Ảnh hưởng của môi trường và giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM (Arbuscular mycorhiza) in vitro

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT




NGUYỄN THỊ GIANG



NGHIÊN CỨU
ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG VÀ GIÁ THỂ MÔ RỄ ĐẾN
KHẢ NĂNG NHÂN SINH KHỐI CỘNG SINH NẤM RỄ AM
(ARBUSCULAR MYCORRHIZA)IN VITRO

Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số: 60 42 40


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC



Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS.LÊ QUỐC HUY



Hà Nội– Năm 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận
được nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô, các anh chị và gia đình.
Với tất cả tấm lòng chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.
Lê Quốc Huy, Phòng Công nghệ vi sinh và Sinh học môi trường, Trung tâm Công
nghệ sinh học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, người đã tận
tình giúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa để tôi
hoàn thiện luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tập thể cán bộ, giáo viên bộ môn Vi
sinh vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, những người Thầy đã giúp đỡ,
động viên tôi trong suốt quá trình học tập, tạo mọi thuận lợi cho tôi trong quá trình
thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào Tạo sau Đại Học
Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn,giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn CN. Ngô Thị Thanh Huệ và tập thể cán bộ Phòng
Công nghệ vi sinh và Sinh học môi trường cũng như tập thể cán bộ thuộc Trung
tâm Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã
dành cho tôi sự giúp đỡ quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài.
Xin cảm ơn các bạn đã động viên, ủng hộ tôi trong quá trình học tập.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình thân yêu của
tôi,những người đã luôn ở bên tôi, ủng hộ, động viên và là chỗ dựa vững chắc để

tôi yên tâm học tập hoàn thành khóa học này./.

Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2012
Tác giả luận văn


Nguyễn Thị Giang



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi.
Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác./.

Tác giả luận văn


Nguyễn Thị Giang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU……………………………………………………………………….
1
1.1. Đặt vấn đề………………………………………………………………
2
1.2. Mục tiêu đề tài…………………………………………………………
2
1.2.1. Mục tiêu chung………………….……….………………………
2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể………… … …………………………………
2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài………………………………
2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học………………………………………………….

2
1.3.1. Ý nghĩa thực tiễn………………………………………………….
2
1.4. Phạm vi nghiên cứu……………………………………………………
2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU………………………
3
1.1. Tổng quan về nấm rễ nội cộng sinh AM ………………………………
3
1.1.1. Khái niệm………………………………………………………….
3
1.1.2. Đặc điểm của Nấm rễ nội cộng sinh AM(Arbuscular mycorrhiza)…….
4
1.1.3. Vai trò của nấm rễ nội cộng sinh với cây chủ……………………
9
1.2. Tổng quan về vi khuẩn Agrobacterium rhizogense……………………
12
1.3. Nghiên cứu nẫm rễ nội cộng sinh trên Thế giới và Việt Nam…………
13
1.3.1. Trên thế giới ……………………………………………………
13
1.3.2. Trong nước ………………………………………………………
19
Chƣơng 2. VẬT LIỆU - NỘI DUNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…
22
2.1. Vật liệu nghiên cứu…………… ………………………………………
22
2.2. Nội dung nghiên cứu ………………………………………………….
23
2.2.1. Nghiên cứu tạo vật liệu giá thể mô rễ in vitro…………………

23
2.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh
khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro………………….……………………

23
2.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân
sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro…………………………………

23
2.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến khả năng nhân sinh khối
cộng sinh nấm rễ AM in vitro………………………………… …………

23
2.3. Phương pháp nghiên cứu …………………………………………….
24
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm…………………………………
24
2.3.2. Phương pháp tạo vật liệu mô rễ in vitro …………………………
24
2.3.3. Phương pháp cấy chuyển và nhân sinh khối mô rễ ………………
28
2.3.4. Phương pháp tạo cộng sinh AM in vitro…………………………
28
2.3.5. Phương pháp nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro ……………
29
2.3.6. Phương pháp thu thập, phân tích và xử lý thống kê số liệu thí
nghiệm………………………………………………………………………….

29
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………………………………………
31
3.1. Kết quả tạo vật liệu giá thể mô rễin vitro ……… ……………………
31
3.2.Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng
sinh AM in vitro………………………………………………………………

32
3.3. Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng
sinh AM in vitro…………………………………………………………

38
3.4. Đánh giá ảnh hưởng của giá thể mô rễ đến nhân sinh khối cộng sinh AM
in vitro…………………………………………………………………….

44
Chƣơng 4. KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ………………………
50
4.1. Kết luận…………………………………………………………………
50
4.2. Tồn tại và kiến nghị………………………………………………
51
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………
52
PHỤ LỤC………………………
58

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

STT
Viết tắt
Viết đầy đủ
1
AM
Arbuscular mycorrhiza
2
EM
Ectomycorrhiza
3
IBA
Indole butylic acid
4
IP
Infective propagules
5
M

Minimal medium
6
MS
Murashige and Skoog medium
7
MSR
Strullu and Romand medium
8
PCR
Polymerase chain reaction
9
Ri-tDNA
Root inducing –transfer Deoxyribonucleic acid
10
rRNA
Ribosomal Ribonucleic acid
11
TY
trypton-yeast extract medium
12
VAM
Vesicular arbuscular mycorrhiza
13
VM
Vesicular mycorrhiza

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh
AM in vitrogiữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-
tDNA…………………………………………………………………………


32
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh
AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-
tDNA………………………………………………………………………….


34
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh
AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri-
tDNA……………………………………………………………………


35
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh
AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri-
tDNA………………………………………………………………………….

36
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng
sinh AM in vitrogiữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-
tDNA…………………………………………………………………………


38
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng
sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-
tDNA…………………………………………………………………………


40
Bảng 3.7:Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng
sinh AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri-
tDNA……………………………………………………………………………


41
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng
sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri-
tDNA……………………………………………………………………


42
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh
khối cộng sinh AM in vitro trên chủng 41833………………………………

45
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh

khối cộng sinh AM in vitro trên chủng M7…………………………………

48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng
sinh AM in vitrogiữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-
tDNA………………………………………………………………………….


33
Biểu đồ3.2: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng
sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-
tDNA………………………………………………………………………….


35
Biểu đồ3.3: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh AM
in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri-
tDNA………………………………………………………………………….


36
Biểu đồ3.4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng
sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri-
tDNA………………………………………………………………………….

37
Biểu đồ 3.5: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối
cộng sinh AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen
Ri-tDNA………………………………………………………………………


39
Biểu đồ3.6: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng
sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-
tDNA………………………………………………………………………


41
Biểu đồ3.7:Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng sinh
AM in vitro giữa chủng 41833 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri-tDNA….

42
Biểu đồ3.8: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến nhân sinh khối cộng
sinh AM in vitrogiữa chủng M7 với giá thể mô rễ Medicago chuyển gen Ri-
tDNA………………………………………………………………….


43
Biểu đồ3.9: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 41833-Cà rốt Ri-tDNA,
M7-Cà rốt Ri-tDNA, 41833-Medicago Ri-tDNA, M7-Medicago Ri-tDNA
trên môi trường MSR 0,5% agar, pH 5,5……………………………………


44

Biểu đồ3.10: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh
khối cộng sinh AM in vitro trên chủng 41833………………………………

46
Biểu đồ3.11: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 4 loại giá thể mô rễ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


cộng sinh với chủng 41833 trên môi trường MSR 0,5% agar, pH 5,5………
47
Biểu đồ3.12: Ảnh hưởng của các loại giá thể mô rễ khác nhau đến nhân sinh
khối cộng sinh AM in vitro trên chủng M7…………………………………

49
Biểu đồ3.13: Kết quả nhân sinh khối AM in vitro của 4 loại giá thể mô rễ
cộng sinh với chủng M7 trên môi trường MSR 0,5% agar, pH 5,5………….

49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cây phân loại nấm rễ nội cộng sinh AM…………………… … ….5
Hình 1.2.a: Búi sợi nấm (Arbuscules)………………… ………………… ……6
Hình 1.2.b: Túi sợi nấm (Vesicules)………………… ………… …6
Hình 1.3.a : Sợi nấm ngoại bào(extraradical hyphae) ………………… ……… 7
Hình 1.3.b : Bào tử (spores) …………………………………… …………… 7
Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc AM điển hình……………………………………………8
Hình 1.5.a: Cây Medicago truncatula phát triển bình thường………… … 11
Hình 1.5.b: Cây Medicago truncatula có cộng sinh nấm rễ…………….…… 11
Hình 1.6: Cấu trúc vòng Ri-plasmids của vi khuẩn A. rhizogenes(Veena and
Taylor 2007)……… …………………………………………………… ………13
Hình 2.1.a: Gieo hạt Medicago…………………… …………… ……… … 24
Hình 2.1.b: Rễ Medicago phát triển sau 5 ngày……………… …….……… 24

Hình 2.2.a: Hạt Cà rốt nảy mầm sau 4 ngày gieo hạt 25
Hình 2.2.b: Rễ Cà rốt không chuyển gen Ri-tDNA phát triển sau 30 ngày 25
Hình 3.1.a : Rễ Cà rốt không có gen Ri-tDNA 31
Hình 3.1.b :Rễ Cà rốt có gen Ri-tDNA 31
Hình 3.2. Phân tích PCR cho mô rễ Cà rốt chuyển gen Ri-tDNA và không chuyển
gen Ri-tDNA. Băng 1: có gen rolB; băng 2: có gen rolC (cho mẫu chuyển gen);
băng 3 và 4: không có gen rolB và rolC (cho mẫu không chuyển gen); M: DNA
thang chuẩn 100 bp (Fermentas) 32
Hình 3.3.a: Rễ Medicago không có gen Ri-tDNA 32
Hình 3.3.b: Rễ Medicago có gen Ri-tDNA 32
Hình 3.4.a: Rễ cộng sinh phát triển trên môi trường MSR 0,5% agar……… ….37
Hình 3.4.b: Rễ cộng sinh phát triển trên môi trường MSR lỏng…… …… … 37
Hình 3.4.c: Rễ cộng sinh phát triển trên môi trường MS 0,5% agar ……….….37
Hình 3.5.a: AM cộng sinh vào rễ Cà rốt và sinh trưởng sợi nấm mới…… … 45
Hình 3.5.b: AM cộng sinh vào rễ Medicago và sinh trưởng sợi nấm mới…… 45
Hình 3.6.a: Sinh sản bào tử AM trên giá thể Cà rốt có Ri-tDNA sau 1 tháng 50
Hình 3.6.b: Sinh sản bào tử AM trên giá thể Cà rốt có Ri-tDNA sau 4 tháng 50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, nhân loại đang rất nỗ lực trong việc giải quyết 3 vấn đề lớn, đó là
(i) Tăng sinh trưởng và năng suất cây trồng, đảm bảo an ninh lương thực và năng
lượng, (ii) Giảm thiểu thiên tai, ô nhiễm môi trường và thích ứng với biến đổi khí
hậu, (iii) Phát triển bền vững và nâng cao chất lượng cuộc sống(AFCconference
2012).
Các giải pháp sinh học theo hướng ―tiếp cận xanh‖ (Green approach) được
nghiên cứu và hưởng ứng áp dụng mạnh mẽ nhằm làm tăng năng suất cây trồng,

vật nuôi, giảm thiểu thiên tai, ô nhiễm môi trường và thích ứng tốt nhất với biến
đổi khí hậu. Nghiên cứu phát triển ứng dụng các chế phẩm sinh học, vi sinh, dần
thay thế các loại sản phẩm hóa học cho tăng năng suất cây trồng và bảo vệ môi
trường đang ngày càng được quan tâm và đầu tư phát triển.
Nâm rễ nội cộng sinh AM (Arbuscular mycorrhiza) được nghiên cứu sử dụng
như một loại phân bón sinh học, một mặt có tác dụng làm tăng cường hấp thụ dinh
dưỡng của cây trồng, đặc biệt là hấp thụ Lân và giữ nước trên những lập địa thoái
hóa, do đó làm tăng sinh trưởng và năng suất, mặt khác nó cũng có tác dụng làm
ổn định cấu trúc, đặc tính sinh học của đất và là yếu tố chỉ thị cho mức độ suy
thoái của môi trường đất.
Tuy nhiên, các nghiên cứu ứng dụng nấm rễ nội cộng sinh AM mới chỉ tập
trung nhiều cho các cây trồng ngắn ngày, công nghệ chế phẩm AM vẫn phổ biến
áp dụng ở dạng thô sơ truyền thống là ―chất nhiễm đất‖ (soil innoculum), bẫy thực
vật (AM trap plant), chưa đáp ứng được các nhu cầu đòi hỏi của xản xuất cả về mặt
số lượng, chất lượng sản phẩm, cũng như quy mô và hiệu quả của việc áp dụng vào
sản xuất. Do vậy, hướng đi đột phá mới trong nghiên cứu AM là công nghệ nhân
sinh khối AMinvitrocó khả năng góp phần giải quyết được các vấn đề tồn tại nêu
trên của các loại chế phẩm AM truyền thống, trong đó môi trường nuôi cấy và giá
thể rễ thực vật chủ là những yếu tố rất quan trọng trong nghiên cứu về công nghệ
nhân sinh khối AM invitro.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Nhằm góp phần giải quyết các vấn đề tồn tại đã nêu trên của nghiên cứu ứng
dụng công nghệ AM, đặc biệt trong lĩnh vực Lâm nghiệp, Đề tài nghiên cứu Thạc
sĩ ―Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng và giá thể mô rễ đến khả năng
nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM (Arbuscular mycorhiza) in vitro ‖đã được
đề xuất thực hiện. Đề tài Thạc sĩ này của tôi được thực hiện trong khuôn khổ Đề tài
cấp Nhà nước về ―Nghiên cứu sản xuất nấm rễ nội cộng sinh AM (Arbuscular
mycorrhiza) cho cây Lâm nghiệp‖thuộc Chương trình trọng điểm phát triển và

ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn
đến năm 2020.
1.2. Mục tiêu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu chung
Nhằm nghiên cứu một số cơ sở khoa học cho công nghệ nhân sinh khối cộng
sinh AM invitro và sản xuất chế phẩm ứng dụng cho cây trồng và bảo vệ môi
trường.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Nhằm nghiên cứu lựa chọn được môi trường phù hợp cho hình thành cộng
sinh và nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ AM in vitro.
- Nhằm nghiên cứu lựa chọn được giá thể mô rễ phù hợp cho nhân sinh khối
cộng sinh nấm rễ AM in vitro.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.3.1.Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các cơ sở khoa học quan trọng
cho công nghệ nhân sinh khối cộng sinh AM invitro và sản xuất chế phẩm ứng
dụng cho cây trồng và bảo vệ môi trường.
1.3.2.Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ đề xuất được loại môi trường và giá thể mô
rễ phù hợp nhất cho công nghệ nhân sinh khối cộng sinh AM in vitro, làm nguyên
liệu sản xuất chế phẩm AM phục vụ gây trồng cây lâm nghiệp.
1.4. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài được tiến hành nghiên cứu trong phạm vi phòng thí nghiệm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Chƣơng 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về nấm rễ nội cộng sinh AM
1.1.1.Khái niệm
Mycorrhiza là thể cộng sinh giữa hệ sợi nấm trong đất với rễ của thực vật bậc

cao.Frank là người đầu tiên phát hiện ra đặc điểm kết hợp đặc biệt này ở rễ của cây
Cupulifereae vào năm 1885 và gọi đó là mycorrhiza. Từ ―mycorrhiza‖ có nghĩa là
―nấm- rễ‖, tác giả đã dùng từ này để nhấn mạnh mối quan hệ giữa nấm và rễ cây
(Roger et al. 2004a).
Nấm rễ nội cộng sinh AM được xác định là mối quan hệ không thể thiếu ở
hầu hết các loài thực vật (hơn 90% các loài thực vật có khả năng hình thành cộng
sinh AM). Sự kết hợp đó mang lại lợi ích cho cả thực vật và vi sinh vật, qua đó,
nấm có được các hợp chất đồng hóa từ thực vật để sống, đồng thời nấm lại giúp rễ
cây tăng cường khả năng hấp thụ nước, các chất hữu cơ hòa tan trong đất đặc biệt
là phospho, chống chịu các yếu tố bệnh hại cũng như các chất độc kim loại nặng.
Do đó, có tác dụng cải tạo và ổn định cấu trúc đất, cân bằng hệ sinh thái.Quan hệ
cộng sinh này đặc biệt thể hiện vai trò trên những vùng đất khô cằn, hệ sinh thái bị
xáo trộn nghiêm trọng, nghèo dinh dưỡng hay có tiềm năng độc hại cao. Vì vậy
công nghệ AM có khả năng áp dụng rộng cho nhiều loài cây lâm nghiệp, không chỉ
giúp tạo ra được nguyên liệu cây trồng rừng có chất lượng cao, khả năng thích nghi
và năng suất tốt trên những lập địa cằn cỗi mà còn đáp ứng tốt nhất cho nhu cầu sử
dụng hiệu quả nguồn tài nguyên đất đai theo mục tiêu mở rộng diện tích cây trồng
rừng nhưng không cạnh tranh với đất trồng cây nông nghiệp, tăng cường hiệu quả
sử dụng các vùng đất hoang hóa theo cách bền vững và thân thiện với môi trường.
Mycorrhiza có phân bố ở hầu khắp các nơi, thấy ở cây cỏ, rêu, dương xỉ, một
số cây lá kim, và hầu hết các cây lá rộng. Sự phổ biến cùng với những vai trò tích
cực của nấm rễ đã kích thích việc nghiên cứu về mycorrhiza ngày càng mở rộng và
sâu sắc hơn. Trong khoảng 20 năm trở lại đây, những nghiên cứu cơ bản được thực
hiện bởi hàng trăm các nhà nghiên cứu từ các nước khác nhau trên thế giới đã đem
lại nhiều kết quả hết sức ý nghĩa cho ứng dụng mycorrhiza trong hệ sinh thái nông
nghiệp,lâm nghiệp và môi trường.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Dựa trên đặc điểm xâm nhiễm của nấm vào rễ cây chủ, mycorrhiza được phân

thành 2 nhóm chính là ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza, EM), và nội cộng sinh
(Endomycorrhiza, AM).
Ectomycorrhiza:Ectomycorrhiza có ở những cây gỗ lớn, điển hình là thông,
sồi, cáng lò, những cây có giá trị kinh tế cao, tuy nhiên ectomycorrhiza có tính đặc
trưng loài. Đặc điểm của ectomycorrhiza là sợi nấm nội bào chỉ xâm nhập vào
khoảng gian bào của các tế bào vùng vỏ rễ và sợi nấm ngoại bào phân nhánh mạnh
tạo thành lớp vỏ bao quanh rễ nên làm biến đổi hình thái bên ngoài của rễ. Hầu hết
ectomycorrhiza thuộc LớpBasidiomycetes như Agaricales, số ít thuộc
LớpAscomycetes.
Endomycorrhiza:Hình thành ở khoảng 80% thực vật bậc cao. Đặc điểm của
endomycorrhyza là sợi nấm của chúng xâm nhập vào bên trong tế bào vỏ rễ của
thực vật bậc cao và không gây nên những biến đổi hình thái bên ngoài của rễ,
thường có một phần của sợi nấm còn nằm phía ngoài nhưng chúng không tạo lớp
vỏ bao ngoài rễ. Cấu trúc điển hình của endomycorrhiza là sự hình thành những
cấu trúc đặc biệt vesicules và arbuscules. Ở một số nhóm endomycorrhiza người ta
quan sát thấy có vesicules(Vesicular mycorrhiza, VM) hoặc arbuscules
(Arbuscular mycorrhiza, AM) hoặc đồng thời cả hai cấu trúc này trong tế bào vỏ rễ
(Vesicular arbuscular mycorrhiza, VAM).
Vậy AMlà thể cộng sinh giữa nấm với rễ cây ở thực vật bậc cao mà hình thành
nên cấu trúc đặc biệt vesicules, arbuscules trong tế bào vỏ rễ và không gây biến đổi
hình thái ngoài của rễ.
Do tính phổ biến, có lợi và không cố hữu cho 1 loài nên nhóm
vesiculesarbuscular mycorrhiza rất được quan tâm nghiên cứu để ứng dụng trong
nông nghiệp cũng như trong lâm nghiệp.
1.1.2. Đặc điểm của Nấm rễ nội cộng sinh AM (Arbuscular mycorrhiza)
a. Phân loại
Trong một thời gian dài AM được xếp vào ngành phụ nấm tiếp hợp
(Zygomycota) do cấu trúc sợi nấm không có vách ngăn, lớp nấm tiếp hợp
(Zygomycetes). Hiện nay, bằng những nghiên cứu mức độ phân tử hệ thống phát
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

sinh loài đã cho thấy Zygomycota là ngành đa hệ (poli-phyletic), do đó nấm AM
được tách ra khỏi ngành Zygomycota hình thành lên ngành mới là Glomeromycota.
Phân loại đến cấp họ cho AM được dựa trên 4 tiêu chí cơ bản:
- Cấu trúc mycorrhiza cộng sinh trong rễ.
- Phương thức hình thành bào tử khi được phân lập trong đất.
- Cấu trúc nội bào tử.
- Phương thức nảy mầm bào tử.
Hệ thống phân loại AM hiện nay ( dựa trên trình tự của rRNA ) được tóm tắt
trong hình sau:








(Nguồn: />wvu.edu/fungi/taxonomy)

b. Cấu trúc
Nấm rễ nội cộng sinh (AM) có cấu tạo điển hình bao gồm cấu trúc nội bào
(arbuscules, vesicules, sợi nấm nội bào) và cấu trúc ngoại bào (sợi nấm ngoại bào,
bào tử).

Hình 1.1: Cây phân loại nấm rễ nội cộng sinh AM

N


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


 Nhóm cấu trúc nội bào:

Hnh 1.2: Bi si nấm (Arbuscules) (a)
Ti si nấm (Vesicules) (b)
Nguồn:(Hà 2011)
- Arbuscules: là thể giác mút, lưỡng phân, dạng như lông bàn chải, là phần
trao đổi dinh dưỡng chính giữa thực vật chủ và nấm (Gianinazzi et al. 2002).Chúng
được hình thành bên trong tếbào vỏ rễ(Mosse and Hepper 1975b) và là dấu hiệu
cho biết có hoạt động của mycorrhiza. Tùy vào từng loài khác nhau mà arbuscules
cũng có những đặc trưng riêng về hình dạng và sự phân nhánh.
- Vesicules: có dạng hình cầu hoặc trứng, có thành tế bào dày, là cơ quan dự
trữ dinh dưỡng cho nấm, có chứa lipit và glycolipit (Mosse and Thompson 1981a).
Nó được tạo thành bởi đoạn giữa hay đầu lồi tận cùng của sợi nấm nội bào, phân
bố trong khoảng gian bào hoặc bên trong tế bào vỏ rễ.
- Sợi nấm nội bào: sợi nấm nội bào không có vách ngăn,dạng thẳng hoặc phân
nhánh hình chữ H hoặc Y,chúng cũng hình thành dạng cuộn, tần số xuất hiện của
chúng phụ thuộc vào vị trí trong rễ và đặc điểm của từng loài nấm (Morton2000).
Sợi nấm vừa là phần chứa chất dự trữ vừa là một phần của con đường vận chuyển
các chất hấp thụ bởi các sợi nấm bên ngoài từ đất tới arbuscules hoặc trực tiếp tới
tế bào rễ của cây chủ (Bieleski 1973).

a
b
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


 Nhóm cấu trúc ngoại bào:

Hnh 1.3: a: Sợ i nấ m ngoạ i bà o (extraradical hyphae)
b: Bo t (spores)
Nguồn: (Hà 2011)
- Sợi nấm ngoại bào:Sợi nấm ngoại bào không có vách ngăn, vai trò làm tăng
rõ rệt diện tích hấp thụ của rễ cây (Bieleski 1973), cầu sợi nấm hình thành con
đường vận chuyển chất dinh dưỡng giữa thực vật cộng sinh và khối đất bám quanh
rễ (Koske and Gemma 1989). Sợi nấm ngoại bào tạo ra chỗ cư ngụ quan trọng của
hệ nấm rễ (Jasper et al. 1989, 1991).
- Bào tử:Bào tử có thể dạng đơn hoặc đa bào, chủ yếu hình thành ở đầu của
sợi sinh bào tử nối tiếp với sợi nấm ngoại bào, đôi khi bào tử cũng xuất hiện bên
trong rễ (Koske et al. 1985), trên bề mặt đất (BeCard and Fortin 1988), trên bề mặt
thực vật hay các mảnh phân giải (Blaszkowski et al. 1998). Số lượng bào tử hình
thành phụ thuộc vào từng loài nấm (Blaszkowski, 1993), loài cây chủ và tính đa
dạng của nó (Blaszkowski1993; Hetrick and Bloom1986), độ màu mỡ của đất và
chế độ phân bón (Koske et al. 1989), đặc điểm vật hậu của cây chủ (Giovannetti
and Avio 2002), cường độ ánh sáng (Daft and El Giahmi 1978), và khả năng cạnh
tranh của từng loài nấm (Koske et al. 1989). Bào tử có kích thước tương đối lớn
(50 ÷ 500 µm), lớn hơn nhiều so với bào tử của những loại nấm khác. Vai trò của
bào tử là phát tán đến nơi sống mới, và khởi đầu quá trình sinh trưởng khi được

tách ra từ cơ thể mẹ. Do đặcđiểm cấu trúc các thành phần cấu tạo nên bào tử ổn
a
b
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


định trong những điều kiện sinh thái khác nhau nên chúng được coi là tiêu chí quan
trọng trong phân loại AM.

Hình 1.4: Sơ đồ cấu trc AM điển hình
(Bao gồm arbuscules, vesicles, si nấm ngoại bào và bào t)
(Nguồn: o/vam/vamsoil2.gif)
c. Sinh trưởng
AM là thể cộng sinh bắt buộc. AM có thể tồn tại một thời gian dài trong đất,
thậm chí khi đất bị hạn hay băng giá dưới dạng các mảnh sợi nấm trong các rễ chết
hoặc tự do trong đất. Tuy nhiên, để sinh trưởng được trong một thời gian dài AM
cần có cây chủ để thu nhận cacbon và năng lượng cần thiết. Do đặc điểm này mà
không thể tiến hành nuôi cấy AM trực tiếp trên môi trường nhân tạo mà cần phải
có giá thể là rễ của thực vật bậc cao.
d. Chu trình sinh sản và vòng đời
Không có chứng liệu về sự sinh sản hữu tính của AM. Nghiên cứu bằng chỉ
thị phân tử đã xác định không có sự tái tổ hợp hoặc ở mức độ rất thấp (Kuhn et al.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


2001). Vì thế thường giả định rằng bào tử được hình thành bằng sinh sản vô tính
bằng bào tử hoặc sợi nấm.
Phương thứ c nả y mầ m củ a bào tử: Trong nhữ ng điề u kiệ n nhiệ t độ thí ch hợ p,
bào tử AM sẽ nảy mầm trong đất , trên rễ cây chủ , hình thành sợi nấm tạo mạng
lướ i hệ sợ i phân bố trong đấ t và ăn sâu và o rễ cây chủ . Bào tử có thể tạo ra hệ sợi

nấ m bên trong cũ ng như bên ngoà i rễ .
Sinh sả n bằ ng sợ i nấ m: Nhiề u loà i AM có thể nhân lên từ mả nh sợ i nấ m trong
đấ t hoặ c trự c tiế p từ thể cộ ng sinh trên rễ cây. Đặc điểm của nấm rễ nội cộng sinh AM
là thể cộng sinh bắt buộc với rễ cây chủ, do đó nế u không có rễ cây chủ cho cá c sợ i
nấ m nả y mầ m và cộ ng sinh thì sinh trưở ng củ a nấ m sẽ bị ngừ ng trệ lạ i sau mộ t thờ i
gian và tế bà o chấ t có thể co lạ i bên trong bà o tử.
Phương thứ c nuôi cấ y: Để nuôi cấ y nấ m rễ nộ i cộ ng sinh AM, có thể sử dụng
hai phương thứ c nuôi cấ y , đó là : nuôi cấ y in vitro và in vivo. Đối với nuôi cấy in
vivo, có thể nuôi cấy trong chậu bằng đất hiện trường có chứa bào t ử hay sợi nấm
(Bianciotto và cộ ng sự , 2000; Hijri và cộ ng sự , 2002). Còn đối với nuôi cấy in
vitro, có thể tạo ra một số lượng lớn nấm rễ thông qua nuôi cấy mô rễ trên môi
trườ ng nuôi cấ y nhân tạ o (Fortin et al. 2002). Đặc biệt là trong nuôi cấy mô rễ, sinh
khố i nấ m rễ tạ o ra thườ ng không chứ a tạ p chấ t và cá c vi sinh vậ t khá c nên phương
pháp này được sử dụng nhiều.
1.1.3. Vai trò của nấm rễ nội cộng sinh với cây chủ
Nấm rễ là thể sống cộng sinh bắt buộc. Những hoạt động của nấm cũng như
của thực vật có vai trò hỗ trợ cho nhau. Nấm sử dụng nguồn cacbon từ thực vật
dưới dạng đường hexoses và các vitamin. Sự vận chuyển cacbon từ thực vật sang
nấm được thực hiện nhờ arbuscules hoặc các sợi nấm nội bào. Tại các sợi nấm nội
bào diễn ra quá trình biến đổi dinh dưỡng thứ cấp để cung cấp glycogen, pentose,
lipit… cho hoạt động của nấm (Turmel 2004). Gần 20% cacbon do thực vật tổng
hợp được chuyển sang nấm và khoảng 25% cacbon nguồn gốc từ thực vật được
nấm biến đổi và dự trữ ở những sợi nấm ngoại bào, việc này góp phần làm tăng
thêm nguồn hữu cơ trong đất.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Lợi ích của AM đối với thực vật chủ yếu là tăng cường cải thiện hấp thụ các
chất dinh dưỡng và nước, trong đó quan trọng nhất là tăng cường hấp thụ dinh
dưỡng lân (P), hấp thụ nước, chống chịu với các yếu tố bất lợi của môi trường, đặc

biệt trên các hiện trường đất đai cằn cỗi, khô hạn. Hoạt động này được tăng cường
là do nấm rễ nội cộng sinh hình thành nhiều hệ sợi nấm phân nhánh mảnh tạo
thành vô số cầu nối giữa môi trường đất với các tế bào rễ, tăng diện tích tiếp xúc
với đất, biến đổi môi trường quanh rễ làm cho các chất trở nên linh động và thực
vật có thể hấp thụ được (đến 80% nhu cầu về P và 25% nhu cầu về N của cây được
cung cấp nhờ nấm) (Turmel 2004). Sợi nấm có thể lan rộng đến 8cm quanh rễ và
hấp thụ chất dinh dưỡng vận chuyển lại vào rễ, tăng khả năng hấp thụ các chất dinh
dưỡng cao hơn so với lông rễ 10 lần. Tốc độ thâm nhập của P qua sợi nấm cao gấp
6 lần so với qua các lông rễ.
Không những thế, thực vật còn được hưởng lợi nhờ được tăng cường khả
năng hấp thụ nước và bảo vệ rễ khỏi nguồn bệnh. AM có vai trò kích thích sinh
trưởng thực vật bằng cách tiết ra rất nhiều các chất kích thích sinh trưởng như
auxins, cytokinins, gibberellic acids và một số chất kháng sinh để bảo vệ cây chủ
chống lại các mầm bệnh từ trong đất.
Sự cộng sinh AM có thể làm tăng cường sinh trưởng của cây con lên đến
400%, giúp cây có khả năng chống chịu với điều kiện khô hạn và nghèo dinh
dưỡng (Pope 2007). Thực tế ở những loài gỗ lớn có cộng sinh AM cho thấy cây
vẫn tồn tại và sinh trưởng trong điều kiện độ ẩm rất thấp trong khi những cây
không có cộng sinh thì không sống được hoặc sinh trưởng yếu. Kết quả nghiên cứu
cũng cho thấy, sinh trưởng của cây con những loài gỗ lớn có sự cộng sinh AM đạt
ngang với cây không có sự cộng sinh nhưng chúng chỉ sử dụng lượng dinh dưỡng
bằng một nửa. Những loài sống phụ thuộc vào AM chủ yếu là ở những nơi đất
chặt, khô cằn, có hệ rễ ít phân nhánh vì lúc đó lượng chất dinh dưỡng tồn tại nhiều
ở dạng khó tiêu, rễ cây không thể hấp thụ được mà phải nhờ đến sự lan rộng của hệ
sợi nấm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Hình 1.5. Cây Medicago truncatula phát triển bình thường (a)

Cây Medicago truncatula có cộng sinh nấm rễ (b)
Nguồn:(Lan 2011)
Nấm AM không phải là một thành phần chính trong đất nhưng có vai trò
quan trọng trong sự điều chỉnh hoạt tính sinh học của đất nhờ sự phân bố rộng
khắp của hệ sợi nấm AM trong lớp đất tầng mặt. Nấm AM hấp thụ trực tiếp hợp
chất carbon do cây cố định và cấu thành đầu vào chính của carbon và năng lượng
trong đất, chúng phân phối carbon này khắp cả khu vực đất quanh rễ cây cho vi
sinh vật đất sử dụng. Lượng cacbon đáng kể được vận chuyển bằng hệ sợi nấm từ
cây này sang cây khác đã được xác định (Simard et al. 1997). Điều này giúp giảm
sự cạnh tranh giữa các loài khác nhau và góp phần vào tính ổn định và đa dạng của
hệ sinh thái.
AM tham gia vào biến đổi mối quan hệ đất- cây- nước, tăng cường sự thích
nghi của thực vật với các điều kiện bất lợi (khô hạn, nhiễm kim loại). Ở những nơi
có hàm lượng kim loại nặng cao, AM có vai trò khử độc môi trường giúp cây sinh
trưởng tốt (Songul and Sevinc 2002).Bắt đầu từ cải thiện hấp thụ nước và các chất
dinh dưỡng quan trọng cho sự sinh trưởng của cây sẽ dẫn tới tăng hiệu suất quang
hợp, sự vận chuyển chất dinh dưỡng và sự trao đổi chất của cây. Cây sinh trưởng
nhanh, giảm bớt việc sử dụng phân bón hóa học (đôi khi lên tới một nửa lượng dự
kiến) dẫn tới tăng thu nhập cho nông dân. Kết quả thử nghiệm phân bón sinh học
mycorrhiza trên cây Asparagus đã chứng minh được điều đó, khi những nông dân
sử dụng lượng phân bón hóa học cùng với phân bón sinh học mycorrhiza thì năng
a
b
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


suất cây trồng được cải thiện hơn 50% và thu nhập của nông dân tăng 61% so với
khi sử dụng chỉ mỗi phân bón hóa học.
1.2. Tổng quan về vi khuẩn Agrobacterium rhizogenses
Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenses lần đầu tiên được phát hiện cách đây

hơn 70 năm (Riker et al. 1930, Hildebrand 1934, White 1972) như một yếu tố gây
nên bệnh ―lông rễ― (hairy-root disease) ở một số thực vật. A. rhizogenses thuộc
Chi Agrobacterium, là vi khuẩn đất, gram âm, có hình que. A. rhizogenses có quan
hệ gần gũi với vi khuẩn A. tumefaciens, một loại vi khuẩn được biết nhiều đến vì
gây nên bệnh ―u biếu thực vật― (crown gall disease) rất phổ biến (Conn 1942).
Cơ chế nhiễm thông qua quá trình tiếp xúc, vi khuẩn A. rhizogenses chuyển
một đoạn T-DNA, trong đó có mang các gen liên quan đến tạo lông rễ(rol-genes),
gen liên quan tới quá trình sinh tổng hợp và cả các gen chưa xác định được chức
năng trong vòng Ri- Plasmid của chúng vào bộ gen của tế bào thực vật chủ; các
gen (rol-genes) trong T-DNA tương tác với gen của thực vật chủ để tạo ra lông rễ.
Các biểu hiện gen có chứa các thông tin được mã hóa trong T-DNA này đã thúc
đẩy quá trình phát triển và sản xuất ra lông rễ với hầu hết các thực vật hai lá mầm
(Veena and Taylor 2007) (Hình 1.6). Quá trình chuyển các gen (rol-genes) trong T-
DNA từ vi khuẩn A. rhizogenses sang thực vật chủ có thể được xảy ra ngẫu nhiên,
cũng có thể được thực hiện bằng các kỹ thuật đồng nuôi cấy đơn giản với các
chủng A. rhizogenses hoang dại tự nhiên (Abdoulaye 2003, Chabaud et al. 2006),
và cũng có thể thực hiện bằng kỹ thuật biến nạp gen hiện đại (Pak et al. 2009, Park
et al. 2011).
Vi khuẩn A. rhizogenses tiếp cận chuyển gen T-DNA sang thực vật chủ
thông qua các ―vết thương―, các hợp chất phenolic tiết ra từ các vết thương của tế
bào thực vật đã hấp dẫn A. rhizogenses, sau quá trình nhiễm là quá trình hợp nhất
các nguyên liệu di truyền T-DNA của A. rhizogenses với hệ gen thực vật chủ, và
kết quả tạo nên bệnh lông rễ (Veena and Taylor 2007). Về hình thái học, lông rễ
tạo ra do vi khuẩn A. rhizogenes có hình dạng và cấu trúc rất giống với các loại rễ
thông thường, tuy nhiên nó có những tính trạng rất đặc trưng, dễ dàng nhận biết là:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


tóc rễ dài, sinh khối rễ lớn, phân nhánh nhiều, tóc rễ phát triển nghiêng và không
có tính hướng đất (negative geotropism)

Bệnh lông rễ từ vi khuẩn A. rhizogenses được nghiên cứu áp dụng rộng rãi
như một công cụ hữu hiệu cho các nghiên cứu trao đổi chất thứ cấp, chức năng
gen, cộng sinh vi khuẩn cố định đạm rhizobium, nấm rễ nội cộng sinh AM
(Abuscular mycorhizae), và các đặc tính sinh học rễ thực vật khác (Tsuro et al.
2005, Chabaud et al. 2006, Veena and Taylor 2007, Sidwa-Gorycka et al. 2009,
Park et al. 2011).

Hình 1.6:Cấu trúc vòng Ri-plasmids của vi khuẩn A. rhizogenes
(Veena and Taylor 2007)
1.3. Nghiên cứu nấm rễ nội cộng sinh trên Thế giới và Việt Nam
1.3.1. Trên Thế giới
Giai đoạn đầu, các nghiên cứu về AM trên thế giới tập trung ở các mặt: đa
dạng sinh học của các chủng bản địa, phân loại, chọn lọc các chủng hiệu lực với
từng đối tượng cây trồng và đất trồng khác nhau, đồng thời phát triển những
phương pháp để định lượng và nhân nhanh chúng. Phương pháp nhân sản xuất chất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


nhiễm AM truyền thống là sử dụng các thực vật chủ (trap plant) để nhân AM trong
nhà kính, vườn ươm từ hệ rễ của chúng trên các giá thể gây trồng khác nhau (in
vivo). Bằng phương pháp này, chất nhiễm AM thu được còn được gọi là ―soil
innoculum‖ ở dạng thô, thường có độ sạch AM không cao, số lượng, chất lượng
AM (IP- infective propagules) và hiệu quả áp dụng còn bị hạn chế. Vấn đề đặt ra là
cần có một công nghệ cao hơn, hiệu quả hơn để có thể nhân sinh khối lớn, sản xuất
chế phẩm chất nhiễm AM thuần khiết, chất lượng và có hiệu quả áp dụng cao cho
tăng sinh trưởng, chất lượng sản phẩm cây trồng và bảo vệ môi trường đất. Trong
công nghệ này, chúng ta cần phải chú ý tới một đặc tính quan trọng của nấm rễ nội
cộng sinh AM, đó là, trong bất kỳ điều kiện nuôi cấy nào, ở bên ngoài môi trường
đất (in vivo) hay trong điều kiện nuôi cấy vô trùng (invitro), sinh khối của chúng
chỉ có thể được nhân lên khi hình thành được cộng sinh với tế bào vỏ rễ của các

thực vật chủ. Do đó, việc sử dụng môi trường dinh dưỡng nhân tạo không có giá
thể mô rễ không đáp ứng được nhu cầu sinh trưởng, phát triển của AM (Roger et
al. 2004b).
Nghiên cứu về AM thường xuyên bị cản trở bởi đặc tính cộng sinh bắt buộc
của chúng (Bago and Bécard 2002). Một hướng nghiên cứu mới đó là, nuôi cấy in
vitro đã phát huy được rất nhiều lợi thế, nó cho phép nghiên cứu được cơ bản
những đặc tính sinh lý của sự cộng sinh nấm-rễ. Những nghiên cứu thử nghiệm
đầu tiên đã được tiến hành, có thể kể đến như (Mosse and Hepper 1975a). Sau đó
được bổ sung bởi (Fortin et al. 2002)(Declerck et al. 2005).
Trong những năm 1980, sự phát triển công nghệ nuôi cấy mô rễ đã mở ra
một hướng đi mới, cho phép nuôi cấy thành công một số chủng AM trong điều
kiện in vitro. Sử dụng phương pháp này, nấm AM và rễ cây được nhân lên đồng
thời và nhanh chóng qua một số lần cấy chuyển, thời gian được rút ngắn rất nhiều
và đảm bảo được độ thuần khiết cao (Fortin et al. 1996b).
Hai loại môi trường được sử dụng thường xuyên nhất trong nuôi cấy AM in
vitro là môi trường M(BeCard and Fortin 1988) và môi trường MSR (Strullu and
Romand 1986, Declerck et al. 1998). Cả hai loại môi trường này đều có chứa các
nguyên tố đa lượng, vi lượng, vitamin và đường (Cranenbrouck et al. 2005). Đồng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


thời, chúng có thể được làm rắn bởi hợp chất Agargel hoặc Phytagel. Năm 2006,
nhóm nghiên cứu của Gadkar và cộng sự (Gadkar et al. 2006) đã tiến hành nuôi cấy
AM trên môi trường M lỏng bằng phương pháp chia ngăn. Theo đó, một ngăn của đĩa
petri nuôi cấy nấm có cung cấp thêm đường, ngăn còn lại không có đường cũng như
vitamin. Giống như trong phương pháp nuôi cấy in vivo, việc cung cấp đầy đủ ôxi cho
môi trường lỏng là việc làm cần thiết trong nuôi cấy in vitro(Jolicoeur et al. 1999).
Tuy nhiên, một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng, môi trường MSR (Strullu and
Romand 1986, Declerck et al. 1998) là môi trường đã được biến đổi thành phần với
mục đích tối ưu hóa cho sự phát triển của nấm rễ trong điều kiện in vitro. Trong đó,

thành phần đa lượng của MSR là tương tự trong môi trường M (Minimal medium).
Sự khác nhau giữa hai loại môi trường này là ở thành phần vitamin: MSR vừa thiếu
iốt, myo-inositol và glycin còn trong thành phần vitamin của môi trường M thiếu
panthotenate, biotin và cyanocobalamine. Tuy nhiên, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng,
sự vắng mặt của những thành phần này không có hiệu quả tiêu cực rõ rệt đến sự
cộng sinh AM.
Trong những năm 2000, rất nhiều nghiên cứu về công nghệ nuôi cấy AM in
vitro được tiến hành trên môi trường MSR (Strullu and Romand 1986, Declerck et
al. 1998) không bổ sung đường và vitamin (Voets et al. 2005a)(De Boulois et al.
2006)và được làm rắn bởi Phytagel hoặc Agargel. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc
bổ sung đường và vitamin là không cần thiết trong hệ thống nuôi in vitro vì thực
vật có khả năng tự quang hợp tạo đường và chuyển hóa vitamin cần thiết cho sự
phát triển của chúng. Nghiên cứu của (Declerck et al. 2009) cũng sử dụng MSR mà
không có đường và vitamin.
Năm 1996, St-Arnaud và cộng sự (St-Arnaud et al. 1996) lần đầu tiên sử
dụng phương pháp chia ngăn. Trong phương pháp này, đĩa petri được chia thành
hai ngăn riêng biệt, một ngăn có chứa giá thể rễ, ngăn còn lại chỉ có AM phát triển.
Sử dụng phương pháp phân chia đĩa, (Douds 2002a) đã chứng minh được rằng, bào
tử AM tiếp tục được hình thành sau khi có sự bổ sung môi trường có đường từ
ngăn chứa giá thể rễ.