Đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan lên một số loại cây trồng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC



NGUYỄN TIẾN BƯỚC



ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG
CỦA VI KHUẨN PHÂN GIẢI PHOSPHATE
KHÓ TAN LÊN MỘT SỐ LOẠI CÂY TRỒNG



LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC




THÁI NGUYÊN - 2014
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC



NGUYỄN TIẾN BƯỚC



ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG

CỦA VI KHUẨN PHÂN GIẢI PHOSPHATE
KHÓ TAN LÊN MỘT SỐ LOẠI CÂY TRỒNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC


Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Tăng Thị Chính


THÁI NGUYÊN - 2014


i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của chúng tôi dưới
sự hướng dẫn của PGS. TS. Tăng Thị Chính, sự giúp đỡ của các cán bộ phòng Vi
Sinh Vật Môi Trường - Viện Công Nghệ Môi Trường - Viện Hàn Lâm Khoa học và
Công Nghệ Việt Nam. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa
được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về những số liệu trong luận văn này.
Thái Nguyên, ngày 19 tháng 05 năm 2014
Tác giả luận văn


Nguyễn Tiến Bước

ii
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập tại Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái
Nguyên cũng như thời gian thực tập tại Phòng Vi sinh vật Môi Trường - Viện
Công Nghệ Môi Trường - Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, tôi
đã được trang bị một số kiến thức và kinh nghiệm thực tế giúp tôi hoàn thành
luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cám ơn những tập thể và cá nhân đã giúp
đỡ tôi hoàn thành luận văn của mình.
Tôi xin chân thành cám ơn PGS.TS. Tăng Thị Chính - Trưởng phòng Vi sinh
vật Môi Trường - Viện Công Nghệ Môi Trường - Viện Hàn Lâm Khoa Học và
Công Nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu và tạo điều kiện thuận lợi nhất
cho tôi thực hiện đề tài luận văn.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Th.S. Đặng Thị Mai Anh và các anh chị
cán bộ Phòng Vi sinh vật Môi Trường - Viện Công Nghệ Môi Trường - Viện Hàn
Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực
tập hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh cùng các thầy cô giáo
Khoa Khoa học Sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã luôn quan
tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè những
người đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và
thực hiện đề tài luận văn.
Thái Nguyên, ngày 19 tháng 05 năm 2014
Tác giả luận văn


Nguyễn Tiến Bước

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i
L Ờ I CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN vi
DANH MỤC BẢNG vii
DANH MỤC HÌNH viii
MỞ ĐẦU 1
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Khái quát về photpho đối với cây trồng 3
1.2. Ảnh hưởng của photpho đối với sinh trưởng và phát triển của cây trồng 3
1.3. Nguồn dinh dưỡng cho cây trồng từ phosphate 3
1.4. Sự tồn tại của phosphate trong đất 4
1.4.1. Phosphate hữu cơ 4
1.4.2. Phosphate vô cơ 5
1.4.3. Vòng tuần hoàn của phosphate trong tự nhiên 6
1.5. Vai trò của vi sinh vật phân giải phosphate khó tan 9
1.5.1. Vi sinh vật phân giải phosphate khó tan 9
1.5.2. Ảnh hưởng của vi sinh vật phân giải phosphate lên phân bón 12
1.6. Hiệu quả của phân vi sinh vật phân giải phosphate 14
1.7. Quá trình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật phân giải phosphate 14
1.7.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật phân giải phosphate trên thế
giới 14
1.7.2. Ứng dụng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan để sản xuất phân vi sinh

trên thế giới 16


iv
1.7.3. Ứng dụng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan sản xuất phân vi sinh ở
Việt Nam 18
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. Vật liệu nghiên cứu 20
2.2. Thiết bị (Phụ lục) 20
2.3. Môi trường (Phụ lục) 20
2.4. Hóa chất 20
2.4.1. Các hóa chất chung 20
2.4.2. Dung dịch phân tích 20
2.5. Phương pháp phân tích vi sinh vật 21
2.5.1. Phương pháp lấy mẫu đất 21
2.5.2. Phương pháp pha loãng 21
2.5.3. Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật 22
2.6. Phương pháp phân tích hóa học 22
2.6.1. Phương pháp phân tích P tổng số trong đất 22
2.6.2. Phương pháp phân tích phosphate dễ tiêu trong đất (Phương pháp Olsen) 25
2.6.3. Phương pháp xác định độ ẩm và hệ số khô kiệt 27
2.7. Bố trí thí nghiệm 28
2.7.1. Bố trí thí nghiệm trong phòng thí nghiệm 28
2.7.2. Thực hiện bố trí thí nghiệm trên quy mô đồng ruộng 29
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30
3.1. Kết quả ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan đối với cây trồng
đỗ xanh trong phòng thí nghiệm 30
3.1.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan đối với hàm lượng
photpho tổng số và photpho dễ tiêu trong đất 30
3.1.2. Ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan lên các vi sinh vật trong

đất 32
3.1.3. Đánh giá tác động của VSV phân giải phosphate khó tan lên sinh trưởng
chiều cao, chiều dài rễ và sinh khối của cây đỗ xanh 34


v
3.2. Kết quả ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan đối với cây trồng
ngoài thực địa 37
3.2.1. Ảnh hưởng của vi sinh vật phân giải phosphate khó tan đối với cây Ngô 37
3.2.2. Ảnh hưởng của VSV phân giải phosphate khó tan đối với cây rau bắp cải
42
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47
1. Kết luận 47
2. Đề nghị 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
PHỤ LỤC 52


vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

TT Chữ viết tắt Nội dung
1 CFU/ml Clony Forming Unit
2 CFU/g Colony Forming Unit
3 ĐC(-) Đối chứng âm
4 ĐC(+) Đối chứng dương
5 HCVS Phân hữu cơ vi sinh
6 MPA Meat pepton agar
7 N Nitơ
8 NPK Nitơ - Photpho - Kali

9 P Photpho
10 PGL Phân giải lân
11 PTN Phòng thí ngiệm
12 TN Thí nghiệm
13 VK Vi khuẩn
14 VSV Vi sinh vật





vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các VSV có khả năng phân giải các nguồn phosphate khó tan
khác nhau 11
Bảng 2.1. Nồng độ dung dịch tiêu chuẩn ppm P để xây dựng đường chuẩn P
tổng số 23
Bảng 2.2. Nồng độ dung dịch tiêu chuẩn ppm P để xây dựng đường chuẩn P
dễ tiêu 25
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm quy mô phòng thí nghiệm 28
Bảng 2.4. Bố trí thi nghiệm quy mô đồng ruộng 29
Bảng 3.1. Mật độ VSV phân giải phosphate và VSV tổng số hiếu khí ở các mẫu
đất trồng cây đỗ xanh 33
Bảng 3.2. Chiều cao sinh trưởng của cây đỗ xanh phòng thí nghiệm theo thời gian 34
Bảng 3.3. Khối lượng và chiều dài của rễ cây đậu xanh 35
Bảng 3.4. Kết quả mật độ vi sinh phân giải phosphate và vi sinh vật tổng số trong
đất trồng ngô 40
Bảng 3.5. Kết quả mật độ vi sinh vật phân giải phosphate khó tan và VSV tổng
số trong đất trồng rau bắp cải 45

viii
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Quá trình chuyển hóa P trong hệ sinh thái 8
Hình 1.2. Chu trình chuyển hóa P trong đất 8
Hình 1.3. Chu trình P trong tự nhiên 8
Hình 1.4. Các VSV phân giải phosphate 10
Hình 1.5. Một số vi khuẩn Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Agrobacterium 13
Hình 1.6. Vi khuẩn Streptomyces 13
Hình 2.1. Phương pháp lấy mẫu đất 21
Hình 2.2. Đồ thị đường chuẩn thể hiện mỗi tương quan giữa P tổng số (mg/ml)
với OD
882
23
Hình 2.3. Đồ thị đường chuẩn thể hiện mỗi tương quan giữa P dễ tiêu (mg/ml)
với OD
882
26
Hình 3.1. Hàm lượng photpho tổng số trong mẫu đất trồng cây đỗ xanh 30
Hình 3.2. Hàm lượng photpho dễ tiêu trong các mẫu đất trồng cây đỗ xanh 31
Hình 3.3. Đồ thị mô tả sự tăng trưởng chiều cao của cây đỗ xanh trong các mẫu
thí nghiệm 34
Hình 3.4. Biều đồ mô tả khối lượng và chiều dài rễ cây đỗ xanh 35
Hình 3.5. Ảnh chụp quả đỗ xanh thu hoạch ngày cuối ở quy mô phòng thí nghiệm 36
Hình 3.6. Tỷ lệ quả chắc, khối lượng quả chắc và năng suất quả của cây đỗ xanh 36
Hình 3.7. Ảnh hưởng của VK phân giải phosphate lên hàm lượng P tổng số trong
đất trồng cây ngô 38
Hình 3.8. Ảnh hưởng của VK phân giải phosphate khó tan lên hàm lượng P dễ

tiêu trong đất trồng ngô 39
Hình 3.9. Hình ảnh cây ngô ở quy mô ngoài đồng ruộng 41
Hình 3.10. Ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan và mùn hữu cơ
từ rác thải sinh hoạt lên năng suất của cây ngô 41
Hình 3.11. Kết quả phân tích hàm lượng photpho tổng số trong mẫu đất trồng cây
rau bắp cải 43
Hình 3.12. Kết quả phân tích hàm lượng photpho dễ tiêu 44
Hình 3.13. Ảnh hưởng của VK phân giải P lên sự phát triển sinh khối và rễ của
cây rau bắp cải 46



1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Phospho (P) là một trong những nguyên tố đóng vai trò quan trọng trong quá
trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Nó là một trong những thành phần
chính cấu tạo nên tế bào thực vật bao gồm axit nucleic, phospholipid, coenzyme,
đường phosphoryl, nucleotide và phytate. P có vai trò quan trọng trong nhiều quá
trình trao đổi chất liên quan đến sinh trưởng và phát triển của cây [8]. Nhưng trong
đất P thường tồn tại ở các dạng muối phosphate khó tan mà cây trồng không thể hấp
thụ được. P tồn tại trong đất dưới dạng hợp chất hữu cơ và hợp chất vô cơ. Tỉ lệ của
hai dạng này là khác nhau ở các loại đất, thường xấp xỉ 2/3 là P vô cơ, phần còn lại
là P hữu cơ [3].
Xuất phát từ thực tế nước ta có trữ lượng P rất lớn. Chúng ta đã sản xuất
được một số loại phân hóa học có chất lượng tốt. Tuy nhiên, việc lạm dụng phân
hóa học kéo theo nhiều nguy hại cho môi trường, đất bị bạc màu, cạn kiệt chất dinh
dưỡng. Do đó, sử dụng phân bón vi sinh thay thế một phần phân hóa học là giải
pháp tốt hướng tới một nền nông nghiệp sạch và bền vững sinh thái [8].
Để đáp ứng yêu cầu ngày càng cao của nông nghiệp và để góp phần nâng

cao hiệu quả sử dụng phân bón hóa học, từ những năm đầu thế kỉ XX nhiều
nước trên thế giới đã và đang làm quen với việc sử dụng phân bón VSV thay
thế một phần phân bón hóa học [2]. Việc sử dụng phân bón vi sinh tận dụng
được nguồn P có sẵn trong đất, nâng cao hiệu quả của nguồn P đã bón, đáp ứng
một phần nhu cầu của P đối với cây trồng. Thông qua hoạt động của VSV mà P
cũng như các nguyên tố khác tồn tại trong đất được chuyển biến từ dạng khó
hấp thụ sang dễ hấp thụ cho cây trồng. Chính VSV có ý nghĩa quyết định trong
việc tạo năng suất cây trồng [33].
VSV tham gia vào quá trình chuyển hóa P khó tiêu để cung cấp cho cây từ
nguồn P khó tiêu sẵn có trong đất. VSV phân giải phosphate khó tiêu phân bố rộng
rãi trong đất đặc biệt là vùng rễ [3].


2
Nhiều VSV có khả năng phân giải Ca
3
(PO
4
)
2
, AlPO
4
, FePO
4
, hydroxy apatit
và quặng phosphate [17]. Những VSV này gồm VK và nấm men. VSV phân giải P
được phân lập từ đất, rễ cây, nốt sần của cây họ đậu, phân trộn và quặng P [2]
Để giữ được độ phì nhiêu bền vững của đất, đảm bảo được năng suất cây
trồng, cần thiết phải sử dụng một cách hợp lý giữa phân vô cơ, hữu cơ và phân vi
sinh, kết hợp với hệ thống trồng trọt đa dạng thích hợp với môi trường [2].

Phân vi sinh là chế phẩm có chứa các VSV sống có hoạt lực cao đã được tuyển
chọn. Thông qua các hoạt động trao đổi chất chúng tạo ra các chất dinh dưỡng cho đất
và cây trồng. Để đảm bảo lượng phân vi sinh cần có sự kiểm tra chặt chẽ, thường
xuyên về mật độ cũng như chất lượng của chủng VSV hữu ích có trong phân bón để
tránh gây lãng phí, thiệt hại cho người tiêu dùng [2], [4]. Sử dụng chế phẩm VSV
thường tăng năng suất cho cây trồng, đồng thời có thể tiết kiệm lượng phân hóa học
đáng kể, góp phần tạo sản phẩm sạch cho nông nghiệp và bảo vệ môi trường [13], [17].
Việc đánh giá được mức độ ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó
tan làm cho đất có độ phì nhiêu cao và cây trồng đạt năng suất cao. Trên cơ sở lý
luận và thực tiễn của hướng nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan lên một số loại
cây trồng”
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tuyển chọn được chủng có khả năng phân giải phosphate khó tan cao phục
vụ cho sản xuất phân hữu cơ vi sinh
3. Nội dung nghiên cứu
Đề tài được thực hiện với các nội dung sau:
Đánh giá mật độ vi sinh vật phân giải phosphate trong đất trồng đỗ xanh
trong phòng thí nghiệm và mật độ vi sinh vật trong đất trồng ngô và rau bắp cải ở
ngoài đồng ruộng.
Phân tích hàm lượng P tổng số và P dễ tiêu trong đất trồng đỗ xanh phòng thí
nghiệm và đất trồng ngô, đất trồng rau bắp cải ngoài đồng ruộng.
Đánh giá ảnh hưởng của vi sinh vật lên năng suất cây trồng.



3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về photpho đối với cây trồng

Nguyên tố P được Brandt phát hiện đầu tiên vào năm 1669, sau đó
Lippic - tác giả của học thuyết chất khoáng, là người đầu tiên thấy được sự cần
thiết của P đối với cây trồng. Tuy nhiên, phải đến những năm 40 của thế kỉ XIX
những bằng chứng thực sự về sự cần thiết của P đối với cây trồng mới được
Gortmare đưa ra [16].
P là chất dinh dưỡng cần thiết cho thực vật đứng thứ hai sau nitơ (N). Nó là
một trong những thành phần chính cấu tạo nên tế bào thực vật bao gồm axit nucleic,
phospholipid, coenzyme, đường phosphoryl, nucleotide và phytate. Nó liên quan
đến sự biến đổi năng lượng trong cây và những cơ thể khác và là một thành phần
quan trọng của vật liệu di truyền. P có vai trò quan trọng trong nhiều quá trình trao
đổi chất liên quan đến sinh trưởng và phát triển của cây. Việc cung cấp nguyên tố
này cho cây là cần thiết để thu được năng suất mùa màng tối ưu [8], [27].
1.2. Ảnh hưởng của photpho đối với sinh trưởng và phát triển của cây trồng
Do P có vai trò quan trọng đối với thực vật như vậy, cho nên việc cung cấp P
cho cây ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển bình thường của cây trồng.
Khi cây đủ P: sẽ tăng cường sự phát triển của bộ rễ, kích thích sự tạo nốt sần
ở cây bộ đậu, làm tăng cường phẩm chất nông sản, giúp cho hạt giống nảy mầm
nhanh và có sức sống cao. Ngoài ra, P còn làm cho cây mau chín, rút ngắn thời gian
sinh trưởng, tăng khả năng chịu rét và tăng tỷ lệ hạt [5].
Khi cây thiếu P: sẽ làm cho cây lúa có đặc điểm lá mềm yếu, rễ kém phát
triển và cây sinh trưởng kém, khả năng đẻ nhánh và phân cành kém, lá có màu xanh
đậm, có ảnh hưởng lớn đến sự hình thành quả và hạt. Ngoài ra khi thiếu P còn hạn
chế hình thành nốt sần của cây bộ đậu [2].
1.3. Nguồn dinh dưỡng cho cây trồng từ phosphate
Có ba dạng axit phosphoric quan trọng đối với dinh dưỡng cây trồng đó là:
metaphosphoric, pyrophosphoric và octophosphoric. Cả ba loại này được tạo thành
bằng con đường hóa học anhydriophosphoric với số lượng khác nhau.


4

P
2
O
5
+ H
2
O = 2HPO
3
Metaphosphoric
HPO
3
+ H
2
O = H
3
PO
4
ortophosphoric
2H
3
PO
4
= H
4
P
2
O
7
+ 2 H
2

O Pyrophosphoric
Trong cả ba nguồn trên thì muối của octophosphoric là nguồn dinh dưỡng
chính cho cây trồng. Ngoài ra, một ít muối của pyrophosphoric cũng được cây
trồng sử dụng. Sự hấp thụ P phụ thuộc vào pH môi trường. Theo Woodbrodge,
cây hấp thụ P cao nhất ở pH = 4 - 6, ở pH = 7 thu được lượng cân bằng H
2
PO
4
-

và HPO
4
2-
, ở pH < 7 hầu như thu được H
2
PO
4
-
, còn ở pH cao hơn thì thu nhận
được ion H
2
PO
4
-
[32], [38].
1.4. Sự tồn tại của phosphate trong đất
Hàm lượng P trong vỏ trái đất tính theo khối lượng là 0,8%. P dễ bị oxi hóa
nên không tồn tại ở trạng thái tự do. P là tài nguyên thiên nhiên không tái tạo và P
tồn tại trong đất (chiếm 0,02 - 0,2% tùy theo từng loại đất) có nguồn gốc từ các
khoáng chất chứa P như apatit, phosphorit, vivianit…hoặc cũng có thể có nguồn

gốc từ sự phân hủy xác chết của sinh vật. Tùy vào nguồn gốc và quá trình tạo thành
mà hàm lượng P trong các loại đất, các tầng đất khác nhau là khác nhau [9].
P trong đất cung cấp cho cây qua đất, phân phosphate vô cơ, phân chuồng
động vật, các chất thải nông nghiệp, xác động thực vật cũng như VSV, rác thải hữu
cơ, rác thải sinh hoạt và quặng phosphate [21], [26].
Trong tự nhiên nói chung và trong đất nói riêng, P tồn tại ở hai dạng chủ yếu
là P hữu cơ và P vô cơ. Tỉ lệ của hai dạng này là khác nhau ở các loại đất, thường
xấp xỉ 2/3 là P vô cơ, phần còn lại là P hữu cơ [3].
1.4.1. Phosphate hữu cơ
Tùy theo loại đất, tỷ lệ P hữu cơ thường chiếm từ 20 - 80% P tổng số trong
đất. Ở lớp đất mặt, P chiếm khoảng 50%. Những nhóm hợp chất P hữu cơ tồn tại
trong đất gồm: phospholipid, axit nucleic, inositol phosphate, nucleoprotein và
phytate [12].
P hữu cơ chuyển sang phosphate vô cơ bởi quá trình khoáng hóa nhờ VSV.
VSV phân hủy những hợp chất này và tạo ra P dễ tiêu cho cây trồng dưới dạng axit
phosphoric và muối dễ tan của nó [29], [32]. Nhưng các dạng lân này lại bị đất hấp


5
phụ và VSV hút lại, nên trong đất có rất ít phosphate ở dạng hòa tan. Nhiều tác giả
nghiên cứu cho rằng: nếu chất hữu cơ vùi trong đất là chất hữu cơ nghèo phosphate
thì qua quá trình phân giải hàm lượng P hữu cơ trong đất không tăng mà còn giảm
xuống [10].
Theo những công trình nghiên cứu của Kalia (1954): nếu chất hữu cơ vùi
xuống đất chứa ít hơn 0,2 - 0,3% P
2
O
5
thì quá trình phân giải không tăng thêm
lượng phosphate dễ tan cho cây vì VSV sẽ hút hết. Cường độ hút P hữu cơ của đất

thông qua sự phân giải của VSV phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ. Theo Sepfe -
Satsaben (1960) trong điều kiện nhiệt độ bình thường, ở các nước ôn đới, sự khoáng
hóa P hữu cơ diễn ra rất chậm và lượng P cung cấp cho cây từ những hợp chất hữu
cơ là không đáng kể. Trái lại, ở nhiệt độ từ 35 - 50
0
C thì quá trình khoáng hóa tăng
lên rất mạnh và cung cấp cho cây được nhiều P từ những hợp chất hữu cơ. Vì thế, ở
nước ta bón phân chuồng cũng là giải pháp cung cấp P cho cây trồng [10].
1.4.2. Phosphate vô cơ
P vô cơ chiếm khoảng 2/3 so với P hữu cơ trên P tổng số. P vô cơ ở trong đất
là các hợp chất khác nhau của axit phosphoric do vậy tùy thuộc vào loại đất mà xuất
hiện các hợp chất của axit phosphoric khác nhau. Theo khả năng hòa tan, P vô cơ
trong đất được chia thành 3 dạng chính [12]:
P không tan: chiếm phần lớn, hầu như không tan trong nước hoặc muối trung
tính, thực vật không sử dụng được ở dạng này. Đó là các loại apatit Ca
5
(PO
4
)
3
(F,
Cl, OH), các muối sắt nhôm FePO
4
, AlPO
4
, FePO
4
-nH
2
O, AlPO

4
-nH
2
O và
phosphate của kim loại kiềm thổ trong đất trung tính hoặc kiềm Ca
3
(PO
4
)
2
,
Mg
3
(PO
4
)
2
.
P tan trong axit yếu: loại này thực vật có thể sử dụng được nhưng chậm.
Trong đất thường gặp ở dạng CaHPO
4
, MgHPO
4
nhất là trong đất chua nhẹ và đất
trung tính.
P tan trong nước: thường gặp là những P tan như K
2
HPO
4
, NaH

2
PO
4
,
KH
2
PO
4
, Ca(H
2
PO
4
)
2
, Mg(H
2
PO
4
)
2
… Thực vật sử dụng P ở dạng này là tốt nhất
nhưng hàm lượng của chúng trong đất rất thấp và không ổn định, dễ biến thành 2
dạng trên.


6
Sự tồn tại của ion phosphate trong môi trường đất bị chi phối bởi ion
phosphate chuyển đổi hóa trị [10].
Môi trường chua: H
2

PO
4
-
→ HPO
4
2-
→ PO
4
3-

Trong thực tế, H
2
PO
4
-
là dạng cây trồng dễ hấp thụ nhất. Các dạng phosphate
còn lại thường là những dạng khó tan mà cây trồng không thể đồng hóa được, muốn
cây trồng sử dụng được phải qua quá trình biến đổi thành dạng dễ tan. Dưới tác
dụng của VSV, P hữu cơ được vô cơ hóa biến thành các dạng muối của axit
phosphoric. Các dạng P này một phần được cây trồng sử dụng biến thành dạng P
hữu cơ, một phần bị cố định dưới dạng khó tan như Ca
3
(PO
4
)
2
, FePO
4
, AlPO
4

.
Những dạng khó tan này trong các môi trường có pH thích hợp sẽ chuyển thành
dạng dễ tan. Trong quá trình này, VSV đóng vai trò quan trọng [10].
1.4.3. Vòng tuần hoàn của phosphate trong tự nhiên
Trong tự nhiên vật chất chuyển động theo một vòng tuần hoàn gọi là chu trình
sinh địa hóa. Như các nguyên tố hóa học có vai trò quan trọng trong tự nhiên: C, H,
O, N, … thì P cũng chuyển động theo một chu trình sinh địa hóa nhưng chu trình của
nó rất đặc biệt đó là không có sự chuyển hóa sang pha khí. Vòng tuần hoàn của P
không giống vòng tuần hoàn của nitơ. Trong khi nitơ luôn khan hiếm trong đất thì P
tồn tại nhiều trong đất ở dạng khó phân giải [27], [35]. Nitơ được đưa vào đất nhờ
VSV cố định đạm từ không khí, còn đối với P chúng được các VSV phân giải từ các
nguồn P vô cơ và hữu cơ khác nhau. P dự trữ chủ yếu trong sinh quyển đặc biệt là ở
lớp vỏ của Trái đất và với các điều kiện thời tiết khác nhau thì nó phân tán dưới các
dạng phosphate. Sau đó, P thấm vào đất và thực vật hấp thụ P thông qua rễ của
chúng. Thực vật lại bị động vật ăn thực vật tiêu thụ. Động vật ăn thịt lại thu nhận P
thông qua việc ăn thịt động vật ăn cỏ… P trở thành các hợp chất hữu cơ trong cơ thể
sống. Trong cơ thể động vật, P là thành phần cấu tạo của xương, của các liên kết, các
enzyme… Sau đó, khi động vật phát thải (nước tiểu và phân) hoặc chết đi thì P hữu
cơ được chuyển trở lại môi trường đất, nước. Khi trả lại đất, P hữu cơ này được giải
phóng thành P vô cơ hoặc tạo thành vật liệu hữu cơ đất bền vững hơn. Sự giải phóng
P vô cơ từ P hữu cơ gọi là sự khoáng hóa và nhờ VSV phá vỡ những hợp chất hữu cơ
phosphorit thành những dạng vô cơ dễ tiêu. Vì vậy, thực vật lại có thể sử dụng lại
tiếp, cứ lặp đi lặp lại như thế tạo thành một chu trình [5].


7
Một phần P đi vào chu trình nước trong đại dương. Mưa làm P trong đất bị
hòa tan vào nước chảy qua sông, suối rồi ra biển. Một phần P được sử dụng bởi sinh
vật phù du dưới đại dương. Cá, tôm ăn phù du lại trả lại cho động vật ăn cá và cuối
cùng lại trả lại P cho môi trường đất. Một nguyên tử P nhỏ có thể quay vòng qua

chu trình nước và các sinh vật sống dưới nước trung bình xấp xỉ 100.000 năm cho
đến khi nó cuối cùng nghỉ ngơi dưới đáy đại dương trong thành các trầm tích [8].
P có thể ở lại bên trong trầm tích hơn 100 triệu năm và trái với chu trình
carbon và nitơ, P không lọc qua bầu khí quyển của Trái đất. Chu trình P lần lượt là
một chu trình trầm tích. P trong các đại dương và trầm tích sông được nâng lên bởi
các thành phần bên ngoài địa chất và có thể lại trở lại bề mặt trái đất một lần nữa. Mọi
thứ cứ quay vòng như thế tạo chu trình to nhỏ [8].
Tác động của con người đã làm thay đổi rất lớn tới chu trình P trong tự
nhiên thông qua các hoạt động như khai thác mỏ, các hoạt động nông nghiệp:
trồng cây và bón phân (đặc biệt là các sản phẩm phân bón hóa học). Trong phân
bón có chứa một lượng lớn P. Lượng P khi sử dụng sẽ đi vào chu trình P thông
qua các con đường khác nhau. Nguồn phosphate làm phân bón được khai thác từ
quặng apatit chứa chủ yếu là canxi phosphate. Trong quá trình sản xuất phân bón
super phosphate, axit sulfuric giúp chuyển hóa đá chứa phosphate thành phân
bón. Hàng năm, P trả lại cho chu trình đại sinh thái là 60.000 tấn. Trong khi đó
đầu vào của chu trình là khoảng 2.000.000 tấn (qua phân bón). Thực vật không
hấp thu hoàn toàn lượng phân bón phosphate sử dụng chứng tỏ lượng hao hụt
qua chu trình là khá lớn, một lượng lớn còn lại bị rửa trôi vào nguồn nước và
tích tụ ở nền đáy ao hồ gây ô nhiễm nguồn nước. P bổ sung quá nhiều không chỉ
gây ảnh hưởng tới môi trường nước mà còn có thể làm tăng sự phát triển của
sinh vật (ví dụ hiện tượng phú dưỡng gây hiện tượng tảo nở hoa) và làm thay đổi
sự cân bằng sinh vật trong các hệ sinh thái [1], [8].
Dưới đây là sơ đồ tóm tắt chu trình tuần hoàn của P giúp ta hiểu phần nào về
chu trình này thông qua cả 2 chu trình P trong nước, chu trình P trong đất và tác
động của con người tới chu trình [41].


8

Hình 1.1. Quá trình chuyển hóa P trong hệ sinh thái [41]

Hình 1.2. Chu trình chuyển hóa P trong đất [41]

Hình 1.3. Chu trình P trong tự nhiên [41]


9
Trong đề tài này, chúng ta quan tâm tới chu trình P ở trong đất và vai trò của
VSV trong chu trình chuyển hóa. Trong đó, VSV phân giải phosphate có vai trò đặc
biệt quan trọng trong chu trình chuyển hóa P ở trong đất. P được giữ lại trong đất
dưới dạng các hợp chất khó tan và chỉ được trả lại cho đất dưới dạng dễ tan nhờ vào
sự chuyển hóa của VSV phân giải phosphate [26].
Trong tự nhiên sự chuyển hóa P xảy ra dưới tác dụng của 2 quá trình chính:
- Chuyển hóa hóa học là quá trình xảy ra các hoạt động phong hóa của đất.
- Chuyển hóa sinh học là quá trình chu chuyển của P xảy ra dưới tác dụng
của các nhân tố sinh học.
Trong vòng tuần hoàn P thì quá trình sinh học chiếm ưu thế và quá trình
này VSV đóng vai trò quan trọng, giúp chuyển P khó tan thành dễ tan đối với
cây trồng. P tích lũy ở động, thực vật và VSV được cố định một cách tạm thời,
khi tế bào chết nó trở thành nguồn P hữu cơ, được giải phóng vào đất và cung
cấp trở lại cho thực vật nhờ các VSV đất. VSV đất phân giải phosphate khó tan,
khoáng hóa các hợp chất P hữu cơ thành dạng vô cơ (octophosphate) để cung
cấp cho sinh trưởng và phát triển của cây. Thực vật lại trở thành thức ăn của
động vật và chu trình P lại lặp lại [18].
1.5. Vai trò của vi sinh vật phân giải phosphate khó tan
1.5.1. Vi sinh vật phân giải phosphate khó tan
VSV phân giải hợp chất phosphate khó tan là những VSV, thông qua hoạt
động của chúng, với các hợp chất P khó tan được chuyển hoá thành dễ tan đối
với cây trồng. VSV phân giải phosphate khó tan tạo vòng tròn trong suốt bao
quanh khuẩn lạc (vòng phân giải) trên môi trường chứa nguồn P duy nhất là

Ca
3
(PO
4
) hoặc lexitin [11].
Các vi sinh vật phân giải phosphate khó tan được biết đến nay là các
loài: Pseudomonas, Micrococus, Bacillus, Flavobacterium, Penicillium, Sclelotium,
Aspergillus. Các VSV này không chỉ phân giải phosphate canxi, phosphate nhôm,
sắt, mangan và kể cả quặng. VSV không chỉ chuyển hóa phosphate vô cơ, mà còn
có khả năng khoáng hóa các hợp chất lân hữu cơ tạo ra sản phẩm mà cây trồng có
thể hấp thu được [36].


10


Hình 1.4. Các VSV phân giải phosphate [36]
VSV phân giải P khó tan phân bố rộng rãi trong các tầng đất và đặc biệt ở
vùng rễ, các loại rễ khác nhau thì khác nhau (các VSV này có thể ở trong rễ, bề mặt
rễ, đất vùng rễ và đất không phải vùng rễ). Đồng thời số lượng VSV phân giải P
cũng thay đổi theo điều kiện khí hậu và lịch sử của đất, phụ thuộc vào chất đất, chế
độ canh tác, loại cây trồng, mùa vụ và tuổi của cây… [20].
Theo Jayandra và cộng sự đã tổng kết: “Sự xuất hiện của VSV phân giải
phosphate trong rễ cây là cao nhất sau đó là đất quanh rễ. Tới nửa số VSV đất được
kiểm tra có khả năng hòa tan Ca
3
(PO
4
)
2

. Số lượng VK hòa tan P vô cơ khó tan có thể
tới 10
6
CFU/gam đất. Vì vậy, VSV không chỉ đồng hóa P mà còn hòa tan một lượng
lớn vượt quá nhu cầu dinh dưỡng của chúng” [31].
Nhiều VSV có khả năng phân giải Ca
3
(PO
4
)
2
, AlPO
4
, FePO
4
, hydroxyl apatit
và quặng phosphate. Những VSV này gồm VK, xạ khuẩn, vi nấm, nấm men cũng
như tảo. Chúng được phân lập từ các nguồn khác nhau. Số lượng các loài phụ thuộc
vào nguồn carbon, nitơ, dạng P khó tan, pH, nhiệt độ…[4].
Ngày nay, danh sách các VSV có khả năng phân giải các nguồn P khó tan
khác nhau đã được công bố [34].


11
Bảng 1.1. Các VSV có khả năng phân giải
các nguồn phosphate khó tan khác nhau [34]
Các VSV có khả năng phân giải
nguồn P khó tiêu
Nguồn phosphate khó tiêu
Vi khuẩn

Achromobacter spp
Bacillus sp, B.pulvifacien, B.criculans,
B.subtilis, B.mycoides, B.mesenteries,
B.fluorescence, B.megaterium.
Pseudomonas sp, P.putida, P.culcis,
P.rathonia, P.liquifaciens.
Escherichia freundii, E.intermedia
Xanthomonas spp
Flarobacterium spp
Brevibacterium spp
Serratia spp
Alcaligenes spp
Aerobacter acrogens
Erwinia spp
Nitrosomonas spp
Thiobaccillus thiooxidans

Xạ khuẩn
Micromonospora sp
Nocardia sp
Streptomyces sp
Chất khoáng
Phytate
Tricanxi phosphate
Canxi phosphate
Sắt phosphate
Hydroxyapatit

Fluorapatit
Quặng phosphate

Chất hữu cơ
Canxi phytate
Canxi
Glyxero phosphate
Lectithin
Hexose
Mono phosphate
Este
Các phosphate hữu cơ khác…

Qua bảng 1.1 cho thấy các VSV phân giải phosphate thuộc nhiều nhóm khác
nhau bao gồm: VK, nấm và xạ khuẩn. Chúng được phân lập từ các nguồn khác
nhau. Số lượng các loài trong đất phụ thuộc vào nguồn C, N, dạng P khó tan, pH,
nhiệt độ


12
VSV phân giải P khó tan chia thành hai nhóm chính: VSV phân giải P hữu
cơ và VSV phân giải P vô cơ [37].
VSV phân giải P hữu cơ chủ yếu gồm các chi Bacillus và Pseudomonas. Ngoài ra
còn có một số xạ khuẩn và nấm khác. Đáng chú ý là B. megaterium var phosphatsum có
khả năng phân giải P hữu cơ cao [10]. Đồng thời B. megaterium còn có khả năng hình
thành bào tử có sức sống rất mạnh [10].
Nhiều VK như Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus butyricus,
Pseudomonas fluorescens, VK nitrat hóa, xạ khuẩn có khả năng phân giải
Ca
3
(PO
4
)

2
và bột apatit. Khả năng phân giải P vô cơ liên quan mật thiết tới sự sản
sinh axit của VSV. Quá trình lên men tạo ra axit carbonic, là axit chủ yếu thúc đẩy
quá trình hòa tan P vô cơ [10].
Ca
3
(PO
4
)
2
+ H
2
CO
3
+ H
2
O → Ca(PO
4
)
2
H
2
O + Ca(HCO
3
)
2

Trong đất, VK nitrat hóa và VK chuyển hóa lưu huỳnh cũng có tác dụng
quan trọng trong việc phân giải Ca
3

(PO
4
)
2
. Vì trong quá trình sống các VK này
tích lũy trong đất HNO
3
và H
2
SO
4
. Quá trình hòa tan có thể biểu thị theo
phương trình sau:
Ca
3
(PO
4
)
2
+ 4HNO
3
→ Ca(H
2
PO
4
)
2
+ 2Ca(NO
3
)

2

Ca
3
(PO
4
)
2
+ 2H
2
SO
4
→ Ca(H
2
PO
4
)
2
+ CaSO
4

Đối với nấm thì Aspergillus niger có khả năng phân giải P mạnh nhất. Ngoài
ra còn có một số chi khác như Penicillin, Rhizopus…
1.5.2. Ảnh hưởng của vi sinh vật phân giải phosphate lên phân bón
Trong tự nhiên, P nằm trong nhiều dạng hợp chất khác nhau. Các hợp chất P
hữu cơ trong đất có nguồn gốc từ xác động vật, thực vật, phân xanh, phân chuồng…
Những hợp chất P hữu cơ này được vi sinh vật phân giải tạo thành những hợp chất
P vô cơ khó tan, một số ít được tạo thành ở dạng dễ tan. Hợp chất P hữu cơ quan
trọng nhất được phân giải ra từ tế bào vi sinh vật là nucleotide.
Nucleotide có trong thành phần nhân tế bào. Nhờ tác động của các nhóm vi

sinh vật hoại sinh trong đất, chất này tách ra từ thành phần tế bào và được phân giải
thành 2 phần protein và nuclein. Protein sẽ đi vào vùng chuyển hóa các hợp chất
nitrogen, nuclein sẽ đi vào vòng chuyển hóa các hợp chất P.Sự chuyển hóa các hợp
chất P hữu cơ thành muối của H
3
PO
4
đuợc thực hiện bởi nhóm vi sinh vật phân hủy
P hữu cơ. Những vi sinh vật này có khả năng tiết ra enzyme phosphate dễ xúc tác


13
cho quá trình phân giải.Các vi sinh vật phân giải P hữu cơ theo sơ đồ tổng quát sau:
Nucleoprotein → Nuclein → Acid.Nucleic → H
2
SO
4
[36].
Vi sinh vật phân hủy P hữu cơ chủ yếu thuộc 2 chi Bacillus và Pseudomonas.
Các loài có khả năng phân giải mạnh là: B.megaterium, Serratia, B.subtilis,
Serratia, Proteus, Arthrobster,
Vi khuẩn: Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Agrobacterium,
Aerobacter, Brevibacterium, Micrococcus, Flavobacterium…

Hình 1.5. Một số vi khuẩn Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter,
Agrobacterium [36]
Xạ khuẩn: Streptomyces

Hình 1.6. Vi khuẩn Streptomyces [36]

14
1.6. Hiệu quả của phân vi sinh vật phân giải phosphate
Hàm lượng P dễ tiêu trong hầu hết các loại đất đều rất thấp. Vì vậy việc bón
lân cho đất nhằm nâng cao năng suất cây trồng là việc làm cần thiết. Người ta cũng
biết rằng khoảng 2/3 lượng lân bón vào đất được chuyển hóa thành dạng cây trồng
không sử dụng được hoặc bị rửa trôi. Phân vi sinh vật phân giải phosphat khó tan
không chỉ có tác dụng nâng cao hiệu quả cuả phân bón lân khoáng nhờ hoạt tính
phân giải và chuyển hóa của các chủng vi sinh vật mà có tác dụng tận dụng nguồn
phosphat có sẵn trong đất. Nhiều công trình nghiên cứu ở châu Âu, châu Mĩ cũng
như ở các nước châu Á đều cho thấy hiệu quả to lớn của phân vi sinh vật phân giải
phosphate. Tại Ấn Độ VSV phân giải lân được đánh giá có tác dụng tương đương
với 50 kg P2O5/ha. Sử dụng VSV phân giải lân cùng quặng phosphat có thể thay
thế được 50% lượng lân khoáng cần bón mà không ảnh hưởng đến năng suất cây
trồng.
Các kết quả nghiên cứu ở Liên Xô, Canada cũng cho các kết quả tương tự.
Sản phẩm phosphobacterin và PB500 đã được sản xuất trên quy mô công nghiệp ở 2
quốc gia này. Hiện nay Trung Quốc và Ấn Độ là 2 quốc gia đang đẩy mạnh quy mô
phát triển và ứng dụng công nghệ sản xuất phân lân vi sinh vật ở quy mô lớn với
diện tích sử dụng hàng chục triệu ha. Tại Việt Nam các công trình nghiên cứu gần
đây cho biết 1 gói chế phẩm VSV phân giải lân sử dụng cho cafe trên vùng đất đỏ
Bazan có tác dụng tương đương với 34,3kg P
2
O
5
/ha. Bón phân vi sinh có tác dụng
làm tăng số lượng VSVPGL trong đất, dẫn đến tăng cường độ phân giải lân khó tan
trong đất 23-35%. Cây trồng phát triển tốt hơn, thân lá cây mập hơn, to hơn, bản lá
dày hơn, tăng sức đề kháng sâu bệnh, tăng năng suất đậu tương 5-11%, lúa 4,7-15%
so với đối chứng

1.7. Quá trình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật phân giải phosphate
1.7.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật phân giải phosphate trên thế giới
Việc tiến hành phân lập các chủng VSV có khả năng phân giải P vô cơ
khó tan đã được tiến hành từ những năm 40 của thế kỉ XX qua các công trình của
Gerretsen (1948), Sperber (1958), Low (1959)…sau đó đến các công trình của
Greaves (1965)…và ngày nay vẫn còn tiếp tục bởi các tác giả Kucey (1997),


15
Kappoor (1989), Salish (1989), Sattar (1989), Richardson (1997) trên các vùng
đất và các loại đất khác nhau.
Đồng thời với việc phân lập, việc nghiên cứu để làm sáng tỏ cơ chế của sự phân
giải cũng được tiến hành khá sớm với các đóng góp của Sperber (1958), Rose (1986)
Bardiya và Gaur (1985) kiểm tra khả năng hòa tan Ca
3
(PO
4
)
2
của một số chủng
VK thu được kết quả B. pulvifaciens (RS) hòa tan 76mg P
2
O
5
/100mg; sau đó là B.
pulvifaciens (R1) 57mg; B. megatherium (PB) 36,5 mg; B. pumilus 31mg; B.
megatherium (28) 26mg; B. polymyxa (H-5) 22mg [19].
Từ đất kiềm, muối, đất đen, đất nâu vàng, đất đỏ, đất phèn lấy từ Nam, Bắc và
Đông Bắc Trung Quốc, Yin (1988) đã tách được các VSV phân giải phosphate bao gồm
VK, xạ khuẩn, nấm. Mật độ VSV phân giải phosphate cao nhất trong đất đen

(48,9.10
6
/g) và thấp nhất ở đất kiềm ( 20.10
3
/g), trong khi ở đất nâu vàng, đất đỏ và đất
phèn là 20,4. 10
6
; 1,07. 10
6
; 0,98. 10
6
/g đất. Trong số 265 chủng VK PS, 44 chủng chiếm
16,6% bao gồm B. megatherium, Arthrobacter sp., Flavobacter sp., Erwinia sp.,
Pseudomonas sp. có hoạt tính hòa tan P 25,30mg/g; 67 chủng chiếm 25,3% bao gồm B.
alcaligenes, B. polumyxa, B. sutilis có hoạt tính hòa tan P 20,25g/mg; 51 chủng (19,2%)
bao gồm B. cereus, B. sphaericus có hoạt tính hòa tan P 15,20mg/g; 33 chủng (12,5%)
bao gồm Chromobacterium violaceum và Serratia sp. có hoạt tính hòa tan P 5,1mg/g và
18 chủng (6,8%) gồm B. firmus có hoạt tính hòa tan P 2,5mg/g [44].
Halder và cs (1991) cũng nghiên cứu khả năng hòa tan phosphate của chủng
Bradihizobium trong môi trường nuôi cấy có chứa cả hydroxyapatit và canxi phosphate.
Quá trình hòa tan phosphate của các chủng dẫn đến làm giảm pH môi trường. Nitơ ở
dạng amoni là nguồn nitơ thích hợp cho quá trình hòa tan phosphate. Tuy nhiên, nitrat
cũng là một nguồn nitơ khá hiệu quả hỗ trợ PO
4
3-
phân giải. Trong đó, glucose là nguồn
carbon tốt nhất cho quá trình phân giải [30].
Sự hòa tan FePO
4
và AlPO

4
được quan sát bởi Gaur và Gaind (1991)
trong môi trường dịch thể. Kết quả cho thấy sự hòa tan FePO
4
và AlPO
4
nhờ A.
awamori đạt tối đa vào ngày thứ 10 và 11. Lượng P
2
O
5
tối đa hòa tan do
Penicillium đối với Ca
2
HPO
4
, Ca
3
(PO
4
)
2
, FePO
4
và AlPO
4
tương ứng với các tỉ
lệ 30,8; 58,4; 12 và 24% [28].