nuôi cấy mô tế bào thực vật

Sơ lược về lịch sử
•
Áp dụng trên hoa lan – 1 năm/1 lần.
•
Nhân qua protocorms, 1,000,000/năm.
Chồi phát sinh
từ protocorm
Tái sinh thành cây
hoàn chỉnh
Các phương pháp nhân giống vô
tính in vitro
•
Chồi nách
•
Tạo chồi bất định
•
Tạo phôi soma
Nuôi cấy chồi nách
Ngọn
Chồi nách trên
trục của lá
Thân Lá
Lựa chọn mẫu nuôi cấy
Các đặc tính mong
muốn:
•
Dễ tiệt trùng
•
Non
•
Phản ứng tốt với môi

trường nuôi cấy
•
Ngọn (mô phân sinh
đỉnh)
•
Chồi nách
•
Hạt
•
Lá
Môi trường
•
Khi cắt mẫu nuôi cấy
ra khỏi cây mẹ, lấy đi
nguồn dinh dưỡng ⇒
cần phải cung cấp các
chất này cho mẫu nuôi
cấy.
Ngọn - Auxin
và Gibberellin
Rễ - Nước, vitamins
Chất khoáng và cytokinin
Lá -
Đường, GA
Thành phần môi trường
•
Môi trường khoáng cơ bản
•
Đường
•

Vitamins
•
Nước
•
Hormon sinh trưởng TV - auxin, cytokinin, GA
•
Các chất tạo gel
•
Các thành phần không xác định
Đường
•
Khi nuôi cấy mô thường quang hợp không đủ
cung cấp đủ đường ⇒ thêm saccaroza 2-3% w/v.
•
Glucoza hay hỗn hợp glucoza và fructoza.
•
Khi nuôi cấy công nghiệp, các nguồn carbon khác
(rỉ đường, dịch thủy phân tinh bột) có thể sử dụng.
Nuôi cấy tự dưỡng
•
Sinh trưởng không có nguồn carbon ⇒ cần kích
thích quang hợp
•
Cường độ ánh sáng lớn (90-150µMole/m
2
/s) điều
kiện tự nhiên (30-50).
•
Nồng độ CO
2

lớn (1000ppm) thông thường
369.4ppm.
•
Ức chế sự nhiễm VSV và cây dễ thích ứng khi
chuyển vào nhà kính.
Môi trường khoáng cơ bản
•
Bao gồm các nguyên tố đa lượng (>mg/l) và vi
lượng (<mg/l).
•
Tồn tại rất nhiều môi trường khoáng cơ bản.
•
Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1965) là
môi trường nuôi cấy chồi phổ biến nhất.
•
Môi trường Gamborgs B5 được sử dụng phổ biến
cho canh trường huyền phù tế bào (không chứa
NH
4
).
Vitamin
•
Chức năng là các coenzyme (vitamin nhóm B).
•
Mẫu nuôi cấy càng nhỏ, nhu cầu vitamin càng
chính xác.
•
Thường sử dụng hỗn hợp vitamin (Nicotinic acid,
glycine, Thiamine, pyridoxine).
•

Inositol thường sử dụng với nồng độ lớn gấp hàng
trăm lần (100mg/l)
Chất kích thích sinh trưởng
•
Auxin
•
Cytokinin
•
Axit Gibberellic
•
Ethylene
•
Axit Abscisic
•
Các chất khác
Auxin
•
Không thể thay thế (không tồn tại đột biến)
•
Trong tự nhiên có 1 chất: Indole-3-acetic acid
(IAA). Dẫn xuất tổng hợp: NAA, IBA, 2,4-D,
2,4,5-T, Pichloram
•
Kích thích sự phân chia tế bào và sự tăng kích
thước. Tạo rễ.
•
Được tổng hợp ở mô phân sinh đỉnh.
Cytokinin
•
Không thể thay thế

•
Trong tự nhiên có 1 chất: Zeatin. Dẫn xuất tổng
hợp: Benyzladenine (BA), Kinetin.
•
Kích thích sự phân chia tế bào.
•
Tạo chồi.
•
Được tổng hợp ở rễ.
Gibberellin
•
Tổ hợp 70 hợp chất tương tự gọi là các axit
Gibberellic.
•
Thường sử dụng GA3 và GA4+9.
•
Kích thích sự kéo dài tế bào ⇒ chiều cao cây và
kích thước quả
•
Phá ngủ cho hạt.
•
Tổng hợp ở lá non.
Ethylene
•
Kiểm soát quá trình chín của quả.
•
Tổng hợp ở tất cả các tế bào làm tăng chiều dày
thân và gây héo lá.
•
Ngăn cản quá trình tạo chồi bất định ⇒ sử dụng

AgNO
3
hay norbonadien.
Axit Abscisic (ABA)
•
Có duy nhất 1 chất.
•
Kích thích sự héo của lá và ngủ của hạt.
•
Kiểm soát sự đóng khí khổng và tính chịu hạn ở
thực vật.
•
Giúp tạo phôi soma.
07 March 2002 Dr. Michael Parkinson 23
Các chất tương tự hormon
•
Polyamin – vai trò quan trọng trong sự phát triển
của phôi.
•
Axit Jasmonic – phản ứng của cây khi bị tổn
thương.
•
Axit Salicylic.
•
Không được coi là hormon do nồng độ sử dụng
cao.
Các thành phần không xác định
•
Nguồn hormon, vitamin and polyamin.
•

Ví dụ nước dừa, cao nấm men, cao malt
•
Không lặp lại
•
Hiệu quả
Kiểm soát quá trình phân hóa
Cytokinin
Auxin
Đĩa lá
Chồi bất định
Rễ
Mô sẹo
Điều kiện trong nuôi cấy mô TBTV
•
Vật liệu nuôi cấy khởi đầu phải phù hợp (một
số loại mô phản ứng tốt hơn so với các mô
khác)
•
Môi trường thích hợp
•
Điều kiện vô trùng
•
Cấy chuyển
Các giai đoạn trong nuôi cấy mô TBTV
Các giai đoạn nuôi cấy mô TBTV
•
Chọn vật liệu khởi đầu: thường từ các mô non,
chưa bị phân hóa từ các cây mẹ khỏe, sạch
bệnh
Các giai đoạn nuôi cấy mô TBTV

•
Tiệt trùng bề mặt mẫu nuôi cấy: sử dụng tác nhân oxy hóa, clo
hoạt động, kim loại nặng, rượu kết hợp với các chất tẩy rửa
•
Đảm bảo điều kiện vô trùng sau tiệt trùng và trong
khi cấy chuyển: tủ cấy vô trùng gió thổi ngang áp
suất dương
Các giai đoạn nuôi cấy mô TBTV
•
Đưa mẫu nuôi cấy lên môi trường nuôi cấy thích hợp (mỗi loài,
giống cây trồng có môi trường riêng)
→
Nhân nhanh trong
ống nghiệm
Các giai đoạn nuôi cấy mô TBTV
•
Đưa cây vào vườn ươm