Thí nghiệm hóa sinh

Bài 1: XÁC ĐỊNH NITƠ TỔNG
1.Nguyên tắc:
Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ
tổng số. Nitơ có trong thành phần axit amin của protein là N protein.
Nitơ không có trong thành phần protein như các muối đạm vô cơ, axit
nitric, các axit amin tự do, ure và các dẫn xuất của ure, các alcaloit, các
bazơ purin và pyrimidin…là các nitơ phi protein.
Nitơ tổng số = nitơ protein + nitơ phi protein
Nguyên tắc của quá trình phân tích
Mẫu được vô cơ hoá bằng H
2
SO
4
đậm đặc ở nhiệt độ cao và có chất
xúc tác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hoá mẫu xảy ra như sau:
2H
2
SO
4
→ 2 H
2
O + 2SO
2
+ O
2
Oxy tạo thành trong phản ứng lại oxy hoá các nguyên tố khác. Các
phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H
2
SO
4
tạo thành NH

3
. Các protein
bị thuỷ phân thành axit amin. Cacbon và hydro của axit amin tạo thành
CO
2
và H
2
O, còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH
3
kết hợp với axit
H
2
SO
4
dư tạo thành (NH
4
)
2
SO
4
tan trong dung dịch.
2NH
3
+ H
2
SO
4
→ (NH
4
)

2
SO
4
Các nguyên tố khoáng khác như P, K, Ca, Mg,…chuyển thành dạng
oxit: P
2
O
5
, K
2
O, CaO, MgO…tuy tồn tại trong dung dịch mẫu nhưng
không ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
Quá trình chưng cất đạm (hệ thống tự động):
Đuổi amoniac ra khỏi dung dịch bằng NaOH. Amonium sulfate khi
tác đụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ giải phóng ra khí amoniac:
(NH
4
)
2
SO
4
+ 2NaOH = Na
2
SO
4
+ H
2
O + 2NH
3
NH

3
bị lôi cuốn bởi nước và bay sang bình hứng. Bình hứng có chứa
H
3
BO
3
do đó NH
3
bay ra sẽ tác dụng ngay với H
3
BO
3
theo phản ứng:
2NH
3
+ 2H
2
O + 4H
3
BO
3
= (NH
4
)
2
B
4
O
7
+ 7H

2
O
Lượng (NH
4
)
2
B
4
O
7
được xác định thông qua việc chuẩn độ bằng HCl
chuẩn. Chuẩn độ với chất chỉ thị Methyl đỏ (pH chuyển màu 4.2-6.2)
cho đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt và không bị mất màu.
2.Cách làm:
Nguyên liệu: Nước mắm, nước tương
Hóa chất:
- Dung dịch H
2
SO
4
đậm đặc, d=1.84
- Dung dịch NaOH 40%
- Hỗn hợp xúc tác K
2
SO
4
và CuSO
4
(tỉ lệ 3:1)
- Dung dịch H

3
BO
3
4%
- Hỗn hợp metyl đỏ 0.1 pha trong cồn
Dụng cụ và máy móc:
- Bộ chưn cất đạm Kieldal
- Erlen 250ml
- Burette 25ml
Cách tiến hành :
Bước 1:Vô cơ hoá mẫu
-Cân một l lượng mẫu xác định (0.3-1g).
-Cho mẫu vào tận đáy của ống Kieldal (chu ý không để dính trên
thành ống)
-Cho hỗn hợp xúc tác K
2
SO
4
và CuSO
4
theo tỉ lệ 3:1 vào ống(2-5g).
-Dùng pipet hút 5ml H
2
SO
4
đậm đặc (d=1,84) cho vào ống vô cơ hoá
mẫu có chứa hỗn hợp trên.
-Lắp ống trên vào hệ thống vô cơ hoá mẫu.
-Việc vô cơ hoá mẫu hoàn toàn khi toàn bộ dung dịch trong ống vô cơ
hoá mẫu có màu xanh trong suốt.

Bước 2: Chưng cất mẫu
-M ẫu sau khi được vô vơ hóa đưa vào máy kieldal để định đạm, lắp
bình hứng chứa 10-60ml H
3
BO
3
4% và vài giọt thuốc thử metyl đỏ.
-Khởi động máy cất.
-Chưng cất đến khi dung dịch có màu trong suốt thì được.
Bước 3: Chuẩn độ: Mẫu sau đó đem đi chuẩn độ bằng HCl 0.1N đến
khi xuất hiện màu hồng nhạt.
Bước 4: Tính kết quả
Sơ đồ tiến hành:
Hỗn hợp phản ứng
Vô cơ hóa mẫu (đến khi mẫu có màu trong suốt)
Định đạm bằng máy kielal
Sản phẩm sau khi định đạm và thuốc thử
0.5g Mẫu
Chuẩn độ bằng HCl 0.1N
Tính toán kết quả
3.Mở rộng:
Hàm lượng Nitơ tổng
60ml H
3
BO
3
4%, 5-7 giọt thuốc thử
Xúc tác, 5ml H
2
SO

4
đđ
Một số phương pháp phân tích Protein
3.1 Định lượng Protein bằng phương pháp Lowry
+ Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng màu của protein và thuốc thử Folin,
cường độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ protein, và dựa vào
đường chuẩn của protein, có thể tính được hàm lượng protein của mẫu
nghiên cứu.
3.2 Định lượng Protein bằng phương pháp Coomassie Brilliant
Blue G – 250
+ Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi
Coomassie Brilliant Blue G – 250 liên kết với protein trong dung dịch
axit. Dạng proton hoá của thuốc nhuộm Coomassie Blue có màu đỏ da
cam. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với cả
nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein.
Trong môi trường của các gốc mang điện tích dương, sự proton hoá
không xảy ra và có màu xanh xuất hiện.
3.3 Định lượng Protein bằng phương pháp quang phổ
+ Nguyên tắc: Phát hiện và đo protein: Phương pháp đơn giản nhất để
đo nồng độ protein trong dung dịch là độ hấp thụ tia cực tím của nó. Nếu
protein tinh sạch thì nồng độ tuyệt đối của nó được tính theo giá trị được
đo. Nếu protein không tinh sạch thì nồng độ của protein tổng số được
tính tương đối từ độ hấp phụ.
3.4 Định lượng Protein bằng phương pháp Dumas
+ Nguyên tắc: Phương pháp đốt cháy Dumas để xác định protein thô.
Quy trình dùng một thiết bị lò điện đun nóng mẫu phân tích lên đến
600
o
C trong một lò phản ứng được bịt kín với sự hiện diện của oxy. Hàm
lượng nitơ của khí đốt sau đó được đo bằng cách dùng máy dò dẫn nhiệt.

Mỗi lần xác định chỉ cần khoảng 2 phút.
4.Kết quả:
Hàm l ượng nitơ tổng s ố (N
t
) có trong 1l nguyên liệu:
Với:
- : thể tích HCl 0.1N chuẩn độ mẫu thật.
- : thể tích HCl 0.1N chuẩn độ mẫu trắng
- : thể tích dịch mẫu lấy ban đầu.
- K : Hệ số điều chỉnh nồng độ kiềm.
- 0.0014 : số gam nitơ ứng với 1 ml HCl 0.1N
- 1000 : hệ số tính ra g/l
5.Biện luận: