Nghiên cứu nhân nhanh loài lan kim tuyến ( anoectochilus roxburghii (wall ) lindl ) của việt nam bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

BỘ GIÁO DỤC VÀO ðÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM









NGUYỄN THỊ LÀI



NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH LOÀI LAN KIM
TUYẾN (ANOECTOCHILUS ROXBURGHII (WALL.)
LINDL.) CỦA VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO






LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI – 2012



BỘ GIÁO DỤC VÀO ðÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM









NGUYỄN THỊ LÀI

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH LOÀI LAN KIM
TUYẾN (ANOECTOCHILUS ROXBURGHII (WALL.)
LINDL.) CỦA VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO


Chuyên ngành: Khoa học cây trồng
Mã số: 60620110



LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP


Người hướng dẫn khoa học:
TS. Phạm Hương Sơn






HÀ NỘI – 2012


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố
trong bất kỳ công trình nào khác, các thông tin trích dẫn trong luận văn này
ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc.



Hà Nội, ngày tháng năm 2012
Tác giả luận văn



Nguyễn Thị Lài


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

ii

LỜI CẢM ƠN

ðể có ñược kết quả này, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
nhất ñến TS. Phạm Hương Sơn người ñã tận tình dìu dắt, hướng dẫn và tạo
mọi ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cám ơn các thầy cô giáo Ban ñào tạo sau ðại học,
Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn
thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ của gia ñình và các bạn bè ñồng

nghiệp Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ ñã cho
tôi ñộng lực và tạo ñiều kiện trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ng
ày tháng năm 2012
Tác giả



Nguyễn Thị Lài

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iii

MỤC LỤC
MỞ ðẦU 1

1. Tính cấp thiết của ñề tài 1

2. Mục ñích và yêu cầu của ñề tài 3

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 4

4. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu của ñề tài 5

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ðỀ
TÀI 6

1.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 6

1.1.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật 6

1.1.2. Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào 6

1.1.3. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô
tế bào 8

1.1.3.1. Môi trường nuôi cấy 8

1.1.3.2. Các chất ñiều hoà sinh trưởng 11

1.1.3.3. Môi trường vật lý 13

1.1.3.4. Vật liệu nuôi cấy 14

1.1.3.5. ðiều kiện vô trùng 14

1.1.4. Các giai ñoạn chính trong quá trình nhân giống nuôi cấy in vitro. 15

1.2. Một vài nét về Lan kim tuyến 17

1.2.1. Phân loại 17

1.2.2. ðặc ñiểm hình thái 17

1.2.3. Sinh học và sinh thái 18

1.2.4. Phân bố 19

1.2.5. Giá trị dược liệu của A. roxburghii (Wall.) Lindl. 19

1.2.5.1. Hoạt tính sinh học của A. roxburghii (Wall.) Lindl 19

1.2.5.2. Tác dụng và công dụng của A. roxburghii (Wall.) Lindl. 22

1.2.6. Thực trạng khai thác và phát triển cây Lan A. roxburghii (Wall.)
Lindl.) 23


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iv

1.3. Nuôi trồng Lan kim tuyến 23

1.3.1. Ánh sáng 23

1.3.2. Nhiệt ñộ 24

1.3.3. ðộ ẩm 24

1.3.4. Nguồn nước tưới 24

1.3.5. Phân bón 24

1.4. Một số nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn cây Lan kim tuyến 24

1.4.1. Nghiên cứu nhân giống và bảo tồn nguồn gen cây Lan kim tuyến
trên thế giới 25

1.4.2. Nghiên cứu nhân giống và bảo tồn nguồn gen cây Lan kim tuyến ở
Việt Nam 29

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 31

2.1. Vật liệu nghiên cứu 31

2.1.1. Giống nghiên cứu 31

2.1.2. Hoá chất và thiết bị nuôi cấy mô 31

2.1.3. Các giá thể sử dụng trong nghiên cứu 32

2.1.4. Các loại phân bón sử dụng 33

2.2. Nội dung nghiên cứu 34

2.3. Phương pháp nghiên cứu 34

2.3.1. Phương pháp lấy mẫu, khử trùng và nuôi cấy tạo vật liệu khởi ñầu
Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. 34

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu nhân nhanh chồi cây Lan A. roxburghii
(Wall.) Lindl 36

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu tạo cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl.
hoàn chỉnh 39

2.3.4. Phương pháp ñưa cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. ra vườn
ươm 40

2.4. Các chỉ tiêu theo dõi 42


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

v

2.5. Phương pháp xử lý số liệu 43

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44

3.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng tạo vật liệu khởi ñầu cho nuôi cấy in
vitro loài Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 44

3.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng tới tỷ lệ sống
của mẫu cấy trên môi trường MS 44

3.1.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng ñến khả năng tạo chồi từ mẫu
cấy ban ñầu 46

3.1.3. Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng BA ñến khả năng tạo chồi
từ mẫu cấy ban ñầu 49

3.2. Giai ñoạn nhân nhanh chồi 51

3.2.1. Ảnh hưởng của Kinetin (Kin) ñến khả năng nhân nhanh chồi Lan
A. roxburghii (Wall.) Lindl 51

3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của Thidiazuron (TDZ) ñến quá trình nhân
nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 54

3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp (TDZ + IBA) ñến khả năng nhân
nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 56

3.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp (BA + αNAA) ñến khả năng
nhân nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. 59

3.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền khoai tây ñến khả năng
nhân nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. 61

3.3. Giai ñoạn tạo cây hoàn chỉnh in vitro 65

3.3.1. Ảnh hưởng của than hoạt tính 65

3.3.2. Ảnh hưởng của αNAA tới giai ñoạn tạo cây hoàn chỉnh 67

3.4. Giai ñoạn ñưa cây in vitro ra vườn ươm 70

3.4.1. Ảnh hưởng của giá thể trồng khác nhau ñến sự sinh trưởng phát
triển của cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 71

3.4.2. Ảnh hưởng của một số loại phân bón khác nhau ñến sự sinh trưởng
phát triển cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 73


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vi

KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 80

1. Kết luận 80

2. ðề nghị 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO 82

Tiếng việt 82

Tiếng Anh 82

PHỤ LỤC 87



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
BA: Benzyladenine acid
CITES: Công ước về buôn bán quốc tế những loài ñộng, thực vật hoang
dã nguy cấp (Convention on International Trade in Endangered
Species of Wild Fauna and Flora)
CT: Công thức

CTTN: Công thức thí nghiệm
CV% : Hệ số biến ñộng (Correlation of Variants)
ð/C: ðối chứng
IAA: Indol-3-acetic acid
IBA: Indolbutyride acid
αNAA : α - Naphthalene acetic acid
Kin: Kinetin (6-furfuryl-aminopurine)
LSD: So sánh theo giá trị khác biệt có nghĩa nhỏ nhất ở mức α ≤ 0,05
(Least Significant Difference)
MS: Murashige and Skoog
RE: Robert Ernst
TB: Trung bình
TDZ: Thidiazuron (N-phenyl-N,-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea)
VW: Vacin and Went
WHO: Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization)
WWF: Quỹ Quốc tế Bảo vệ Thiên nhiên (World Wide Fund For
Nature)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng H
2
O
2
và NaOCl 35

Bảng 2.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau ñến khả năng tạo

chồi từ mẫu cấy ban ñầu 35

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng H
2
O
2
lên mẫu cấy Lan A. roxburghii
(Wall.) Lindl 44

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng NaOCl lên mẫu cấy Lan A.
roxburghii (Wall.) Lindl. 46

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau ñến khả năng tạo
chồi từ mẫu cấy ban ñầu 47

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng BA ñến khả năng tạo
chồi từ mẫu cấy ban ñầu 50

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của Kin ñến khả năng nhân nhanh chồi Lan A.
roxburghii (Wall.) Lindl. 52

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của TDZ ñến khả năng nhân nhanh chồi của Lan A.
roxburghii (Wall.) Lindl. 55

Bảng 3.7. Kết quả ảnh hưởng của tổ hợp (TDZ + IBA) ñến khả năng nhân
nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 57

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tổ hợp (BA + αNAA) ñến khả năng nhân nhanh
chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. 60

Bảng 3.9. Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền khoai tây ñến khả năng
nhân nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 62

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của than hoạt tính tới giai ñoạn tạo cây hoàn chỉnh. 66

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của αNAA tới giai ñoạn tạo cây hoàn chỉnh 68

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của giá thể trồng khác nhau ñến sự sinh trưởng phát
triển của cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. (sau 12 tuần) 72

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của một số loại phân bón khác nhau ñến sự sinh
trưởng phát triển của cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. (sau 12
tuần) 74


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cây Lan kim tuyến (A. roxburghii (Wall.) Lindl.) 18

Hình 2.1. Cây Lan kim tuyến (A. roxburghii (Wall.) Lindl.) ñược ñưa vào
nuôi cấy mô 31

Hình 2.2. Rêu Sphagnum moss 32

Hình 2.3. Dớn tổ quạ 32

Hình 2.4. HVP 1601 WP N: P: K = 30: 10: 10 33

Hình 2.5. Growmore (Mỹ) N: P: K = 30: 10: 10 33

Hình 2.6. B1 Thái Lan 33

Hình 3.1. Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau ñến khả năng tạo
chồi từ mẫu cấy ban ñầu 48

Hình 3.2. Giai ñoạn nhân nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 64

Hình 3.3. Tạo cây hoàn chỉnh in vitro 70

Hình 3.4. Ảnh hưởng của giá thể trồng khác nhau ñến tỷ lệ sống của cây Lan
A. roxburghii (Wall.) Lindl. (sau 12 tuần) 72

Hình 3.5. Ảnh hưởng của một số loại phân bón ñến số rễ mới xuất hiện của
cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. (sau 12 tuần) 75

Hình 3.6. Cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. nuôi cấy mô sinh trưởng phát
triển ở vườn ươm 76



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

1

MỞ ðẦU
1. Tính cấp thiết của ñề tài

Theo tổ chức Y tế thế giới, hiện nay khoảng 80% dân số toàn cầu sử
dụng các loại thảo dược truyền thống ñể bảo vệ sức khỏe. Phong trào dùng
cây thuốc ñể phòng và chữa bệnh trên thế giới ñã ñặt ra một vấn ñề cần quan
tâm ñó là 2/3 trong số 50.000 loài cây thuốc ñược sử dụng là khai thác từ cây
hoang dại mà không hề ñược trồng bổ sung. Theo một nghiên cứu của nhà
thực vật học người Anh, Alan Hamilton, thành viên của quỹ Quốc tế Bảo vệ
Thiên nhiên (WWF) có tới 4.000 – 10.000 loài cây cỏ làm thuốc có nguy cơ
bị tuyệt chủng. Nguyên nhân không phải hoàn toàn do sự phát triển của y học
cổ truyền mà theo tác giả là do thị trường dược thảo ở Châu Âu và Bắc Mỹ
tăng 10% mỗi năm trong vòng 10 năm nay. Trên quy mô toàn cầu, doanh thu
mua bán cây thuốc hàng năm ước tính lên tới 16 tỷ Euro. Ở Trung Quốc, mỗi
năm có khoảng 700.000 tấn dược liệu ñược ñưa vào sản xuất 6.266 mặt hàng,
mang lại doanh thu khoảng 17,57 tỷ USD; việc buôn bán dược liệu cũng là
một nguồn thu lớn của Ấn ðộ, mặt hàng này ñem về cho quốc gia này trên 60
tỷ rupi, cung cấp 12% nhu cầu thế giới.
Theo Pawar V. M. và Puri S. N (2005) thị trường thảo dược tiếp tục
tăng trưởng với tốc ñộ 15% /năm. Theo ước tính của WHO thị trường toàn
cầu về các sản phẩm thảo dược sẽ ñạt 5 nghìn tỷ USD. Trong ñó Trung Quốc
ñạt 5 tỷ USD từ thảo dược mỗi năm.
Viện Thực vật học Trung Quốc cho rằng, cùng với Trung Quốc, Lào,
Việt Nam là một trong những nước có tài nguyên cây thuốc phong phú nhất.
Tuy nhiên, nguồn cây thuốc của Việt Nam ñang cạn kiệt vì hoạt ñộng khai
thác bừa bãi và sự yếu kém trong công tác bảo tồn, ngay cả ở các khu bảo tồn

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

2

thiên nhiên và rừng quốc gia. Có một ñiều ñáng lưu ý là việc khai thác tài
nguyên rừng trong ñó có cây thuốc là sinh kế chủ yếu của các dân tộc ít người

trong vùng ñược các thương nhân khai thác. Tuy vậy, việc tàn phá tài nguyên
rừng cũng chỉ mang lại cho họ một mức sống rất thấp. Trong khi ñó, các dự
án trồng rừng chủ yếu mới chỉ quan tâm ñến cây lấy gỗ, cây nguyên liệu và
cây ăn quả mà chưa chú ý ñến cây dược liệu, loại cây có giá trị hàng hóa rất
cao. Chẳng hạn, số tiền thu ñược từ 0,2 ha sa nhân cũng tương ñương với thu
nhập từ 1,5 ha dong riềng. Vì vậy trong ñiều kiện kinh tế như hiện nay, việc
mở rộng khu vực trồng cây thuốc không chỉ nhằm phát triển nguồn dược liệu,
mà còn là biện pháp hữu hiệu ñể xóa ñói giảm nghèo tại ñịa phương.
Orchidaceae là một trong những họ thực vật rất phong phú về chủng
loại. ðây không những là một họ nổi tiếng và ñược yêu thích bởi có hoa rất
ñẹp, nhiều màu sắc và hình dáng, mà có nhiều loài lan thuộc họ thực vật này
còn là những vị thuốc chữa bệnh rất công hiệu. Việt Nam có chủng loại Lan
rất phong phú gồm tổng số 125 chi và 902 loài lan, trong ñó có nhiều loài Lan
rất quý, ñược nước ngoài biết ñến và ñặt mua với số lượng lớn nhưng thực tế
chủ yếu mới chỉ khai thác trong tự nhiên nên không ñáp ứng ñược nhu cầu
của khách hàng, ñồng thời lại vi phạm các ñiều khoản của Hiệp ước CITES là
khai thác ngày càng cạn kiệt các loài Lan, ñồng thời là cây dược liệu nguồn
gen quý hiếm của Việt Nam. Ví dụ như: Thanh ñạm (Coelogyne cristata
Lindl.), Thanh lan (Cymbidium cyperifolium Wall. ex Lindl.) (một trong
những loài lan ñẹp nhất thế giới), Mạc lan (Cymbidium ensifolium (L.) Sw.).
Trong ñó có những loài Lan ñược sử dụng làm thuốc chữa bệnh: Lan kim
tuyến (A. roxburghii (Wall.) Lindl.), Lan kim tuyến (Ludisia discolor (Ker-
Gawl.) A. Rich.), A. lylei Rolfe ex Downie Seidenf, A. lylei Rolfe ex Downie
Seidenf, A. formossanus, A. calcareu ñặc biệt là loài Lan kim tuyến (A.
roxburghii (Wall.) Lindl.) hiện số lượng còn rất ít.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

3

Trên thực tế cho thấy Lan kim tuyến (A. roxburghii (Wall.) Lindl.) là
một cây thuốc quan trọng thuộc họ Lan (Orchidaceae). Nó không chỉ là một
loài hoa có bộ lá rất ñẹp mà nó còn là một loài dược liệu quý hiếm của Việt
Nam và các nước Châu Á khác. Nó thường ñược gọi với cái tên là “Lan kim
tuyến”. A. roxburghii (Wall.) Lindl. phân bố ở các nước châu Á: Trung Quốc,
Nhật Bản, Sri Lanka, Ấn ðộ, Nepal và Việt Nam Ở Việt Nam, A.
roxburghii (Wall.) Lindl. phân bố tại Huế, Tam ðảo, Lào Cai, Quảng Trị,
Kon Tum, Gia Lai. Chúng mọc rải rác trong rừng núi ñá vôi, nơi ẩm, dọc theo
khe suối, ở ñộ cao 300 - 1800 m.
A. roxburghii (Wall.) Lindl. ñược coi là một loại “thần dược” vì có tác
dụng chữa bệnh ña dạng như: ñiều trị tiểu ñường, ung thư, trẻ em suy dinh
dưỡng, bệnh gan, bệnh tim mạch, viêm thận, cao huyết áp và trị rắn ñộc cắn
(Xiao – Xue Wang và cộng sự, 2011).
Hiện nay, loài A. roxburghii (Wall.) Lindl. ở nước ta ñang ñứng trước
nguy cơ bị tuyệt chủng do nạn khai thác bừa bãi và buôn bán trái phép ra
nước ngoài. Do ñó việc nghiên cứu nhân nhanh loài Lan kim tuyến (A.
roxburghii (Wall.) Lindl.) của Việt Nam là hết sức cần thiết. Vì lẽ ñó, chúng
tôi tiến hành ñề tài: “Nghiên cứu nhân nhanh loài Lan kim tuyến
(Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.) của Việt Nam bằng phương pháp
nuôi cấy mô tế bào” nhằm góp phần bảo tồn và phát triển loài Lan dược liệu
quý hiếm của Việt Nam.
2. Mục ñích và yêu cầu của ñề tài
Mục ñích của ñề tài
Xây dựng ñược quy trình nhân nhanh loài Lan kim tuyến (A. roxburghii
(Wall.) Lindl.) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, nhằm góp phần bảo tồn
và phát triển loài Lan dược liệu quý hiếm của Việt Nam.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

4

Yêu cầu của ñề tài
ðề tài tập trung giải quyết một số vấn ñề sau:
- Nghiên cứu tạo nguồn vật liệu khởi ñầu cho nuôi cấy mô tế bào, tìm ra
phương pháp khử trùng tối ưu.
- Nghiên cứu công ñoạn nhân nhanh chồi.
- Nghiên cứu sự sinh trưởng phát triển của chồi và tạo cây hoàn chỉnh.
- Nghiên cứu kỹ thuật ñưa cây ra ngoài vườn ươm, bao gồm nghiên cứu về
các giá thể và một số loại phân bón thích hợp.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài
Ý nghĩa khoa học
- Bước ñầu xây dựng ñược quy trình nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy
mô cây Lan kim tuyến.
- Góp phần trồng trọt và phát triển cây dược liệu quý hiếm mà trước ñó chỉ
khai thác trong tự nhiên, trên cơ sở ñó bảo tồn nguồn gen quý hiếm ñang có
nguy cơ tuyệt diệt.
- Cung cấp cơ sở dữ liệu cho việc xây dựng quy trình nhân giống in vitro các
loại cây dược liệu khác ở Việt Nam.
Ý nghĩa thực tiễn của ñề tài
- A. roxburghii (Wall.) Lindl. là nguồn gen quý hiếm của Việt Nam ñang
ñứng trước nguy cơ tuyệt chủng, nhân giống Lan kim tuyến là nhằm bảo tồn
ñưa vào trồng trọt và phát triển nguồn gen quý hiếm này.
- Tạo ra ñược nguồn cây giống với số lượng lớn và sạch bệnh, giá cả phù
hợp, ñáp ứng nhu cầu của thị trường, tạo nguồn nguyên liệu quý cho ngành
Dược.
- Góp phần giúp ñồng bào dân tộc ở vùng núi cao tăng thu nhập, góp phần
xóa ñói giảm nghèo và ñồng thời là biện pháp tốt ñể bảo vệ rừng.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

5

4. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu của ñề tài
- Cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. thu thập từ Sa Pa ñược nuôi trồng
trong nhà lưới và ñưa vào nuôi cấy mô tại phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật
của Trung tâm Sinh học Thực nghiệm - Viện Ứng dụng Công nghệ - Bộ Khoa
học và Công nghệ. Thời gian tiến hành thí nghiệm từ tháng 5/2011 ñến tháng
10/2012
- Quy trình nhân giống in vitro cây Lan kim tuyến ñến giai ñoạn ñưa cây ra
vườn ươm.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

6

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC
CỦA ðỀ TÀI
1.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.1.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Năm 1902, nhà sinh lý thực vật học người ðức Haberlandt, ñã tiến
hành nuôi cấy các tế bào thực vật ñể chứng minh tế bào là toàn năng.
Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng ñều có khả năng
tiềm tàng ñể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận thấy rằng, mỗi
tế bào của cơ thể ña bào ñều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân
bào nguyên nhiễm. ðiều ñó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa
toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp ñiều
kiện thuận lợi nhất ñịnh, những tế bào ñó có thể sẽ phát triển thành một cơ thể
hoàn chỉnh.
Năm 1953, Miller và Skoog ñã thành công khi thực nghiệm tái sinh cây
con từ tế bào lá, chứng minh ñược tính toàn năng của tế bào. Thành công trên

ñã tạo ra công nghệ mới: công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô
tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu.
Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận
của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho ñến nay, con người ñã
hoàn toàn chứng minh ñược khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh
từ một tế bào riêng rẽ (Nguyễn Quang Thạch, 2003).
1.1.2. Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô là kết quả phân hoá và
phản phân hoá tế bào. Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống
nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong ñó có nhiều loại tế

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

7

bào khác nhau, thực hiện chức năng cụ thể khác nhau. Các mô có ñược cấu
trúc chuyên môn hoá nhất ñịnh nhờ vào sự phân hoá.
Phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành các tế bào
của mô chuyên hoá, ñảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá
trình phân hoá có thể biểu diễn như sau:
Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào phân hoá chức năng
Khi tế bào ñã phân hoá thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn
mất khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở ñiều kiện
thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục
thực hiện quá trình phân hoá, quá trình này gọi là sự phản phân hoá của tế
bào.



tế bàoT

Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá
phân hoá gen. Tại một thời ñiểm nào ñó trong quá trình phát triển cá thể, có
một số gen ñược hoạt hoá ñể cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức
chế hoạt ñộng. Quá trình này xảy ra theo một chương trình ñã ñược mã hóa
trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào. Khi tế bào nằm trong cơ thể
thực vật, chúng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách tế bào riêng rẽ,
gặp ñiều kiện bất lợi thì các gen ñược hoạt hoá, quá trình phân chia sẽ ñược
xảy ra theo một chương trình ñã ñịnh sẵn trong DNA của tế bào (Vũ Văn Vụ,
1994).
Phân hóa
Tế bào phôi sinh
Tế bào dãn
Tế bào chuyên hóa
Phản phân hóa

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

8

ðể ñiều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường
bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất ñiều tiết sinh trưởng thực vật
là Auxin và Cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi trường
khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau theo quy luật. Khi trong
môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng ñộ Auxin (IAA, IBA, NAA, 2,4-
D)/Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, TDZ) thấp thì sự phát sinh hình thái của
mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, ngược lại nếu tỷ lệ cao thì mô nuôi cấy sẽ
theo hướng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân ñối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo

(callus).
1.1.3. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô
tế bào
Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào gồm nhiều giai ñoạn kế tiếp nhau,
quá trình này có thể chia thành các nhân tố sau:
1.1.3.1. Môi trường nuôi cấy
Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy và ñiều kiện bên ngoài
ñược xem là vấn ñể quyết ñịnh sự thành bại của quá trình nuôi cấy. Môi
trường nuôi cấy ñược xem là phần ñệm ñể cung cấp các chất dinh dưỡng cần
thiết cho sự tăng trưởng và phân hoá mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro.
Cho ñến nay, ñã có nhiều môi trường dinh dưỡng ñược tìm ra (MS, WPM,
VW, RE, N6, B5, LS…) tuỳ thuộc vào ñối tượng và mục ñích nuôi cấy.
Môi trường nuôi cấy bao gồm thành phần sau:
+ Nguồn các bon: Trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang
hợp ñể tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải ñưa vào môi trường
một lượng hợp chất các bon nhất ñịnh ñể cung cấp năng lượng cho tế bào và
mô. Nguồn các bon ở ñây là các loại ñường khoảng 20-30 mg/L có tác dụng
giúp mô tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

9

khối, ngoài ra nó ñóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường. Người
ta thường sử dụng 2 loại ñường ñó là saccarose và glucose (Trần Văn Minh,
1994).
+ Nguồn Nitơ: Tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển
mô. Thông thường, nguồn nitơ ñược ñưa vào môi trường ở hai dạng là NH
4

+

và NO
3
-
. Trong ñó, việc hấp thụ NO
3
-

của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả
hơn so với NH
4
+
.
+ Nhưng ñôi khi NO
3
-
gây ra hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì vậy giải
pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitơ với tỷ lệ hợp lý ñược sử dụng rộng rãi
nhất.
+ Các nguyên tố ña lượng: Là những nguyên tố khoáng như: N, P, K, S, Mg,
Ca… cần thiết và thay ñổi tuỳ ñối tượng nuôi cấy. Nhìn chung, các nguyên tố
này ñược sử dụng ở nồng ñộ trên 30 ppm.
Có nhiều môi trường với thành phần, tỷ lệ các chất khác nhau có thể
lựa chọn sử dụng. Nói chung, môi trường giàu nitơ và kali thích hợp cho việc
hình thành chồi, còn môi trường giàu kali sẽ thúc ñẩy quá trình trao ñổi chất
mạnh hơn.
+ Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, Bo, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố rất
quan trọng do chúng ñóng vai trò quan trọng trong các hoạt ñộng của enzym.
Chúng ñược dùng ở nồng ñộ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố ña lượng ñể

ñảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây (Nguyễn Văn Uyển,
1993).
+ Các vitamin: Mặc dù cây nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp ñược vitamin,
nhưng không ñủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952). Do ñó, ñể cây sinh trưởng
tối ưu một số vitamin nhóm B ñược bổ sung vào môi trường với lượng nhất
ñịnh tuỳ theo từng hệ mô và giai ñoạn nuôi cấy. Các vitamin B1 (Thiamin) và

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

10

B6 (Pyridocin) là những vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường
nuôi cấy với nồng ñộ thấp khoảng 0,1-1mg/L (Trần Văn Minh, 1994).
+ Dung dịch hữu cơ: Có thành phần không xác ñịnh như nước dừa, dịch chiết
nấm men, cà rốt, chuối, khoai tây ñược bổ sung vào môi trường có tác dụng
kích thích sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan.
* Nước dừa: Thường chứa các axít amin, axít hữu cơ, ñường, ARN, ADN.
ðặc biệt trong nước dừa có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy in
vitro ñó là: myo - inositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các glucosit của
cytokinin. Do vậy, khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy nước dừa kích thích
sự phân chia, sinh trưởng và phát sinh hình thái của tế bào, mô nuôi cấy.
Nước dừa thường ñược sử dụng rất hiệu quả trong việc thay thế các hợp chất
ñiều tiết sinh trưởng tổng hợp nhân tạo khi nuôi cấy hoa lan (Mamoru
Kusomoto, 1980).
Nước dừa ñược sử dụng như là một chất truyền thống trong nuôi cấy
mô nhân giống cây trồng, trong nước dừa có nhiều các thành phần ñộc ñáo
của các loại ñường, vitamin, khoáng chất, axít amin và chất ñiều tiết sinh
trưởng. Các loại ñường có trong nước dừa như: saccaroza, glucoza, fructoza,
mannitol, sorbitol, myo-inositol, scyllo-inositol…; các vitamin như: C, B1,
B2, B3, B5, B6, folate, folic axít, biotin, niacin…; khoáng chất như: Ca, Fe,

Mg, P, K, Na, Zn, Cu, Mn, Se, Cl, S, Al ; Nhóm auxin có trong nước dừa
chủ yếu là indole-3-acetic acid 40 chiếm 150,6 nM; nhóm cytokinin có: N6-
isopentenyladenine chiếm 0,26 nM, dihydrozeatin chiếm 0,14 nM, trans-
zeatin chiếm 0,09 nM, kinetin chiếm 0,31 nM (Jean W.H. Yong và cộng sự,
2009).
* Dịch nghiền của khoai tây: Có chứa cacbonhydrat dưới dạng saccaroza,
glucose và fructose, amino axít (21 loại bao gồm cả lysine là một axít amin
thường không có trong protein thực vật), các muối khoáng (K, Fe, Mg…) và

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

11

ñặc biệt là các vitamin (C, B1, B6). Dịch nghiền khoai tây thường ñược bổ
sung vào môi trường vi nhân giống hoa lan và ñặc biệt có hiệu quả với một số
loài như: Phalaenopsis, Doritaenopsis (Thorpe và cộng sự, 2008).
+ Than hoạt tính: Bổ sung than hoạt tính vào trong môi trường nuôi cấy sẽ có
lợi ích và có tác dụng khử ñộc. Khi bổ sung than hoạt tính vào môi trường
nuôi cấy sẽ kích thích sự tăng trưởng. Than hoạt tính nói chung ảnh hưởng
trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất ñiều hòa sinh trưởng và các chất
làm ñen môi trường.
Người ta cho rằng tác dụng ngăn cản sự tăng trưởng của mô cấy khi có
sự hiện diện của than hoạt tính trong môi trường là do nó hút chất ñiều hòa
sinh trưởng có trong môi trường. NAA, kinetin, IAA, BAP, 2iP liên kết với
than hoạt tính. Khả năng kích thích sự tăng trưởng của than hoạt tính là do nó
kết hợp với các hợp chất phenol ñộc tiết ra trong thời gian nuôi cấy. Than
hoạt tính thường ñược bổ sung vào môi trường với nồng ñộ 0,5-3%, còn có ý
nghĩa kích thích sinh trưởng và phân hóa ở các loài hoa Lan.
Than hoạt tính cũng giúp làm giảm ñộc tố bằng cách ñào thải các hợp
chất ñộc (ví dụ: phenol) ñược tạo ra trong quá trình nuôi cấy và cho phép tế

bào sinh trưởng mà không bị trở ngại gì.
+ Chất làm ñông cứng môi trường: Agar (thạch) là một loại Polysacharid của
tảo có khả năng ngậm nước khá cao 6-12g/L. ðộ thoáng khí của môi trường
thạch có ảnh hưởng rõ rệt ñến sinh trưởng mô nuôi cấy. Nồng ñộ thạch dao
ñộng trong khoảng 6-10g/L tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy.
1.1.3.2. Các chất ñiều hoà sinh trưởng
Các Phytohormon là những chất có tác dụng ñiều hoà sinh trưởng và
phát triển của thực vật. Chúng ñóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh
trưởng và phát triển của thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngoài ra
còn có ảnh hưởng ñến quá trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác. Các

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

12

phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: Auxin, Cytokinin, Giberillin,
Ethylen, Abscisic axít. Chúng là yếu tố quan trọng nhất trong môi trường
quyết ñịnh ñến sự thành công của kết quả nuôi cấy.
+ Auxin: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3-Indol butyric acid),
IAA (Indol acetic acid), NAA (Nathyl acetic acid),… trong nuôi cấy mô thực
vật Auxin thường ñược sử dụng ñể kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ,
hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ (Nguyễn
Văn Uyển, 1993).
+ Cytokinin: ðược bổ sung vào môi trường chủ yếu ñể kích thích sự phân chia
tế bào và quyết ñịnh sự phân hoá chồi bất ñịnh từ mô sẹo và cơ quan. Các hợp
chất thường sử dụng là: Kinetin (6-Furfuryl aminopurine – C
10
H
9
NO

5
), BAP
(6-Benzyl amino purine), Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin… Trong các chất
này thì Kinetin và BAP ñược sử dụng phổ biến nhất vì chúng có hoạt tính cao
và giá thành rẻ. Ở nồng ñộ thấp (10
-7
- 10
-6
M) chúng có tác dụng kích thích sự
phân bào, ở nồng ñộ 10
-6
- 10
-5
M chúng kích thích sự phân hoá chồi. Trong
nuôi cấy mô ñể kích thích sự nhân nhanh người ta thường xử dụng Cytokinin
với nồng ñộ 10
-6
- 10
-4
M (Lê Văn Chi, 1992).
+ Gibberellin: Nhóm này có khoảng 20 loại hormone khác nhau nhưng quan
trọng nhất là GA
3
(Gibberellin acid 3). GA
3
có tác dụng kích thích nảy mầm
của các loại hạt khác nhau, kéo dài các lóng ñốt thân cành. Bên cạnh ñó GA
3

còn có tác dụng phá ngủ của các phôi, ức chế tạo rễ phụ cũng như tạo chồi

phụ (Street, 1974). Ngoài ra, có còn có tác dụng ảnh hưởng ñến sự ra hoa của
một số thực vật và có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trưởng sinh dưỡng của
cây.
+ Axít Abscisic (ABA): Là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên nhưng vẫn ñược
dùng trong nuôi cấy tế bào in vitro. ABA có ảnh hưởng âm tính ñến mô nuôi

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

13

cấy, khi ABA tương tác với BAP cho hệ số nhân chồi cao hơn khi dùng BAP
riêng rẽ (Lê Văn Chi, 1992).
+ Ethylen: Có biểu hiện tác ñộng hai chiều, nó kìm hãm sự hình thành chồi ở
giai ñoạn sớm nhưng lại kích thích sự phát triển chồi ở giai ñoạn muộn. Trong
một số trường hợp, Ethylen có tác dụng kích thích hình thành rễ nhưng một số
trường hợp nó lại kìm hãm quá trình này (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
Ngoài ra, cần phải chú ý tới ñộ pH của môi trường. ðộ pH thường ñược
sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung từ 5,6 - 6.
1.1.3.3. Môi trường vật lý
Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trường vật lý ñược quan
tâm ñó là ánh sáng, ñộ ẩm, nhiệt ñộ.
+ Ánh sáng: ðây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái
của các mô nuôi cấy. Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian
chiếu sáng, cường ñộ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng
có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Với ña số các
loài cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8-12h/ngày. Cường ñộ ánh sáng
ảnh hưởng ñến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy.
Cường ñộ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mô sẹo trong khi
cường ñộ thấp gây nên sự tạo chồi. Nhìn chung, cường ñộ ánh sáng thích hợp
cho mô nuôi cấy là từ 1000 - 7000 lux.

Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường ñộ ánh sáng thì chất lượng ánh
sáng cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Ánh
sáng ñỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh
sáng xanh thì ức chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh
trưởng của mô sẹo. Chính vì vậy mà trong phòng thí nghiệm thường sử dụng
ánh sáng của ñèn huỳnh quang với cường ñộ 2000 - 3000 lux.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

14

+ Nhiệt ñộ: Là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt ñến sự phân chia tế bào và các
quá trình trao ñổi chất của mô nuôi cấy, ñồng thời nó có ảnh hưởng tới sự
hoạt ñộng của auxin, do ñó làm ảnh hưởng ñến khả năng ra rễ của cây mô.
Theo kết quả nghiên cứu của Vonanorld (1982) thì nếu nhiệt ñộ ngày/ñêm là
20
0
C/15
0
C hoặc 20
0
C/18
0
C tỷ lệ ra rễ ñạt ñược khoảng 33%, thậm chí còn
thấp hơn. Ở nhiệt ñộ trung bình thì hoạt ñộng trao ñổi chất tốt hơn. Còn ở
nhiệt ñộ cao lại tạo nhiều tế bào không có tổ chức. Trong nuôi cấy mô, nhiệt
ñộ thường ñược duy trì ổn ñịnh, ban ngày từ 25 - 30
0
C và ban ñêm từ 17 -
20

0
C.
+ ðộ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì ñộ ẩm tương ñối luôn bằng 100% ñể
ñảm bảo sự phát sinh phát triển bình thường của cây nuôi cấy mô.
1.1.3.4. Vật liệu nuôi cấy
Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy quyết ñịnh ñến sự thành bại của quá
trình nhân giống in vitro. Về nguyên tắc thì mọi tế bào của các mô chuyên
hoá ñều có tính toàn năng, nghĩa là ñều có thể nuôi cấy thành công. Thực tế
cho thấy các loài tế bào và các loại mô khác nhau có mức ñộ nuôi cấy thành
công khác nhau. Một nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào là các tế
bào làm vật liệu nuôi cấy càng non thì khả năng nuôi cấy thành công càng
cao. Như vậy, tế bào và mô phôi non là triển vọng nhất, rồi ñến các tế bào của
ñỉnh sinh trưởng như: mô phân sinh ñỉnh ngọn, ñầu rễ, lá non, tượng tầng…
sau ñó là các tế bào sinh dục như noãn bào và tế bào hạt phấn ở giai ñoạn non
(Nguyễn ðức Thành, 2000); (Nguyễn Quang Thạch, 1995).
1.1.3.5. ðiều kiện vô trùng
ðây là ñiều kiện cơ bản ñầu tiên quyết ñịnh sự thành bại của quá trình
nuôi cấy in vitro. Nếu ñiều kiện này không ñược ñảm bảo thì mẫu nuôi cấy
hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai