictaluri là rất cần
thiết và hữu ích.