cay truyen phoi

Chuyên đề
GVHD: TS. Nguyễn Văn Ban
SVTH: Trần Văn Toàn
Nguyễn Thị Bích Việt
1
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
NỘI DUNG CHÍNH
Nguồn gốc
Nuôi phôi
Cấy phôi
Chương IV: CÔNG NGHỆ HỖ TRỢ SINH SẢN
2
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
3
4.1 NGUỒN GỐC:
•
Đối với người
-
Ở người, nguồn phôi sử dụng cho cấy truyền chủ yếu được tạo từ in vitro
-
Được công bố thành công đầu tiên năm 1984 khi cho ra đời 1 đứa trẻ bởi
Lutjen và cs.
-
Thời gian đầu, được sử dụng điều trị cho những trường hợp buồng trứng
bị hư hại.
•
Đối với động vật:
-
Phôi được nhận từ những con giống tốt sau khi thụ tinh in vitro.
-
Để có nguồi phôi in vivo, thông thường phải chọn những con cái tốt và

tiến hành gây siêu rụng trứng bằng hoocmon, kết hợp gây động dục đồng
pha.
-
Sự thụ tinh tiến hành bằng 2 cách: cho giao phối tự nhiên và dẫn tinh nhân
tao.
4
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
Thu nhận phôi: thu nhận phôi giai đoạn sớm từ ống dẫn
trứng hay thu nhận ở giai đoạn muộn từ tử cung. Thích hợp
nhất khi phôi ở giai đoạn phôi nang hoặc phôi dâu.
+ Có 2 phương pháp thu nhận phôi in vivo ở động vật là dội
rửa lấy phôi thông qua phẫu thuật và không thông qua phẫu
thuật.
-
Soi tìm phôi: là cách nhặt ra những phôi có trong dung
dịch gọt rửa. Thường sử dụng dụng cụ Emcon, hệ thống lọc
Minitub. Thực hiện trên đĩa petri hay trên hệ thống đĩa lọc
phôi.
-
Sau đó nhanh chóng hút phôi ra ngoài và chuyển phôi vào
môi trường thích hợp.
5
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
6
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
7
4.2 NUÔI PHÔI:
4.2.1 Chuẩn bị:
Tủ ấm CO2, nhựa trung tính của Nunc, thủy tinh của Schott
thường được dùng.

4.2.2 Môi trường nuôi cấy:
a. Các môi trường thông dụng:
Được Krebs Ringer dựa vào thí nghiệm sinh lý mô tả rỏ ràng,
chung được chia làm 3 kiểu sau:
-
MT muối đơn giản bổ sung các cơ chất năng lượng
-
MT nuôi cấy mô phức tạp: có chứa các acid amin, VTM. Cơ chất
của nucleic, ion kim loại và được bảo sung 5-20% huyết thanh.
-
MT liên tục: gần đây, thích hợp nhất với sự biến đổi sinh lý của
phôi.
8
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
b. Thành phần cơ bản:
MT nuôi cấy luôn là MT đẳng trương và chứa các ion
cần thiết cho quá trình sống ( Na+ ,K+ , Ca++ , Mg++ , Cl-
), hệ đệm bicarbonat. Đồng thời phải bổ sung thêm kháng
sinh và lượng protein tối thiểu dạng huyết thanh or
albumin.
-
Nước: là thành phần chính chiếm 99%. Quyết định khả
năng phát triển của phôi.
-
Thành phần ion kim loại: ảnh hưởng đến sự phát triển
bình thường của phôi nhất là giai đoạn blastocyst.
-
Carbohydrat: có nhiều trong toàn bộ ống dẫn trứng và tử
cung với các mức độ khác nhau. Kết hợp với amino acid
là những thành phần cơ chất năng lượng quan trọng. Các

carbohydat như pyruvat, lactate và glucose.
9
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
-
Các amino acid tự do có một lượng lớn trong dịch tử cung
và ống dẫn trứng.
-
Vitamin có thể luôn hiện diện trong môi trường nuôi cấy,
nhưng các tác động của chúng thì chưa được biết nhiều.
-
Các cơ chất nucleic acid: không hiện diện trong môi trường
nuôi cũng không ảnh hưởng gì đến sự phát triển của phôi
chuột và người đến giai đoạn blastocyst.
+ EDTA tác động có ích lên sự phát triển của phôi in vitro,
nhưng nó cũng làm ảnh giảm đáng kể sự phát triển của phôi
sau đó.
-
Các chất chống oxy hóa: được cho là một trong những chất
làm chậm sự phát triển của phôi in vitro trước khi làm tổ so
với phôi in vivo bởi chúng có thể gây ra stress oxy hóa.
có thể bố sung vào môi trường SOD, glutathyone,
cysteamine có lợi cho sự phát triển của phôi.
10
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
-
Các kháng sinh truyền thống: thường bổ sung
penicillin,streptomycin, gentamicin trong nuôi cấy phôi.
-
Nguồn protein và các đại phân tử khác: sử dụng nhiều
nhất trong IVF và nuôi cấy phôi là của chính bệnh

nhân.
-
Hormon và các nhân tố tăng trưởng: có vai trò quan
trọng trong môi trường phôi. Vai trò của nó trong sự
tăng trưởng của phôi in vitro phôi động vật có vú được
nghiên cứu nhiều bao gồm: insulin, IGF-II,EGF,TGF,…
kích thích sự phân cắt, sự vận chuyển các amino acid,
sự hình thành các phôi.
-
Hệ thống đệm: sử dụng chủ yếu bicarbonate, co2 để
duy trì pH sinh lý. Tuy nhiên pH sẽ tăng khi tiếp xúc với
không khí làm phôi hư.
11
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
c. Kiểm soát chất lượng môi trường:
Phôi chuột trước khi làm tổ phải được sử dụng
rộng rãi trong các thí nghiệm sinh học nhằm kiểm tra
thành phần của môi trường nuôi cấy cũng như thiết bị
hổ trợ sinh sản và được gọi là các thử nghiệm sinh học.
với mục đích tương tự, tinh trùng cũng thường
được sử dụng.
12
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
4.2.3. Một số điều kiện nuôi cấy:
•
Nồng độ oxy:
-
Trong lòng ống dẫn trứng của thỏ từ 2-6%, chuột túi,khỉ gân
bằng 8%.
-

Nồng độ oxy giảm -> tăng cường phát triển phôi. Với thỏ,
bò,cừu nồng độ oxy giảm giữa 5-8% sẽ gia tăng sự phtas triển
của phôi in vitro hơn so với 20%.
•
Carbon dioxide:
-
Chúng xâm nhập vào trong protein, nucleic acid trong tất cả
các giải đoạn của phôi chuột trước khi làm tổ.
-
Hệ thống nuôi cấy phôi động vật có vú thường kết hợp 5%
CO2 trong không khí.
•
pH của dịch: thu nhận từ bộ phận sinh dục của khỉ Rhesus
thay đổi song song với các sự thay đổi nồng độ CO2.
-
Kiểm tra bằng phương pháp tiêu chuẩn màu.
13
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
•
Nhiệt độ:
-
Thích hợp để nuôi phôi là 37
0
C.
-
Giao động nhiệt ở sự phân cắt sớm sẽ làm giảm khả năng
phát triển của phôi in vitro.
-
Phôi người tiếp xúc với nhiệt độ phòng thì gây cảm ứng tạo
các hư hỏng không thể sửa chửa được trong thoi vô sắc của

quá trình giảm phân.
•
Ánh sáng: nhất là ánh sáng nhìn thấy được có ảnh hưởng
đáng kể đến sự phát triển của phôi in vitro.
•
Thể tích giọt ủ hoặc việc tạo nhóm phôi trong in vitro cũng
cần được quan tâm.
-
Tỉ lệ phân cắt và hình thành phôi g/đ blastocyst tăng khi
phôi phát triển thành nhóm hay trong thể tích giảm.
-
Thể tích ủ giảm thì tăng sức sống của phôi.
14
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
4.2.4. Phương pháp đồng nuôi cấy:
- Là phương pháp nuôi cấy phôi kết hợp với các tế bào
khác.
-
Có 2 hệ thống đồng nuôi cấy là: đồng nuôi cấy tương đồng và
đồng nuôi cấy tự thân và chúng luôn có sự hiện diện của tế bào
cho ăn để làm cải thiện hiệu quả sự phát triển của phôi.
-
Ở cùng giai đoạn phát triển, các phôi đồng nuôi cấy có số
lượng tế bào phân chia cao hơn các tế bào ICM tạo sư kết dính
hoàn toàn. Đặc điểm của sự phát triển này là kết quả của bốn
cơ chế khác nhau như sau:
+ Khóa chuyển hóa
+ Các nhân tố cần thiết cho sự phát triển có thể được cung cấp
do tế bào feeder.
15

SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
+ Các chất động có thể được dọn sạch.
+ Những kim loại nặng có thể được bắt giữ bởi các glycine được
xuất từ các tế bào feeder.
-
Weimer và cs (1998), khi ứng dụng kĩ thuật đồng nuôi cấy đã bổ
sung và củng cố được sự tiên lượng cho các bệnh nhân vô sinh.
-
Hệ thống đồng nuôi cấy thường sử dụng với các tế bào fibroblast
nội mạc tử cung thai bê, các dòng tế bào nội mạc tử cung người và
vòi dẫn trứng và các dong tế bào Vero thương mại.
-
Một số bất lợi trong kĩ thuật đồng nuôi cấy:
•
Tốn công và tốn nhiều thời gian.
•
Môi trường các tế bào feeder bị chuyển hóa rất nhanh, pH thay
đổi nhanh.
•
Các điều kiện nuôi khó duy trì.
•
Các tế bào làm giá thể có thể bị nhiễm vi rut, vi khuẩn và
mycoplasma.
16
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
4.2.5 Một số diễn biến quan trọng trong sự
phát triển phôi
17
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
-

Hình thái và tỉ lệ phát triển của phôi là 2 chỉ tiêu được sử
dụng đầu tiên theo dõi sự phát triển của phôi in vitro.
-
Sau 20-34h sau thụ tinh hai tiền nhân tiến xát với nhau và
hợp giao. Sau 35-36h thì hình thành 2 tế bào phôi lưỡng bội
-
Sau 16-18h sau khi tinh trùng thụ tinh với trứng thị nhân
được hiện rõ và chúng có nhiệm vụ tổng hợp rARN của phôi.
-
Tesarik và Greco cho biết sự sắp xếp tiền nhân liên quan
đến trục thể cực, sự định vị của nhân và tính ổn định nguyên
sinh chất. Như trứng 3 tiền nhân là kết quả của sự hình thành
thoi 3 thể cực.
-
Khi trứng được thụ tinh bình thường, thì bất đầu phân cắt
hợp tử, sau 35,6h hình thành phôi 2 tb, sau 2 ngày thụ tinh
hình thành phôi 4tb, sau 3 ngày -> phôi 8tb.
-
Từng tb riêng lẽ phân chia không toàn bộ sau một thời gian
xuất hiện số tb lẽ.
18
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
-
Sự phân mảnh phôi là tiêu chuẩn về hình thái để đánh giá
chất lượng phôi.
-
Kích thước tb phôi ảnh hưởng đến khả năng phát triển của
chúng.
-
Trên các mảnh phôi có các protein có vai trò quan trọng,

chúng tác động vào từng tb trong suốt quá trìnhphats triển của
phôi.
-
Tốc độ phân bào nguyên nhiễm của phôi có 3 mức độ:
+ Thấp (2-6tb vào ngày thứ 3)
+ Phân cắt nhanh (9 tb vào ngày thứ 3)
+ bình thường (7-8tb vào ngày thứ 3)
-
Trong suốt ngày thứ 3 sau thụ tinh, nguyên sinh chất của
phôi trở nên có hạt và các lõm nhỏ xuất hiện
-
Ngày thứ 4, phôi còn được gọi là morula, chúng có sự hình
thành kết nối chặt chẽ và kết nối gap, xuất hiện sự phân cực
của tb.
19
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
Dẫn đến sự phân tách rõ ràng 2 quần thể tb bên trong và tb bên
ngoài, hình thành nên các mô ngoại phôi.
-
Khi morula xuất hiện khoảng rổng bên trong được gọi là giai
đoạn blastocyst, khoang phôi chứa đầy dịch.
-
Giữa ngày thứ 5 và ngày thứ 7 hình thành nên blastocyst in
vitro.
-
Phôi được gọi là blastocyst sớm khi khoang đã hiện diện rõ và
các tb ICM, tb lá nuôi phôi biểu hiện hình thái khác nhau.
-
Blastocyst gia tăng kích thước thì được gọi là blastocyst mở
rộng -> sự ỏng dần của màng zona pellucida.

-
Ngày thứ 6, thứ 7: blastocyst phát triển phôi nang thoát ra khỏi
màng zona pellucida và được gọi là quá trình thoát nang.
-
Ngày thứ 8 và thứ 9, những phôi không thoát nang được sẽ bị
thoái hóa.
-
Số lượng tb phôi blastocyst liên quan đến sức sống của phôi
20
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
21
4.3. CẤY PHÔI
4.3. CẤY PHÔI
1. Giới thiệu:

Việc cấy phôi vào tử cung gọi là chuyển phôi hay cấy
truyền phôi, các phôi sau khi được tạo ra từ invitro cần
được đưa vào tử cung của cá thể nhận thích hợp.

Chuyển phôi là kỹ thuật thu nhận phôi từ bộ phận sinh
dục của cá thể cái để cấy vào tử cung của con cái nhận,
nhằm tiếp tục hoàn thành quá trình mang thai và sinh con

Chuyển phôi trải qua các bước cơ bản sau:
•
Chuẩn bị phôi
•
Chuẩn bị con nhận phôi
•
Cấy truyền phôi vào con cái nhận

22
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt

Khi đưa vào cá thể nhận, phôi vẫn sống và phát triển bình
thường trên cơ sở trạng thái sinh lý, sinh dục của con cái
nhận phôi phù hợp với trạng thái sinh lý, sinh dục của con cái
cho phôi và phù hợp với tuổi phôi.

Cấy truyền phôi bò được tiến hành đầu tiên bởi Willett và
cộng sự tại Đại học Cornell (Mỹ) năm 1951.
Năm 2000, đã có 530 000 phôi bò, 4 886 phôi cừu, 10 519
phôi dê, 1 264 phôi hươu, 2 830 phôi ngựa được cấy truyền
trên thế giới.
23
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
2. Chuẩn bị cơ thể mẹ nhận phôi:

Việc chuẩn bị một con cái để có thể đón nhận những phôi
từ con khác (cùng loài) gặp nhiều khó khăn và phức tạp hơn,
trước hết phải tạo ra sự đồng pha sinh dục giữa con cái nhận
phôi với con cái cho phôi.

Chỉ khi nào các kết quả đều thuận lợi, việc cấy phôi mới
được tiến hành.

Gây trạng thái cùng cùng động dục: con cái nhận phôi phải
cùng tuổi và nên có cân nặng xấp xỉ, vớicon cho phôi. Chúng
được tiêm kích dục tố cùng thời điểm với con cho phôi hoặc
sau 1 ngày, sau đó, những con cái này sẽ được phối tự nhiên
với con đực đã bị cắt ống dẫn tinh hoặc vô sinh.

24
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt
Chúng ta theo dõi sự động dục tự nhiên hoặc tạo trạng thái
động dục cho con vật bằng hoocmone.
VD: ở bò sữa gây động dục nhân tạo bằng phương pháp
tiêm PGF2α, đặt CIDR hoặc Prid
25
SVTH:Trần Văn Toàn-Nguyễn Thị Bích Việt