Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Escherichia Coli trên thịt lợn bán tại Thành phố Thái Nguyên

1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC





ĐỖ BÍCH DUỆ





NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA
VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI TRÊN THỊT LỢN
BÁN TẠI THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN







LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2012
2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngày nay, khi đời sống xã hội ngày càng nâng cao, chất lƣợng cuộc sống
ngày càng cải thiện, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm trở thành vấn đề đƣợc quan
tâm của các ngành, các cấp và của toàn thể ngƣời tiêu dùng. Thực phẩm phải đảm
bảo tiêu chuẩn: tƣơi, sạch, giàu dinh dƣỡng và an toàn cho ngƣời sử dụng. Trong
đó, thịt tƣơi là một loại thực phẩm thông dụng trong thực đơn hàng ngày của mỗi
gia đình. Tuy nhiên, trong quá trình vận chuyển, tiêu thụ con ngƣời thƣờng chỉ quan
tâm tới lợi nhuận trƣớc mắt mà sẵn sàng bỏ qua các quy chuẩn về vệ sinh an toàn
thực phẩm (VSATTP), do vậy nguồn thực phẩm tƣơi sống nói chung, nguồn thịt nói
riêng bị ô nhiễm ngày càng lớn đe dọa sức khỏe của con ngƣời. Thực phẩm ô nhiễm
do nhiều nguyên nhân, trong đó chủ yếu là các vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt ô nhiễm
vi khuẩn Escherichia coli trong thực phẩm đã trở thành đề tài nghiên cứu của nhiều
tác giả trong những năm gần đây. E. coli gây bệnh bằng nhiều yếu tố khác nhau
nhƣ nhiễm trùng huyết, sinh tổng hợp độc tố gây ngộ độc thực phẩm (NĐTP), rối
loạn tiêu hóa hấp thu. Nếu bệnh xảy ra không đƣợc điều trị kịp thời có thể dẫn đến
tử vong. Điều đáng ngại hơn, ngƣời ta lo ngại về nguy cơ biến chủng của loài vi
khuẩn này. Nếu không đƣợc kiểm soát và xử lý kịp thời, có thể gây ngộ độc hàng

loạt nhƣ ở Đức và một số nƣớc Châu Âu trong thời gian vừa qua.
Với vị trí địa lý là trung tâm vùng của khu vực trung du miền núi phía bắc,
thành phố Thái Nguyên có nhiều cơ quan, xí nghiệp, nhà máy, công ty đặc biệt có
nhiều trƣờng Đại học, Cao đẳng nằm trên địa bàn nên nhu cầu tiêu thụ thực phẩm
thịt lợn là rất lớn. Mặt khác, việc giết mổ lợn và bán thịt chủ yếu do tƣ nhân thực
hiện, phƣơng tiện vận chuyển, dụng cụ bán thịt chƣa đạt tiêu chuẩn vệ sinh thú y.
Việc kiểm tra vệ sinh thú y của cán bộ kiểm dịch còn gặp nhiều khó khăn, hiện chỉ
dừng lại ở mức độ kiểm tra cảm quan thịt đƣợc bày bán tại các chợ.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một
số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Escherichia coli trên thịt lợn bán tại thành
phố Thái Nguyên”.


3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2. Mục tiêu nghiên cứu
- Đánh giá tình trạng nhiễm E. coli trên thịt lợn tƣơi.
- Tìm hiểu một số đặc điểm sinh học, hóa học đặc điểm di truyền phân tử
của một số chủng E. coli phân lập đƣợc, xác định gen gây ngộ độc thực phẩm, từ đó
có biện pháp hạn chế, giảm thiểu thiệt hại cho ngƣời dân.
3. Nội dung nghiên cứu
- Lấy mẫu phân lập vi khuẩn E. coli trong 1 gram thịt lợn tƣơi.
- Tìm hiểu đặc điểm sinh hóa, khả năng mẫn cảm kháng sinh, type huyết
thanh của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc. Tìm gen gây ngộ độc thực
phẩm (VT1; VT2 ) bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR, polymerase
chain reaction).
- Nghiên cứu đặc điểm di truyền bằng việc đọc trình tự gen mã hóa riboxom
16S

+ Nuôi cấy các chủng vi khuẩn phân lập
+ Tách chiết DNA tổng số, nhân đoạn gen mã hóa riboxom 16S bằng kỹ
thuật PCR, thiết kế plasmid tái tổ hợp, tạo tế bào E. coli DH 5α khả biến, biến nạp
plasmid vào E. coli DH 5α, tách và tinh sạch plasmid.
+ Đọc trình tự đoạn gen mã hóa riboxom 16S

4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ THỊT
1.1.1. Đặc tính chung của thịt
Thịt là loại thực phẩm giàu dinh dƣỡng và dễ tiêu hóa, cung cấp nhiều loại
axit amin không thay thế, cần thiết cho hoạt động sống của cơ thể, giúp con ngƣời
phát triển tốt về thể lực. Thịt cũng là loại thực phẩm giàu khoáng chất, đặc biệt là
các khoáng chất dễ hấp thu [23]. Thịt tƣơi là thịt chƣa bị biến chất bởi quá trình tự
phân hủy, chƣa có sự thay đổi về cảm quan và độc chất có hại.
1.1.2. Thành phần hóa học của thịt
Thành phần hóa học của thịt rất khác nhau, phụ thuộc vào các yếu tố giống,
loài, lứa tuổi, độ béo gầy và điều kiện chăm sóc, nuôi dƣỡng. Nhƣng nhìn chung
thành phần hóa học của thịt bao gồm:
+ Nƣớc : 50 - 75%
+ Protein : 14 - 21%
+ Lipit : 3,5 - 21,5 %
+ pH của thịt tƣơi thông thƣờng ở mức 6 - 6,5%
Ngoài các thành phần chính ở trên thớ thịt còn có các khoáng chất, các loại
vitamin, các loại men và các chất dinh dƣỡng khác cần thiết cho con ngƣời.

Đánh giá cảm quan đối với thịt tƣơi theo phƣơng pháp của Nguyễn Vĩnh
Phƣớc [13] và trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y Trung ƣơng I - Cục thú y [19] đã
đƣa ra một số đánh giá cảm quan thông qua bảng 1.1.


5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Bảng 1.1. Đánh giá cảm quan thịt
Chỉ tiêu
Thịt tƣơi
Thịt kém tƣơi, thịt ôi
Trạng thái bên
ngoài
Hơi khô, màu hơi nhạt
Khô, có khi ƣớt nhớt, màu
sẫm
Vết cắt
Hơi ƣớt, màu hồng
Ƣớt nhớt, màu thẫm
Độ đàn hồi
Rắn chắc, đàn hồi cao, ấn ngón tay vào
thịt tạo vết lõm, nhấc tay ra không để
lại vết.
Hơi nhão, nhão, ấn ngón
tay vào để lại vết nhẹ (thịt
kém tƣơi), vết hằn sâu,
không mất (thịt ôi)
Mỡ

Màu sáng, độ rắn và mùi vị tự nhiên
của thịt tƣơi, không có mùi lạ
Màu tối, độ rắn giảm, có vị
ôi
Gân
Gân trong, bám chặt vào thành ống
xƣơng
Kém trong, độ đàn hồi
kém
Tuỷ
Tuỷ trong, bám chặt vào thành ống
xƣơng
Đục, co lại, không đầy ống
xƣơng
Nƣớc luộc
Trong, mùi vị thơm ngon, trên mặt có
những giọt mỡ to
Đục, mùi vị ôi, trên bề mặt
có giọt mỡ nhỏ
Theo phƣơng pháp sinh hóa học, thịt tƣơi đƣợc đánh giá bằng các phản ứng
sinh hóa học dựa theo các tiêu chuẩn nhƣ bảng 1.2.



6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Bảng 1.2. Tiêu chuẩn đánh giá thịt tƣơi bằng các phản ứng sinh hóa học

Tiêu chuẩn
Thịt tƣơi
Thịt kém tƣơi
Thịt ôi
pH của nƣớc thịt ngâm
5,4 - 6,4
6,5 - 6,7
> 6,7
Hàm lƣợng NH
3
(mg)
< 1,26
1,27 - 1,68
> 1,68
Phản ứng CuSO
4
làm sa
lắng protein
Nƣớc thịt trong
hoặc hơi đục
Nƣớc thịt vẩn đục
hoặc có hạt
Nƣớc thịt đục có
cặn sánh nhƣ keo
Phản ứng tìm
peroxydaza (thử
benzidin)
Nƣớc thịt ngâm,
lọc có màu xanh lá
mạ, sau mấy phút

chuyển màu nâu
Nƣớc thịt ngâm,
lọc không có hoặc
lâu mới có màu
xanh lá mạ
Nƣớc thịt ngâm,
lọc không biến đổi
màu sắc
Phản ứng Nestler tìm
NH
3

Nƣớc thịt ngâm,
lọc không màu
Nƣớc thịt ngâm,
lọc có màu vàng
nhạt
Nƣớc thịt ngâm,
lọc có màu vàng
vỏ chanh
Phản ứng tìm H
2
S
(dùng axetat chì)
Giấy lọc giữ
nguyên màu
Giấy lọc có màu
nâu nhạt
Giấy lọc có màu
nâu sẫm hoặc đen

1.1.3. Các nguyên nhân gây hƣ hỏng thịt
* Quá trình tự phân giải của thịt
Trong các mô bào của cơ đều có chứa các loại enzym, chúng là sản phẩm của
quá trình sống, giúp cho phản ứng hóa học tại các mô bào diễn ra nhanh hay chậm [31].
Thịt trong quá trình bảo quản có thể bị biến chất và hƣ hỏng. Sau khi giết
mổ, thịt chƣa bị biến chất. Nhƣng nếu, thịt để lâu chƣa kịp tiêu thụ hoặc cất giữ
dùng dần ở những điều kiện không thích hợp sẽ bị biến chất bởi các enzyme có sẵn
7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

trong thịt và vi sinh vật tạp nhiễm dẫn đến ôi, thiu, hỏng về trạng thái cảm quan,
hình thành những độc chất có hại.
Những hiện tƣợng hƣ hỏng của thịt thƣờng gặp là: Thịt nhớt, thối rữa, lên
men chua, có các chấm màu trên bề mặt thịt, thịt mốc [10].
* Vi khuẩn gây hƣ hỏng thịt
Mặc dù rất nhiều biện pháp vệ sinh và các kỹ thuật chống nhiễm khuẩn đƣợc
áp dụng đối với con vật trƣớc khi giết mổ và trong quá trình giết mổ, nhƣng hiện tƣợng
nhiễm khuẩn vào thân thịt vẫn xảy ra [26]. Vi khuẩn nhiễm vào thịt gồm có một số loài
vi khuẩn gây hƣ hỏng thịt và nhiều loài vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời [46].
- Một số vi khuẩn gây hư hỏng thịt tươi
Dựa vào khả năng phân hủy thịt của vi khuẩn ngƣời ta có thể chia chúng theo 3
nhóm [35].
+ Nhóm Proteolytic có các men phân giải protein thành các cơ chất đơn giản cần
thiết cho hoạt động sống của chúng, đại diện là vi khuẩn Pseudomonas.
+ Nhóm vi khuẩn có khả năng lên men đƣờng sẽ phân hủy glucogen còn dự trữ
trong cơ thành rƣợu, axit và hơi.
+ Nhóm vi khuẩn có enzym phân giải lipit sẽ phân hủy mỡ thành axit béo và
glycerol.
Dựa vào khả năng làm thay đổi đặc tính sinh học của thịt ngƣời ta chia các

loại vi khuẩn gây hƣ hỏng theo các nhóm sau [27]:
+ Nhóm vi khuẩn làm mất độ tƣơi của thịt: gồm có các vi khuẩn thuộc họ
Alcaligenes, Chromobacteriaceae các loài vi khuẩn Proteus vulgaris và
Pseudomonas fluorescens.
+ Nhóm làm chua thịt: gồm có các vi khuẩn thuộc họ Chromobacteriaceae, và vi
khuẩn Pseudomonadaceae.
+ Nhóm làm nhớt mặt thịt: vi khuẩn Alcaligenes, Xanthomonas.
+ Nhóm gây mùi khó ngửi ở thịt với điển hình là Pseudomonas.

8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- Một số vi khuẩn gây hư hỏng thịt bảo quản lạnh.
Nhiều loài vi khuẩn không phát triển ở nhiệt độ thấp, nhƣng vẫn có thể sống
sót trong quá trình bảo quản lạnh. Theo Bell và Gill (1986) [28] đã tìm thấy một số
loài của các giống Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Lactobacillus,
Brochothrix, Alteromonas và thành viên của họ Enterobacteriaceae trong thịt bảo
quản lạnh. Nói chung, các vi khuẩn ở dạng sinh dƣỡng tăng lên trong suốt thời gian
bảo quản lạnh [47].
Một số vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời có thể phát triển trong thịt bảo quản
lạnh với tốc độ chậm. Số lƣợng ban đầu, chủng loại vi khuẩn gây hƣ hại thịt và tốc
độ sinh trƣởng của chúng sẽ quyết định thời gian bảo quản thịt [40]. Tuy nhiên
trong thịt bảo quản lạnh vẫn có các vi sinh vật ƣa lạnh nhƣ: Nhóm Pseudomonas,
Achrmobacter, Flavobacterium, Alcaligenes, Aerobacterium và một số loại cầu
khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas nhƣ Pseudomonas fragi, Pseudomonas
fluoresceus, Pseudomonas geniculata, ngoài ra còn có nấm men, nấm mốc vẫn phát
triển. Thịt có mùi đất là do xạ khuẩn mọc. Thịt muối vẫn tồn tại vi sinh vật ƣa mặn
và làm hỏng thịt [10].
1.2. VI KHUẨN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM

1.2.1. Ngộ độc thực phẩm
Ngộ độc thực phẩm (NĐTP) hay là trúng độc thức ăn xảy ra do ăn phải thức
ăn chứa chất độc. Bệnh thƣờng xảy ra một cách đột ngột, hàng loạt (nhƣng không
phải là dịch), có những triệu chứng của một bệnh cấp tính. Biểu hiện bệnh thƣờng là
nôn mửa, tiêu chảy (riêng trƣờng hợp nhiễm độc tố của vi khuẩn độc thịt thì bị táo
bón) và các triệu chứng khác đặc hiệu cho loại ngộ độc [1].
1.2.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm
Thực phẩm có nguồn gốc động vật và thực vật là nguồn thực phẩm thiết yếu
của con ngƣời. Việc lựa chọn thực phẩm và cách chế biến thực phẩm phù hợp khoa
học đem lại cho con ngƣời nguồn dinh dƣỡng quan trọng đảm bảo sức khỏe và chất
9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

lƣợng dân số. Tuy nhiên, ngoài việc đáp ứng nhu cầu dinh dƣỡng cho con ngƣời thì
các nguồn thực phẩm kém chất lƣợng có thể gây nguy hại đến sức khỏe con ngƣời.
Ngộ độc thực phẩm xảy ra khi chúng ta dùng phải thức ăn, thức uống nhiễm
bẩn, bảo quản không đúng cách hoặc bị nhiễm trùng, virus, ký sinh trùng, nấm mốc
hay hóa chất độc hại Ở nƣớc ta những năm gần đây các ca NĐTP có chiều hƣớng
gia tăng mà nguyên nhân chính là do các nguồn thực phẩm hay nƣớc uống bị ô
nhiễm. Các thực phẩm có nguồn gốc động vật có xu hƣớng dễ bị nhiễm khuẩn hơn.
Nhiễm độc thực phẩm có thể chia làm hai loại: Loại 1, nhiễm độc do hóa chất; loại
2, nhiễm độc do vi sinh vật gây bệnh.
Hóa chất độc bao gồm các hóa chất sử dụng trong công nghiệp và nông
nghiệp. Trong sản xuất nông nghiệp nhiều loại hóa chất bảo vệ thực vật độc hại
đƣợc sử dụng, đặc biệt là nhóm clo hữu cơ nhƣ diclo-diphenyl-tricloetan (DDT),
dipteren, lindane, padane… Các hóa chất này một phần ngấm xuống mạch nƣớc
ngầm, phân tán vào môi trƣờng không khí, tồn dƣ trên các sản phẩm nông sản, động
vật ăn phải các sản phẩm này, tiếp đến con ngƣời sử dụng thực phẩm động vật
nhiễm hóa chất, rau quả nhiễm hóa chất, làm gia tăng các bệnh rối loạn chuyển hóa,

bệnh hiểm nghèo.
Ngộ độc thực phẩm có thể gây ra do thực phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật và độc
tố do vi sinh vật tạo ra. Vấn đề NĐTP đang là mối lo ngại và đƣợc quan tâm xử lí ở
hầu hết các quốc gia trên thế giới, thậm chí cả các quốc gia phát triển nhƣ Mỹ (Hoa
Kỳ), Anh, Nhật Bản, Trung Quốc… cũng không phải là ngoại lệ [1].
1.2.3. Một số vi khuẩn phân lập đƣợc từ thịt gây ngộ độc thực phẩm
Vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm không gây bệnh cho ngƣời sử dụng nhƣng
trong quá trình trao đổi chất cũng sản sinh ra yếu tố gây hại [14], [45]. Một số vi
sinh vật nhiễm trong thực phẩm gây ngộ độc, có thể chia làm 2 dạng:
i) Ngộ độc thực phẩm xảy ra ngay lập tức trong các trƣờng hợp thức ăn nhiễm các
vi khuẩn tổng hợp ngoại độc tố nhƣ S. aureus, C. botulinum, B. cereus… Các vi
khuẩn này sinh trƣởng và phát triển trong thức ăn và giải phóng ra một lƣợng độc tố
gây ngộ độc cấp tính cho ngƣời khi ăn thực phẩm bị nhiễm loại vi khuẩn này.
10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ii) Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi một số vi khuẩn nhƣ: Listeria, Salmonella, E. coli,
Shigella, Campylobacter nhiễm trong thực phẩm, khi xâm nhập vào cơ thể chúng
không những gây nên các triệu chứng ngộ độc mà còn làm tổn thƣơng nghiêm trọng
các cơ quan nội tạng.
* Tổng số vi khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện
Sự phát hiện ra số lƣợng lớn vi khuẩn trên thịt, điều này chứng tỏ rằng việc
giết mổ gia súc và gia cầm tại các cơ sở với điều kiện vệ sinh là rất kém. Việc xác
định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm đƣợc sử dụng nhƣ một yếu tố đánh
dấu (maker) về điều kiện vệ sinh, nhiệt độ bảo quản trong quá trình sản xuất, vận
chuyển thực phẩm. Đây là phƣơng pháp tốt nhất để đánh giá sơ bộ tình trạng vệ
sinh của thực phẩm [29]. Số lƣợng vi khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện ở thịt thay
đổi theo thời gian và điều kiện bảo quản. Hệ vi khuẩn hiếu khí trên thịt đƣợc chia
làm 3 nhóm, dựa vào nhiệt độ thích hợp để chúng có thể phát triển đƣợc.

Nhìn chung vi khuẩn gây hƣ hỏng thực phẩm có thể phát triển đƣợc từ 12
o
C
đến 42
o
C. Tuy nhiên, một số chủng đột biến có thể phát triển ngoài khoảng nhiệt độ
này. Trong bảo quản thực phẩm khoảng nhiệt độ vi khuẩn có thể phát triển đƣợc gọi
là vùng nhiệt độ nguy hiểm.
* Coliforms
Coliforms là những vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí không bắt buộc, lên men
đƣờng lactose trong môi trƣờng canh thang lactose (màu mật bò xanh dƣơng) trong
vòng 48 giờ ở 35
o
C. Các Coliforms có nguồn gốc từ rác thải hữu cơ của thực vật và
động vật [36].
Sự có mặt của các thành viên thuộc nhóm Coliforms trong thực phẩm phản
ánh tình trạng vệ sinh của thực phẩm, chúng chỉ ra khả năng có mặt của các yếu tố
gây bệnh khác ẩn trong thực phẩm. Một số nhà nghiên cứu cho rằng các mẫu thực
phẩm nhiễm Coliforms với số lƣợng lớn thì khả năng có mặt của các vi khuẩn gây
bệnh lớn. Yếu tố chỉ điểm này có liên quan tới tác nhân gây bệnh hay không đang
11

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

còn là vấn đề tranh luận của các nhà khoa học. Nhƣng nhiều nhà khoa học cho rằng
sự có mặt của Coliforms với số lƣợng lớn cảnh báo tình trạng vệ sinh thực phẩm
kém [38].
* Salmonella
Salmonella đƣợc phát hiện lần đầu tiên năm 1885 bởi Salmon và Smith là
Salmonella choleraesuis. Năm 1934 chính thức đƣợc đặt tên Salmonella [22], [44].

Là những trực khuẩn bắt màu gram (-) thuộc họ Enterrobacterriaceae. Hiện nay theo
bảng phân loại Kauffmann-white ngƣời ta phân loại đƣợc hơn 600 type huyết thanh.
Trong đó 86 type huyết thanh đã đƣợc phát hiện ở nƣớc ta. Một số type gây bệnh
cho ngƣời, phổ biến nhất là S. typhimurium, S. enteritidis gây ngộ độc thực phẩm.
Salmonella có sức đề kháng với môi trƣờng cao, chúng tồn tại đƣợc vài
tháng trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật. Vi khuẩn phát triển đƣợc trong
khoảng nhiệt độ từ 5,2 – 45
o
C và pH từ 4,3 -9,6. Khả năng chịu mặn tối đa là 8,0%
muối. Vi khuẩn phát triển đƣợc khi nƣớc hoạt động (a
w
) tối thiểu trong thực phẩm là
0,95 [35].
Bệnh nhiễm trùng, nhiễm độc do Salmonella có đặc điểm lâm sàng chủ yếu
là hội chứng viêm dạ dày, tiểu tràng cấp đôi khi có cả viêm đại tràng, bao gồm sốt
đau bụng, sốt tiêu chảy kèm theo nôn, dễ mất nƣớc ở trẻ em. Thời gian phát bệnh từ
6-72 giờ phổ biến từ 2- 3 giờ sau khi ăn thực phẩm nhiễm khuẩn.
* E. coli
Là loại trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, có lông di động đƣợc, không
hình thành nha bào, bắt màu gram âm, thƣờng thẫm hai đầu, ở giữa nhạt, kích thƣớc
2-3 µ × 0,4-0,6 µm. E. coli thử nhóm phản ứng sinh hóa IMVIC cho kết quả (++ )
[25].
E. coli có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 7 – 46
o
C, nhiêt độ thích hợp
nhất là 35 - 40
o
C, chúng phát triển tốt trong thực phẩm có nƣớc hoạt động (a
w
) từ

0,93 trở lên và độ pH của thực phẩm trong khoảng 4,4-8,5. E. coli có sức đề kháng
kém với nhiệt độ [32]. Dựa vào đặc tính gây bệnh mà ngƣời ta chia làm 6 nhóm
chính: nhóm gây xuất huyết đƣờng ruột; nhóm sinh độc tố; nhóm xâm nhập đƣờng
12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ruột; nhóm gây bệnh đƣờng ruột; nhóm gây kết dính đƣờng ruột; nhóm gây kết dính
lan tỏa. Đối với bệnh tiêu chảy do E. coli gây lây truyền qua thức ăn đƣợc quan tâm
nhiều hơn cả là nhóm gây xuất huyết đƣờng ruột (EHEC), đặc biệt là E. coli
O157:H7, E. coli sinh độc tố verotoxin [17], [39].
1.2.4. Tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam và trên thế giới
* Ở Việt Nam
Mỗi năm, tại Việt Nam có khoảng 8 triệu ngƣời (xấp xỉ 1/10 tổng dân số) bị
NĐTP hoặc ngộ độc do liên quan đến thực phẩm, trong đó phần lớn xảy ra tại các
bếp ăn tập thể, khu công nghiệp, bếp ăn của học sinh. Theo thống kê của của Bộ Y
tế, từ năm 2004-2009 đã có 1.058 vụ NĐTP, trung bình 176,3 vụ/năm, số ngƣời bị
NĐTP là 5.302 ngƣời/năm, số ngƣời chết là 298 ngƣời (trung bình 49,7
ngƣời/năm), tính trung bình tỷ lệ ngƣời bị NĐTP cấp tính là 7,1 ngƣời/100 ngàn
dân/năm. Năm 2009 có 152 vụ NĐTP với 5.212 ngƣời mắc và 31 ngƣời tử vong, về
nguyên nhân NĐTP, 29,6% số vụ do thực phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật, 5,2% số vụ
do hóa chất, 24,7% do thực phẩm có sẵn độc tố tự nhiên, 40,5% số vụ không xác
định đƣợc nguyên nhân. Tình hình NĐTP trong năm 2010 diễn biến phức tạp, cả
nƣớc xảy ra 175 vụ ngộ độc (trong đó có 34 vụ ngộ độc hàng loạt, trên 30 ngƣời
/vụ) xảy ra tại 47 tỉnh/thành phố, làm 5.664 ngƣời bị ngộ độc và 42 trƣờng hợp tử
vong [1]. Báo cáo của Cục Thú y, kết quả của Chƣơng trình giám sát VSATTP đối
với thịt năm 2010 cho biết: về ô nhiễm vi sinh vật trong thịt: tại nơi giết mổ có
47/233 mẫu thịt lợn và thịt gà không đạt tiêu chuẩn về tổng số vi khuẩn hiếu khí,
89/233 mẫu thịt lợn và thịt gà vƣợt mức giới hạn enterobacteriaceae. Tại nơi kinh
doanh, 71/431 mẫu thịt nhiễm Salmonella, 68/150 mẫu thịt lợn nhiễm E. coli [1],

[3]. Đây chính là những nguy cơ tiềm tàng gây ngộ độc thực phẩm. Trong 6 tháng
đầu năm 2011, Cục ATVSTP cho biết: toàn quốc đã xảy ra 53 vụ ngộ độc với 1.776
nạn nhân, trong đó có 9 trƣờng hợp tử vong. So với cùng kỳ 2010, số vụ ngộ độc đã
giảm, số tử vong giảm, nhƣng con số vẫn còn đáng lo ngại.
13

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

* Trên thế giới
Theo báo cáo gần đây của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hơn 1/3 dân số các
nƣớc phát triển bị ảnh hƣởng của các bệnh do thực phẩm gây ra mỗi năm. Đối với
các nƣớc đang phát triển, tình trạng lại càng trầm trọng hơn nhiều, hàng năm gây tử
vong hơn 2,2 triệu ngƣời, trong đó hầu hết là trẻ em. Các vụ ngộ độc thực phẩm có
xu hƣớng ngày càng tăng. Hàng năm, tại Mỹ hiện xảy ra 76 triệu ca NĐTP với
325.000 ngƣời phải nhập viện và 5.000 ngƣời chết vì NĐTP. Trung bình cứ 1.000
dân có 175 ngƣời bị NĐTP và một ca NĐTP tiêu tốn 1.531 đôla Mỹ (US, FDA
2006). Nƣớc Úc có Luật thực phẩm từ năm 1908 nhƣng hiện nay mỗi năm vẫn có
khoảng 4,2 triệu ca bị NĐTP và các bệnh truyền qua thực phẩm, trung bình mỗi
ngày có 11.500 ca mắc bệnh cấp tính do ăn uống gây ra và chi phí cho 1 ca NĐTP
là 1.679 đôla Úc. Ở Anh cứ 1.000 dân có 190 ca bị NĐTP mỗi năm và chi phí cho 1
ca NĐTP là 789 bảng Anh. Ngày 7/4/2006 ở trƣờng học Thiểm Tây, Trung Quốc,
hơn 500 học sinh bị NĐTP. Tại Hàn Quốc, tháng 6/2006 có 3.000 học sinh ở 36
trƣờng học bị ngộ độc thực phẩm [1].
Trong diễn tiến dịch nhiễm khuẩn E. coli ở châu Âu, Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO) cho biết, có khoảng 12 nƣớc bị ảnh hƣởng. Nó đã cƣớp đi sinh mạng của 16
ngƣời châu Âu. CHLB Đức đã ghi nhận gần 1.400 trƣờng hợp nhiễm bệnh do vi
khuẩn E. coli gây ra. Nhiều ca nhiễm bệnh cũng đã xảy ra tại Pháp, Thụy Điển, Anh
Quốc, CH Séc, Hà Lan… Tổ chức Y tế Thế giới WHO cũng nhận định, đợt dịch E.
coli đang hoành hành ở châu Âu hiện nay là trận dịch lớn nhất trong những năm gần
đây, so với đợt dịch E. coli bùng phát tại Canada hồi năm 2000 đã làm chết 7

ngƣời. Trƣớc đó, vào năm 1996 tại Nhật Bản có gần 12.000 ngƣời bị lây nhiễm khuẩn
E. coli, với khoảng 12 ca tử vong, xuất xứ của nguồn bệnh do có liên quan đến rau cải
sống phục vụ trong bữa ăn trƣa ở học đƣờng. Theo các chuyên gia y tế, con đƣờng lây
lan chủ yếu của vi khuẩn E. coli là nguồn thực phẩm tƣơi sống [3], [23].
Xu hƣớng ngộ độc thực phẩm, bệnh truyền qua thực phẩm xẩy ra ở quy mô
nhiều quốc gia càng trở nên phổ biến, việc phòng ngừa và xử lý vấn đề này ngày càng
khó khăn với mỗi quốc gia và trở thành một thách thức lớn của toàn nhân loại [1].
14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI (E. COLI )
1.3.1. Lịch sử nghiên cứu
Năm 1885 nhà khoa học ngƣời Đức là Theodor Escherich đã phân lập E. coli
từ phân trẻ em bị bệnh. Sau này vi khuẩn đƣợc mang tên ông, tên “coli” có nguồn
gốc tiếng Hilap “kôlon” nghĩa là “ruột” thƣờng có trong phân ngƣời và động vật.
Năm 1971 ngƣời ta xếp chúng vào nhóm các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm
và hiện nay với hầu hết các sản phẩm thực phẩm đều dùng chỉ tiêu này để đánh giá
mức độ an toàn của thực phẩm [12], [22].
E. coli là vi sinh vật hiếu khí tùy nghi hiện diện trong đƣờng ruột của ngƣời
và các loại động vật máu nóng, ở phần cuối của ruột non và ruột già. Hầu hết các
chủng E. coli không gây hại và đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý
đƣờng ruột. Tuy nhiên, 5 chủng có thể gây rối loạn đƣờng tiêu hóa ở ngƣời và một
số loài động vật. E. coli hiện diện rộng rãi trong môi trƣờng bị ô nhiễm phân hay
chất thải hữu cơ. Chúng phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trƣờng. E. coli dễ
dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hoặc thông qua nguồn nƣớc trong quá
trình sản xuất, chế biến [20].
1.3.2. Phân loại
Dựa vào các đặc điểm gây bệnh gồm các đặc tính độc lực, sự tác động khác
nhau lên màng nhày ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch

tễ của bệnh. Cho đến nay, E. coli đƣợc chia thành 5 nhóm:
- VTEC (Verotoxigenic E. coli) hoặc STEC (E. coli sản xuất độc tố Shiga)
và EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli): E. coli gây xuất huyết ở ruột.
- EPEC (Enteropathogenic E. coli): E. coli gây bệnh đƣờng ruột.
- ETEC (Enterotoxigenic E. coli): E. coli sinh độc tố ruột.
- EAGGEC hay EAEC (Enteroaggregative E. coli): E. coli kết tập ở ruột.
- EIEC (Enteroinvasive E. coli): E. coli xâm lấn niêm mạc ruột [22], [46].
15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.3.3. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của vi khuẩn E. coli
- Đặc điểm hình thái
E. coli là trực khuẩn Gram âm, hình que ngắn, kích thƣớc trung bình từ 0,5 x
1 – 3 µm hai đầu tròn, di động bằng tiên mao quanh tế bào, đứng riêng lẻ, đôi khi
xếp thành chuỗi ngắn, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có vỏ bao capsule, loại
không có động lực thì không có vỏ bao capsule [5], [26].
Theo hệ thống phân loại của Bergey, vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) thuộc:
- Lớp: Gammaproteobacteria
- Bộ: Eubacteriales
- Họ: Enterobacteriaceae
- Giống: Escherichia
- Loài: Escherichia coli
- Đặc điểm cấu trúc
E. coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp. Năm 1947 Kauffmann đƣa ra
hệ thống phân nhóm huyết thanh (serotype) dựa vào việc xác định kháng nguyên bề
mặt O, H, K.
- Kháng nguyên thân O (somatic antigen): có bản chất là
lipopolysaccharide của màng ngoài tế bào, bền với nhiệt và cồn. Khi đun nóng ở
100

o
C trong 2 giờ vẫn giữ đƣợc tính kháng nguyên, kháng cồn không bị phân hủy
khi tiếp xúc với cồn 50%, bị phân hủy bởi formol 5%, rất độc, chỉ cần 0,05mg đủ
giết chết chuột nhắt sau 24 giờ gây nhiễm. Kháng nguyên O có thể phát hiện đƣợc
bằng phản ứng ngƣng kết. Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng
gây bệnh của dòng vi khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ.
Kháng nguyên O tạo nền tảng cho việc phân loại nhóm huyết thanh của E. coli.
Có hơn 170 nhóm huyết thanh kháng nguyên O và đƣợc chia làm 4 nhóm chính
O
I
, O
II
, O
III
, O
IV
. Trong mỗi nhóm huyết thanh có một hay nhiều kiểu huyết thanh,
kháng nguyên O bám vào nhung mao ruột làm giảm sự hấp thụ [6].
- Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): Có bản chất là protein, tạo nên
khả năng di động của E. coli, kém chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các
proteinase, không bị hủy bởi formol 5% , có khoảng 50 type kháng nguyên H.
16

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): Kháng nguyên K lúc đầu
đƣợc xác định bằng phản ứng ngƣng kết. Ngƣời ta xác định có sự hiện diện của
kháng nguyên K ở vi khuẩn nếu vi khuẩn chỉ ngƣng kết với kháng nguyên huyết
thanh O khi bị đun nóng. Dựa vào khả năng chịu nhiệt ngƣời ta chia kháng nguyên
K thành 3 type là A, L và B. Về sau ngƣời ta phân loại kháng nguyên K dựa vào

thành phần hóa học của chúng và đã có hơn 80 loại kháng nguyên K đƣợc xác
định.
1.3.4. Đặc tính nuôi cấy, đặc điểm sinh hóa
- Đặc tính nuôi cấy:
E. coli là loại hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát
triển từ 35 – 37
o
C, nhƣng có thể phát triển trên 40
o
C, pH thích hợp 6,4 – 7,5
nhƣng pH tối ƣu nhất từ 7,2 – 7,4.
- Trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng (Nutrient agar) tạo khuẩn lạc
tròn ƣớt (dạng S) sau 24 giờ, màu trắng đục hơi lồi, kích thƣớc khoảng 2 – 3 mm,
để lâu có dạng khô rìa hơi nhăn (dạng R).
- Trên thạch máu có chủng dung huyết α hoặc β.
- Trên môi trƣờng chẩn đoán chuyên biệt Eozin Methylen Blue tạo khuẩn
lạc có ánh kim tím.
- Trên môi trƣờng Rapid có khuẩn lạc màu tím.
- Trên môi trƣờng MacConkey khuẩn lạc màu hồng đỏ.
- Trên thạch Gelatin không tan chảy.
- Trên môi trƣờng thạch nghiêng Triple Sugar Iron Agar: E. coli tạo
acid/acid màu vàng/vàng.
- Trên môi trƣờng Kliger Iron Agar lên men đƣờng glucose và lactose
(vàng/vàng), sinh gas, không sinh H
2
S.
- Trên môi trƣờng Brilliant Green Agar tạo khuẩn lạc xanh lá mạ.
- Trên môi trƣờng canh dinh dƣỡng sau 4 – 5 giờ E. coli làm đục nhẹ môi
trƣờng, để càng lâu càng đục, sau lắng xuống đáy có màu tro nhạt hay xám, sinh
H

2
S có mùi hôi thối, sau vài ngày có thể có váng mỏng nổi trên mặt môi trƣờng .
17

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- Đặc điểm sinh hóa:
E. coli lên men sinh hơi trên nguồn carbon nhƣ: lactose, glucose, manitol,
galactose; không sinh khí trên nguồn đƣờng maltose; lên men không đều trên nguồn
saccarose; không lên men trên nguồn dextrin, glycogen.
E. coli không sinh khí H
2
S, không phân hủy gelatin và đạm, chuyển hóa
nitrate thành nitrite.
Phân biệt E. coli với các vi khuẩn đƣờng ruột khác thông qua thử nghiệm
IMViC: + + - -; phản ứng Indol dƣơng tính (+), phản ứng Methyl Red (MR) dƣơng
tính (+), phản ứng Voges – Proskauer (VP) âm tính (-) và Citrate âm tính (-).
1.3.5. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli
- Cơ chế gây bệnh:
Để gây bệnh, trƣớc hết E. coli bám vào các tế bào nhung mao ruột bằng yếu
tố bám dính nhƣ kháng nguyên F. Sau đó nhờ các yếu tố xâm nhập (Invasion), vi
khuẩn sẽ xâm nhập vào tế bào biểu mô của thành ruột. Ở đó vi khuẩn phát triển,
nhân lên và phá hủy lớp tế bào biểu mô gây viêm ruột, đồng thời sản sinh độc tố
ruột enterotoxin. Độc tố này tác động vào quá trình trao đổi muối, nƣớc và làm rối
loạn quá trình trao đổi này. Nƣớc từ cơ thể tập trung vào ruột và làm căng ruột,
cùng với khí do lên men vi sinh vật gây nên một tác dụng cơ học làm nhu động ruột
tăng, đẩy nƣớc và các chất trong ruột ra ngoài gây nên tiêu chảy. Sau khi phát triển
ở thành ruột, vi khuẩn vào hạch lâm ba của ruột và phát triển, tiếp đến là di chuyển
đến hệ tuần hoàn, gây nhiễm trùng máu. Trong máu vi khuẩn chống lại hiện tƣợng
thực bào, gây dung huyết làm cho cơ thể thiếu máu. Vi khuẩn từ hệ tuần hoàn di

chuyển đến các cơ quan trong cơ thể. Ở đó vi khuẩn lại phát triển nhân lên lần thứ
hai, phá hủy tế bào, gây viêm và sản sinh độc tố gồm Enterotoxin và Verotoxin, phá
hủy tế bào tổ chức gây tụ huyết và xuất huyết [6], [11].
- Các yếu tố gây bệnh:
Các yếu tố gây bệnh của E. coli bao gồm khả năng kháng khuẩn, yếu tố bám
dính, khả năng xâm nhập, yếu tố gây dung huyết và khả năng sản xuất độc tố. Các
chủng vi khuẩn không có yếu tố trên thì không có khả năng gây bệnh [6].
18

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.4. PHƢƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI PHÁT HIỆN E. COLI TRONG THỰC PHẨM
1.4.1. Phƣơng pháp PCR (polymerase Chain Reaction)
* Nguyên tắc
Phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction) là một phƣơng pháp in vitro
để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu khuếch đại,
nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của
enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này [21].
* Môi trường tăng sinh
Do số lƣợng E. coli nhóm STEC, đặc biệt là E. coli gây bệnh hiện diện trong
thực phẩm rất ít. Do vậy, trƣớc khi phân lập cần sử dụng môi trƣờng tăng sinh
pepton đệm có bổ sung kháng sinh cefixime (0,0125 mg/l) và vancomycin (8 mg/l)
để ức chế các vi khuẩn Gram dƣơng và vi khuẩn sống hoại sinh khác.
* Môi trường phân lập
Môi trƣờng MacConkey (MAC), Sorbitol MacConkey (SMAC), Sorbitol
MacConkey (CT-SMAC) có bổ sung kháng sinh cefixime (0,05 mg/l) và tellurite
(2,5 mg/l) đƣợc sử dụng để phân lập. Khoảng 90% chủng E. coli đều lên men
đƣờng lactose, trên môi trƣờng MAC. E. coli điển hình có khuẩn lạc màu đỏ, trên
môi trƣờng SMAC và CT-SMAC. Chủng E. coli không lên men đƣờng sorbitol nên
cho khuẩn lạc màu trắng. Ngƣợc lại những chủng E. coli lên men sorbitol cho khuẩn

lạc màu hồng.
Trên từng loại môi trƣờng MAC, SMAC, CT-SMAC chọn ngẫu nhiên 6-10
khuẩn lạc rời rạc đại diện cho mỗi nhóm hình thái, cấy từng khuẩn lạc đƣợc chọn vào
từng ống thạch nghiêng chứa môi trƣờng dinh dƣỡng (Nutrient Agar). Làm thử nghiệm
sinh hóa IMViC cho từng khuẩn lạc riêng lẻ thuộc nhóm đó để xác định E. coli.
* Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp PCR
- Ưu điểm:
Thời gian cho kết quả nhanh
Có thể phát hiện đƣợc nhƣng vi sinh vật khó nuôi cấy. Việc tăng sinh là đơn
giản hơn và đôi khi không cần thiết.
Hóa chất cần cho phản ứng PCR dễ mua và bảo quản hơn so với trƣờng hợp
huyết thanh học, không cần dụng cụ và môi trƣờng chẩn đoán phức tạp.
19

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Ít tốn kém về nhân công, có thể tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện các
vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm.
- Nhược điểm:
Sự ức chế Taq DNA polymerase bởi một số mẫu thực phẩm thƣờng có những
thành phần phức tạp. Tuy nhiên, việc chiết tách và tinh chế DNA từ thực phẩm hay
môi trƣờng nuôi cấy cho phản ứng PCR cho phép loại bỏ đƣợc những hợp chất ức
chế đó.
Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thƣờng thấp, nên
trong đa số trƣờng hợp cần có bƣớc nuôi cấy làm giàu để có đƣợc mật độ đủ để thực
hiện bằng phản ứng PCR.
Phƣơng pháp này không phân biệt đƣợc tế bào sống với tế bào chết, do vậy có
thể dẫn đến trƣờng hợp dƣơng tính giả do DNA từ tế bào chết. Ngƣợc lại, phƣơng
pháp này cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào đã chết của các vi
sinh vật gây bệnh hoặc gây ngộ độc.

1.4.2. Phƣơng pháp ELISA
* Nguyên tắc
Sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng (microplate).
Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ
đƣợc giữ lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ đƣợc phát hiện bằng cách
sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme nhƣ horseradish peroxidase hay
alkaline phosphatase. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme
sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các phản ứng có màu hay phát sáng.
Bằng cách theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lƣợng kháng
nguyên.
Kháng nguyên (antigen) là những chất có khả năng huy động hệ miễn dịch
tiết ra kháng thể đặc hiệu với chúng gây ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu. Kháng
nguyên bao gồm protein lạ, axit nucleic, một số lipit và polysacharide.
20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Kháng thể (antibody) là protein ﻹ - globulin đƣợc sinh ra bởi dòng tế bào
lympho tham gia phản ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên
* Các phương pháp Elisa :
+ ELISA gián tiếp (indirect ELISA)
+ Sandwich ELISA
+ ELISA cạnh tranh
* Phát hiện E. coli O157:H7 bằng phương pháp Elisa:
- Phản ứng Elisa gián tiếp:
+ Nguyên liệu:
- Microplate
- Kháng nguyên chuẩn, huyết thanh thỏ,conjugate (chất gắn kết) có gắn enzym
peroxidase, bub


trate (chất tạo màu phản ứng, thƣờng là TMBZ (3,3’ 5,5’
tetramethybenzodine)), PBS,PBS-Tween, Sữa tách bơ (casein).
- Máy đọc phản ứng.
+ Trình tự phản ứng:
- Bƣớc 1. Phủ kháng nguyên 100µl kháng nguyên pha loãng ở nồng độ thích
hợp đƣợc gắn trƣc tiếp vào đĩa microplate. Thời gian ủ kháng nguyên thƣờng là qua
đêm ở nhiệt độ 4
o
C hoặc 37
o
C trong 2 giờ.
- Bƣớc 2. Phủ đĩa bằng 200µl dung dịch sữa tách bơ 5% mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ
phòng trong 2 giờ hoặc lắc ở 37
o
C sau 1 giờ. Đổ bỏ dung dịch có trong microplate.
Rồi dùng dung dịch PBS ( Phosphate Buffer Saline) còn chứa 0,05% Tween 20, rửa
đĩa 3 lần và đập khô.
- Bƣớc 3. Gắn kháng thể: 100µl huyết thanh pha loãng ở nồng độ thích hợp
bằng dung dịch PBS-sữa tách bơ 5%. Kháng thể ủ trong đĩa ở nhiệt độ 37
o
C, lắc sau
30 phút. Đổ bỏ dung dịch có trong microplate. Rồi dùng dung dịch PBS ( Phosphate
Buffer Saline) có chứa 0,05% Tween 20, rửa đĩa 3 lần, và đập khô.
21

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- Bƣớc 4. Kháng thể đặc hiệu loài : 100 µl phức liên hợp (conjugate) pha loãng
bằng PBS với độ pha loãng là 10.000 lần, nhỏ mỗi giếng và ủ ở 37
o

C trong 30 phút.
Đổ bỏ dung dịch có trong microplate. Rồi dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer
Saline) có chứa 0,05% Tween 20, rửa đĩa 5 lần, và đập khô.
- Bƣớc 5. Cơ chất tạo màu: 100 µl TMB vào mỗi giếng, để nhiệt độ phòng 15
phút, phản ứng sẽ chuyển sang màu xanh lục nếu là dƣơng tính. Dừng phản ứng
bằng dung dịch 1M H
2
SO
4
, lúc này phản ứng có màu vàng.
- Bƣớc 6. Đọc đĩa trên máy đọc đĩa ELISA ở bƣớc sóng 450 nm.
- Kháng nguyên thu hoạch nhƣ trên, đƣợc đo nồng độ protein và giữ ở nhiệt độ -
20
0
C.
* Ứng dụng của kháng thể đơn dòng trong xác định E. coli O157:H7
E. coli O157:H7 có hai loại kháng ngyên có ý nghĩa trong chuẩn đoán là
kháng nguyên O157 và H7. Vì vậy, kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các epitop của
hai loại kháng nguyên này thƣờng sử dụng để xác định vi khuẩn trong các hệ thống
chuẩn đoán huyết thanh.
Kháng thể đơn dòng đặc hiệu MAB 46 E9-9 nhận biết đặc hiệu kháng
nguyên lông H7 của loài E. coli .
Kháng thể MAB 13C4 nhận biết theo hƣớng nhận biết kháng nguyên độc tố
Stx1 của E. coli O157:H7.
* Ưu nhược điểm của phương pháp Elisa
- Ƣu điểm:
+ Nhanh chóng và thuận tiện .
+ Kháng nguyên của nồng độ rất thấp hoặc không biết có thể đƣợc phát hiện kể
từ khi bắt giữ kháng thể chỉ lấy kháng nguyên cụ thể.
- Nhƣợc điểm:

+ Thời gian xét nghiệm lâu.
+ Chỉ có các kháng thể đơn dòng có thể đƣợc sử dụng nhƣ cặp phù hợp.
22

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- Kháng thể đơn dòng có thể chi phí nhiều hơn so với các kháng thể đa dòng.
- Enzyme/chất nền phản ứng trong microwells phải đƣợc đọc càng sớm càng tốt.
1.4.3. Phát hiện E. coli bằ ng phức hợp kháng thể, hạt nano silica phát quang
Trong số cá c loạ i vi khuẩ n gây ngộ độ c thƣ̣ c phẩ m , E. coli O157:H7 đƣợ c
xem là rấ t nguy hiể m vớ i liề u gây độ c thấ p (10-100 tế bà o). Ngƣời ta đã sử dụng
nhiều phƣơng pháp khác nhau để phát hiện chúng. Tuy nhiên, các phƣơng pháp đều
không thể phát hiện chính xác số lƣợng vi khuẩ n ở nồng độ thấp . Để khắc phục
nhƣợc điểm nêu trên, ngƣời ta đã và đang ứng dụng các loại vật liệu nano phát
quang nhƣ hạt silica chứa tâm màu hay chấm lƣợng tử QD chƣ́ a cá c nhó m chƣ́ c
năng sinh họ c trên bề mặ t nhƣ một chất đánh dấu huỳnh quang để phát hiện nhanh
và chính xác số lƣợng vi khuẩn gây bệnh thực phẩm bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh
quang. Khâu cố t lõ i củ a kỹ thuậ t sƣ̉ dụ ng hạ t nano silica chƣ́ a tâm mà u là việ c chế
tạo ra đƣợc phức hợp giữa kháng thể đặc hiệu vi khuẩn đích với hạt silica phát
quang bề n vững.
Phƣ́ c hợ p khá ng thể và hạ t silica đƣợ c tạ o thà nh này có khả năng nhậ n biế t
và liên kết đặc hiệu với vi khuẩn đích E. coli O157 : H7 trong vò ng 20 phút, tỉ lệ vi
khuẩn đích gắn phức hợp và phát quang đạ t > 60% và phƣ́ c hợ p vẫ n giƣ̃ nguyên
hoạt tính sau 3 ngày. Giớ i hạ n phá t hiệ n củ a kỹ thuậ t nà y đố i vố i vi khuẩ n đí ch là
102 CFU/ml, thờ i gian phá t hiệ n nhanh hơn cá c phƣơng phá p thông thƣờ ng nhiề u
lầ n. Hình ảnh SEM (kính hiển vi quét ) và kính hiển vi đồ ng tiêu củ a tế bào E.
coli O157 : H7 đƣợc đánh dấu bởi phức hợp kháng thể và hạt nano silica đã chứng
minh rằng phức hợp này có thể bao bọc đều hoàn toàn và nhƣ nhau lên bề mặt tế
bào vi khuẩn. Qua đó có thể khẳng định các hạt nano silica hợ p sinh vớ i kháng thể
vẫn giữ nguyên tính chất phát quang hiệu quả và các phân tử kháng thể khi gắn với

hạt nano silica vẫn giữ đƣợc hoạt tính và có khả năng nhận biết và liên kết với vi
khuẩn đích [21].



23

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Mẫu nghiên cứu
86 mẫu thịt lợn tƣơi lấy ngẫu nhiên tại các chợ trên địa bàn thành phố Thái
Nguyên trong khoảng thời gian từ 5/2011 đến 5/2012.
2.1.2. Môi trƣờng, nguyên liệu, hóa chất
* Môi trường:
- Môi trƣờng thông dụng (Merck, Đức) đạt tiêu chuẩn Quốc tế (ISO) đƣợc sử
dụng để phân lập và giám định vi khuẩn E. coli. Môi trƣờng chế biến sẵn ở dạng
tổng hợp, khi dùng pha theo công thức hƣớng dẫn.
+ Môi trƣờng thạch Macconkey: Dùng để phân lập vi khuẩn E. coli.
+ Môi trƣờng thạch máu: Thử khả năng dung huyết của vi khuẩn E. coli.
+ Môi trƣờng TSI (Triple Sugar Iron Agar): Dùng để kiểm tra khả năng lên
men đƣờng glucose, lactose, saccharose, sinh khí, sinh H
2
S của vi khuẩn E. coli.
+ Môi trƣờng Nutrient Broth, thuốc thử Kovac’s: Dùng để kiểm tra đặc tính
sinh Indol của vi khuẩn E. coli.

+ Nƣớc muối sinh lý 0,9%: Dùng để pha loãng mẫu.
- Môi trƣờ ng LB (Luria-Bertani) để nuôi cấy vi khuẩn.
- Kháng huyết thanh chuẩn.
* Nguyên liệu và hóa chất:
Khoanh giấy (đƣờng kính 9 mm) đã tẩm các loại kháng sinh khác nhau, do
hãng Nam Khoa cung cấp, đƣợc bảo quản tại Viện Khoa học sự sống – Đại học
Thái Nguyên.
Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm đƣợc cung cấp bởi các hãng tin
cậy: Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) (Wako, Nhật Bản);
24

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Lysozyme RNase A, XhoI, NotI, MluI, T4-ligase (Fermentas); Probond
TM
resin
(Invitrogen, Đức); Amplification kit (GE Healthcare); immidazole, NiCl
2
, NaCl,
NaH
2
PO
4
, Na
2
HPO
4
, MgSO
4
, MnCl

2
, sodium dodecyl sulfate (SDS) (Merck, Đức);
Agarose, cao nấm men, peptone (Biobasic ICN, Mỹ); và một số hóa chất khác đều ở
dạng tinh khiết.
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
* Dụng cụ
Dụng cụ
Nƣớc sản xuất
Đĩa petri thủy tinh đƣờng kính 90-100 mm
Việt Nam
Pipet có chia độ loại 1ml, 5 ml, 10 ml
Việt Nam
Bình tam giác thủy tinh dung tích 250 – 500 ml
Đức
Ống nghiệm loại 16 – 10 mm và lớn hơn
Đức
Đèn cồn, que cấy, giá để ống nghiệm
Việt Nam
Kéo, panh, quả bóp, cối chày sứ
Việt Nam

* Thiết bị thí nghiệm
Thiết bị thí nghiệm đƣợc sử dụng tại Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái
Nguyên; Phòng CNSH Enzyme, Phòng Các chất chức năng sinh học và Phòng thí
nghiệm trọng điểm Công nghệ gene, Viện Công nghệ sinh học, Viện KH và CN
Việt Nam.

25

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



2.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Lấy mẫu tại một số chợ trung tâm trên địa bàn thành phố Thái Nguyên.
- Phân lập xác định mức độ nhiễm và nghiên cứu một số đặc điểm sinh
học, hóa học tại bộ môn Công nghệ vi sinh, Viện Khoa học Sự sống, Đại học Thái
Nguyên từ tháng 5/2011- 4/2012
- Nghiên cứu đặc điểm di truyền, giải trình tự, xây dựng cây phân loại tại
Phòng CNSH Enzyme, Phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh
Bảng 2.1. Các thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
Thiết bị
Hãng sản xuất (nƣớc)
Tủ ấm
Sanyo Electric (Nhật Bản)
Tủ ATSH cấp II
Euroclone-BioAir (Italia)
Máy đo pH
Hana (Italia)
Vortexer
Bio-RAD (Mỹ)
Bể ổn nhiệt (VS-1205 CW)
Vision (Hàn Quốc)
Bể ổn nhiệt (E22331)
Trung Quốc

Box cấy vi sinh vật clean bench
Việt Nam
Cân phân tích BL 150S
Sartorius (Đức)
Cân phân tích AB 240
Thụy sỹ
Hệ thống chụp ảnh gel-doc
Pharmacia
Hệ thống điện di ngang
Mupid  (Nhật bản)
Lò vi sóng
Samsung (Hàn Quốc)
Máy lắc nuôi cấy
Certomat HK (Đức)
Máy ly tâm lạnh Mikro 22R
Hettich (Đức)
Nồi khử trùng ES-315
Tomy (Nhật Bản)
Tủ lạnh -80C, -20C, 4C
Sanyo, Toshiba (Nhật)