nghiên cứu chuyển gen vào đậu cove (phaseolus vulgarí.l) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHỆP HÀ NỘI






PHẠM THỊ TRANG



NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO ðẬU COVE
(PHASEOLUS VULGARIS. L) THÔNG QUA VI KHUẨN
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS





LUẬN VĂN THẠC SĨ







HÀ NỘI, NĂM 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI





PHẠM THỊ TRANG



“NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO ðẬU COVE
(PHASEOLUS VULGARIS. L) THÔNG QUA VI KHUẨN
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS”




CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ : 06.42.02.01


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO

HÀ NỘI, NĂM 2013

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
ii

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả


Phạm Thị Trang

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iii

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được hoàn thành theo chương trình đào tạo Thạc sĩ, hệ chính quy
niên khóa 2011-2013 của trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội.
Trong suốt quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp
đỡ tạo mọi điều kiện thuận lợi của Ban Giám Hiệu và phòng Đào Tạo Nhà trường;
Ban chủ nhiệm khoa, các giảng viên và nhân viên bộ môn Công nghệ sinh học thực
vật; Ban Giám Hiệu và các đồng nghiệp trường Đại Học Hải Dương. Tôi xin bày tỏ
lòng biết ơn sâu sắc trước những sự quan tâm và giúp đỡ quý báu đó.
Để có được kết quả trên là nhờ sự hướng dẫn và chỉ bảo tận tình của giảng
viên PGS.TS. Nguyễn Thị Phương Thảo, trưởng Khoa Công nghệ sinh học. Nhân
dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và sự kính trọng nhất đối với cô.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới giảng viên ThS. Ninh
Thị Thảo, ThS. Nguyễn Thị Thủy, ThS. Phạm Thị Thu Hằng cán bộ tại phòng thí
nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học thực vật đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập.
Tôi còn nhận được sự giúp đỡ và động viên tinh thần của cha mẹ, anh chị em
trong gia đình cùng các bạn học cùng khóa. Tôi thành thật cảm ơn và ghi nhớ tất cả
sự giúp đỡ chân thành đó.

TÔI XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN!

Tác giả luận văn


Phạm Thị Trang




Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iv

MỤC LỤC

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục các bảng vi

Danh mục hình vii

Danh mục biểu đồ viii

Danh mục chữ viết tắt ix

TÓM TẮT 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu chung về cây đậu cove 4

1.2 Các nghiên cứu về hệ thống nuôi cấy mô cây đậu cove 4

1.2.1 Tái sinh in vitro thông qua tái sinh cơ quan sinh dưỡng 5

1.2.2 Tái sinh in vitro thông qua phát sinh callus 9

1.3 Vi khuẩn A. tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen ở thực vật 10

1.3.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn A. tumefaciens 10

1.3.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 11

1.3.3 Cấu trúc và chức năng của T-ADN 12

1.3.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens 13

1.3.5 Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa trên Ti-plasmid 13

1.3.6 Các gen chỉ thị chọn lọc và sàng lọc 14

1.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens 16

1.4 Các nghiên cứu về chuyển gen vào đậu cove 18

1.5 Các nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của V – ATPase ở côn trùng 20

1.6 Các nghiên cứu về chuyển gen RNAi vào cây trồng kháng côn trùng 22

1.7 Các nghiên cứu sử dụng RNAi cho các mục tiêu khác 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Địa điểm, thời gian, vật liệu nghiên cứu 27

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 27

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 27

2.1.3 Vật liệu nghiên cứu 27


Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
v

2.2 Nội dung nghiên cứu 29

2.2.1 Nghiên cứu nuôi cấy tái sinh in vitro các giống đậu cove 29

2.2.2 Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của một số thông số của quy trình
chuyển gen đậu cove 30

2.2.3 Nghiên cứu chuyển cấu trúc vector mang gen amiRNA V-ATPase
vào giống đậu cove GS012 30

2.3 Phương pháp nghiên cứu 30

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy mô 30

2.3.2 Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Nghiên cứu nuôi cấy tái sinh in vitro các giống đậu cove 36

3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng việc bóc vỏ hạt đến sự nảy mầm của các giống
đậu cove 36

3.1.2 Đánh giá khả năng nảy mầm của các giống đậu cove 38

3.1.3 Nghiên cứu môi trường nhân nhanh tốt nhất đậu cove 39

3.2 Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của một số thông số của quy trình
chuyển gen đậu cove 41

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh kanamycin đến sức
sống của mẫu cấy 41

3.2.2 Đánh giá khả năng biểu hiện gen gus của các giống đậu cove khác nhau 43

3.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của mật độ quang của dịch khuẩn (OD) đến khả
năng biểu hiện gen gus ở giống GS012 45

3.3.4 Đánh giá ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến khả năng biểu hiện gen
gus của GS012 47

3.4 Nghiên cứu cải tiến quy trình chọn lọc đậu co ve chuyển gen 49

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53

1 Kết luận 53

2 Đề nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 58


Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên bảng Trang

1.1 Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes) và các
gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker genes) 15

3.1 Ảnh hưởng của việc bóc vỏ hạt đến sự nảy mầm của các giống đậu cove 37

3.2 Ảnh hưởng công thức nhân nhanh tới khả năng tái sinh của đậu cove
sau 3 tuần nuôi cấy 40

3.3 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh kanamycin đến sức sống của mẫu
cấy (sau 3 tuần) 42

3.4 Khả năng biểu hiện gen gus của các giống đậu cove khác nhau 44

3.5 Ảnh hưởng của mật độ quang của dịch khuẩn (OD) đến khả năng
biểu hiện gen gus của GS012 46

3.6 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến khả năng biểu hiện gen gus của
giống GS012 48

3.7 Kết quả chọn lọc cây chuyển gen theo các phương pháp khác nhau 50


Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vii

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình và ñồ thị Trang

1.1 Ti-Plasmid () 11

1.2 Cấu trúc của H+ V – ATPase (Kawasaki Nishi và Forgac, 2003) 21

2.1 Các giống đậu cove 27

2.2 Plasmid pBin 19 28

2.3 Plasmid pPS1 28

2.4 Mẫu chuyển gen: đốt lá mầm (1) từ cây đậu nảy mầm sau 3 ngày gieo
cấy. 31

3.1 Mẫu hạt đậu cove sử dụng cho nuôi cấy in vitro ( C1: không bóc vỏ,
C2: bóc vỏ). 37

3.2 Sự nảy mầm của các giống đậu cove sau 3 ngày nuôi cấy trên môi
trường MSB5 39

3.3 Khả năng tái sinh giống GS012 trên các môi trường khác nhau 40

3.4 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh Kanamycin đến sức sống của
mẫu cấy (sau 3 tuần) 43

3.5 Khả năng biểu hiện gen gus của GS012 (A) và AYOKA (B) 45

3.6 Mẫu sử dụng chuyển gen 49

3.7 Chọn lọc cây chuyển gen theo các phương pháp khác nhau trên 51



Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
viii

DANH MỤC BIỂU ðỒ


STT Tên biểu ñồ Trang

3.1 Sự nảy mầm của các giống đậu cove sau 3 ngày nuôi cấy trên môi
trường MSB5. 38

3.2 Ảnh hưởng của mật độ quang của dịch khuẩn (OD) đến khả năng biểu
hiện gen gus của giống GS012 46

33.3 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến khả năng biểu hiện gen gus của
giống GS012 48


Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
ix

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

A.tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens
AmiRNA Artificial miRNA - miRNA nhân tạo
Amp Ampicillin
CT Công thức
ĐC Đối chứng
ICP Insecticidal crystal protein - protein tinh thể diệt côn trùng
Kan Kanamycin
MiRNA MicroRNA
Nst Nhiễm sắc thể
Nts Nucleotides
ND Nước dừa
PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp
RE Restriction Enzyme - Enzyme giới hạn
RISC RNA Inducing Silencing Complex - Phức hợp làm câm RNA
RNAi RNA interfering - RNA can thiệp
SiRNA Small interfering RNA - RNA can thiệp kích thước nhỏ

Srna Small RNA - RNA nhỏ
Strep Streptomycin
GA
3
Gibberellic acid
TDZ N-phenyl-N’-1, 2,3-thiadiazol-5-urea [thidiazuron]
BAP 6 -Benzylaminopurine
IAA Indole-3- acetic acid
α – NAA α-Naphthalene acetic acid
IBA Indole-3-butyric-acid
AS Adenine sulphate
2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
IPM Integrated Pests Management - Quản lý dịch hại tổng hợp

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
1

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện nhằm nghiên cứu chuyển gen vào đậu cove Phaseolus
vulgaris. L thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Các chủng Agrobacterium
tumefaciens (A. tumefaciens) được sử dụng là LB 303 mang plasmid pBin 19 chứa gen gus
và chủng LBA 4404 mang plasmid pPSI chứa cấu trúc amiRNA (có trình tự 5’-
TCAAACTCTTTGAATTGCCTT-3’) có tiềm năng làm câm gen mã hóa V-ATPase ở 5
loài sâu hại, để tạo cây đậu chuyển gen kháng côn trùng.
Đối tượng nghiên cứu là các giống đậu GS012, AYOKA, BEA01,
CONTENDER. Sau một số thí nghiệm, chúng tôi đã thu được kết quả như sau: Khử
trùng hạt ngâm qua đêm rồi tách vỏ hạt sau đó mới cấy vào môi trường nảy mầm
hạt giúp rút ngắn thời gan này mầm hạt và tăng chất lượng mẫu sử dụng cho chuyển
gen. Khả năng tiếp nạp gen của đậu cove khá khó khăn, sự biểu hiện gus ở đậu cove

rất thấp. Trong 4 giống xét nghiệm xác định được giống có tiềm năng để được sử
dụng trong chuyển gen đậu cove là GS012. Nguồn vật liệu cho hệ thống tái sinh cây
đậu cove là đốt lá mầm. Nồng độ khuẩn thích hợp sử dụng để chuyển gene OD
600

0,6 – 0,8. Thời gian lây nhiễm mẫu với dịch khuẩn chuyển gen là 60 phút. Sau khi
đồng nuôi cấy trong tối 3 ngày, mẫu được rửa khuẩn và nuôi cấy trên môi trường
diệt khuẩn chọn lọc.
MSB5+20mg/lAS+2,5mg/lBA+0,1mg/l α-NAA+25mg/l kanamycin + 400mg/l
cefotaxime +10%ND. Qua 3 lần chọn lọc các chồi đủ tiêu chuẩn được cấy sang môi
trường ra rễ diệt khuẩn MSB5+20mg/lAS+1mg/lIBA+1mg/lGA
3
+400mg/l cefotaxime.
Sau đó tiến hành kiểm tra PCR và chuyển cây ra ngoài nhà lưới.
.





Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
2

MỞ ðẦU

Tính cấp thiết
Đậu cove (Phaseolus vulgaris. L) là nguồn cung cấp năng lượng và protein
thực vật quan trọng ở nhiều nước trên thế giới đặc biệt ở những vùng còn thiếu
nguồn protein động vật (Mariam Sticklen, 2012). Đậu rau cung cấp 15% tổng lượng
calories và hơn 30% tổng lượng protein cần thiết hàng ngày ở nhiều nước đang phát

triển (FAO:http//faostat.fao.org). Mặc dù có giá trị dinh dưỡng quan trọng, nhưng
năng suất đậu cove ở một số vùng trên thế giới còn thấp chưa tương xứng với năng
suất tiềm năng. Năng suất đậu trung bình ở các nước Tây Á và Bắc Mĩ khoảng
1100-1500kg/ha, Châu Mĩ Latin và Châu Phi khoảng 500-600 kg/ha, trong khi tiềm
năng sản lượng có thể đạt 4000kg/ha (Aragao và Rech, 2001). Một trong những
nguyên nhân làm suy giảm nghiêm trọng năng suất của đậu rau chính là sâu hại.
Đậu rau dễ bị tấn công bởi 200-450 loài sâu hại trong đó các loài sâu gây hại chính
thuộc họ Lepidotera gây giảm năng suất từ 35-100% (Singh và Schartz, 2010).
Bên cạnh các phương pháp phòng chống sâu hại truyền thống như sử dụng
thuốc hóa học, biện pháp canh tác, biện pháp thủ công, IPM… thì việc sử dụng cây
trồng biến đổi gen là biện pháp rất được quan tâm chú ý, đặc biệt việc áp dụng công
nghệ RNAi trong việc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của côn trùng khi gây hại
trên cây (Baum và cộng sự, 2007; Mao.Y.B, 2007). Các RNAi chỉ tham gia ức chế
quá trình sau phiên mã (ức chế dịch mã hoặc phân hủy mRNA), không sản sinh các
protein lạ trong cây vốn là vấn đề đang gây tranh cãi về an toàn sinh học của cây trồng
biến đổi gen.
Tuy nhiên, kĩ thuật chuyển gen cho đậu cove vẫn gặp những khó khăn nhất
định. Giống như các giống đậu khác, khó khăn chính trong quy trình chuyển gen sử
dụng vi khuẩn Agrobacterium là tỉ lệ tái sinh thấp trong nuôi cấy mô (Svetlev và
cộng sự, 2003; Zambre và cộng sự, 2005; Colpaert và cộng sự, 2008; Arellano và
cộng sự, 2009). Điều này được giải thích là do chúng không có khả năng hồi phục
vết thương kịp thời và sự phát sinh callus thứ cấp quá mức tại vị trí cắt (Kwapata
và cộng sự, 2010). Hơn thế nữa, khả năng ra rễ của chồi tái sinh in vitro cũng là một thách

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
3

thức do chồi của đậu cove sản sinh một lượng lớn callus làm ngăn cản sự hình thành rễ và hợp
chất phenol tạo ra có thể là nguyên nhân khiến mô chết do quá trình oxi hóa (Arnaldos và
cộng sự, 2001). Trên cơ sở đó chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Nghiên cứu

chuyển gen vào ñậu cove (Phaseolus vulgaris L.) thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens ”.
Mục ñích, yêu cầu
Mục đích của đề tài nhằm xây dựng quy trình chuyển gen gus có hiệu quả
nhất để từ đó áp dụng chuyển gen mang cấu trúc amiRNA ức chế biểu hiện gen V-
ATPase của một số loài sâu hại đậu đỗ vào đậu cove (Phaseolus vulgaris. L) thông
qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:
Yêu cầu: Trong khuôn khổ một luận án tốt nghiệp, chúng tôi tập trung
nghiên cứu cụ thể các nội dung sau:
- Xác định một số giống đậu cove có hiệu quả chuyển nạp cao
- Xác định môi trường tái sinh tối ưu cho cây đậu cove
- Xác định ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến sức sống của mẫu cấy
- Xác định mật độ quang (OD) dịch khuẩn lây nhiễm thích hợp với mô nuôi cấy
- Xác định thời gian lây nhiễm thích hợp dịch khuẩn với mô nuôi cấy
- Cải tiến quy trình chọn lọc cây đậu cove chuyển gen.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
Việc thực hiện đề tài này không những giúp cho tác giả có tư duy logic, tầm
khái quát vấn đề, am hiểu hơn lý thuyết mà còn bổ sung nhiều kinh nghiệm quý báu
trong thực nghiệm.
Kết quả của đề tài tạo nền tảng cho phát triển các nghiên cứu chuyển gen đậu
cove tiếp theo đồng thời cũng là nguồn tài liệu tham khảo cho sinh viên cũng như
cho các học giả quan tâm.





Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây ñậu cove
Đậu cove (Phaseolus vulgaris L.) có nguồn gốc từ Trung Mỹ và được trồng
cách nay hơn 600 năm, là cây hàng năm quan trọng thuộc chi Phaseolus, họ Fabaceae.

Chi Phaseolus gồm 5 loài P. vulgaris, P.acutifolius, P. coccineus, P. lunatus và P.
polyanthus. Trong đó, P. vulgaris là loài đậu quan trọng thứ 2 sau đậu tương G. max
(Dillen và cộng sự, 1997). Trái đậu non chứa khoảng 2,5% đạm, 0,2% chất béo, 7%
chất đường bột và đặc biệt nhiều vitamin A, vitamin C và chất khoáng, trái có thể dùng
ăn tươi, đóng hộp và đông lạnh. Ở các nước Châu Á như: Ấn Độ, Miến Điện, Nepal,
Sri-Lanka, Bangladesh hạt đậu cove khô được sử dụng trong các bữa ăn kiêng. Đậu
cove là một trong những loại hoa màu thích hợp trong hệ thống luân canh với lúa và có
khả năng là nguồn thu nhập khá cao cho các nông hộ. (Trần Thị Ba, 2005).
P. vulgaris là một loài lưỡng bội với 11 cặp nhiễm sắc thể và kích thước bộ
gen trung bình dao động trong khoảng 558 đến 637 Mbp (Bennett và Leitch, 2005)
Phụ thuộc vào từng giống khác nhau mà vỏ đậu có màu sắc khác nhau như xanh,
đen, vàng hoặc tím. Mỗi quả đậu thường chứa từ hai tới bốn hạt và hình dáng cũng
thay đổi từ dạng hình trụ tròn tới dạng dẹt.
1.2. Các nghiên cứu về hệ thống nuôi cấy mô cây ñậu cove
Xây dựng hệ thống tái sinh đậu cove hoàn chỉnh là điều kiện tiên quyết cho
phát triển quy trình chuyển gen vào cây (Elsa Espinosa-Huerta, 2012). Tuy nhiên, quy
trình tái sinh in vitro đậu cove được đánh giá là khó khăn trong thực tế (Chandra and
Pental, 2003; Veltcheva và cộng sự, 2005). Hiệu quả tái sinh của đậu cove rất thấp và
khả năng tái sinh tùy thuộc vào từng giống, từng loại mẫu cấy … Các mẫu đậu cove
thường sử dụng cho chuyển gen bởi Agrobacterium gồm đốt lá mầm (McClean và
cộng sự, 1991), tế bào trần (Leon và cộng sự, 1991), phôi hạt trưởng thành (Aragao và
cộng sự, 1992), đĩa lá và trụ dưới lá mầm (Franklin và cộng sự, 1993), meristem
(Russell và cộng sự, 1993; Brasileiro và cộng sự, 1996), đỉnh chồi từ hạt nảy mầm
(Lewis và Bliss, 1994), trục phôi (Kim và Minamikawa, 1995)… Hầu hết các quy

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
5

trình tái sinh in vitro của đậu cove đều dựa trên sự phát sinh trực tiếp của chồi từ các
bộ phận này (Nagl và cộng sự, 1997; Veltcheva và cộng sự, 2005). Còn các quy trình
tái sinh gián tiếp thì hiệu quả tái sinh chồi từ callus là vô cùng thấp (Arellano và cộng
sự, 2009; Mahamune và cộng sự, 2011) hoặc có sự lệ thuộc cao vào từng giống
(Zambre và cộng sự, 1998; Mohamed và cộng sự, 1993).
1.2.1. Tái sinh in vitro thông qua tái sinh cơ quan sinh dưỡng
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là một công cụ hữu hiệu cho việc nhân giống số
lượng lớn, loại bỏ mầm bệnh vi rút đồng thời giữ nguyên được các tính trạng tốt của
cây. Sự tái sinh thành công cây con từ đỉnh sinh trưởng của đậu cove phụ thuộc vào
nhiều yếu tố như kiểu gen, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và môi trường
nuôi cấy (Arias và cộng sự, 2010).
Kiểu gen đóng vai trò vô cùng quan trọng trong nuôi cấy in vitro đỉnh sinh
trưởng. Kwapata và cộng sự (2010) đã sử dụng 10 giống đậu cove và tiến hành thử
nghiệm chúng trên 63 công thức môi trường khác nhau. Kết quả đã chỉ ra rằng số
lượng chồi tái sinh khác nhau đáng kể giữa các giống được đánh giá. Đối với giống
Olathe, có hơn 20 chồi tái sinh quan sát được trên một mẫu còn giống Condor thì
chỉ có 9 chồi/mẫu. Những kết quả tương tự cũng được chỉ ra bởi Quintero và cộng
sự (2010) với thí nghiệm chỉ ra tỉ lệ tái sinh dao động khoảng 13-100 % tùy thuộc
từng loài. Một nghiên cứu khác của Arias và cộng sự (2010) cho thấy số lượng chồi
tái sinh trung bình trên một mô nuôi cấy là khác nhau giữa các giống, cụ thể là
giống Brunca có tỉ lệ tái sinh cao nhất còn Huetar tỉ lệ tái sinh thấp nhất.
Cytokinin chính là nhân tố chính cho quá trình tái sinh chồi từ đỉnh sinh
trưởng. Kartha và cộng sự (1981) đã tiến hành thí nghiệm tái sinh đậu cove với các
nồng độ 6 – Benzylaminopurine (BAP) khác nhau và kết quả cho thấy môi trường
bổ sung (BAP) thúc đẩy sự phát triển của chồi từ đỉnh sinh trường và nồng độ
1,0µM BAP cho tỉ lệ tái sinh cao nhất. Mohamed và cộng sự (1992a) tái sinh thành

công cây từ chồi bất định của phôi mầm trong môi trường bổ sung 5,0µM BAP.
Kwapata và cộng sự (2010) giành được những kết quả nhất định với việc tái sinh
thành công đa chồi từ trục phôi trên môi trường MS bổ sung 11,1µM BAP và
0,57µM Indole-3-acetic acid (IAA). Ngược lại, Benedicic và cộng sự (1997) chỉ ra

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
6

rằng 6-y, y- Dimethylallylamino purine (2iP) có kết quả tốt hơn BAP trong việc
cảm ứng chồi từ đỉnh sinh trưởng.
Để tìm ra những môi trường tối ưu cho việc tái sinh đỉnh sinh trưởng,
Quintero và cộng sự (2010) tiến hành nuôi cấy trục phôi từ hạt thành thục trên môi
trường MS (Murashige và Skoog, 1992) hoặc môi trường B5 (Gamborg và cộng sự,
1968) chứa 10mg/l BA có bổ sung hoặc ko bổ sung adenine hemisulphate (20mg/l).
Kết quả là có sự khác biệt đáng kể trong hiệu quả tái sinh giữa hai môi trường: môi
trường B5 kích thích tạo chồi 98 -100% và tái sinh thành cây hoàn chỉnh 93% còn
ngược lại kết quả cho thấy chỉ có 15-73% mẫu nuôi cấy và 29% chồi in vitro được
tái sinh trên môi trường MS.
Bên cạnh mẫu cấy là mô phôi, thì các mẫu không phải mô phôi cũng được
sử dụng. Hầu hết thí nghiệm được tiến hành với việc nuôi cấy lá mầm và đốt lá
mầm từ hạt nảy mầm in vitro (Zambre và cộng sự, 1998; Ahmed và cộng sự,
2002; Veltcheva và cộng sự, 2005).
McClean và Grafton (1989) tiến hành tái sinh đậu cove từ đốt lá mầm của
cây nảy mầm trên môi trường MS bổ sung 5,0µM BAP. Những nghiên cứu trước đó
chỉ ra rằng chồi phát sinh từ tế bào nhu mô biểu bì dưới của đốt lá. Malik và cộng
sự (1991) tiến hành tái sinh thành công cây từ lá non chứa một phần mỏng cuống lá
của P. vulgaris L. Mohamed và cộng sự (1992) thực hiện quá trình tái sinh chồi
bằng việc nuôi cấy đốt lá mầm trên nền môi trường có bổ sung N-2-chloro-4-
pyridyl- N’- phenylurea (CPPU) hoặc thidiazuron (TDZ) có nồng độ 0,25µM hoặc
1µM. Ahmed và cộng sự (2000) phát triển quy trình tái sinh từ cây con và mô đốt lá

mầm với kết quả 100% mô nuôi cấy tái sinh chồi trên môi trường MS chứa 4,44µM
BAP và 0,54µM α-Naphthalene acetic acid (α-NAA). Số lượng chồi tái sinh từ cây
con là cao hơn đáng kể so với mẫu đốt lá mầm. Họ cũng chỉ ra rằng hầu hết chồi tái
sinh xuất phát từ đỉnh sinh trưởng của lá mầm.
Carvalho và cộng sự (2000) tiến hành nuôi cấy trụ trên lá mầm để tái sinh
chồi. Sự phân chia và phát triển của chồi được kích thích bằng việc nuôi cấy các
mẫu này trên nền môi trường MS bổ sung BAP và nitrate bạc.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
7

Veltchva và cộng sự (2005) xây dựng hệ thống tái sinh cơ quan sinh dưỡng
từ cuống lá của cây đậu cove con nảy mầm trong môi trường MS bổ sung BAP
khoảng 7 ngày, sau đó các mẫu cuống lá được đặt trong tối trên môi trường MS bổ
sung 2µM TDZ, 0,6µM α-NAA và 2µM paclobutrazol và ra rễ cho chồi in vitro trên
môi trường MS bổ sung với 22,2µM BAP và 0,057µM IAA.
P. vulgaris cũng có thể được tái sinh từ phôi hợp tử ở giai đoạn hình tim
hoặc hình cầu thông qua nuôi cấy phôi (Geerts và cộng sự, 1999; Geerts và cộng sự,
2000). Tuy nhiên, những quy trình này lại không hiệu quả với những phôi 8 ngày
sau khi thụ phấn hoặc nếu sử dụng phôi 2 ngày sau thụ phấn, tỉ lệ tái sinh là rất thấp
(2,8%). Schryer và cộng sự (2005) cung cấp một quy trình tái sinh cho tiền phôi từ
phôi một ngày sau thụ phấn bao gồm cả vỏ và tỉ lệ tái sinh cây con là 12,5%.
Phôi sinh dưỡng được cảm ứng thành công theo đường hướng trực tiếp (Klu,
1997; Svetleva và cộng sự, 1999) hoặc gián tiếp thông qua hình thành callus
(Martins và Sondahl, 1984; Jacobsen và Kysely, 1986) quá trình này phụ thuộc vào
kiểu gen, loại mẫu và các chất điều hòa sinh trưởng.
Trong mối quan hệ phát sinh phôi soma, nhiều yếu tố hóa học và vật lý ảnh
hưởng đến sự phát sinh hình thái. Ví dụ: cấu trúc hình cầu được phát triển từ nuôi cấy
callus trên môi trường MS chứa 2,3µM kinetin, 0,9µM 2,4- Dichlorophenoxyacetic
acid (2,4-D) và 50mg/l casein hydrolysate. Tuy nhiên các phôi soma này đều không

thể phát triển tiếp được (Martin và Sondahl, 1984). Những kết quả tương tự thu
được bởi Saunders và cộng sự (1987). Họ tìm ra 45,2µM hoặc 135,7µM 2,4-D
kích thích sự phát triển của cấu trúc hình cầu nhưng những cấu trúc này không
phát triển được thành phôi soma khi chúng được chuyển sang môi trường MS bổ
sung hoặc không bổ sung 2,4-D. Cũng cho kết quả tương tự, Hoyos (1990) không
thấy được sự khác biệt về số lượng và chất lượng của phôi soma tái sinh trong môi
trường bổ sung 45,2 - 135,7µM 2,4-D và sau đó chuyển sang hoặc môi trường
tương tự hoặc tới môi trường bổ sung IBA. Tác giả đồng thời cũng chỉ ra sự không
khác biệt của callus phát sinh phôi dưới điều kiện ánh sáng hoặc trong tối.
Gần đây, những cố gắng để tái sinh cây thông qua phát sinh phôi soma tập

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
8

trung vào giai đoạn tiền nuôi cấy cho cây khởi đầu trong môi trường giàu cytokinin.
Quá trình tái sinh cây giành được sau giai đoạn tiền nuôi cấy của cây cho trên nền
môi trường được bổ sung với CPPU (Mohamed và cộng sự, 1992b). Đây có thể là
một trong những phương pháp để thay đổi thể trạng sinh lý của mô và khởi động
quá trình tái sinh phôi sinh dưỡng.
Kwapata và cộng sự (2010) tiến hành tái sinh phôi sinh dưỡng của mười
giống đậu cove từ trục phôi nhưng sự hình thành cây từ phôi soma là tương đối khó
khăn với hiệu quả tái sinh thấp và thời gian tái sinh kéo dài khi so sánh với việc tái
sinh chồi từ chồi bất định.
Mohamed và cộng sự (1992b) sử dụng đốt lá mầm và mầm sơ cấp tách ra từ
cây đậu cove con 14 ngày tuổi để thử nghiệm tái sinh chồi và kết quả cho thấy số
lượng chồi phát sinh là cao nhất từ mẫu tách ra từ cây con nảy mầm trong điều kiện
tối. Những đáp ứng này tối ưu trên môi trường chứa 5µM BAP trong suốt thời kì
phát triển của cây con và giai đoạn nuôi cấy sau đó. Số lượng chồi/mẫu nuôi cấy
trên môi trường chứa 0,25-1,0µM CPPU hoặc TDZ cao hơn từ 2 tới 5 lần so với
môi trường bổ sung 5µM BAP.

Dang và Wei (2009) đã phát triển thành công quy trình tái sinh cho P.
vulgaris từ đốt lá mầm của cây con 6 ngày tuổi. Đốt lá mầm được cắt ra từ cây con
6 ngày tuổi nảy mầm trên môi trường MS bổ sung thêm thidiazuron và N
6
-
benzylaminopurine (BA). Sau đó nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 5,0mg/l BA
để cảm ứng hình thành cụm chồi với tần suất cảm ứng 71,9% sau 4 tuần nuôi cấy.
Các chồi sau đó được chuyển sang môi trường phát triển chồi chứa 1,0mg/l BA,
0,1mg/l GA
3
và 2,0mg/l AgNO
3
. Môi trường ra rễ là môi trường ½ MS bổ sung
0,75mg/l

IBA và

0,02mg/l BA với tỉ lệ ra rễ là 84,3%. Cây tái sinh rễ sinh trưởng tốt
và chuyển ra đất thành công.
Ninh Thị Thảo và cộng sự (2012) cũng đã xây dựng hoàn thiện quy trình tái
sinh cho cây đậu cove. Tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của hai loại mẫu khác
nhau: đốt khởi nguyên và đốt lá mầm đến khả năng phát sinh hình thái. Kết quả cho

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
9

thấy cả hai loại mẫu có tỉ lệ cảm ứng hình thành chồi tương đương nhau tuy nhiên
số chồi/mẫu của đốt lá mầm cao hơn so với mẫu đốt khởi nguyên. Mẫu tốt nhất sử
dụng cho chuyển gen là đốt lá mầm. Môi trường nhân nhanh tốt nhất là MSB5 bổ
sung 2,5mg/l BAP + 0,1mg/l α-NAA. Sau 4 tuần nuôi cấy các chồi đủ tiêu chuẩn sẽ

được ra rễ trong môi trường MSB5 bổ sung 1mg/l GA
3
+ 1mg/l IBA.
1.2.2. Tái sinh in vitro thông qua phát sinh callus
Dillen và cộng sự (2000) cho rằng tái sinh gián tiếp thông qua cảm ứng hình
thành callus phù hợp cho chuyển gen đậu cove bằng vi khuẩn Agrobacterium hơn
tái sinh trực tiếp chồi từ meristem. Tuy nhiên cho tới nay, chỉ có bốn báo cáo được
công bố về việc tái sinh chồi P. vulgaris từ callus. Phát sinh hình thái chồi từ callus
với đối tượng đậu cove được báo cáo lần đầu tiên bởi Mohamed và cộng sự (1993).
Trong nghiên cứu này, callus được cảm ứng từ cuống nhỏ trên môi trường B5 hoặc
MS bổ sung với 2,3 hoặc 4,5µM TDZ riêng biệt hoặc kết hợp với những nồng độ
khác nhau của IAA. Những biểu hiện sớm của quá trình tái sinh chồi hình thành
trên môi trường B5 chứa 4,4µM BA. Sự biểu hiện ổn định của sự phát triển chiều
cao và sự trưởng thành sớm được xác định thông qua dòng R2 từ cây tái sinh. Tuy
nhiên, quy trình này chỉ thành công với hai giống Tara và Xan-159. Zambre và cộng
sự (1998) cũng đã công bố quy trình tái sinh in vitro từ callus cảm ứng từ lá mầm
của giống Xan-159 trong đó 39% mẫu sản sinh ra mô phân sinh màu xanh thu được
trên môi trường MSB5 bổ sung 0,45µM TDZ và 0,29µM IAA nhưng số lượng của
chồi tái sinh không được đưa ra. Arellano và cộng sự (2009) đã phát triển một quy
trình tái sinh in vitro cho giống P. vulgaris Negro Jamapa trong đó sử dụng đường
hướng phát sinh cơ quan gián tiếp. Trong thí nghiệm này, mô phân sinh đỉnh chồi
và đốt lá mầm được sử dụng cho cảm ứng callus trên môi trường chứa 1,5µM 2,4-D
và môi trường chứa 22,2µM BAP được sử dụng cho tái sinh chồi.
Mahamune và cộng sự (2011) xây dựng quy trình tái sinh phù hợp cho đậu
cove từ những mẫu nuôi cấy mô khác nhau như nách lá, chồi, đốt, lóng và rễ thông
qua cảm ứng callus trên môi trường chứa 6,7µM BAP và 2,9µM IAA. Tuy nhiên,
sự hình thành chồi từ callus không được báo cáo.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
10

1.3. Vi khuẩn A. tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen ở thực vật
Hiện nay, có rất nhiều các phương pháp chuyển gen vào thực vật khác nhau
như sử dụng súng bắn gen, dùng xung điện tế bào và mô thực vật, dùng vi tiêm,
chuyển gen thông qua con đường ống phấn,… Tuy nhiên, hai phương pháp thường
sử dụng cho chuyển gen đậu cove là chuyển gen trực tiếp thông qua súng bắn gen
và chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn đất gram âm Agrobacterium bị mất độc
tính (Dillen và cộng sự 1995; Kim và Minamikawa 1997; Aragao và cộng sự, 2002;
Rech và cộng sự, 2008). Phương pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium
là một phương pháp rất được ưa chuộng trong việc tạo cây chuyển gen với nhưng
ưu điểm như: sự tái tổ hợp tốt, số lượng bản sao thấp, hiệu quả đồng thể hiện của
gen chuyển cao (Gheysen và cộng sự, 1998).
1.3.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn A. tumefaciens
A. tumefaciens là loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u ở các vị trí
tổn thương của thực vật hai lá mầm. Chỉ rất ít thực vật một lá mầm thuộc họ
Liliaceae và Amaryllidaceae bị bệnh này. Mô khối u tổng hợp amino acid và các
dẫn xuất của đường được gọi là opine. Loại opine tổng hợp trong khối u (ví dụ như
nopaline, octopine, agrocinopine, mannopine và agropine) phụ thuộc vào dòng
Agrobacterium khởi đầu sự hình thành khối u. Những opine phổ biến nhất là
Octopine và nopaline. Do đó nhiều dòng A. tumefaciens phổ biến được thiết kế theo
kiểu octopine hoặc nopaline.
A. tumefaciens có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển một
đoạn ADN (T-DNA) của nó vào tế bào thực vật. Khi ADN vi khuẩn được hợp nhất
với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách
có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn.
Để khai thác và sử dụng A. tumefaciens như là một vector chuyển gen các
nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của T-ADN và thay
thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của
T-ADN và các gen vir. Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-ADN. Nó sẽ
được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
11

Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ A. tumefaciens đã được kiểm tra
đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển đặc
biệt. Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô được
biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức khởi đầu của vi khuẩn A. tumefaciens sử
dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn
lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật.
1.3.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid
Trong thế giới động-thực vật đều tồn tại các thể plasmid. Đó là các vòng
DNA tự do sinh sản độc lập. Ở vi khuẩn và động-thực vật, plasmid liên quan tới yếu
tố giới tính của tế bào, đến khả năng chống chịu các loại kháng sinh,… Đặc điểm
quan trọng của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể nhưng cũng có
thể tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể một cách độc lập.

Hình 1.1. Ti-Plasmid ()
Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A. tumefaciens gây độc, có
kích thước khoảng 200-250 kb. Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở
nhiệt độ dưới 30
o
C. Bằng phương pháp lai ADN-ADN và lập bản đồ chuỗi kép di
hợp (heteroduplex mapping), người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương
đồng. Kết quả phân tích di truyền cho thấy vùng T-ADN (transferred DNA) và vùng

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
12

gây độc (virulence) liên quan đến sự hình thành khối u trong khi hai vùng khác liên

quan đến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong Agrobacterium.
Trong khi hình thành khối u, T-ADN được chuyển vào tế bào thực vật và
hợp nhất với genome nhân. T-ADN ổn định trong genome nhân. Lai Ti-plasmid với
ADN của khối u đã cho thấy T-ADN trong tế bào thực vật là tương ứng song song
với T-ADN trong Ti-plasmid của Agrobacterium. Kết quả này chứng tỏ không có
sự sắp xếp lại vị trí của T-ADN trong lúc khối u được tạo thành. Một hoặc nhiều
bản sao của T-ADN có thể có mặt ở các đoạn lặp nối tiếp. Chúng cũng có thể tách
ra và liên kết với các vùng khác nhau của ADN thực vật. Vị trí hợp nhất của T-
ADN vào ADN thực vật là hoàn toàn ngẫu nhiên.
1.3.3. Cấu trúc và chức năng của T-ADN
T-ADN là một đoạn ADN có kích thước 25 kb, trong đó chứa gen mã hóa cho
sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u. Trong Ti-plasmid, vị trí
của T-ADN được giới hạn bằng bờ phải (RB - Right Border) và bờ trái (LB - Left
Border). Ngoài T-ADN, trên Ti-plasmid còn có các vùng ADN mã hóa cho việc tái
sinh plasmid, cho khả năng lấy nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine.
Ở Ti-plasmid dạng nopalin, T-ADN xâm nhập vào genome thực vật ở dạng
một đoạn liên tục dài 22kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopine, T-ADN là một
đoạn gen liên tục dài 13kb. T-ADN mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mã hoá
những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine; (2) Các gen gây khối u
như tms1, tms2, tmsr mã hoá cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp
auxin và cytokinine.
Trong các vùng ADN của Ti-plasmid, ngoài T-ADN được nghiên cứu nhiều
hơn cả là vùng ADN phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Sản phẩm
hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất
phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu như virE
2
, virB, virD,
virD
2
,… Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết

là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-ADN, bao bọc che chở các
đoạn ADN này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
13

1.3.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi khuẩn
như: hydroxy-acetosiryngone Dưới tác dụng của các hợp chất này, A.tumefaciens
nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-ADN vào tế bào thực vật. Quá
trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và RB, LB. Cũng chính các hợp chất
này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng vir hoạt động và tăng cường biểu hiện.
Khi Agrobacterium tiếp xúc với các tế bào thực vật bị tổn thương, hoặc
acetosyringone tinh khiết đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid phiên mã, sản phẩm
của gen virA (có thể liên kết với màng) sẽ nhận diện và tương tác với acetosyringone
và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen
virC. Sau đó protein virC đã biến đổi hoạt hóa làm cho các gen vir B, C, D và E
không hoạt động và làm tăng cường sự phiên mã của gen vir C.
Sự cảm ứng gen vir xảy ra nhờ sự xuất hiện các điểm đứt sợi đơn trong các
trình tự biên 25bp nằm ở mép của T-ADN và sự xuất hiện phân tử sợi đơn mạch
thẳng tương ứng với T-ADN. Các sản phẩm của operon vir D có hoạt tính
endonuclease. Bằng một cơ chế tương tự sự tiếp hợp của vi khuẩn, T-ADN được
chuyển sang tế bào thực vật và xen một cách ổn định vào ADN nhân.
1.3.5. Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa trên Ti-plasmid
Nhiều vector biến nạp dựa trên Ti-plasmid đã được phát triển. Các vector này
không chứa bất kỳ trình tự ung thư nào và vì vậy tế bào thực vật có thể sinh trưởng
bình thường sau khi chuyển ADN vào nhân của nó. Các vector không gây ung thư
hiện đang sử dụng có thể được chia làm hai loại là cis và trans, dựa vào việc có hay
không các vùng T-ADN nằm ở mép các trình tự lặp lại trực tiếp 25 bp trên cùng đơn
vị tái bản (replicon) như các gen vir hoặc trên một plasmid phân tán. Trước đây,

loại vector thường được đề cập đến là vector liên hợp (co-intergrative vector), tuy
nhiên gần đây vector nhị thể (binary vector) là phổ biến hơn.
+ Hệ thống vector liên hợp (co-integrate vector) là kết quả của sự liên hợp
hai loại plasmid: Ti-plasmid đã loại từ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất
opine nhưng vẫn giữ lại vùng gen vir và vùng bờ trái, bờ phải. Thay vào những gen
bị cắt bỏ là đoạn tương đồng với một đoạn trên plasmid thứ hai (plasmid trung gian)

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
14

để phục vụ cho việc liên hợp hai loại plasmid. Plasmid trung gian là một plasmid
tách dòng từ vi khuẩn E.coli và có thể tái sinh được ở Agrobacterium. Plasmid này
có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp, các gen chỉ thị phục vị việc chọn lọc và có
mặt đoạn tương đồng. Khi cho tương tác hai loại plasmid này với nhau chúng sẽ
liên hợp qua sự trao đổi chéo giữa hai đoạn tương đồng và hình thành nên vector
liên hợp. Vector liên hợp này nằm trong vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens và
hoạt động theo cơ chế chuyển gen thông thường của vi khuẩn đất.
+ Hệ thống vector nhị thể khác với vector liên hợp là chúng có hai vector
(plasmid) cùng có mặt và hoạt động trong Agrobacterium. Một plasmid tách dòng
từ E.coli trong đó có thiết kế vùng bờ trái và bờ phải nằm giữa chúng là các gen chỉ
thị và vùng gắn gen cần chuyển. Plasmid thứ hai là Ti-plasmid cải tiến: toàn bộ
vùng T-DNA và vùng bờ trái, bờ phải bị cắt bỏ chỉ giữa lại vùng gen vir. Plasmid
này được gọi là plasmid hỗ trợ. Hệ thống vector này cũng hoạt động theo cơ chế
chuyển gen của vi khuẩn đất Agrobacterium một cách rất hữu hiệu.
1.3.6. Các gen chỉ thị chọn lọc và sàng lọc
Các gen chỉ thị chọn lọc chung nhất mã hóa các protein khử độc các nhân tố
ức chế trao đổi chất như các kháng sinh hoặc chất diệt cỏ. Các gen chỉ thị sàng lọc
thường được sử dụng là các gen β-glucuronidase (gus A), luciferase và gần đây hơn
là gen mã hóa protein huỳnh quang màu xanh lục (green fluorescent) của sứa.
Gen chỉ thị thường dùng nhất là các gen gus A (β-glucuronidase), gen npt II

(neomycin phosphotransferase), gen lux (luciferase), gen cat (chloramphenicol
acetyltransferase), gen nos (nopaline synthase).
Gen npt II: Gen nptII là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme neomycin
phosphotransferase (npt II), là một enzyme vi sinh vật có trọng lượng phân tử
khoảng 25kD, xúc tác cho phản ứng phosphoryl hóa một số kháng sinh gốc
aminoglycoside như neomycin, kanamycin và G148. Trong phản ứng này, nhóm γ
phosphate của ATP được gắn vào phân tử chất kháng sinh làm nó trở nên bất hoạt
do ngăn trở sự liên kết của kháng sinh với ribosome.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
15

Bảng 1.1. Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes)
và các gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker genes)
A. Một số gen chỉ thị chọn lọc
Kí hiệu gen Enzyme tương ứng Chất dùng ñể chọn lọc
npt II Neomycin phosphotransferase Kanamycin
hyg Hygromycin phosphotransferase Hygromycin
gent Gentamycin acetyltransferase Gentamycin
aat Streptomycin phosphotransferase Streptomycin
bleo Enzyme kháng bleomycin Bleomycin
bar Phosphinothricin acetyltransferase Phosphinothricin
bxn Bromoxynil nitrilase Bromoxynil
B. Một số gen chỉ thị sàng lọc
Kí hiệu gen Enzyme tương ứng Chất dùng ñể phát hiện
gus A β-glucuronidase X-gluc
lacZ β-galactosidase X-Gal
luc Luciferase đom đóm Lumis Phos
lux Luciferase khuẩn Lumi Phos
cat Chloramphenicol acetyltransferase Chloramphenicol đánh dấu

nos Nopaline synthase nopaline

Gen bar: Gen bar là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin
acetyltransferase (PAT), có tác dụng làm mất độc tính của phosphinothricin (PPT),
là hoạt chất chính của thuốc trừ cỏ như Bialaphos và Basta. Gen bar được tạo dòng
đầu tiên từ một dòng vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus. Phương pháp đơn giản
nhất để kiểm tra sự có mặt của gen bar là phương pháp trực tiếp. Mô, tế bào hoặc
cây chuyển gen được đặt trên môi trường có các nồng độ phosphinithricin khác
nhau (hoặc thuốc trừ cỏ tương ứng) và so sánh sinh trưởng của mô, tế bào hoặc cây
đối chứng đặt trên cùng môi trường.
Gen gusA: là gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β-
glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản
phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronide thường
dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-gluc (5-bromo-