KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG LÁ SEN HYDROCOTYLE BONARIENSIS COMM. EX LAM. VÀ HYDROCOTYLE VUGARIS L.(APIACEAE)

HÀNH PHCHÍ MINH









LÁ SEN HYDROCOTYLE BONARIENSIS COMM. EX LAM.
VÀ HYDROCOTYLE VUGARIS L.
(APIACEAE)










- 2013



 - HCM


Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. 

Phản biện 1: GS.TS. 
Phản biện 2
Phản biện 3: PGS.TS. 
Phản biện ĐL 1: PGS.TS.  
Phản biện ĐL 2: TS. 



Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án Tiến sĩ cấp CSĐT
Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia TP. HCM vào hồi
giờ ngày tháng năm


Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Khoa học Tổng hợp TP. HCM ;
- Thư viện Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - ĐHQG TP. HCM




1. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương,
Chemical examination of Hydrocotyle bonariensis (L.), family of Apiaceae, Tạp
chí Hóa học, 47(5), 542-546, 2009
2. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương,
Contribution to the study on chemical constituents of Hydrocotyle vulgaris (L.),
Apiaceae, Tạp chí Phát triển Khoa Học & Công Nghệ, NXB Đại học quốc gia,
TPHCM, 12(10), 29-32, 2009.
3. Tôn Nữ Liên Hương, Lê Hoàng Ngoan, Nguyễn Kim Phi Phụng,
Nguyễn Ngọc Sương, Thành phần hóa học của các cây rau má lá sen Hydrocotyle

bonariensis và Hydrocotyle vulgaris, họ Ngò (Apiaceae), ở tỉnh Tiền giang và
thành phố Cần thơ, Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ, 22b, 190-199, 2012
4. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương,
Study on bioactivities and chemical constituents of Hydrocotyle bonariensis (L.),
family Apiaceae, Tạp chí Hóa học, 50(4A), 187-190, 2012
5. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương,
Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học của cây Rau má lá sen Hydrocotyle
bonariensis L. họ Apiaceae, Tuyển tập Hội nghị Khoa học lần thứ 5 Trường ĐH
KHTN TPHCM 11 / 2006
6. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Bá Vi, Nguyễn
Ngọc Sương, Poster No. 52, Chemical constituents of volatile oil and organic
extract from Hydrocotyle bonariensis L. (Apiaceae), Intensive Course
“Medicinal Chemistry” EU-ASIA LINK Medicinal Chemistry, 2006
7. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương,
Paper (p.68-70) and Oral presentation, Contribution to the study on chemical
constituents of Hydrocotyle vulgaris (L.), family Apiaceae, The 7
th
Vietnam-
Japan Joint Seminar on Collarboration in Advanced Science and Technology,
Organized by University of Science, VNU-HCMC, Kyoto Institute of
Technology, March 6-7, 2009
8. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương,
Poster 57, Isolation of some phenolic and glycosidic compounds from
Hydrocotyle bonariensis L. & Hydrocotyle vulgaris L. family Apiaceae, Tóm tắt
Tuyển tập Hội nghị Khoa học lần thứ 7 Trường ĐHKHTN TPHCM, 2010
9. Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương,
Poster, Contribution to the study on the bioactivities of Hydrocotyle bonariensis
L. & Hydrocotyle vulgaris L., family Apiaceae, Hội nghị Khoa học lần thứ 7
Trường ĐH KHTN TPHCM, 2010

1
1
1. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1.1 Đặt vấn đề
Các cây thuộc chi Hydrocotyle mọc dễ nơi ẩm mát và còn được trồng phổ biến
làm rau ăn không những ở nước ta và ở nhiều nước khác cùng có khí hậu nhiệt
đới, nóng ẩm. Một số cây thuộc chi này vừa là thực phẩm vừa là dược phẩm -
không chỉ theo các tài liệu y học cổ truyền mà cả trong các y văn hiện đại.
Trong những năm gần đây, ở vùng đồng bằng sông Cửu Long có các loài rau

má lá tròn gần giống lá sen, có hương thơm, vị đắng, thường được trồng làm
kiểng, sử dụng lá làm rau ăn, được gọi là rau má lá sen. Các loài này có tên
khoa học là Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. và Hydrocotyle vulgaris
L., chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học.
Luận án chọn thực hiện khảo sát thành phần hóa học các cây rau má lá sen,
Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. và Hydrocotyle vulgaris L. nhằm
góp phần tìm hiểu về chi thực vật gần gũi với cuộc sống, chi Hydrocotyle, họ
Ngò (Apiaceae).




1.2. Nhiệm vụ chính của luận án:
- Cô lập, tinh chế, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất thiên nhiên từ
cây Hydrocotyle bonariensis Comm ex. Lam và Hydrocotyle vulgaris L.
- Trích ly tinh dầu từ các bộ phận của mỗi cây, xác định thành phần hóa học
- Khảo sát hoạt tính sinh học của hai cây rau má lá sen này
1.3. Ý nghĩa khoa học và đóng góp mới của luận án
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
- Luận án là công trình đầu tiên thực hiện các nghiên cứu hóa học trên cây
Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. và bổ sung thêm hai nhóm hợp chất
hóa học mới được cô lập từ cây Hydrocotyle vulgaris L.
- Thử nghiệm hoạt tính gây độc trên một vài dòng tế bào ung thư, tính kháng
khuẩn, kháng oxy hóa và khảo sát khả năng làm lành vết thương (in vivo) của
các cao, tinh dầu và một vài hợp chất cô lập được từ hai cây rau má lá sen này.
1.3.2. Đóng góp mới của luận án


Hình 1. Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. Hydrocotyle vulgaris L.
2

Luận án đã đóng góp những kết quả mới về thành phần hóa học của hai cây
Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. và Hydrocotyle vulgaris L. như sau:
 Đã cô lập được 24 hợp chất tinh khiết, và 4 hỗn hợp, trong đó, có 1 hợp chất
mới đã được kiểm tra bằng phần mềm Scifinder vào tháng 08 năm 2012.
Hợp chất tự nhiên có cấu trúc mới là:
●1-O-(β-D-galactopyranosyl)-(2S,3S,4R,9′E)-2-(hexadeca-9′-enoylamino)
octadecane-1,3,4-triol
Các nhóm hợp chất được cô lập lần đầu tiên từ Hydrocotyle bonariensis:
 Alkaloid: tetrahydropalmatine, (-)-(S)-xylopinine
 Cerebroside: 1-O-(β-D-galactopyranosyl)-(2S,3S,4R,18E)-2-[(2′R)-2′-
hydroxynonadecanoylamino]tricosa-18-ene-1,3,4-triol;
Hỗn hợp 1-O-(β-D-galactopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-(14’-methyl
pentadecanoylamino)tricosa-8-ene-1,3,4-triol và 1-O-(β-D-galacto
pyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2′R)-2′-hydroxyhexadecanoylamino]
docosa-8-ene-1,3,4-triol và 1 hỗn hợp các đồng đẳng cerebroside.
 Lignan: hinokinin và savinin (tỷ lệ 1:3)
 Flavonoid: quercetin, quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside,
kaempferol, kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside
 Triterpene: acid ursolic, lupeol, squalene
 Steroid: dioscin, stigmastan-3,6-dione, β-sitosterol 3-O-β-D-gluco
pyranoside, stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranoside và spinasterol 3-O-
β-D-glucopyranoside (tỷ lệ 1:1), 3 hợp chất sterol tương ứng
 Các hợp chất khác: acid hexadecanoic, esculetin, sucrose, 2-(4′-
methylphenyl)-1,3-dioxolane.
Các nhóm hợp chất mới được cô lập từ Hydrocotyle vulgaris là:
 Lignan: hinokinin
 Flavanoid: hesperidin
 Đã xác định thành phần hóa học của tinh dầu các bộ phận hoa, lá, thân, rễ
của mỗi cây.
 Từ kết quả thử nghiệm gây độc trên một vài dòng tế bào ung thư người, tính

kháng khuẩn và khả năng làm lành vết thương (in vivo) cho thấy các cao chiết
và tinh dầu của hai cây rau má lá sen có hoạt tính, trong đó các nhóm hợp chất
của cây Hydrocotyle bonariensis cho kết quả nổi trội hơn.
2. BỐ CỤC LUẬN ÁN
3
Luận án gồm phần mở đầu 2 trang, 138 trang nội dung với 4 chương, 86 tài
liệu tham khảo, 2 trang danh mục công trình và phần phụ lục các phổ. Nội
dung gồm có tổng quan 21 trang, thực nghiệm 30 trang, kết quả và biện luận
83 trang, kết luận và kiến nghị 4 trang.

NỘI DUNG LUẬN ÁN

2.1. Chương 1. Tổng quan
Tổng hợp các tài liệu nghiên cứu về mô tả thực vật, thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học của cây Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam.,
Hydrocotyle vulgaris L. và các cây trong cùng chi Hydrocotyle.
2.2. Chương 2. Thực nghiệm
2.2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
2.2.1.1. Nguyên liệu
Đối tượng nghiên cứu là toàn cây Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. và
cây Hydrocotyle vulgaris L Nguyên liệu Hydrocotyle bonariensis được thu
hái tại phường 5, thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang; cây Hydrocotyle
vulgaris được thu hái tại phường An Hòa, thành phố Cần Thơ. Mẫu cây được
nhận danh bởi Dược sĩ Phan Đức Bình công tác trong ban biên tập tạp chí
Thuốc và sức khỏe – thành phố Hồ Chí Minh, và Thạc sĩ Nguyễn Thị Kim
Huê, bộ môn Sinh học, khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại Học Cần Thơ.
2.1.1.2 Hóa chất và thiết bị
Trong thực nghiệm, chúng tôi đã sử dụng các hóa chất, thiết bị thường được
các nhà hóa thực vật dùng để chiết tách hợp chất thiên nhiên.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1. Điều chế các loại cao
Trích nóng 2,2 kg bột khô lá cây Hydrocotyle bonariensis với ethanol,
nhiều lần đến kiệt, lọc và cô quay ở áp suất thấp, thu được 145 gam cao
ethanol ở dạng sệt. Tương tự, trích nóng 2,3 kg bột khô lá cây Hydrocotyle
vulgaris với ethanol, lọc và cô quay ở áp suất thấp, thu được 158 gam cao
ethanol ở dạng sệt. Phần cao thô ethanol được hòa tan bằng nước, sau đó chiết
lỏng-lỏng lần lượt với dung môi petroleum ether, chloroform, ethyl acetate và
n-butanol. Dịch chiết được làm khan, cô quay dưới áp suất thấp, thu được các
4
cao tương ứng. Các loại cao từ lá cây Hydrocotyle bonariensis gồm cao ether
dầu hỏa (Hb-PE, 40 g), cao chloroform (Hb-C, 12,2 g), cao ethyl acetate (Hb-
E, 11,6 g), và cao butanol (Hb-B, 21 g). Các loại cao từ lá cây Hydrocotyle
vulgaris gồm cao ether dầu hỏa (Hv-PE, 47 g), cao chloroform (Hv-C, 14,1 g),
cao ethyl acetate (Hv-E, 13,8 g), và cao butanol (Hv-B, 23,1 g).
Ngoài ra, ngâm dầm (nhiệt độ phòng) 6,7 kg bột khô toàn cây
Hydrocotyle bonariensis với ethanol (nhiều lần, trích kiệt), lọc và cô quay
dung dịch ở áp suất thấp, thu được 560 gam cao ethanol ở dạng sệt. Cao thô
ethanol được trích pha rắn với silica gel, dung môi giải ly đầu tiên là ether dầu
o
C) rồi đến chloroform, ethyl acetate, sau cùng là methanol. Các
dung dịch giải ly được thu hồi dung môi dưới áp suất thấp, cho ra các cao
tương ứng: cao ether dầu hỏa (Hbon-PE, 180 g), cao chloroform (Hbon-C, 30
g), cao ethyl acetate (Hbon-E, 37 g) và cao methanol (Hbon-M, 200 g).
2.2.2.2. Trích ly, cô lập các hợp chất hữu cơ
* Việc cô lập hợp chất hữu cơ được thực hiện bằng sắc ký cột hở với silica gel
pha thường hoặc pha đảo RP-18, kết hợp với sắc ký bản mỏng và HPLC.
* Cây tươi mỗi loài được phân chia thành các bộ phận: lá, hoa, thân, rễ và trích
ly tinh dầu mỗi bộ phận bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.
2.2.2.3. Xác định cấu trúc hợp chất được cô lập, thành phần tinh dầu
Việc xác định cấu trúc được thực hiện bằng các phương pháp phân tích phổ

nghiệm như
1
H-NMR,
13
C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, HR-ESI-MS,
FT-MS và so sánh với số liệu phổ từ tài liệu tham khảo. Xác định cấu trúc
cerebroside bằng cách thủy phân, oxy hóa mạch carbon và xác định thành phần
của các dịch trích sau khi thủy phân, khi oxy hóa này bằng phương pháp GC-
MS, LC-MS. Xác định thành phần của tinh dầu bằng phương pháp GC-MS.
2.2.4. Thử nghiệm hoạt tính sinh học

Thử nghiệm Brine-shrimp xác định độc tính với ấu trùng Artemia salina
(Artemia nauplius) nhằm sơ bộ đánh giá độc tính của mẫu cao hoặc hợp chất
cô lập được, được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ, khoa KHTN,
trường ĐH Cần Thơ.
5
Thử nghiệm in vitro gây độc tế bào ung thư, kháng vi sinh vật kiểm định và
kháng oxy hóa: gửi mẫu thử tại phòng Sinh học thực nghiệm, viện Hóa học
các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học - Công nghệ Việt Nam.
Thử nghiệm in vivo hoạt tính làm lành vết thương: tại khoa Khoa học tự nhiên,
Trường Đại học Cần thơ, thực hiện qui trình chữa phỏng cho chuột dựa theo
tài liệu đã công bố của Shukla Y.N. và cộng sự

nghiên cứu hoạt tính làm lành
vết thương của asiaticoside cô lập từ cây cùng chi Hydrocotyle asiatica.
2.3. Chương 3. Kết quả và biện luận
2.3.1. Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất cô lập được
Từ dịch chiết ethanol của cây Hydrocotyle bonariensis, đã cô lập được 22 hợp
chất hữu cơ tinh khiết và ba hỗn hợp gồm hai đồng phân. Từ dịch chiết ethanol
của cây Hydrocotyle vulgaris đã cô lập được 7 hợp chất hữu cơ.

Trong phần này, chúng tôi chỉ trình bày tóm tắt những điểm mới của luận án.
2.3.1.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất Hb-Ea5
Hợp chất Hb–Ea5 (15 mg) cô lập được từ cao ethyl acetate của toàn cây
H. bonariensis (cao Hbon-E), có những đặc điểm như sau:
 Tinh thể dạng phiến, màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy 139–140 C.
 Năng lực triền quang [α]
D
= + 6,43 (c 0,014 g/ml, MeOH)
 Phổ HR-ESI–MS cho mũi ion phân tử giả với m/z 866,6719 [M+Na]
+

 Phổ đồ LC-MS cho thấy mẫu có 1 peak chính với thời gian lưu là 16,5
phút và m/z = 866,6738
 Phổ FT-MS cho các mũi với m/z 866,7; 545,3; 383,2
 Phổ
1
H–NMR (CD
3
OD) (Bảng 1).
 Phổ
13
C kết hợp với phổ DEPT–NMR (CD
3
OD) (Bảng 1).
 Phổ COSY, HSQC, HMBC–NMR (CD
3
OD) (Bảng 1).
 Biện luận cấu trúc
Trong phổ
1

H–NMR có các tín hiệu của proton olefin tại δ
H
5,41–5,42,
proton của carbon liên kết với oxygen trong vùng δ
H
3,10–4,30, các proton
methylene trong vùng δ
H
1,30–2,30 và các proton của hai nhóm –CH
3
cuối
mạch dài, tại δ
H
0,90 (t) và 0,91 (t).
6
Phổ
13
C kết hợp phổ DEPT–NMR cho thấy hợp chất này có 1 carbon tứ
cấp amide >C=O (δ
C
177,1), 2 carbon HC=CH (δ
C
131,4; 131,9), 7 carbon loại
>CH-O (δ
C
70,1–79,0), 2 carbon loại –O–CH
2
– (δ
C
62,7 và 69,9), các nhóm

methylene (δ
C
23,0–39,9) và carbon methyl cuối mạch dài (δ
C
14,4). Ngoài ra,
thông qua phổ HSQC, còn xác định được một carbon dạng >CH-N (δ
C
51,7)
và carbon anomer (δ
C
104,7).
Phổ
1
H–NMR và HSQC cho thấy có một proton anomer tại δ
H
4,31 (1H;
d; J = 7,5 Hz) tương ứng với carbon anomer. Tín hiệu này có tương quan
1
H–
1
H COSY đến tín hiệu H–2″ tại δ
H
3,20. Ngoài ra, cũng xác định các tín hiệu
H–3″/ H–4″/ H–5″/ H–6″ trong vùng δ
H
3,20–4,10 dựa vào tương quan
1
H–
1
H

COSY, chỉ rõ sự hiện diện của phần đường pyranose trong phân tử.
Các dữ liệu phổ 1D-NMR của Hb-Ea5 cho thấy sự hiện diện của 1 phân
tử đường liên kết glycosid với mạch béo, 1 nối amide giữa mạch aminoalcol
với mạch béo và có tất cả 4 nhóm –OH trong mạch hở của phân tử, phù hợp
với cấu trúc cerebroside tự nhiên.
Căn cứ vào phổ HMBC, xác định được 1 nhóm –CHOH có tương quan
với nhóm >C=O trong mạch acid béo, 3 nhóm hydroxyl còn lại là thuộc về
mạch aminoalcol, tại các vị trí 2, 3 và 4. Thông thường các cerebroside tự
nhiên có cấu trúc mạch aminoalcol với cấu hình 2S, 3S, 4R, và là hợp chất hữu
triền, (phần acid béo có thể có hoặc không có nhóm –OH). Hợp chất Hb-Ea5
cũng hữu triền, năng lực triền quang [α]
D
= + 6,43 (c 0,014 g/ml; MeOH),
tương tự các cerebroside có các carbon thủ tính với cấu hình 2S, 3S, 4R, 2′R
(như thí dụ trong hình 3.1), nên có thể đề nghị cấu hình cho các carbon thủ
tính của hợp chất Hb-Ea5 là 2S, 3S, 4R và 2′R.




[α]
D
= + 29 (c 0,11 g/ml; pyridine)
 
30
D

= + 34 (c 0,08 g/ml; pyridine)

Tài liệu tham khảo cho biết trong chi Hydrocotyle chỉ mới cô lập được

cerebroside từ cây H. leucocephala, gọi tên là các hợp chất leucocerebroside
O
NH
O
OH
OH
OH
1
3
2
22'
20
18
19
1'
2'
14
14
3
4
Leucocerebroside - Lb4
O
OH
HO
OH
OH
C
49
H
95

O
10
N
O
NH
O
OH
OH
OH
1
3
2
24'
18
12
13
1'
2'
16
7
4
4
Mucusoside
O
OH
HO
OH
HO
C
48

H
93
O
10
N
Hình 2. Cấu trúc hóa học và năng lực triền quang của leucocerebroside-Lb
4

và
của mucusoside
7
(Lb
1
–Lb
7
) với phần đường trong các hợp chất này là β–D–galactopyranose.
Trong hợp chất Hb-Ea5 vừa cô lập được từ cây H. bonariensis này, xác định
được tín hiệu proton của đường H–4″ và H–5″ là mũi đôi-đôi có J < 5,0 Hz,
nên đề nghị phần đường của hợp chất Hb-Ea5 là β–D–galactopyranose.
Phổ HR-ESI–MS cho mũi ion phân tử giả ở m/z 866,6719 [M+Na]
+
phù
hợp với công thức phân tử C
48
H
93
O
10
N (tính toán lý thuyết: 866,6692).
Mặt khác, từ phổ FT-MS (ghi nhận ion dương) của phân tử Hb-Ea5

ngoài mũi ion phân tử giả ở m/z 866,7 [M+Na]
+
còn có các mũi của mảnh ion:
m/z 545,3; m/z 383,2; m/z 311,3; và m/z 311,3.
Mảnh m/z 545,3 [C
29
H
55
O
8
N]
+
tương ứng mảnh ion phân tử mất đi mảnh
acid béo. Đây là mảnh aminoalcol gắn 1 phân tử đường.
Mảnh m/z 383,2 [C
23
H
45
O
3
N]
+
: Đây là mảnh aminoalcol mất đi phần
đường. Vậy suy ra mảnh đường là C
6
H
10
O
5
.

Mảnh m/z 311,3 [C
18
H
35
O
3
N]
+
: Đây là mảnh aminoalcol mất đi phần
đường và bị cắt đứt tại nối đôi C=C tại C-18.
Từ công thức phân tử C
48
H
93
O
10
N và sự hiện diện của các mảnh ion như
trình bày trên cho thấy mảnh acid béo là C
19
H
37
O
2
hay acid 2-
hydroxynonadecanoic. Việc minh họa sự phân mảnh ion trong phân tử Hb-Ea5
được thể hiện trong hình 3.

Việc thủy phân để xác định độ dài mỗi mạch carbon hai bên nhóm
amide, và thực hiện oxy hóa để xác định vị trí liên kết đôi trong phân tử chưa
thực hiện được vì mẫu chất không đủ nhiều.

O
NH
O
HO
OH
1
3
2
18
19'
1'
2'
15
13
4
18'
19
23
3
O
OH
HO
OH
OH

1"
3"
4"
OH
m/z 383,2
(C
23
H
45
O
3
N)
m/z 311,3
(C
18
H
35
O
3
N)
M = 843,7
m/z = 545,3
(C
29
H
55
O
8
N)
(C

48
H
93
O
10
N)
Hình 3. Hình ảnh minh họa sự phân mảnh nhờ phổ FT-MS của hợp chất Hb-Ea5
8
Bảng 1. Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb–Ea5 so sánh với cerebroside (2) có cùng
CTPT (C
48
H
93
O
10
N) và với leucocerebroside-Lb
4
(C
49
H
95
O
10
N) có cùng gốc đường

TT
Loại
carbon
Hb–Ea5
(CD

3
OD)
Leucocer.
Lb
4
(C
5
D
5
N)
Cerebroside
(2) (C
5
D
5
N)

H
, J (Hz)

C

HMBC
(
1
H
13
C)

C


C

1
–O–CH
2
–
4,08 dd (10,5; 6,0)
69,9
4
70,5
70,4
3,84 dd (10,5; 7,5)
2
–N–CH<
4,27 m
51,7
–
51,8
51,9
3
HO–CH<
3,65 t (6,0)
73,0
2
75,9
75,9
4
HO–CH<

3,54 m
72,8
–
75,2
72,5
5
–CH
2
–
1,78; 1,65 m
33,8
4
33,9
33,9
6-9
–CH
2
–
1,30–1,80
30,3–30,8

26,7
33,0–33,2
10
–CH
2
–
1,30–1,80
30,3–30,8

33,4
130,9
(b)

11
–CH
2
–
1,30–1,80
30,3–30,8

130,9
(a)

130,7
(b)

12-16
–CH
2
–
1,30–1,80
32,9

130,7
(a)

33,3
17
–CH

2
–
2,00
33,7
18
22,9–33,0
(a)

29,6–30,0
18
=CH–
5,41 m
131,6

22,9–33,0
(a)

14,3
(b)

19
=CH–
5,42 m
131,4

22,9–33,0
(a)

-
20

–CH
2
–
2,00
33,1
19
14,3
(a)

-
21
–CH
2
–
1,65–2,00
30,4

-
-
22
–CH
2
–
1,65–2,00
24,1

-
-
23
–CH

3

0,90 t (7,0)
14,4

-
-
1′
>C=O
-
177,1

175,8
175,7
2′
HO–CH<
4,03 m
72,0

72,5
72,5
3′
–CH
2
–
2,12
35,7

39,6
35,6

4′
–CH
2
–
1,65–2,00
26,1

27,3
25,9
5′–18′
–CH
2
–
1,65–2,00
24,1–26,1

-
(c)

29,6–30,0
19′
–CH
3

0,91 t (7,0)
14,4

-
(c)

29,6–30,0


-
-

-
(c)

14,5
(b)

1″
–O–CH–
O
4,31 d (7,5)
104,7

105,6
105,5
2″
HO–CH<
3,20 m
75,0
1″, 3″
75,2
75,2
3″
HO–CH<
3,39 dd (10; 5,0)

77,9
5″
78,6
78,5
4″
HO–CH<
3,32 dd (3,5; 2,0)
71,6

71,5
71,6
5″
HO–CH<
3,30 dd (5,0; 2,0)
78,0

78,5
78,6
6″
HO–CH
2
<
3,70 m; 3,90 m
62,6

62,8
62,8
Ghi chú
(a)
Hợp chất leucocerebroside-Lb

4
có liên kết đôi vị trí không được xác định
trên mạch acid béo dài 20 carbon.

(b)
Hợp chất cerebroside (2) có mạch aminoalcol dài 24 carbon và liên kết
đôi giữa C-10 và C-11 trên mạch acid béo dài 18 carbon.

(c)
tài liệu không đề cập
9
Theo tài liệu

Yamada K. nhận định rằng: thông thường tín hiệu carbon
bên cạnh nối đôi cis sẽ xuất hiện ở δ
C
27-28, trong khi carbon liền kề nối đôi
trans xuất hiện ở δ
C
32-33. Do trong hợp chất Hb-Ea5, độ chuyển dời hóa học
của các carbon liền kề nối đôi thuộc vùng δ
C
32-33, nên đề nghị nối đôi có cấu
hình trans.
Việc phân tích dữ liệu phổ NMR của Hb–Ea5 và so sánh với số liệu
của các hợp chất cerebroside trong cây Hydrocotyle leucocephala

cơ bản giống
nhau. Tuy nhiên, khối phổ ESI-MS của Hb–Ea5 phù hợp với CTPT
C

48
H
93
O
10
N nhưng trong cây H. leucocephala không có hợp chất nào có cùng
công thức phân tử này nên chúng tôi còn chọn hợp chất cerebroside 2 có cùng
phân tử khối nhưng khác cấu trúc mạch carbon, đã được cô lập từ cây Cucumis
sativus L., để so sánh với phổ của hợp chất Hb-Ea5. Kết quả so sánh được
trình bày trong Bảng 1 cho thấy có sự tương đồng.
Hợp chất Hb-Ea5 được đề nghị là 1-O-(β-D-galactopyranosyl)-
(2S,3S,4R,18E)-2-[(2′R)-2′-hydroxynonadecanoylamino]tricosa-18-ene-
1,3,4-triol.
Đây là hợp chất mới, đã được kiểm tra trên phần mềm Scifinder, tại
Trường Đại học Leuven, Bỉ, tháng 8/2012, tuy nhiên cần phân tích thêm cấu
trúc của hợp chất này ngoài phân tích FT-MS đã nêu.





2.3.1.2 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất Hb–Ea6
Hợp chất Hb–Ea6 (18 mg) thu được từ cao ethyl acetate của toàn cây H.
bonariensis, có những đặc điểm như sau:
 Chất bột vô định hình, màu trắng.
 Năng lực triền quang [α]
D
= + 5,71 (c 0,014 g/ml; MeOH)
 Phổ HR–ESI–MS: cho mũi ion phân tử giả ở m/z 738,5506 [M+Na]
+

.
 Phổ UV kèm theo, có hấp thu cực đại vùng 200 nm.
 Phổ IR (KBr)  cm
-1
: 3440 (N–H), 1715 (C=O) và 1453 (C–C).
O
NH
O
OH
OH
1
3
2
18
19'
1'
2'
15
13
4
Hb-Ea5
18'
19
23
3
O
OH
HO
OH
OH

1"
3"
4"
OH
1-O-(

-D-Galactopyranosyl)-(2S,3S,4R,18E)-2-[(2'R)-
2'-hydroxynonadecanoylamino]tricosa-18-ene-1,3,4-triol
10
 Phổ đồ LC–MS cho thấy mẫu có 1 mũi chính với thời gian lưu là 7,6
phút và m/z = 738,5507
 Phổ
1
H–NMR (CD
3
OD) (Bảng 2),
 Phổ
13
C kết hợp phổ DEPT–NMR (CD
3
OD) (Bảng 2),
 Phổ COSY, HSQC, HMBC (CD
3
OD) (Bảng 2).
 Phổ GC-MS của dịch trích hexane sau khi thủy giải hợp chất Hb-Ea6
chỉ có một hợp chất chính là ester methyl 9E-hexadecenoate
 Phổ LC-MS mạch đường sau khi thủy giải hợp chất cho một mũi có
thời gian lưu RT là 6,5 phút, m/z 203,0527 trùng khớp với RT và m/z
của đường galactose trong phổ LC-MS của đường galactose
 Biện luận cấu trúc

Trong phổ
1
H–NMR có các tín hiệu của proton olefin tại δ
H
5,42–5,43
m, các proton của carbon liên kết với oxygen trong vùng δ
H
3,10–4,40, các
proton của nhóm methylene trong vùng δ
H
1,20–2,20 và 6 proton của hai nhóm
methyl

cuối mạch dài: δ
H
0,92 (t, 7,0 Hz) và 0,93 (t, 7,0 Hz).
Phổ
1
H–NMR và HSQC cho thấy có một proton anomer tại δ
H
4,30
(1H; d; J = 8,0 Hz) tương ứng với carbon anomer có δ
C
104,7. Tín hiệu này
đồng thời có tương quan
1
H–
1
H COSY đến tín hiệu H–2″. Từ phổ COSY cũng
xác định được các proton H–3″ đến H–6″ của một phân tử đường pyranose. Do

tín hiệu proton anomer là mũi đôi có J = 7,5 Hz, cho thấy mạch pyranose của
đường có cấu hình β.
Phổ
13
C kết hợp phổ DEPT–NMR cho thấy hợp chất này cũng có một
carbon tứ cấp amide >C=O (δ
C
177,1), 2 carbon HC=CH (δ
C
: 131,4; 131,6),
6 carbon loại >CH-O (δ
C
: 70,1–79,0), 2 carbon loại –CH
2
–O (δ
C
: 69,9; 62,6),
1 carbon dạng –N–CH< (δ
C
51,7); các nhóm–CH
2
– (δ
C
: 23,0–39,9) và 2 nhóm
–CH
3
cuối mạch dài (δ
C
14,5), nên Hb-Ea6 cũng là một cerebroside.
Phổ HMBC cho thấy tương quan từ tín hiệu δ

H
2,06 (1H; m; H–2′) đến
δ
C
177,1 (C–1′), điều này phù hợp với việc mạch acid béo không có –OH ở vị
trí kế cận nhóm carbonyl, như hợp chất Hb-Ea5 trước đó.
Phổ HR-ESI–MS cho thấy mũi ion phân tử giả tại m/z 738,5506
[M+Na]
+
phù hợp với CTPT C
40
H
77
O
9
N (sai số 1 milimass).
Cấu trúc mạch béo của cerbroside Hb-Ea6 được xác định thông qua việc
thủy phân hợp chất trong môi trường methanol-acid (dung dịch HCl 20% trong
methanol) và trích chloroform hỗn hợp sản phẩm đem khảo sát GC-MS.
11
Kết quả GC-MS của phần acid béo của hợp chất Hb-Ea6 (ký hiệu là
mẫu Ea6b) cho 2 mũi, trong đó mũi có thời gian lưu: 27,86 phút (mũi I) được
thư viện máy đề nghị là acid 9E-hexadecenoic (độ tương hợp là 88%) và mũi
chính với thời gian lưu 31,91 phút được đề nghị là di-(2-ethylhexyl)hexadioate
(là một chất tổng hợp có tính dẻo hóa, là tạp phẩm). Tuy nhiên trong phổ MS
của mũi I có mảnh m/z = 268 (4%) ứng với cấu trúc ester methyl 9E-
hexadecenoate (I), cho phép xác định mạch acid béo của cerebroside này là
9E-hexadecenoyl.
Lớp nước của hỗn hợp sản phẩm thủy phân sau khi trích chloroform
được cô quay và phân tích LC-MS để đánh giá mạch đường. Kết quả LC-MS

dịch nước cho thấy có mũi tương ứng với thời gian lưu là 6,5 phút có m/z =
203,0527 là trùng khớp với thời gian lưu và khối lượng ion phân tử giả cuả
mẫu đường galactose (R
T
= 6,3 phút và m/z = 203,0523 [C
6
H
12
O
6
+ Na]
+
). Vậy
phân tử đường trong Hb-Ea6 là β-D-galactopyranose.
Việc giải phổ NMR và so sánh số liệu của hợp chất Hb-Ea6 với
cerebroside có cùng công thức phân tử C
40
H
77
O
9
N, trích từ cây Serratula
chinensis S. (Compositae), được trình bày trong Bảng 2 cho thấy có sự tương
đồng, ngoại trừ sự khác biệt về vị trí nối đôi trên mạch và không có nhóm –OH
tại C-2′ của mạch acid béo. Hợp chất cerebroside từ cây Serratula chinensis có
nối đôi cấu hình trans tại vị trí C-8 trên mạch aminoalcol (–OH tại C-1, C-3)
và mạch acid béo bão hòa có nhóm –OH tại C-2′; còn trong hợp chất Hb-Ea6
nối đôi xuất hiện trên mạch acid béo, tại vị trí C-9′, cấu hình trans và mạch
aminoalcol bão hòa.
Hợp chất Hb-Ea6 cũng hữu triền, năng lực triền quang [α]

D
= + 5,71
(c 0,014 g/ml; MeOH), tương tự như các cerebroside tự nhiên có các carbon
thủ tính với cấu hình 2S, 3S, 4R, do vậy các carbon thủ tính của hợp chất Hb-
Ea6 cũng được đề nghị có cấu hình là 2S, 3S, 4R.





O
NH
O
OH
OH
1
3
2
16'
18
10'
1'
2'
6
4
10
4
Hb-Ea6
9'
O

OH
HO
OH
OH
4'
3'
H
3
CO
16'
10'
1'
2'
6
4
9'
HCl/CH
3
OH
NH
3
O
OH
OH
1
3
2
18
10
4

O
OH
HO
OH
OH
4'
3'
+
(I)
(II)
O
+
Hình 4. Hình ảnh minh họa sự phân mảnh khi thủy phân hợp chất Hb-Ea6

12
Bảng 2. Số liệu phổ NMR của hợp chất Hb–Ea6 so sánh với serratula-cereboside*

có
cùng công thức phân tử C
40
H
77
O
9
N
TT
Loại carbon
Hb–Ea6
(CD
3

OD)
Ser-cerebroside*
(C
5
D
5
N)

H
, J (Hz)

C

HMBC
(
1
H
13
C)

C

1
–O–CH
2
–
4,07 dd (10,5; 6,5)
69,9
1′′, 2, 3
70,4

3,82 dd (10,0; 3,5)
1′′
2
–N–CH<
4,28 d (2,5)
51,7
3, 4
54,6
3
–HO–CH<
3,63 m
75,6
4, 5
71,3
4
–HO–CH<
3,54 m
73,0
2, 5, 9
34,9
(a)

5
–CH
2
–
1,58 m; 1,78 m
35,7
6
25,9

6
–CH
2
–
1,48-1,50 m
27,2
4
29,7
7
–CH
2
–
1,21-1,58 m
23,7-30,8

33,2
8
–CH
2
–
1,21-1,58 m
23,7-30,8

130,4
9
–CH
2
–
1,21-1,58 m
23,7-30,8

130,6
10
–CH
2
–
1,21-1,58 m
23,7-30,8

33,1
15 -17
–CH
2
–
1,21-1,58 m
23,7-30,8

23,1-30,5
18
–CH
3

0,92 t (7,0)
14,5

14,4
1′
>C=O
-
177,1

175,3
2′
–CH
2
–
1,99 m; 2,06 m
33,8
1′
72,5
3′
–CH
2
–
1,30 m; 2,04 m
33,7

35,7
4′
–CH
2
–
1,48-1,50 m
26,7

26,8
5′-7′
–CH
2
–

1,26-1,78 m
23,7-33,0

29,7-30,1
8′
–CH
2
–
1,30 m; 2,04 m
33,7
9′, 10′
29,7-30,1
9′
-HC=
5,43 m
131,6
10′
29,7-30,1
10′
-HC=
5,42 m
131,4
-
29,7-30,1
11′
–CH
2
–
1,30 m; 2,00 m
33,1

8′, 9′, 10′
23,1-30,1
12′-15′
–CH
2
–
1,22-1,36 m
26,1-32,0

23,1-30,1
16′
–CH
3

0,93 t (7,0)
14,5

14,4
1″
HO–CH<
4,30 d (8,0)
104,7
1, 2″
105,4
2″
HO–CH<
3,20 m
75,0
3″
75,1

3″
HO–CH<
3,38 m
(b)

77,9
4″, 5″
78,4
4″
HO–CH<
3,33 m
(b)

71,6
3″
71,5
5″
HO–CH<
3,33 m
(b)

78,0
3″, 4″
78,5
6″
HO–CH
2
-
3,90 m; 3,69 m
62,6

5″
62,6
Ghi chú: (a) carbon methylene
(b) tín hiệu bị che lấp một phần bởi tín hiệu của dung môi
Hợp chất Hb-Ea6 được đề nghị là 1-O-(β-D-galactopyranosyl)-
(2S,3S,4R,9′E)-2-(hexadeca-9′-enoylamino)octadecane-1,3,4-triol.
13
Đây là hợp chất mới, đã được kiểm tra trên phần mềm Scifinder, tại
Trường Đại học Rennes 1, Pháp, tháng 10/2011 và kiểm tra lại tại Đại học
Leuven, Bỉ, tháng 8/2012.




2.3.1.3 Khảo sát cấu trúc một số hợp chất mới được cô lập từ chi Hydrocotyle
Trong số 28 hợp chất cô lập được, nhóm hợp chất alkaloid, cerebroside,
dibenzylbutyrolactone lignan và flavan glycoside là những hợp chất chưa được
cô lập từ các cây Hydrocotyle hoặc ít được đề cập đến. Dữ liệu phổ các hợp
chất mới này được ghi ở bảng 3, (
1
H-NMR: 500 MHz,
13
C-NMR: 125 MHz).
Bảng 3. Dữ liệu phổ của các hợp chất mới trong chi Hydrocotyle được cô lập từ
Hydrocotyle bonariensis Comm. ex Lam. và Hydrocotyle vulgaris L.
HỢP CHẤT
DỮ LIỆU PHỔ
Tetrahydropalmatine
C
21

H
25
O
4
N







 HR-ESI-MS: m/z 356,1857 [M+H]
+


1
H–NMR (CD
3
OD): δ
H
(ppm): 6,89 (1H, s, H-1);
6,73 (1H, s, H-4); 2,78 (1H, dd, J = 15,5 và 8,5; H-5),
3,15 (1H, m, H-5); 2,67 (1H, dd, J = 11,5 và 3,5; H-
6); 3,26 (1H, dd, J =11,0 và 4,0; H-6); 3,57(1H, dd, J
= 11,5 và 3,5; H-8); 3,26 dd (J =11,0; 4,0; H-6); 4,22
(1H, d, J = 15,5; H-8); 6,92 (1H, d, J = 8,5; H-11);
6,96 (1H, d, J = 8,5, H-12); 2,78 (1H, dd, J = 15,5 và
8,5, H-13); 3,47 (1H, dd, J = 16,0 và 4,0; H-13); 3,62
(1H, dd, J = 11,0 và 2,5; H-14); 3,85 (6H, s, 2-OCH

3

và 3-OCH
3
); 3,83 (3H, s, 9-OCH
3
); 3,86 (3H, s, 10-
OCH
3
)



13
C–NMR (CD
3
OD), δ
C
: 110,7 (C-1); 149,3 (C-2);
149,4 (C-3); 113,1 (C-4); 127,8 (C-4a); 29,3 (C-5);
52,6 (C-6); 54,8 (C-8); 128,6 (C-8a); 146,4 (C-9);
151,8 (C-10); 112,8 (C-11); 125,2 (C-12); 128,7
(C-12a); 36,5 (C-13); 60,6 (C-14); 130,6 (C-14a);
56,8 (2-OCH
3
); 56,5 (3-OCH
3
); 60,8 (9-OCH
3
); 56,4

(10-OCH
3
)
O
NH
O
OH
OH
1
3
2
16'
18
10'
1'
2'
6
4
10
4
Hb-Ea6
9'
O
OH
HO
OH
OH
4'
3'
1-O-(


D-Galactopyranosyl)-(2S,3S,4R,9'E)-2-(hexadeca-9'-enoylamino)octadecane-1,3,4-triol
N
H
3
CO
H
3
CO
OCH
3
OCH
3
H
(Hb C1.1)
1
2
3
6
8 a
9
10
12
12 a
8
4
14 a
4 a
13
14

14

(-)-(S)-Xylopinine
C
21
H
25
O
4
N















 HR-ESI-MS: m/z 356,1824 [M+H]
+



1
H–NMR (CD
3
OD): δ
H
(ppm): 6,87 (1H, s, H-1);
6,68 (1H, s, H-4); 2,61 (1H, d, J = 16,0; H-5); 2,91
(1H, dd, J = 11,5 và 5,0; H-5); 2,46 (1H, d, J = 3,5;
H-6); 3,26 (1H, m, H-6); 3,40 (1H, m, H-8); 4,07
(1H, dd, J =16,0 và 11,0; H-8); 6,88 (2H, s, H-9 và
H-12); 2,55 (1H, dd, J = 13,5 và 4,0, H-13); 3,40
(1H, dd, J = 16,0 và 4,0; H-13); 2,50 (1H, d, J = 11,0
H-14); 3,85 (9H, s, 2-OCH
3
, 3-OCH
3
và 11-OCH
3
);
3,86 (3H, s, 10-OCH
3
)



13
C–NMR (CD
3
OD), δ
C

: 109,5 (C-1); 147,2 (C-2 và
C-3); 111,6 (C-4); 126,3 (C-4a); 28,5 (C-5); 50,9 (C-
6); 53,4 (C-8); 127,6 (C-8a); 111,1 (C-9); 144,4 (C-
10); 149,8 (C-11); 123,6 (C-12); 128,3 (C-12a); 35,6
(C-13); 58,8 (C-14); 128,3 (C-14a); 55,6 (3-OCH
3
);
55,7 (2-OCH
3
và 10-OCH
3
); 59,6 (11-OCH
3
).

Hinokinin
C
20
H
18
O
6


 ESI-MS: m/z 354 [M]
+


1
H–NMR (CDCl

3
): δ
H
(ppm): 2,58 (1H, dd, J = 17,0
và 7,0; H-2); 2,98 (1H, dd, J = 14,0 và 5,0; H-3);
2,84 (1H, dd, J = 14,0 và 7,5; H-3); 6,45 (1H, d, J =
2,0; H-5); 6,72 (1H, d, J =7,5; H-8); 6,46 (1H, dd, J =
7,5 và 2,0; H-9); 5,92 (4H, brs, H-10 và H-20); 4,12
(1H, dd, J = 9,0 và 7,0; H-11); 3,85 (1H, dd, J = 9,5
và 7,5; H-11); 2,46 (1H, dd, J = 16,5 và 8,0; H-12);
2,58 (1H, dd, J = 14,0 và 5,5; H-13); 2,44 (1H, m, H-
13); 6,62 (1H, d, J = 1,5; H-15); 6,70 (1H, d, J =8,0;
H-18); 6,60 (1H, dd, J = 8,0 và 1,5; H-19)

13
C–NMR (CDCl
3
), δ
C
: 178,8 (C-1); 46,5 (C-2) 34,9
(C-3); 131,5 (C-4); 108,8 (C-5); 147,9 (C-6); 146,5
(C-7); 108,3 (C-8); 121,6 (C-9); 101,0 (C-10); 71,1
(C-11); 41,3 (C-12); 38,4 (C-13); 131,4 (C-14); 109,5
(C-15); 147,9 (C-16); 146,6 (C-17); 108,4 (C-18);
122,3 (C-19); 101,1 (C-20).

Savinin
C
20
H

16
O
6


1
H–NMR (CDCl
3
): δ
H
(ppm): 6,46 (1H, m; H-3);
7,03 (1H, d, J = 2,0; H-5); 6,70 (1H, d, J =8,0; H-8);
6,73 (1H, m, H-9); 6,03 (H, m, H-10); 3,95 (1H, dd,
N
H
3
CO
H
3
CO
OCH
3
H
(Hb Flaw3)
1
2
3
6
8 a
10

12
12 a
8
4
14 a
4 a
13
14
OCH
3
11

O
O
O
O
O
O


(Hv-PE5; Hb-Clo.a)


7










15


J = 9,0 và 7,0; H-11); 4,25 (1H, m, H-11); 2,54 (1H,
m, H-12); 2,58 (1H, dd, J = 14,5 và 5,5; H-13); 3,00
(1H, m, H-13); 7,49 (1H, d, J = 2,0; H-15); 6,87 (1H,
d, J =8,0; H-18); 7,07 (1H, dd, J = 8,0 và 2,0; H-19);
5,93 (2H, brs, H-20)

13
C–NMR (CDCl
3
), δ
C
: 172,5 (C-1); 125,2 (C-2);
137,3 (C-3); 122,3 (C-4); 109,5 (C-5); 148,4 (C-6);
149,2 (C-7); 108,8 (C-8); 128,2 (C-9); 101,8 (C-10);
76,8 (C-11); 46,5 (C-12); 38,3 (C-13); 128,2 (C-14);
109,2 (C-15); 147,9 (C-16); 149,2 (C-17); 109,5 (C-
18); 126,1 (C-19); 101,8 (C-20).

Hesperidin
C
28
H
34
O

15









 HR-ESI-MS: m/z 611 [M+H]
+


1
H–NMR (CD
3
OD): δ
H
(ppm): 5,49 (1H, dd,J = 12,0
và 3,0; H-2); 2,77 (1H, dd, J = 17,0 và 3,0; H-3);
3,24 (1H, m, H-3); 6,14 (1H, d, J = 2,0; H-6); 6,12
(1H, s, H-8); 6,90 (1H, d, J =8,5; H-2′); 6,94 (1H, dd,
J =8,0 và 3,5; H-5′); 6,95 (1H, d, J =3,5; H-6′); 4,96
(1H, d, J = 7,0; H-1″); 3,28 (1H, d, J =5,0; H-2″);
5,50 (1H, dd, J =3,0 và 3,0; H-3″); 3,12 (1H, d, J =
9,0; H-4″); 3,22 (1H, d, J = 5,0; H-5″); 3,38 (1H, m,
H-6); 3,82 (1H, m, H-6); 4,66 (1H, d, J = 5,5; H-1′″);
3,42 (1H, d, J = 6,0; H-2′″); 3,63 (1H, m, H-3′″); 3,53
(1H, d, J =8,0; H-4′″); 3,15 (1H, dd, J =5,0 và 3,0; H-

5″′); 1,07 (3H, d,J=6,0; H-6′″); 3,77 (3H, s, 4′-OCH
3
)



13
C–NMR (CD
3
OD), δ
C
: 78,3 (C-2); 42,0 (C-3);
196,9 (C-4); 162,4 (C-5 và C-9); 96,3 (C-6); 165,1
(C-7); 95,5 (C-8); 103,2 (C-10); 130,8 (C-1′); 114,1
(C-2′); 146,4 (C-3′); 147,9 (C-4′); 112,0 (C-5′); 117,9
(C-6′); 99,4 (C-1″); 72,9 (C-2″); 76,2 (C-3″); 70,2
(C-4″); 75,5 (C-5″); 66,0 (C-6″); 100,6 (C-1′″); 70,2
(C-2′″); 69,5 (C-3′″ và C-5′″);); 72,0 (C-4′″); 17,9 (C-
6′″); 56,2 (4′-OCH
3
).

2.3.2. Khảo sát thành phần hóa học của tinh dầu
Tinh dầu của từng bộ phận lá, hoa, thân, rễ của mỗi cây rau má lá sen được
phân tích thành phần bằng phương pháp GC-MS, kết quả ghi ở Bảng 4 và 5.
O
O
O
O
O

O


(Hb-Clo.b)


7









O
O
O
OH
OCH
3
(Hv-Bu3)
7
2
3
4
5
1'
3'

O
HO
HO
OH
O
O
OH
HO
HO
OH
4'
1''
1'"
6''
6'''
5'''

16
Bảng 4. Các cấu phần cuả tinh dầu của các bộ phận trong cây H. bonariensis
T
T
Ðịnh danh theo thư viện dữ liệu
RT
(phút)
Lá
(%)
Hoa
(%)
Thân
(%)

Rễ
(%)
1.
1,3-Dimethylbenzene
4,30
5,50
-
-
-
2.
Nonane
4,36
0,45
-
-
-
3.
Heptanal
4,31
0,33
-
-
-
4.
2,4-Hexadienal
4,59
0,43
-
-
-

5.
α-Pinene
5,18
4,01
9,66
4,26
-
6.
Camphene
5,57
-
0,54
-
-
7.
-
5,65
1,91
0,44
-
-
8.
Verbenene
5,69
-
0,56
-
-
9.
Benzaldehyde

5,83
1,68
-
-
0,33
10.
Sabinene
6,19
1,38
-
0,54
-
11.
2β-Pinene
6,30
2,11
1,91
2,48
-
12.
2,2,4,6,6-Pentamethylheptane
6,57
-
-
-
2,12
13.
β-Myrcene
6,65
1,58

-
1,96
-
14.
Octanal
7,01
0,80
-
0,46
-
15.
Pseudolimonene
7,07
-
0,39
-
-
16.
(3Z)-Hexene-1-ol acetate
7,14
1,69
0,26
-
-
17.
Acid trans-2-hexenoic
7,34
1,16
-
-

-
18.
p-Cymene
7,73
0,91
4,62
32,87
-
19.
dl-Limonene
7,87
8,52
6,98
19,57
-
20.
1,8-Cineole
7,97
-
0,38
-
0,61
21.
Phenylmethanol
7,99
0,84
-
-
-
22.

Benzeneacetaldehyde
8,37
2,16
-
-
-
23.
β-Phellandrene
9,21
0,75
-
-
0,57
24.
4-Methylphenol
9,46
10,51
4,49
6,00
12,81
25.
4-Ethyl-1,2-dimethylbenzen
9,88
-
-
-
0,48
26.
cis-Sabinene hydrate
10,37

0,72
-
-
0,57
27.
α-Terpinolene
10,42
0,82
-
1,50
-
28.
Linalool
10,44
-
-
-
2,68
29.
Phenylethanol
10,92
5,38
-
-
0,52
30.
D-Fenchyl alcohol
10,96
-
0,27

-
-
31.
1,2,3,4-Tetramethylbenzene
11,21
0,56
-
-
2,93
32.
α-Campholene aldehyde
11,47
-
0,57
-

33.
trans-Pinocarveol
11,97
-
2,51
-

34.
p-Menth-2-en-1-ol
11,99
2,57
-
1,00
1,07

35.
Verbenol
12,23
-
1,01
-

36.
Camphor
12,24
-


0,69
37.
(1R)-Methyl-2-phenylcyclopropane
12,40
-
-
-
0,72
38.
1,2,3,4-Tetramethylbenzene
11,06
-
-
-
2,93
39.
Sabina cetone

12,77
-
0,39
-
-
40.
Pinocarvone
12,96
-
1,61
-
-
17
41.
Acid octanoic
13,34
0,84
-
-
-
42.
Terpinen-4-ol
13,57
8,87
0,62
5,97
5,91
43.
1-(4-Methylphenyl)ethanone
13,86

-
0,73
-

44.
Cryptone
13,94
4,18
3,03
3,58
2,43
45.
α-Terpineol
14,14
2,78
1,34
3,46
4,54
46.
Myrtenal
14,40
-
2,83

-
47.
Dodecane
14,55
0,48

-
1,49
48.
Verbernone
14,96
-
2,52
-
-
49.
trans-Carveol
15,35
0,38
2,49
-
-
50.
3-(1-Methylethyl)phenol
15,75
-
0,78
-
-
51.
4-(1-Methylethyl)benzaldehyde
16,26
-
1,14
-

52.
Piperitone
16,87
-
-
-
0,87
53. C
Cyclooctane
17,70
-
-
-
0,86
54.
1-(2-Hydroxy-5-methylphenyl) ethanone
17,87
-
-
0,72

55.
α-Copaene
22,19
0,46
0,30
2,02

56.
Sobrerol

22,32
-
1,64
-

57.
Không xác định được
22,47
-
2,27
-

58.
Tetradecane
23, 28
-
-
-
0,65
59.
trans-Caryophyllene
24,05
0,85
-
9,88

60.
Acid cuminic
24,27
-

1,07
-

61.
Không xác định được
24,38
-
9,36
-

62.
α-Humulene
25,49
-
-
4,86

63.
α-Amorphene
26,48
0,73
-
2,38

64.
trans-α-Ionone
26,87
0,77
-
-

65.
Không xác định được
29,60
6,62
-
-
1,26
66.
Spathulenol
30,58
0,87
-
-
1,65
67.
Caryophyllene oxide
30,82
7,57
-
15,68
9,43
68.
Humulene oxide
31,84
2,58
-
-
-
69.

Không xác định được
31,95
2,33
-
4,56
-
70.
Caryophylla-4(12),8(13)-dien-5β-ol
32,91
-
0,42
-
-
71.
Clamenene
33,14
-
-
-
1,04
72.
α-Cadinol
33,60
1,08
-
-
2,93
73.
Không xác định được
36,00

1,95
1,33
-
6,02
74.
4-(2′,6′,6′)-Trimethylcyclohex-1′-en-
1′-yl)butanal
38,91
-
0,26
-

75.
Aristolene epoxide
39,25
-
1,08


76.
1-(2,6,6-Trimethyl-1-cyclohexen-1-
yl)-3-methyl-2-heptene
40,33
-
0,52
-
-
77.
2-Methyl-4-(2,6,6-Trimethylcyclo
hex-1-enyl)but-2-enal

40,98
-
-
-
1,38
78.
4,4,8-Trimethyltricyclo[6.3.1.0.1]
dodecan-2,9-dione
41,53
-
2,40
-
-
18
79.
1,3-Dioxolane
50,74
-
-
-
0,56
80.
Tricosane
55,08
-
0,49
-
-
81.
Tetracosane

57,90
0,79
0,80
-
0,62
Bảng 5. Các cấu phần cuả tinh dầu của các bộ phận trong cây H. vulgaris







2.3.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học
2.3.3.1 Thử nghiệm Brine-shrimp:
Thử nghiệm Brine-shrimp trên các mẫu cao chiết, tinh dầu của hai cây rau má
lá sen, kết quả xác định giá trị LC
50
của các mẫu thử được ghi trong Bảng 6.
Bảng 6. Giá trị LC
50
của các mẫu thử trong thử nghiệm Brine-shrimp
Mẫu thử
LC
50
(µg/ml)
Cao ether dầu hoả Hydrocotyle bonariensis
20
Cao ether dầu hoả Hydrocotyle vulgaris
30

Cao chloroform Hydrocotyle bonariensis
50
Cao chloroform Hydrocotyle vulgaris
250
Cao ethyl acetate Hydrocotyle bonariensis
300
Cao ethyl acetate Hydrocotyle vulgaris
300
Cao butanol Hydrocotyle bonariensis
250
Cao butanol Hydrocotyle vulgaris
180
Tinh dầu lá Hydrocotyle bonariensis
57
Tinh dầu thân Hydrocotyle bonariensis
57
Tinh dầu rễ H. bonariensis
200
TT
Định danh theo thư viện
dữ liệu
RT
(phút)
Lá
(%)
Hoa
(%)
Thân
(%)
Rễ

(%)
1
Hexanal

6,58
-

-
2
(2E)- Hexenal

18,53
-

-
3
3-Hexen -1-ol

36,01
-

-
4
α-Pinene
5,21
-
-
21,47
-
5

2β-Pinene
6,32
-
-
6,43
-
6
dl-Limonene
7,89
-
7,30
24,90
24,99
7
Santalene
24,12
-
57,33
-
54,03
8
α-Bergamotene
24,79
-
,90
-
3,68
9
trans-β-Farnesen
25,71

6,84
3,27
-
5,33
10
β- Bisabolene
27,86
7,90
13,49
-
11,98
11
β- Sesquiphellandrene

7,31
-
-
-
12
Caryophyllen oxide
30,81
1,19
1,84
4,50
-
13
Globulol
-
5,55
-

-
-
14
β-Santalnene
33,69
-
2,87
-
-

19
* Nhận xét kết quả: Các cao ether dầu hỏa của hai cây, cao chloroform cùng
với tinh dầu lá và thân của cây H. bonariensis gây chết Artemia, giá trị LC
50

nhỏ. Do dương tính trong thử nghiệm Brine-shrimp nên khả năng gây độc tế
bào của các cao và tinh dầu này là khả quan.
2.3.3.1 Thử nghiệm khả năng gây độc tế bào ung thư người
Kết quả thử nghiệm khả năng gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư: cơ
màng tim (RD), gan (Hep-G2), phổi (Lu), biểu mô (KB), vú (MCF-7) và cổ tử
cung (Hela) được trình bày trong Bảng 7, với cao và tinh dầu trích từ cây tươi.
Bảng 7. Kết quả thử nghiệm độc tính với tế bào ung thư (in vitro) của tinh dầu, các
cao và hợp chất cô lập được từ H. bonariensis và H. vulgaris
T
T
Mẫu thử
Khả năng ức chế tế bào ung thư (I%)
tại nồng độ 100 µg/ml
IC
50

(µg/ml)
Hep-
G2
Lu
RD
MCF-
7
Hela
Hep-
G2
Lu
RD
(**)
1
DMSO
(chứng -)
0,00 ±
0,00
0,00 ±
0,00
0,00 ±
0,00
*
*
-
-
-
2
Ellipticine
(chứng +)

97,00
± 0,01
98,50
± 0,00
97,50
± 0,01
*
*
0,19
0,25
0,25
3
Tinh dầu H.
bon.
50,00
± 0,50
15,41
± 1,00
93,13
± 0,60
27,42
± 4,49
7,53
± 7,18
19,93
16,10
16,10
4
Cao ethanol
H. bon.

*
*
100,00
± 0,00
*
*
*
9,90
9,90
5
Cao ethanol
của H.
vulgaris
*
*
11,10
± 0,55
*
*
*
> 20
> 20
6
Cao ether
dầu hỏa H.
bon.
*
*
*
40,07

± 5,17
23,26
± 5,67
*
*
*
7
Cao
chloroform
H. bon.
*
*
*
47,11
± 3,46
36,99
± 4,26
*
*
*
8
Cao ethyl
acetate H.
bon.
*
*
*
10,22
± 7,25
5,94

± 8,17
*
*
*
9
Dịch nước
H. bon.
*
*
*
 0,00
 0,00
*
*
*
1
0
Hợp chất
Hb-C11
*
*

*
*
24,00
24,00
16,39
(**)
Ghi chú: * : không thử nghiệm
**: dòng tế bào KB thay cho RD trong thử nghiệm với mẫu Hb-C11