nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện gen độc tố của b. cereus trong thực phẩm bằng kỹ thuật multiplex pcr

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm (VSATTP) là một trong những
vấn đề được ưu tiên hàng đầu của mọi quốc gia trên thế giới. VSATTP liên
quan trực tiếp tới sức khỏe con người. VSATTP không đảm bảo sẽ có thể gây
ra những tổn thất không nhỏ cho nền kinh tế. Ước tớnh mỗi năm có khoảng 3-
4 triệu người bị ngộ độc thực phẩm. Những năm qua, kinh tế nước ta được đổi
mới, phát triển và nhiều khởi sắc; đời sống nhân dân được cải thiện. Bên cạnh
đú cỏc vụ ngộ độc thức ăn vẫn xảy ra thường xuyên, khắp mọi nơi và ngày
càng nhiều mà nguyên nhõn chớnh là do nhiễm khuẩn
Có 2 dạng ngộ độc chính do vi sinh vật:
+ Do thực phẩm ăn bị nhiễm vi khuẩn: Salmonella, shigella, E. coli,Vibrio…
+ Do thực phẩm ăn bị nhiễm độc tố của vi khuẩn: độc tố của tụ cầu vàng
(Staphylococcus aureus), độc tố của vi khuẩn gây ngộ độc thịt (Clostridium
botulinum), độc tố của vi khuẩn gây nhiễm vào các loại ngũ cốc, gia vị, và các
loại thực phẩm khác Bacillus cereus (B.cereus)
Ngộ độc do nguyên nhân vi khuẩn chiếm khoảng 2/3 các vụ ngộ độc
thực phẩm. Trong số các căn nguyên vi khuẩn, B.cereus được biết đến như là
một trong những căn nguyên gây ngộ độc thực phẩm quan trọng ở các nước
phát triển và đang phát triển, nó đã và đang thu hút được sự quan tõm cả về
mặt lõm sàng lẫn chẩn đoán trong phòng xét nghiệm. B.cereus có trong mặt
khắp nơi trong môi trường, nó gõy bệnh bằng cách sinh độc tố. Tại châu Âu
từ năm 1973-1985 các vụ ngộ độc thực phẩm do B.cereus chiếm khoảng
17,8% các trường hợp ngộ độc thực phẩm [12], tại Hà Lan là 19% và ở Đài
Loan nó xếp thứ 3 trong các nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm
[16].Tại Norway từ năm 1988-1993 B.cereus chiếm khoảng 33% trong tổng
số các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, ở Iceland từ năm 1985-1992 tỷ lệ
1
này là 47% và tỷ lệ thấp hơn ở các quốc gia khác: Mỹ là 1,3% và Canada là
2,2%. B.cereus được tìm thấy trong khoảng 25% sản phẩm thực phẩm lấy
mẫu: kem, bánh, thịt, khoai tây, sữa, gạo. Ô nhiễm của các sản phẩm thực
phẩm thường xảy ra trước khi nấu [26]

Có nhiều phương pháp xác định B.cereus gây ngộ độc thực phẩm:
o Phương pháp định danh kinh điển dựa vào việc phân lập và các
đặc tính sinh hóa, sinh lý của B.cereus. Tuy nhiên phương pháp
này chỉ xác định thực phẩm có hay không có B.cereus mà không
phát hiện được các thực phẩm đó có độc tố hay không.
o Phương pháp ELISA có thể sử dụng để phát hiện độc tố trong
thực phẩm, tuy nhiên đây chỉ là phương pháp gián tiếp nên độ
nhạy không cao [13].
o Phương pháp sử dụng kỹ thuật sinh học phõn tử như phản ứng
khuyếch đại gen – Polymerase Chain Reaction (PCR) đang được
sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng
cũng như trong chẩn đoán các tác nhân gây ngộ độc có trong thực
phẩm. Phương pháp này cho phép xác định chính xác được sự ô
nhiễm của thực phẩm với các chủng vi khuẩn gây bệnh thông qua
sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn gây bệnh.Ưu
điểm của kỹ thuật này là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tiết kiệm
thời gian, kể cả nguyên vật liệu. Ở Việt Nam đó có một vài
nghiên cứu được công bố về việc sử dụng kỹ thuật PCR để phát
hiện căn nguyên gây ngộ độc thực phẩm của các vi khuẩn như
S.aureus, E. coli O157, Salmonella…. nhưng chưa đề cập đến
việc xác định các gen gây độc của B.cereus trong thực phẩm.
Trên thưc tế, Việt Nam là nước có điều kiện khí hậu nóng ẩm tạo điều
kiện thuận lợi cho B.cereus phát triển trong thực phẩm và giải phóng ra độc
2
tố, ý thức của người dân chưa đầy đủ và đặc biệt là việc sử dụng rất nhiều các
sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ gạo làm cho tỷ lệ ngộ độc thực phẩm do
B.cereus là không nhỏ ở Việt Nam do đó việc nghiên cứu áp dụng một kỹ
thuật với nhiều cặp mồi có độ nhạy , độ đặc hiệu cao nhằm phát hiện các gen
đặc hiệu của B.cereus gây ngộ độc thực phẩm trong một phản ứng để tiết
kiệm thời gian và kinh phí là hết sức cần thiết và có ý nghĩa thiết thực, giúp

nghiên cứu sâu hơn về căn nguyên gây ngộ độc thực phẩm do B.cereus. Để
góp phần kiểm soát VSATTP, giảm chi phí xã hội thông qua việc ngăn ngừa
các vụ ngộ độc thực phẩm do B.cereus và nâng cao năng lực kiểm soát
VSATTP của các cơ quan chức năng. Đề tài “Nghiờn cứu xây dựng quy
trình phát hiện gen độc tố của B. cereus trong thực phẩm bằng kỹ thuật
multiplex PCR”
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1. Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện gen độc tố B. cereus bằng kỹ
thuật Multiplex-PCR ở quy mô phòng thí nghiệm.
2. Thử nghiệm quy trình trên để phát hiện gen độc tố của B.cereus trong
một số thực phẩm có nguồn từ gạo tại Hà nội.
3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. TÌNH HÌNH VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM
1.1.1 Trên thế giới
Ngày nay B.cereus được coi là một trong những căn nguyên quan trọng
gây ngộ độc thực phẩm mặc dù không phổ biến như Salmonella hoặc các loài
khỏc gõy bờnh qua thực phẩm [27]. Tuy nhiên số lượng chính xác về các
trường hợp ngộ độc thức ăn do B.cereus không được ghi nhận một cách đầy
đủ. Giữa năm 1972 và năm 1983 các trường hợp ngộ độc thức ăn do B.cereus
chiếm 2% tổng số các dịch bệnh truyền qua thực phẩm. Năm 1980: 9 ổ dịch
đã được báo cáo với trung tâm kiểm soát dịch bệnh, bao gồm các thực phẩm
như thịt bò, gà tây …. Năm 1981: 8 ổ dịch đã được báo cáo chủ yếu liên quan
đến gạo, còn nhiều vụ dịch khác không được báo cáo hoặc bị chẩn đoán sai
vỡ cỏc triệu chứng tương tự nhiễm độc Staphylococcus aureus (B.cereus loại
gây nôn) hoặc C.perfringens (B.cereus loại tiêu chảy) [24].
1.1.2 Ở Việt Nam
Việc ra đời của cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm đã đánh dấu một bước
quan trọng trong công tác quản lý và chăm sóc sức khỏe cho nhân dân trong

đó bao gồm cả các bệnh lây truyền qua đường thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm
là một vấn đề đang được quan tâm hàng đầu tại Việt Nam, theo ước tính của
bộ Y tế, chỉ riêng năm 2001 đó cú 4,2 triệu người bị ngộ độc thực phẩm. Ở
nước ta hiện nay theo báo cáo của bộ y tế, chỉ có khoảng 38 trung tâm y tế có
khả năng kiểm nghiệm được loài vi khuẩn này, khoảng 60% các tỉnh thành có
năng lực kiểm nghiệm [8]. Từ năm 2001-2006, cả nước ghi nhận được hơn
4
5600000 ca tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm, trong đó có 84 ca tử vong. Riêng
trong 9 tháng đầu năm ngoái ghi nhận được hơn 750.000 ca tiêu chảy trong đó
có 12 ca tử vong. Thực tế theo các chuyên gia phải gấp ít nhất 10 lần con số
được công bố. Đặc biệt trong những năm vừa qua đã xảy ra rất nhiều vụ dịch
ngộ độc thực phẩm do Salmonella, Staphylococcus aureus, phần lớn xảy ra tại
các bếp ăn tập thể của các khu công nghiệp. … Tuy nhiên, chúng ta chưa có
thống kê rõ ràng về căn nguyờn gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm. Điều này
phản ánh sự đầu tư chưa đúng mức về nguồn lực trong công tác thanh tra
giám sát VSATTP và đặc biệt vào cỏc phũng xét nghiệm thực phẩm là một
trong những hạn chế ảnh hưởng đến công tác bảo đảm VSATTP. Mặc dù đã
xảy ra rất nhiều vụ ngộ độc thực phẩm mà căn nguyên là do B.cereus nhưng
chúng ta chưa có một công bố nào về tình hình ngộ độc thực phẩm do
B.cereus gây ra tại Việt Nam và chưa có nhiều nghiên cứu nhằm xác định
thực trạng ô nhiễm của vi khuẩn này trong thực phẩm. Các cuộc giám sát tình
trạng ô nhiễm thực phẩm trong những năm vừa qua chủ yếu tập trung vào
việc đánh giá thực trạng ô nhiễm của thực phẩm với E.coli, staphylococus,
vibrio… Việt Nam là quốc gia có khí hậu nóng ẩm điều đó tạo điều kiện thuận
lợi cho B.cereus phát triển trong thực phẩm và giải phóng ra độc tố, ý thức
của người dân chưa đầy đủ và đặc biệt là việc sử dụng rất nhiều các sản phẩm
thực phẩm có nguồn gốc từ gạo làm cho tỷ lệ ngộ độc thực phẩm do B.cereus
là không nhỏ ở Việt Nam
1.2 VÀI NẫT VỀ BACILLUS CEREUS
1.2.1 Cỏc nghiên cứu về B.cereus

Trên thế giới
Các vụ ngộ độc thực phẩm do B.cereus có thể gặp ở các nước phát triển
và đang phát triển. Thức ăn nhiễm độc B.cereus là một khái niệm phổ biến
khắp thế giới. Quá trình nấu chín không tiêu diệt được vi khuẩn này vì B.
Cereus có khả năng tạo thành dạng bào tử để tự vệ, do đó nếu ăn ngay sau khi
5
nấu thì bào tử không có cơ hội phục hồi, dưới các điều kiện bảo quản không
đúng sau khi nấu các bào tử nảy mầm, tạo thành các tế bào sinh dưỡng và
được nhân lên. Đặc biệt là cơm nhiễm B.cereus không hề có biểu hiện gì khác
thường về mùi vị, màu sắc nên không thể nhận biết, do vậy nhiều trường hợp
ngộ độc do cơm nguội chúng ta lại lại nghĩ đến nguyên nhân ngộ độc do các
loại thức ăn khác. B. Cereus có khả năng sản sinh rất nhanh có thể phát triển
trên nhiều loại thực phẩm khác nhau như: rau sống, giá đỗ, bơ sữa [44]. Đõy
là mối lo ngại về vệ sinh, an toàn thực phẩm cho nhiều quốc gia trên thế giới.
Vì vậy việc nghiên cứu về dịch tễ, cơ chế bệnh sinh, các độc tố của B.cereus
ngày càng được chú trọng.
B.cereus lần đầu tiên được Frankland phân lập và mô tả nào năm 1887.
Tuy nhiên, cho đến tận năm 1950, vi khuẩn này mới được Hauge và cộng sự
chứng minh là căn nguyên gây ra các vụ dịch ngộ độc thức ăn. Các vụ dịch
ngộ độc thức ăn do B.cereus với đặc điểm là nôn và tiêu chảy [18]. Để khẳng
định B.cereus là nguyên nhân gây ngộ độc, Hauge đó phỏt triển mẫu phân lập
đến nồng độ khoảng 4x10
6
/ml và uống 200ml cocktail. Sau 13h, ông cảm thấy
đau bụng và đi tiêu ra nhiều nước, triệu chứng này dai dẳng khoảng 8h. Hơn
20 năm sau, một triệu chứng gây ngộ độc thực phẩm khác do chủng B. cereus
gây ra lại xuất hiện ở cỏc cụng nhân người Anh. Triệu chứng này nặng hơn
triệu chứng nôn mửa và kéo dài một thời gian ngắn (chưa đến 5h), điều này
cho thấy rằng đây là một sự nhiễm độc
Việt Nam:

Ở nước ta hiện nay theo báo cáo từ bộ y tế, chỉ có khoảng 38 trung tâm
y tế có khả năng kiểm nghiệm được loài vi khuẩn này, khoảng 60% các tỉnh
thành có năng lực kiểm nghiệm. Tuy nhiên hiện nay phương pháp xét nghiệm
vẫn dựa trên phương pháp đếm tổng số khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh
dưỡng kết hợp với các xét nghiệm hóa sinh khác. Phương pháp này có nhược
6
điểm là thời gian lâu, có thể mất nhiều ngày hoặc vài tuần, độ chính xác
không cao và không có khả năng cơ động
Kỹ thuật ELISA có thể sử dụng để phát hiện độc tố này trong thực
phẩm, tuy nhiên qui trình này tương đồi phức tạp và phải có những cán bộ
kinh nghiệm được đào tạo bài bản mới có thể thực hiện được, bởi vậy kỹ thuật
này chưa được áp dụng ở Việt Nam [13]
Tại Việt Nam, mới chỉ có Trần Linh Thước và CS ứng dụng kỹ thuật
sinh học phân tử trong xét nghiệm một số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm
như: E.coli, E.coli 0157 :H7, Salmonella spp, Shigella spp, V.cholerae,
V.parahaemolyticus, C.perfringens, B.cereus, S.aureus, Listeria
monocytocytes và Campylobacter spp. Trong nghiên cứu này, các tác giả
chọn gen gyr B để phát hiện B.cereus trong thực phẩm cho kết quả phát hiện
tương đương với kết quả bằng phương pháp nuôi cấy [8]. Tuy nhiên, kỹ thuật
trong nghiên cứu này chỉ phát hiện được sự tồn tại của B.cereus trong thực
phẩm mà không thể phát hiện được các chủng vi khuẩn này liệu có mang độc
tố hay không.
1.2.2 Một số hình ảnh của Bacillus cereus
7

Bacillus cereus dưới kính hiển vi
Khuẩn lạc Bacillus cereus trên môi trường thạch máu cừu
1.2.3 Đặc tính sinh học của B.cereus
B.cereus là trực khuẩn kỵ khí, gram dương, rộng khoảng 1 μm, dài
khoảng 3-4μm, có khả năng sinh nha bào, bào tử dạng hình ovan có thể sống

sót khi xử lý nhiệt và hóa chất [11], chúng có khả năng thích nghi với một
loạt các điều kiện môi trường, nó được phân phối rộng rãi trong tự nhiên như
trong bụi, đất, ở các loài động vật khác nhau, thường thấy trong những hạt
8
ngũ cốc, gạo, bột hoặc thực phẩm khô lẫn lộn chung với nhau như gạo, mì,
khoai, ngụ do bị nhiễm từ đất trong quá trình trồng trọt và thu hoạch [32]
Đặc điểm nuôi cấy:
• Là loại vi khuẩn dễ mọc trờn các môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông
thường
• Tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ 5-50
0
C, tối ưu ở 35-40
0
C
• pH 4,5-9,3, thích hợp ở pH 7-7,2
• Trên môi trường LB lỏng: đục
• Trên môi trường thạch MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin) và môi
trường thạch Mossel (cereus selective agar) vi khuẩn B. cereus mọc tạo thành
dạng khuẩn lạc có màu hồng phấn chung quanh có vòng sáng.
Tính chất sinh hóa:
• Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kị khí,
• Khử nitrat thành nitrit.
• Phân giải Tyroxin
• Catalase (+), Citrate (+)
Theo phân loại quốc tế B.cereus :
• Ngành (phylum) firmicutes
• Thuộc giới bacteria
• Lớp (class) bacilli
• Bộ (order) Bacillales
• Họ (family) Bacillaceaem

• Chi (genius) Bacillus
• Loài (species) Cereus
Độc tố của B.cereus : B.cereus gây bệnh bằng sinh độc tố, B.cereus gây
ngộ độc thức ăn sinh ra 6 loại độc tố bao gồm [18].:
9
• Độc tố ly giải hồng cầu (Hbl), có trong khoảng 60% số chủng
B.cereus và nó được xem là yếu tố gây độc cơ bản của B.cereus
nhưng cơ chế hoạt động nội độc tố của nó vẫn chưa được biết rõ.
Độc tố gây ly giải hồng cầu có 3 thành phần protein B, L1, L2, 3
protein đó lần lượt được mã hóa bởi bởi 3 gen nheA, nheB, và nheC.
• Độc tố ruột không ly giải hồng cầu (Nhe) là một độc tố có bản chất là
protein 3 thành phần do hầu hết các chủng B.cereus sinh ra, với các
thành phần tương tự Hbl ; Độc tố khụng gõy ly giải hồng cầu BL có
protein liên kết B mã hóa bởi gen hblA, các protein ly giải L1 và L2
mã hóa bởi gen hblC và hblD. Tất cả các hoạt động của Hbl đều cần
cả 3 loại protein trên.
• Độc tố T(BceT): là độc tố có hoạt động sinh học tương tự như Nhe và
có bản chất protein 1 thành phần.
• Độc tố FM (EntFM) là độc tố có bản chất protein 1 thành phần với
vai trò và đặc tính chưa được biết đến.
• Nội độc tố K (CytK), loại độc tố này giống độc tố beta của vi khuẩn
Clostridium perfring. CytK gần đõy đã được phát hiện trong khoảng
85% số chủng B.cereus.
• Độc tố gây nôn (Emetictoxin). Độc tố này có tên là cereulide được
hình thành trước trong thực phẩm, là nguyên nhõn của hội chứng nôn,
bản chất là một dodecadepsipeptide có một vòng 4 acid amin với phân
tử lượng 1,2 kDa và/ hoặc oxy acid [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val]
lặp đi lặp lại 3 lần, bền với nhiệt, pH và sự phân giải protein: nó vẫn
hoạt động ở nhiệt độ 121
0

C, có khả năng chịu các điều kiện của axit,
độc tố gõy nôn phát triển tốt trong thức ăn từ cơm, khoai tây nghiền,
thực phẩm có nhiều tinh bột và rau [9 ; 32],
10
Hình 1: Cấu trỳc hoỏ học của độc tố gây nôn
Tiêu chảy là do độc tố gây ly giải hồng cầu BL, độc tố ruột khụng gõy
ly giải hồng cầu và độc tố K. Độc tố liên quan đến hội chứng tiêu chảy
không bền với axit của dạ dày, độc tố tiêu chảy phát triển nhiều trong thực
phẩm từ rau, thịt, [32]. Độc tố tế bào K (cytK) của B.cereus là một yếu tố
quan trọng gây ngộ độc thực phẩm vì hoạt tính ly giải hồng cầu và gây độc
tế bào của nó.
Bào tử của B.cereus có khả năng bám vào các tế bào Caco-2 (tế bào
biểu mô của người). Sau khi bám vào, các bào tử này nảy mầm một cách
nhanh chóng (trong vòng 1h), hình thành tế bào B.cereus sinh dưỡng trên đỉnh
của các tế bào biểu mô, tiếp đó là sản sinh ra độc tố, nếu độc tố này xuất hiện
trong đường ruột, độc tố đường ruột sẽ tập trung khoanh vùng ở vùng ngoại
biên của ống ruột sẽ tăng cao hơn và vì vậy gây nên mối nguy lớn hơn và gây
bệnh một cách trầm trọng, thời gian ủ bệnh sẽ lâu hơn [44].
Ngoài gây ngộ độc thực phẩm B.cereus còn gây bệnh ở mắt trong
trường hợp viêm nội nhãn sau chấn thương có thể dẫn đến mất khả năng nhìn
nếu không được điều trị kịp thời. Việc nhiễm B.cereus cũng xuất hiện dự
khụng đặc hiệu ở những người bị ung thư, suy giảm miễn dịch và một số bệnh
11
khác. B.cereus cũng là một trong những nguyên nhân gây viêm vú và sảy thai
ở gia súc, và một số bệnh khác.
Bảng 1.1: So sánh độc tố gây tiêu chảy và độc tố gây nôn[33]
Đặc tính Độc tố gây tiêu chảy Độc tố gây nôn
Thành phần hóa
học Protein Cereulide
Độc tố được sản

sinh ra Trong ruột non
Trong thực phẩm (25-
30
0
C)
Liều nhiễm độc
10
5
-10
8
cfu/g thực phẩm
10
5
-10
8
cfu/g thực
phẩm
Thời gian ủ bệnh 8- 16h ẵ- 5h
Thời gian mang
bệnh 12-24h 6-24h
Bền với nhiệt 45
0
C/ 30 phút 120
0
C/ 90 phút
pH Ổn định pH 4-11
Ổn định pH 2-11
Triệu chứng
Đau bụng dai dẳng, đi ngoài
nhiều nước, thỉnh thoảng

buồn nôn. Buồn nôn, nôn mửa
Loại thực phẩm
thường gặp nhất
Sữa, sản phẩm của sữa, rau,
sản phẩm từ thịt
Cơm nấu chín hoặc
chiên, mì ống, phở
Bảng 1.2: Các loại độc tố của B.cereus
Độc tố Thành phần độc Protein Gen mó hoỏ
12
tố
Độc tố gây ly giải
hồng cầu (Hbl)
L2 HblC
L1 HblD
B HblA
Độc tố khụng gõy
ly giải hồng cầu
(Nhe)
NheA NheA
NheB NheB
NheC NheC
Đ ộc t ố T BceT
CytK-1 CytK-1
CytK-2 cytK-2
Độc tố FM EntFM EntFM
Độc tố gây nôn
(Cereulide)
Cereulide Ces
1.2.3 Triệu chứng lâm sàng

Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B.cereus khi thực phẩm được chuẩn bị
mà không được giữ trong điều kiện lạnh trong vài giờ trước khi sử dụng
Thực phẩm chứa vi khuẩn ở mật độ 10
6
tế bào/g đủ gây ngộ độc. Các
triệu chứng ngộ độc do B.cereus thường nhẹ và nhanh chóng hồi phục, được
rất nhiều tác giả khác nhau đề cập tới với hai dạng ngộ độc chính :
+ Dạng thứ nhất: xảy ra rất nhanh, buồn nôn, nôn, tiêu chảy
thường xuất hiện trong vòng 5 giờ sau khi ăn phải thức ăn bị ô nhiễm
độc tố của B.cereus, thể nhẹ có thể bình phục trong vòng 12-24 giờ [14].
+ Dạng thứ hai: tiêu chảy thường xảy ra sau 8-16 giờ sau khi ăn phải
thức ăn bị nhiễm độc tố của B.cereus, thể thông thường thường không cấp
tính, 1-2 ngày sau khi ăn phải thức ăn ô nhiễm B.cereus sẽ thấy một lượng
lớn B.cereus trong mẫu phân, khi bình phục các chất nhanh chóng được bài
tiết ra khỏi cơ thể. Nguyên nhân của triệu chứng này là do sự sản sinh ra độc
13
tố đường ruột trong thời kỳ sinh trưởng của B.cereus trong ruột non từ việc ăn
vào bụng các tế bào hay bào tử của vi khuẩn.
Thông thường cả hai triệu chứng này là tương đối nhẹ, kéo dài ít nhất là
24h và không phải luôn luôn đòi hỏi phải dùng thuốc. Tuy nhiên, nhiều
trường hợp ngộ độc gõy tiờu chảy nặng có thể xảy ra, nguyên nhân có lẽ là do
các tế bào biểu mô chiếm đa số trong ruột non khi các bào tử của B.cereus
sinh sôi nảy nở và sản sinh ra độc tố đường ruột. Mức độ biến đổi của liều
gây nhiễm do khả năng sản sinh ra các độc tố đường ruột khác nhau và do
tính nhạy cảm của mỗi cá nhân là khác nhau
1.2.4 Các phương pháp chẩn đoán :
1.2.4.1 Phương pháp nuụi cấy :
Hiện nay, phương pháp truyền thống để xét nghiệm B.cereus trong
thực phẩm dựa trên nguyên tắc nuôi cấy, phân lập vi khuẩn ; qui trình này
phải trải qua nhiều bước : đồng nhất mẫu, tăng sinh chọn lọc, xác định các

tính chất hóa sinh và miễn dịch.
- Ưu điểm của phương pháp này
• Thao tác đơn giản.
• Dễ làm.
• Không phải đầu tư dụng cụ và thiết bị đắt tiền.
- Nhược điểm
• Độ nhạy không cao.
• Thời gian để xác định tình trạng ô nhiễm thực phẩm do B.cereus lâu
(khoảng 5-7 ngày).
• Tốn nhiều nhân công, cần có kỹ thuật viên có kinh nghiệm về vi sinh vật.
• Không thể phát hiện được các chủng B.cereus này có hay không có
sinh độc tố do đó hạn chế trong công tác phòng ngừa.
• Tốn nhiều hóa chất.
• Yêu cầu kỹ năng thao tác.
14
1.2.4.2 Phương pháp miễn dịch
Phương pháp này dựa trên phản ứng của kháng thể đặc hiệu với kháng
nguyên bề mặt để phát hiện nhanh sự nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm.
- Ưu điểm
• Độ nhạy cao, cho phép phát hiện các sản phẩm ở mức độ khoảng 10 pg.
• Thời gian cho kết quả nhanh hơn các phương pháp xét
nghiệm truyền thống.
- Nhược điểm
Quy trình phức tạp, phải có những cán bộ kinh nghiệm và được đào
tạo bài bản mới có thể thực hiện được.
1.2.4.3 Phương pháp sinh học phân tử :
- Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi men):
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR dựa trên sự thay đổi nhiệt độ ở 3 giai
đoạn khác nhau của quá trình phản ứng : giai đoạn biến tính, giai đoạn gắn
mồi và giai đoạn kéo dài. Đây là kỹ thuật nhân số lượng bản sao gen của độc tố vi

khuẩn trong thực phẩm lên hàng triệu lần đến mức có thể phát hiện được chúng.
Ưu điểm
• Độ nhạy, độ đặc hiệu cao.
• Thời gian thực hiện nhanh (chỉ cần 3h để khuyếch đại một
trình tự DNA được quan tõm) giúp cho công tác phòng ngừa.
• Đơn giản và ít tốn kém.
Nhược điểm
• Có thể xuất hiện hiện tượng dương tính giả nếu có hiện
tượng nhiễm DNA đích trong không khí hoặc trong sinh
phẩm, trong dụng cụ.
15
Hình 1.1 : Các bước cơ bản của phản ứng PCR
(Nguồn : Vierstraete, 1999)
- Realtime PCR : [9]
Phương pháp này cho phép theo dõi sự hình thành sản phẩm PCR theo
từng chu kỳ của phản ứng qua sử dụng kỹ thuật phát huỳnh quang từ đó định
lượng nồng độ vi sinh vật trong thực phẩm.
Ưu điểm:
• Nhanh, xác định chính xác lượng sản phẩm tạo ra tại
mỗi thời điểm của phản ứng.
• Độ nhạy, độ đặc hiệu cao.
16
• Không cần chạy điện di kiểm tra kết quả PCR.
Nhược điểm:
Kỹ thuật này không phân biệt được sản phẩm PCR đặc hiệu với sản
phẩm khác được khuyếch đại không đặc hiệu.
- Giải mã trình tự gen (Sequencing):
Giúp xác định nhanh chóng trình tự nucleotid của DNA bộ gen và chức
năng của chúng.
Ưu điểm: Xác định được kiểu gen cụ thể, có ý nghĩa trong nghiên cứu.

Nhược điểm: Cần máy móc, trang thiết bị hiện đại, điều kiện kỹ thuật cao.
1.2.5 Điều trị
Vi khuẩn B.cereus tạo ra 1 quang phổ β-lactamase rõ nét, do vậy chỳng
cú sức đề kháng với penicillin, ampicillin và cephalosporins, trimethoprim.
Trong 1 nghiên cứu, 54 mẫu chất phân lập từ mỏu đó thấy rằng tất cả các
chủng đều dễ bị ảnh hưởng bởi imipenem và vancomyxin, và tất cả đều nhạy
với chlroamphenicol, ciprofloxacin, erythromyxin và gentamicin. Các chủng
nhạy với clindamycin, erythromycin, chlroamphenicol, vancomycin,
aminoglycosides, tetraclycline và sulphonamides [20].
1.2.6 Phòng bệnh
Thực phẩm cần phải được ăn ngay sau khi nấu, nếu để lâu cần phải để
nguội nhanh chóng sau đó để trong môi trường lạnh.
1.2.7 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu về B.cereus.
1.2.7.1 Kỹ thuật PCR.
Trên thế giới, các kỹ thuật PCR đã được sử dụng để phát hiện các gen
đặc hiệu của B.cereus trong thực phẩm[13 ; 14 ; 16]. Kỹ thuật PCR không chỉ
giảm thời gian phát hiện B.cereus trong các mẫu thực phẩm, mà còn có thể
17
phát hiện được một cách chính xác các chủng B.cereus này có khả năng sinh
ra các độc tố hay không. Năm 2008, Jackson N.Ombui và cộng sự đã sử dụng
phương pháp Multiplex-PCR để xác định giới hạn lượng B.cereus có thể
phát hiện trong một số loại thực phẩm.
Nghiên cứu xây dựng qui trình phát hiện gen độc tố ruột của B.cereus
trong thực phẩm bằng kỹ thuật multiplex PCR là vấn đề cần thiết. Nó không
những giải quyết việc xác định nhanh các độc tố ruột của B.cereus, giỳp các
bác sĩ lâm sàng và dịch tễ cú cỏc biện pháp xử lý và điều trị kịp thời, mà còn
là tiền đề để phát triển kỹ thuật PCR trong xác định trực tiếp các căn nguyên
khác gõy ngộ độc thực phẩm. Có hai loại phản ứng PCR :
+ PCR đơn thực hiện với một cặp mồi duy nhất.
+ PCR đa mồi (Multiplex-PCR) thực hiện với nhiều cặp mồi trong cùng

một phản ứng.
PCR đơn là một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, có độ nhạy và độ
đặc hiệu cao nhưng do B.cereus gây bệnh bằng cách sinh độc tố nên nếu sử
dụng phương pháp PCR đơn thì sẽ tốn nhiều thời gian và nguyên vật liệu hơn
so với phương pháp PCR đa mồi vì B.cereus có thể sinh ra 6 loại độc tố khác
nhau. Phương pháp PCR đa mồi phát hiện được nhiều tác nhân gây bệnh chỉ
bằng một phản ứng PCR nên tiết kiệm nguyên vật liệu và thời gian đồng thời
có độ nhạy và độ đặc hiệu không kém gì phương pháp PCR đơn mồi.
Tuy nhiên sự có mặt của một số chất trong thực phẩm như : một lượng
lớn DNA không phải từ B.cereus ; sẽ ức chế phản ứng PCR, làm giảm đáng
kể độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật. Vấn đề đặt ra ở đây là làm sao tách
chiết được DNA của các độc tố ruột của B.cereus trực tiếp từ bệnh phẩm.
Đó có một số phương pháp tách chiết DNA trực tiếp từ thực phẩm như:
phương pháp sử dụng nhiệt độ, sử dụng ethanol
Hiện nay trên thị trường có một số bộ kit thương phẩm như bộ sinh
phẩm của hãng QIAGEN. Tuy nhiên phương pháp này quá phức tạp, quá đắt
18
và chỉ thực hiện được ở những phòng xét nghiệm được trang bị máy móc hiện
đại.Vỡ thế, một phương pháp tách chiết DNA trực tiếp từ thực phẩm đơn
giản, nhanh, hiệu quả và ít tốn kém sẽ có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong
điều kiện của Việt Nam, là chỡa khoỏ đối với kỹ thuật Multiplex-PCR, xác
định trực tiếp các độc tố gây ngộ độc thực phẩm của B.cereus từ thực phẩm.
1.2.7.2. Gỉải mã trình tự gen (Sequencing)
Hiện nay các nhà khoa học đã ứng dụng kỹ thuõt giải mã để giải mã
trình tự của các gen HblA, HblB và HblC mã hóa các protein ly giải hồng cầu
BL, các gen NheA, NheB, NheC mã hóa các protein nội độc tố khụng gõy ly
giải hồng cầu, gen CytK mã hóa độc tố tế bào K [44].
1.2.7.3. Kỹ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA đa hình (RAPD-
PCR) [34]
Phương pháp này lần đầu tiên được phát hiện bởi Williams và cộng sự

năm 1990 trên cơ sở kỹ thuật PCR. Khác với kỹ thuật PCR thông thường
thường sử dụng các đoạn mồi bổ sung cho các trình tự đã biết, RAPD chỉ sử
dụng các mồi oligonucleotid được tổng hợp ngẫu nhiên từ 9 đến 12 base. Như
vậy, RAPD cho phép phát hiện tính đa hình mà không cần biết trước một
trình tự nucleotide nhất định. Tính đa hình này có thể sử dụng làm marker
phân tử hoặc dùng để lập bản đồ gen. Năm 1996 Ron S. Ronimus và cộng sự
đã sử dụng phương pháp RAPD-PCR để xác định Bacillus trong các thực
phẩm công nghiệp bị nhiễm.
Ưu điểm : Có độ nhạy và độ đặc hiệu cao khi phân biệt các loài khác nhau.
Nhược điểm: Phương pháp này rất nhạy cảm với điều kiện phản ứng
như chất lượng DNA, nồng độ muối ví dụ Mg
2
+ và tỷ lệ giữa mồi và đoạn
mẫu (template) và vì thế các kết quả không phải luôn trước sau như một.
19
1.2.7.4. Kỹ thuật điện di xung trường (PFGE, Pulsed-Field Gel Electrophoreis) [35]
Kỹ thuật PFGE lần đầu tiên được Schwartz và Cantor (1984) giới thiệu.
Mục đích của kỹ thuật này là tăng khả năng di động của các mảnh DNA có
kích thước lớn trong điện trường, do đó các thành phần gel và đệm hầu như
không thay đổi theo các phương pháp điện di thông thường. Tuy nhiên theo
phương pháp thông thường thì sự điện di liên quan đến sự di động của các
mảnh DNA có kích thước khác nhau trên gel agarose trong một trường điện
không đổi. Kết quả ở đây là phân tử lớn khó di động hơn phân tử nhỏ qua mắt
xích agarose, tạo ra sự tách biệt trong trường điện di. Trong trường hợp PFGE
làm thay đổi khả năng di động lại là trường điện tích thay đổi liên tục dẫn đến
các mảnh DNA có kích thước khác nhau thay đổi hướng di động. Như vậy kết
quả là các mảnh có kích thước khác nhau sẽ có khả năng di động khác nhau.
Kích thước càng lớn thì mức độ di động càng chậm. Sự di động khác nhau
của DNA chủ yếu phụ thuộc vào kích thước chứ không phải do gel agarose
như ở phương pháp điện di thông thường.

Ưu điểm : Tiêu chuẩn vàng để phân tích mối liên hệ về kiểu gen của
các vi khuẩn nói chung và B.cereus nói riêng.
Nhược điểm : Kỹ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyên dụng,
cũng như kinh nghiệm vì việc tách nhiễm sắc thể đôi khi gặp khó khăn trên
một số đối tượng vi sinh vật.
Kỹ thuật PFGE không đủ nhạy để phát hiện những sai khác nhỏ giữa
các mẫu, đặc biệt khi thực hiện với một enzym thì kết quả có thể giống nhau
nhưng không chắc chắn là hai mẫu giống nhau hoàn toàn. Điều đó có nghĩa là
kỹ thuật này nờn dựng để xác định sự khác nhau còn việc xác định sự giống
nhau thì không đủ tin cậy. Sự khác biệt giữa các mẫu có thể phát hiện được
khi dựng cỏc enzym cắt hạn chế khác nhau.
20
Năm 2007 Wenwan Zhong và cộng sự ứng dụng kỹ thuật này để phân
biệt Bacillus cereus, Bacillus anthracis và Bacillus thuringiensis [35].
1.2.7.5. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
(phân tích đa hình ngẫu nhiên chiều dài đoạn cắt DNA).
Kỹ thuật RFLP (viết tắt từ Restriction Fragment Length Polymorphism)
hay kỹ thuật Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) là kỹ thuật nghiên cứu tính
đa hình DNA bằng cách kết hợp kỹ thuật PCR và phản ứng cắt của enzyme
giới hạn (Restriction Enzyme, RE).
Ưu điểm : Đây là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử có độ đặc
hiệu và độ nhậy cao cho phép xác định nhanh chóng và chính xác sự có mặt
của không chỉ một loài vi khuẩn mà còn cho phép xác định và phân biệt nhiều
loài vi khuẩn.
Nhược điểm: Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối
với sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu), và DNA yêu
cầu có chất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này. Hơn nữa
hiện nay, ở nước ta nhà nước chưa cho phép nhập các chất phóng xạ.
Tóm lại : Hiện nay có rất nhiều kỹ sinh học phân tử khác nhau để phát
hiện cũng như các nghiên cứu sâu về B.cereus như tụi đó trình bày ở trên, tuy

nhiờn trong phạm vi luận văn cao học này chúng tôi chỉ áp dụng hai kỹ thuật là :
- Phát hiện sự ô nhiễm của B.cereus trong thực phẩm thông qua phát hiện
các gen độc tố của B.cereus trong các mẫu thực phẩm bằng kỹ thuật
Multiplex-PCR.
- Kỹ thuật giải mã trình tự gen (sequencing) nhằm khẳng định chắc chắn
các gen độc tố phát hiện từ các mẫu thực phẩm trong nghiên cứu của chúng
21
tôi tương đồng 99-100% (giống hệt) với các trình tự gen độc tố chuẩn của
B.cereus trong ngân hàng gen mà đã được thế giới công nhận.
22
CHƯƠNG 2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 1
- Chủng B.cereus chuẩn quốc tế ATCC4342 cú cỏc gen độc tố bceT,
nheA, hblA và hblD được sử dụng để xây dựng qui trình kỹ thuật multiplex
PCR phát hiện các gen độc tố.
- Chủng E. coli, Salmonelle và Klebsiella không có gen độc tố được sử
dụng làm chứng âm
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 2
- Các mẫu thực phẩm bán tại các chợ ở Hà Nội bao gồm: Bánh phở, bún,
cơm, cơm nắm, cơm rang, bánh dày và xụi xộo. Đây là các thực phẩm có
nguồn gốc từ gạo, giàu tinh bột, là môi trường thuận lợi cho B.cereus phát
triển được lựa chọn cho nghiên cứu và phải đảm bảo các tiêu chuẩn:
+ Tối thiểu 100g/mẫu.
+ Đại diện cho cỏc lụ thực phẩm.
+ Được đựng vào cỏc tỳi vô trùng.
+ Các mẫu được giữ trong tủ lạnh nhiệt độ từ 0-5
0
C hoặc ở -20

0
C nếu
chưa tiến hành xét nghiệm ngay.
+ Sau khi được thu thập, các mẫu nên được tiến hành xét nghiệm càng
sớm càng tốt
23
2.2 VẬT LIỆU VÀ DỤNG CỤ
2.2.1 Sinh phẩm, hoá chất, dụng cụ và máy móc dùng trong kỹ thuật
PCR và giải trình tự gen
2.2.1.1 Sinh phẩm, hoá chất
Bảng 2.1. Các cặp mồi (primer) đặc hiệu sử dụng cho nghiên cứu để
phát hiện gen độc tố của B.cereus
Tên mồi Trình tự (5’-3’) Gen
Kích
thước
(bp)
Tài liệu tham khảo
bceT-F:
CGT ATC GGT CGT TCA CTC GG
bceT-R:
GTT GAT TTT CCG TAG CCT GGG
nheA-F:
TAC GCT AAG GAG GGG CA
nheA-R:
GTT TTT ATT GCT TCA TCG GCT
hblA-F:
GTG CAG ATG TTG ATG CCG AT
hblA-R:
ATG CCA CTG CGT GGA CAT AT
hblD-F:

AAT CAA GAG CTG TCA CGA AT
Độc tố
gây tiêu
429
Genbank No :
U63928
hblD-R
CAC CAA TTG ACC ATG CTA AT
- Dung dịch tách triết DNA khuôn mẫu : TE (Tris-EDTA)
- Dung dịch MgCl
2
25mM (Invitrogen)
- Taq DNA polymerase (Invitrogen)
- Hỗn hợp dNTPs 2,5mM (Invitrogen)
- Nước siêu sạch
- Đệm tra mẫu : Gel Loading Buffer
- Thạch điện di (electrophoresis agar, Invitrogen)
- Thang DNA chuẩn (DNA ladder, Invitrogen)
- Dung dịch đệm TAE (Invitrogen)
- Ethidium bromide
- Kít tinh sạch DNA (Qiagen)
24
- Kít Tag DyeDeoxiTerminator Cycle sequencing (Amersham)
2.2.1.2 Máy móc và dụng cụ
- Máy luân nhiệt PCR: Amp PCR System 9700 (USA); Effpendorf (Đức)
- Máy đọc trình tự gen ABI (Applied Biosystem)
- Máy điện di ngang Mupid (Nhật Bản)
- Máy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA)
- Máy đo nồng độ DNA và độ dục vi khuẩn Eppendorf (Đức)
- Máy li tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm để bàn Eppendorf (Đức)

- Tủ lạnh sâu: -30°C; -80°C (SANYO), tủ ấm.
- Lò vi sóng (Samsung)
- Lò hấp ướt : ALP (Nhật Bản)
- Pipet định mức, đầu cụn cỏc loại, ống PCR, ống Eppendorf loại 1,5
ml, 0,2ml, ống Falcon, găng tay, giấy thấm.
2.2.2 Vật liệu dùng cho nuôi cấy và xác định vi khuẩn
2.2.2.1. Môi trường dùng trong nuôi cấy:
- Túi đồng nhất mẫu
- Môi trường thạch manitol egg yolk – polymyxin (MYP).
- Thạch Manitol Polymyxin – lòng đỏ trứng gà.
- Egg yolk emulsion.
- Canh thang trypticase soy polymycin (TSP)
- Thạch dinh dưỡng.
- Thạch trypticase soy máu cừu.
- Môi trường LB (Invitrogen)
- Thạch cơ bản (Invitrigen)
- Các dung dịch đệm phosphat (PBS) dùng để pha loãng đóng trong các lọ
450ml ± 5ml và 90 ml ± 2ml.
25