Nghiên cứu đặc điểm của Gen GmDreb2 phân lập từ cây đậu tương Glycine max (L.) Merrill

S
ố hóa bởi Trung tâm Học liệu


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC






HOÀNG THỊ XOAN






NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmDREB2 PHÂN
LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƢƠNG Glycine max (L.) Merrill





LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2013

S
ố hóa bởi Trung tâm Học liệu



ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC



HOÀNG THỊ XOAN




NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmDREB2 PHÂN
LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƢƠNG Glycine max (L.) Merrill


Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu





Thái Nguyên - 2013


S
ố hóa bởi Trung tâm Học liệu

i

LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ
nguồn gốc.
Tác giả




Hoàng Thị Xoan

S
ố hóa bởi Trung tâm Học liệu

ii
LỜI CẢM ƠN

Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã
tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi
hoàn thành Bản luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Trƣởng
khoa Khoa học Sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã
nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô và tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Khoa
Khoa học Sự sống, cảm ơn Lãnh đạo Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học
Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình
học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn
bè và đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua.

Tác giả




Hoàng Thị Xoan

S
ố hóa bởi Trung tâm Học liệu

iii

MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan
i
Lời cảm ơn
ii
Mục lục
iii
Những chữ viết tắt trong luận văn
v
Danh mục các bảng trong luận văn
vi
Danh mục các hình trong luận văn
vii
MỞ ĐẦU 1
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu 3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG 4
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và vị trí cây đậu tƣơng 4
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng 5
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và ở Việt Nam 7
1.2. GEN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 9
1.2.1. Hạn và tác động hạn đến sinh trƣởng phát triển của thực vật 9
1.2.2. Đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng 11
1.2.3. Một số gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tƣơng 13
1.2.3.1. Nhóm gen chức năng liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn của cây
đậu tƣơng 13
1.2.3.2. Nhóm gen điều khiển quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn 16

1.3. NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB VÀ DREB2 18
1.3.1. Nhân tố phiên mã DREB 18
1.3.2. DREB2 và gen GmDREB2 20
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25

S
ố hóa bởi Trung tâm Học liệu

iv
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 25
2.1.1. Vật liệu 25
2.1.2. Hóa chất 26
2.1.3. Thiết bị 26
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.2.1. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non trong
điều kiện gây hạn nhân tạo 28
2.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử 29
2.2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 29
2.2.2.2. Kỹ thuật PCR 30
2.2.2.3. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR 32
2.2.2.4. Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng 33
2.2.2.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5 34
2.2.2.6. Tách chiết plasmid 34
2.2.2.7. Phƣơng pháp phân tích trình tự gen 35
2.2.2.8. Xử lý kết quả và tính toán số liệu 35
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG
NGHIÊN CỨU 36
3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN GmDREB2 TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU
TƢƠNG NGHIÊN CỨU 39

3.2.1. Tách chiết DNA từ lá non hạt đậu tƣơng 39
3.2.2. Kết quả nhân gen GmDREB2 bằng kỹ thuật PCR 40
3.2.3. Kết quả tách dòng và giải trình tự gen GmDREB2 41
3.2.4. So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB2 của ba giống đậu
tƣơng BS, BG, HG1 và các trình tự đã công bố 43

S
ố hóa bởi Trung tâm Học liệu

v
3.2.5. So sánh trình tự amino acid của protein DREB2 của ba giống đậu
tƣơng BS, BG, HG1 và các trình tự đã công bố 45
3.3 PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG VỀ TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ
TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA GEN DREB2 Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG 45
3.3.1. Sự đa dạng của các giống đậu tƣơng trên cơ sở phân tích trình tự
nucleotide của gen DREB2 45
3.3.2. Phân tích sự đa dạng trong trình tự amino acid của DREB2 48
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51


S
ố hóa bởi Trung tâm Học liệu

vi
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT


ABA
Abscisis acid

bp
Cặp base
CS
Cộng sự
DNA
Deoxiribonucleic acid
DREB
Dehydration- Responsive Element Binding
EDTA
Ethyen Diamin Tetraacetic Acid
HSP
Heat shock protein
kb
Kilo base
LEA
Late Embryogenesis Abundant protein (Protein tích luỹ với số
lƣợng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi)
LTP
Lipid Tranfer protein (Protein vận chuyển lipid)
MGPT
Môi giới phân tử
PCR
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)
RNA
Ribonucleic Acid
TAE
Tris acetat EDTA

S
ố hóa bởi Trung tâm Học liệu

vii
DANH MỤC CÁC BẢNG


Bảng
Tên bảng
Trang
Bảng 1.1
Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ 2005- 2011
8
Bảng 2.1
Nguồn gốc các giống đậu tƣơng nghiên cứu
25
Bảng 2.2
Danh mục các thiết bị đã sử dụng
27
Bảng 2.3
Trình tự cặp mồi nhân gen DREB2
30
Bảng 2.4
Thành phần phản ứng PCR
31
Bảng 2.5
Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
31
Bảng 2.6

Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT
33
Bảng 3.1
Chỉ số chịu hạn của các giống đậu tƣơng nghiên cứu
38
Bảng 3.2
Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự gen
GmDREB2 của 3 giống đậu tƣơng BS, BG và HG1 và
trình tự gen GmDREB2 của 9 giống đậu tƣơng trên
GenBank
46
Bảng 3.3
Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự amino
acid của protein DREB2 của 3 giống đậu tƣơng BS, BG,
HG1 và trình tự amino acid của protein DREB2 của 9
giống đậu tƣơng trên GenBank
48





S
ố hóa bởi Trung tâm Học liệu

viii
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình
Tên hình

Trang
Hình 1.1
Sơ đồ mô tả gen và vùng mã hóa của gen GmDREB2 ở
đậu tƣơng
23
Hình 1.2
Sơ đồ mô tả protein GmDREB2 ở đậu tƣơng
23
Hình 1.3
Trình tự amino acid của vùng AP2 của protein DREB2 ở
đậu tƣơng
23
Hình 2.1
Hình ảnh hạt các giống đậu tƣơng nghiên cứu
26
Hình 2.2
Sơ đồ vector tách dòng pBT
33
Hình 3.1
Hình ảnh cây đậu tƣơng non của 7 giống đậu tƣơng hạn
trƣớc khi gây hạn
36
Hình 3.2
Hình ảnh cây đậu tƣơng non của 7 giống đậu tƣơng sau 7
ngày hạn
37
Hình 3.3
Hình ảnh điện di DNA tổng số của 4 giống HG1, BG,
HG4 và BS
39

Hình 3.4.
Hình ảnh điện di sản phẩm nhân gen GmDREB2 của bốn
giống đậu tƣơng nghiên cứu
40
Hình 3.5.
Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E.coli chủng DH5
chứa vector tái tổ hợp mang gen GmDREB2
41
Hình 3.6
Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR gen
GmDREB2 trực tiếp từ khuẩn lạc
42
Hình 3.7
Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen
GmDREB2
42

S
ố hóa bởi Trung tâm Học liệu

ix
Hình 3.8.
Trình tự gen GmDREB2 phân lập từ ba giống đậu tƣơng
HG1, BG, BS
44
Hình 3.9
Sơ đồ so sánh trình tự amino acid của protein DREB2
suy diễn từ trình tự gen GmDREB2
45
Hình 3.10

Biểu đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền của 11
giống đậu tƣơng dựa trên mức độ tƣơng đồng của trình
tự gen GmDREB2
47
Hình 3.11
Biểu đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền của 11
giống đậu tƣơng dựa trên mức độ tƣơng đồng của trình
tự amino acid của protein DREB2
49




1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill ) là loại cây trồng thuộc họ đậu,
không chỉ có vai trò quan trọng về mặt kinh tế và dinh dƣỡng mà còn có vai
trò quan trọng trong việc cải tạo đất. Trong hạt đậu tƣơng có hàm lƣợng dinh
dƣỡng cao, chứa 35% - 52% protein, 18% - 25% lipit, 10% – 15% glucid và
nhiều loại amino acid không thay thế nhƣ: leucin, isoleucin, lysin, metionin,
phenylalanin, tryptophan, valin. Ngoài ra, trong hạt đậu tƣơng còn chứa nhiều
vitamin (B1, B2, A, D, E, K…) là thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao, rất
cần thiết cho cơ thể ngƣời và động vật. Đặc biệt, protein của đậu tƣơng đƣợc
coi là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lƣợng đáng kể các
amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể, dễ tiêu hoá và không có các
thành phần tạo cholesterol. Lipit của đậu tƣơng chứa tỉ lệ lớn các axit béo
chƣa no, có hệ số đồng hoá lớn (98%), chỉ số iot cao (120-137). Sử dụng
protein và lipit của hạt đậu tƣơng còn có tác dụng chữa một số bệnh nhƣ: đái

tháo đƣờng, béo phì, huyết áp cao, chảy máu não… [3].
Ngoài ra, ở rễ cây đậu tƣơng có các nốt sần, đó là kết quả của sự cộng
sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ tạo khả năng cố định nitơ
trong không khí. Vì vậy, đậu tƣơng là loại cây trồng có tác dụng cải tạo đất,
làm cây trồng vụ sau phát triển tốt hơn, góp phần phá vỡ chu kỳ sâu bệnh,
chống ô nhiễm môi trƣờng do lạm dụng phân bón và thuốc trừ sâu [6].
Do biến đổi khí hậu mà trong những năm gần đây hạn hán xảy ra thƣờng
xuyên đã tác động xấu đến sự sinh trƣởng, phát triển làm giảm năng suất cây
trồng. Đậu tƣơng là loại cây trồng thuộc nhóm cây chịu hạn kém, vì vậy chọn
giống đậu tƣơng theo định hƣớng về khả năng chịu hạn cao hoặc cải thiện đặc
tính chịu hạn của cây đậu tƣơng là yêu cầu thực tiễn đặt ra.


2

Đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng là tính trạng đa gen có hai nhóm
gen liên quan đến tính chịu hạn đó là: (i) nhóm gen chức năng mà sản
phẩm của nhóm gen này trực tiếp liên quan đến tính chịu hạn và (ii) nhóm
gen mà sản phẩm của chúng là những protein điều hòa hoạt động của
nhóm gen chức năng.
DREB là một loại protein điều hòa, có chức năng kích thích hoạt động
phiên mã của nhóm gen chịu hạn. Tuy DREB không trực tiếp tham gia vào
quá trình kháng hạn nhƣng nó giữ vai trò là nhân tố kích thích đồng thời sự
biểu hiện của các gen liên quan đến khả năng chịu hạn. DREB là một họ
protein trong đó có DREB2, gen DREB2 đƣợc biểu hiện trong môi trƣờng
có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp. Chình vì vậy phân
lập và nghiên cứu gen DREB tạo nguyên liệu phục vụ tạo cây chuyển gen
nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tƣơng là vấn đề đang đƣợc quan
tâm nghiên cứu.
Xuất phát từ lý do trên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm của gen GmDREB2 phân lập từ cây đậu tƣơng
[Glycine max (L.) Merrill]”.

2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định đƣợc sự khác nhau về khả năng chịu hạn của một số giống
đậu tƣơng địa phƣơng;
Xác định đƣợc điểm sai khác về trình tự gen GmDREB2 phân lập từ
một số giống đậu tƣơng địa phƣơng.
Đánh giá đƣợc sự đa dạng của một số giống đậu tƣơng dựa trên trình tự
gen GmDREB2 và trình tự amino acid suy diễn.



3

3. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của một số giống đậu tƣơng địa phƣơng
nghiên cứu.
- Thu thập thông tin về gen DREB2 ở cây đậu tƣơng và thiết kế cặp mồi cho
PCR nhân gen.
- Nhân gen DREB2 từ hệ gen của giống đậu tƣơng địa phƣơng bằng kỹ thuật
PCR với cặp mồi đã thiết kế. Tách dòng và xác định trình tự gen DREB2.
- So sánh trình tự gen DREB2 của một số giống đậu tƣơng địa phƣơng với
trình tự gen đã công bố.
- Phân tích hệ số tƣơng đồng di truyền và hệ số sai khác về trình tự gen
DREB2 và trình tự amino acid suy diễn. Thiết lập sơ đồ hình cây giữa các
giống đậu tƣơng dựa trên trình tự gen DREB2 và trình tự amino acid suy diễn.

4

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và vị trí cây đậu tƣơng
Cây đậu tƣơng hay còn gọi là đậu nành, tên khoa học Glycine max (L.)
Merill (2n= 40) thuộc họ đậu (Fabaceae),họ phụ cánh bƣớm (Papilinoideae)
(Hymowitz và Newell, 1981). Các giống đậu tƣơng trồng ở Việt Nam thuộc
loài Glycine max (L.) Merill (2n= 40) trong giống phụ G.Soya, giống Glycine
thuộc họ đậu (Lengunoceace) họ phụ cánh bƣớm (Papilinoideae).
Đối với đậu tƣơng có thể phân loại theo đặc điểm thực vật học, dựa vào
thời gian sinh trƣởng, theo thời vụ. Hiện nay đậu tƣơng đƣợc trồng ở Việt
Nam có hai nguồn gốc, đó là các giống địa phƣơng và các giống nhập nội.
Mặc dù nguồn gốc và lịch sử ban đầu của cây đậu tƣơng chƣa sáng tỏ nhƣng
đã có những bằng chứng chứng tỏ giống đậu này đã đƣợc thuần hoá đầu tiên ở
Trung Quốc. Từ Trung Quốc đậu tƣơng đƣợc đƣa sang Triều Tiên, Nhật Bản,

Nga, sang Đông Nam Á và Nam Á qua con đƣờng tơ lụa. Ở Việt Nam đậu
tƣơng đƣợc trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh trung du, miền núi phía Bắc
và miền Đông Nam Bộ [3], [6], [8].
Cây đậu tƣơng là loại cây quan trọng bậc nhất trong các cây họ Ðậu.
Để có vị trí nhƣ vậy là nhờ đậu tƣơng có những đặc tính ƣu việt hơn những
giống đậu khác, đó là: Hàm lƣợng protein và lipit cao: protein (35% - 52%),
lipit từ (18% - 25%), glucid (10% -15%), chứa nhiều loại vitamin , là nguồn
năng lƣợng quan trọng cho con ngƣời và vật nuôi. Các sản phẩm rất quen
thuộc của đậu tƣơng nhƣ đậu phụ, tƣơng, dầu ăn có vai trò hết sức quan
trọng trong đời sống hàng ngày của con ngƣời. Gần đây các nhà khoa học đã
nghiên cứu và phát hiện đậu tƣơng có vai trò chữa và điều trị bệnh nan y nhƣ


5

ung thƣ, tim mạch Đậu tƣơng còn có thể giải quyết một phần vấn đề hết sức
cấp thiết hiện nay trên thế giới là năng lƣợng từ các sản phẩm của nó. Ngoài
ra đậu tƣơng là cây họ đậu nên có tác dụng cải tạo đất thông qua việc cố định
đạm của vi khuẩn trên các nốt sần ở rễ, góp phần làm giảm lƣợng phân hóa
học bón xuống đất, khắc phục sự thoái hóa đất và ô nhiễm môi trƣờng [3], [6].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng
Cây đậu tƣơng là cây trồng cạn ngắn ngày, gồm các bộ phận chính: rễ,
thân, lá, hoa, quả, hạt.
Đậu tƣơng là cây hai lá mầm có rễ cọc, gồm rễ cái và rễ bên. Khi hạt
nảy mầm, phôi phát triển thành rễ cái. Rễ tập trung ở tầng đất mặt 30 – 40 cm,
ăn lan khoảng 20– 40 cm. Trên rễ có nhiều nốt sần, những nốt sần này đƣợc
ví nhƣ nhà máy sản xuất đạm. Trên nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium
japonicum có khả năng cố định đạm của không khí tạo thành đạm dễ tiêu. Nốt
sần có phẩm chất tốt thì to, có màu hồng. Số lƣợng và trọng lƣợng nốt sần có
liên quan trực tiếp đến sinh trƣởng và năng suất cây đậu tƣơng.

Cây đậu tƣơng là cây thân thảo, ít phân cành, dạng bụi. Thân hình tròn,
nhiều lông, mang nhiều đốt, thân thƣờng đứng, có khi bò hay nửa bò, thân
thƣờng có màu xanh, có từ 14 – 15 lóng, chiều cao trung bình từ 0,5 – 1,2 m,
thay đổi tuỳ theo giống, thời vụ, mật độ cây, đất đai, phân bón…
Cành đậu tƣơng mọc ra từ các đốt trên thân. Đốt đầu tiên của thân chính
mang hai lá mầm, đốt thứ hai mang hai lá đơn đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên
mỗi đốt mang một lá kép, mỗi lá kép có bao lá chét.
Lá đậu tƣơng có hình dạng khác nhau: tròn, hẹp, bầu dục, lƣỡi mác
hoặc hình thoi…nhƣng thƣờng quy thành hai loại là lá rộng và lá hẹp. Gồm có
các dạng lá theo từng thời kì sinh trƣởng, phát triển của cây: lá mầm, lá đơn
và lá kép có 3 lá chét, đôi khi có 4-5 lá chét.


6

Thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào
giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hƣởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ.
Hoa đậu tƣơng thuộc hoa cánh bƣớm, mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ
7 – 8 hoa, có màu trắng hoặc tím, mọc ở ngọn hay nách lá.
Quả đậu tƣơng thuộc loại quả ráp, đa số ngoài vỏ có lông bao phủ, khi
chín có màu vàng hoặc xám đen. Mỗi quả có 1 - 4 hạt, nhƣng thƣờng có 2 hạt.
Hạt đậu tƣơng có hình dạng tròn hay bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, vỏ hạt
thƣờng nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu đen…nhƣng đa số là hạt
màu vàng. Khối lƣợng hạt dao động từ 200 – 400 mg/hạt.
Cây đậu tƣơng có 2 đặc tính sinh trƣởng: sinh trƣởng hữu hạn và sinh
trƣởng vô hạn; căn cứ vào thời gian sinh trƣởng có 3 loại: chín sớm (75- 85
ngày), trung bình (80- 100 ngày), chín muộn (110- 120 ngày).
Đậu tƣơng là cây trồng tƣơng đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh.
Trong tập đoàn giống đậu tƣơng, có những giống chỉ trồng vào vụ hè, ngƣợc
lại có những giống chỉ trồng vào vụ đông [3], [6].

Đặc điểm về sinh thái học của đậu tƣơng
Nhiệt độ: Ở giai đoạn nẩy mầm nhiệt độ thích hợp 24 – 30
0
C, ở giai
đoạn cây con nhiệt độ từ 24 – 30
0
C, ở giai đoạn ra hoa kết trái 24 – 34
0
C và
giai đoạn chín: 20 – 25
0
C. Cây đậu tƣơng cần lƣợng mƣa tối thiểu phải đạt từ
400 mm, tốt nhất là 700 mm. Ở mỗi giai đoạn cây đậu tƣơng có nhu cầu khác
nhau về độ ẩm. Giai đoạn nẩy mầm thích hợp với độ ẩm khoảng 75 – 80%,
đến giai đoạn cây con nhu cầu về độ ẩm giảm 50 – 60% song lại tăng mạnh
ở giai đoạn ra hoa kết quả 70 – 80% và thấp nhất ở giai đoạn chín: 35 – 50 %.
Đa số các giống đậu tƣơng trồng hiện nay đều có phản ứng quang chu kỳ
ngày ngắn. Đậu tƣơng có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau: đất đỏ, đất


7

xám, đất phù sa, đất giồng cát. Nhƣng để trồng đậu tƣơng có hiệu quả phải
trồng trên đất có thành phần cơ giới nhẹ, pH từ 5 – 8 [3], [4], [6].
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và ở Việt Nam
Cây đậu tƣơng đƣợc xem là một loại cây trồng chiến lƣợc của nhiều
quốc gia, với vị trí thứ tƣ, sau lúa, ngô và lúa mỳ.
Đậu tƣơng có khả năng thích ứng khá rộng nên đƣợc trồng khắp các
châu lục, đặc biệt là châu Mỹ (75,68%) và châu Á (21,27%).
Trong những năm gần đây, do kết quả của việc ứng dụng những tiến bộ

của công nghệ sinh học từ chọn, tạo giống đến sản xuất nên năng suất đậu
tƣơng đã tăng lên đáng kể, đƣa đậu tƣơng trở thành cây trồng quan trọng
trong cơ cấu cây trồng của nhiều quốc gia.
Hiện nay, đậu tƣơng đƣợc trồng ở gần 80 quốc gia khác nhau trên thế
giới. Trong đó, 4 nƣớc có sản lƣợng đậu tƣơng đứng đầu là: Mỹ, Brazil,
Argentina và Trung Quốc. Đậu tƣơng là nguồn cung cấp dầu và protein
quan trọng.
Ở Việt Nam, đậu tƣơng đƣợc trồng từ rất lâu, trƣớc cây đậu xanh và
các cây họ đậu khác. Các giống đậu tƣơng ở nƣớc ta bao gồm các giống đậu
tƣơng nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tƣơng đột biến và các giống đậu
tƣơng địa phƣơng.
Trƣớc cách mạng tháng 8 năm 1945, diện tích gieo trồng đậu tƣơng ở
Việt Nam chỉ khoảng 32 ha, năng suất 4,1 tạ/ha. Hiện nay, diện tích đó đã
đƣợc tăng lên đáng kể, cả nƣớc có 7 vùng nông nghiệp đều trồng đƣợc đậu
tƣơng với diện tích gieo trồng (năm 1997) lớn nhất là miền núi phía bắc
(46,6%), tiếp đến là đồng bằng sông Hồng (19,3%), vùng Tây Nguyên (11%),
miền Đông Nam Bộ (10,2%). đồng bằng sông Cửu Long (8,9%), khu Bốn
(2,3%), vùng Duyên hải miền Trung (1,6%) [6].


8

Cây đậu tƣơng chiếm một vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp
của nƣớc ta hiện nay, đặc biệt ở những vùng nông thôn nghèo, kinh tế chƣa
phát triển.
Mặc dù quy mô sản xuất còn khá nhỏ và nhu cầu tiêu thụ trong nƣớc có
xu hƣớng giảm, nhƣng sản lƣợng đậu tƣơng nƣớc ta năm 2010 vẫn đạt
297.000 tấn, tăng 39% so với năm 2009. Nguyên nhân chính là do sự mở rộng
đáng kể về diện tích cây trồng (khoảng 35%) và những nỗ lực nhằm cải thiện
năng suất của ngành. Tuy nhiên, sản lƣợng trên vẫn còn thấp so với mục tiêu

đề ra cho năm 2010 là 325.000 tấn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông
thôn do chi phí sản xuất tăng và năng suất đậu tƣơng của nƣớc ta chƣa cao.
Theo số liệu thống kê chính thức của chính phủ, đậu tƣơng đƣợc trồng
ở 28 tỉnh trên khắp cả nƣớc, trong đó 70% ở miền bắc và 30% ở miền nam.
Khoảng 65% đậu tƣơng nƣớc ta đƣợc trồng ở vùng cao, những nơi đất không
cần màu mỡ; và 35% đƣợc trồng ở những vùng đất thấp ở khu vực đồng bằng
sông Hồng. Đậu tƣơng đƣợc trồng ở nhiều địa phƣơng trên khắp cả nƣớc vào
từng thời điểm khác nhau nên có cả vụ xuân, vụ hè và vụ đông.
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ 2005- 2011

2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
Diện tích canh
tác (nghìn ha)
204,1
185,6
190,1
192,1
146,2
197,8
215*
Sản lƣợng
(tấn/ha)
1,43
1,39

1,45
1,39
1,46
002
1,63*
Tổng sản lƣợng
(nghìn tấn)
292,7
258,1
275,5
267,6
213,6
296,9
350*
(Nguồn: Tổng cục thống kê Việt Nam, * số liệu ước tính của FSA)


9

Tuy nhiên, do chƣa đƣợc đầu tƣ cao nên năng suất đậu tƣơng còn
nhiều hạn chế. Xét về diện tích gieo trồng vẫn tăng qua các năm nhƣng tỉ lệ
diện tích gieo trồng đậu tƣơng còn thấp, chỉ khoảng 1,5- 1,6%. Năng suất
đậu tƣơng của nƣớc ta rất thấp, chỉ bằng 50- 70% năng suất đậu tƣơng của
toàn thế giới. Sản lƣợng đậu tƣơng sản xuất ra chƣa đủ đáp ứng nhu cầu
trong nƣớc. Hàng năm, chúng ta vẫn phải nhập khẩu một số lƣợng đáng kể
từ nƣớc ngoài.
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng trên, có thể là do dịch bệnh,
kỹ thuật canh tác, nhƣng chủ yếu là do biến đổi khí hậu và hạn hán. Vì vậy
một trong những yêu cầu thực tiễn đặt ra là nghiên cứu tạo ra giống đậu
tƣơng có khả năng thích nghi với những điều kiện sinh thái ở những vùng

khác nhau.
Trong những năm gần đây, cùng với việc nghiên cứu các công nghệ
sinh học và các loại đậu tƣơng cao sản mới để tìm ra giống cho năng suất cao
với chi phí sản xuất thấp, các nhà chọn giống Việt Nam còn quan tâm nghiên
cứu các giống đậu tƣơng địa phƣơng có năng suất thấp nhƣng lại có chất
lƣợng hạt cao và có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi
trƣờng nhƣ: nóng, lạnh, mặn, phèn, hạn
1.2. GEN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG
1.2.1. Hạn và tác động hạn đến sinh trƣởng phát triển của thực vật
Hạn là tình trạng mất nƣớc ở cây nguyên nhân có thể do nhiều lý do: nhƣ
sự thiếu nƣớc trong môi trƣờng hay do nhiệt độ thấp, đốt nóng, độ mặn cao.
Hạn cũng nhƣ các yếu tố ngoại cảnh khác khi tác động lên cơ thể gây ra các
phản ứng của cơ thể, tuỳ theo từng loài từng giống mà mức độ phản ứng của cơ
thể cũng nhƣ thiệt hại do khô hạn gây ra là khác nhau: một số bị chết, một số bị
thƣơng, một số khác bị ảnh hƣởng còn lại một số không bị ảnh hƣởng


10

Khô hạn có thể phân ra làm hai trƣờng hợp sau:
(i) Hiện tƣợng khô xảy ra khi mất một phần nƣớc trong các cơ quan ở giai
đoạn nhất định trong chu kỳ sống ở thực vật (hạt, hạt phấn, bào tử). Hiện
tƣợng này không làm ảnh hƣởng đến tế bào, mô của cây. Đây là quá trình
biến đổi trạng thái trong tế bào có sự điều khiển của hệ thống thông tin di
truyền. Trong giai đoạn hình thành hạt nếu tế bào mất nƣớc khả năng chịu hạn
tăng lên. Khả năng này đạt cực đại ở thời kỳ hạt chín và có chiều hƣóng giảm
dần khi hạt nảy mầm. Hạt khô còn có khả năng chống chịu với hàng loạt điều
kiện ngoại cảnh bất lợi khác nhƣ nhiệt độ, gió.
(ii) Hạn do tác động của môi trƣờng chịu tác động bên ngoài rất lớn, gây ảnh
hƣởng đến đời sống của cây, có thể gây huỷ hoại cây cối và gây mất mùa.

Hiện tƣợng này xảy ra khi trong môi trƣờng đất và không khí thiếu nƣớc đến
mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh đƣợc để lấy nƣớc vào tế bào.
Những yếu tố bất lợi chính là các thành phần nhƣ thổ nhƣỡng, nhiệt độ, gió
nóng hay thời tiết, khí hậu. Có hai loại hạn do môi trƣờng tác động là: hạn đất
và hạn không khí.
(iii) Hạn đất thƣờng xảy ra ở những vùng có khí hậu hay thổ nhƣỡng đặc thù,
hạn tác động mạnh mẽ lên bộ rễ của cây. Sự tác động này đƣợc biểu hiện qua
sự điều tiết các hoocmon giúp cho cây chống chịu với điều kiện cực đoan.
(iv) Hạn nhiệt độ không khí: thƣờng xảy ra ở những vùng có gió nóng, nhiệt
độ cao. Hạn không khí thƣờng tác động lên các bộ phận trên mặt đất nhƣ lá,
hoa. Hạn do tác động của môi trƣờng dẫn đến hiện tƣợng mất nƣớc trong cây
ở các bộ phận mô, tế bào khác nhau.
Tác hại của khô hạn
Hạn tác động lên cây theo hai hƣớng chính: làm tăng nhiệt độ cây và
gây mất nƣớc trong cây. Nƣớc là yếu tố giới hạn với cây trồng, vừa là nguyên
liệu khởi đầu vừa là sản phẩm trung gian và cuối cùng của các quá trình


11

chuyển hoá sinh học. Nƣớc còn là môi trƣờng cho các phản ứng sinh hoá
trong tế bào xảy ra, do vậy việc cung cấp nƣớc cho cây trồng và hƣớng nghiên
cứu tăng cƣờng tính chịu hạn của cây trồng là mục tiêu tạo giống thƣờng
xuyên đƣợc quan tâm. Đối với thực vật nói chung và cây trồng nói riêng, hạn
có ảnh hƣởng tới hai quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây đó là giai
đoạn cây non và giai đoạn cây ra hoa.
Nhƣ vậy ảnh hƣởng cực đoan của hạn ở bất cứ giai đoạn sinh trƣởng
nào của cây trồng cũng tác động xấu đến các yếu tố cấu thành năng suất, làm
giảm năng suất cây trồng [1], [2], [5], [7], [9], [10].
1.2.2. Đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng

Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tƣơng nói riêng là cây có nhu cầu về
nƣớc cao hơn các loại cây khác là do trong hạt và cây đậu tƣơng có h
–
50%, trong khi đó ngô chỉ là 30%, lúa là 26% [6].
Khi nghiên cứu về các đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng về phƣơng
diện sinh l
đến đặc điểm hóa keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi
chất. Tính chịu hạn của cây đậu tƣơng mang tính đa gen. Chúng thể hiện ở
nhiều khía cạnh khác nhau nhƣ: sự phát triển mạnh của bộ rễ, tính chín sớm
tƣơng đối, cũng nhƣ bản chất di truyền của từng giống có khả năng sử dụng
nƣớc tiết kiệm trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây. Căn cứ vào
đặc điểm này đậu tƣơng chia làm 2 nhóm:
- Nhóm chịu đƣợc sự mất nƣớc trong từng giai đoạn phát triển của cây.
- Nhóm chịu đƣợc sự thiếu nƣớc trong tất cả các giai đoạn phát triển của cây.
,
còn ở những giai đoạn nhƣ ra hoa
.


12

Cây đậu tƣơng thuộc nhóm cây chịu hạn kém. Các cây họ đậu nói
chung, cây đậu tƣơng nói riêng do có hàm lƣợng protein và lipid trong hạt cao
nên nhu cầu về nƣớc nhìn chung cao hơn các loại cây khác. Để tổng hợp 1 kg
chất khô cần 500- 530 kg nƣớc. Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nƣớc
của đậu tƣơng cũng khá cao, khoảng 50%, trong khi đó ở ngô là 30%, ở lúa là
26% [6].
Đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng liên quan chặt chẽ đến đặc điểm
hoá keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất. Tính chịu
hạn của cây đậu tƣơng mang tính đa gen. Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh

khác nhau: sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm tƣơng đối, cũng nhƣ
bản chất di truyền của từng giống trong quá trình sinh trƣởng và phát triển có
khả năng sử dụng nƣớc tiết kiệm.
Hạn hán và độ mặn cao có ảnh hƣởng làm giảm mạnh năng suất cây
trồng trên toàn thế giới trong đó có đậu tƣơng. Để thích ứng với điều kiện
nhƣ vậy cơ thể thực vật đã phát triển một loạt các cơ chế đòi hỏi sự khởi động
của nhiều gen liên quan chống lại stress do các điều kiện bất lợi vô sinh. Một
số lƣợng lớn các gen liên quan đến khả năng chịu hạn và chịu mặn đã đƣợc
xác định. Tuy nhiên, vẫn còn một số lƣợng đáng kể các gen liên quan đến tính
chống chịu của thực vật chƣa đƣợc xác định. Vì vậy điều quan trọng là nghiên
cứu các chức năng của gen liên quan đến stress để cải thiện khả năng chống
chịu của cây trồng với hạn hán. Có hai nhóm gen có liên quan chủ yếu đến
tính chịu hạn của cây đậu tƣơng:
(1). Nhóm gen mà sản phẩm của chúng có ảnh hƣởng trực tiếp tới đặc
tính chịu hạn; (2). Nhóm gen mà sản phẩm của chúng kích hoạt quá trình
phiên mã của nhóm gen chịu hạn.


13

1.2.3. Một số gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tƣơng
1.2.3.1. Nhóm gen chức năng liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn của cây
đậu tương
Các gen chức năng liên quan đến tính chịu hạn bao gồm: LEA, HSP,
Chaperons, LTP, P5CS…
LEA (Late embryogenesis abundant protein)
LEA là loại protein đƣợc tổng hợp với số lƣợng lớn trong giai đoạn
cuối của quá trình hình thành phôi, là một trong những nhóm protein liên
quan đến điều kiện mất nƣớc của tế bào. Nhóm gen mã hóa loại protein LEA
đóng vai trò quan trọng trong sự chịu khô hạn của hạt và liên quan đến khả

năng chống hạn của cây. Khi hiện tƣợng mất nƣớc xảy ra, gen LEA phiên mã
tổng hợp một số lƣợng lớn mRNA trong hạt chín và bị phân giải hết trong quá
trình nảy mầm. Mức độ phiên mã của gen LEA đƣợc điều khiển bởi acid
abcisic (ABA) và độ mất nƣớc của tế bào, áp suất thẩm thấu trong tế bào.
Protein LEA đƣợc chú ý trong điều kiện thực vật bị stress do thiếu
nƣớc [11], [13]. Nhiều gen LEA đã đƣợc nghiên cứu, phân lập, xác định chức
năng. Đặc điểm nổi bật của nhóm LEA là: giàu acid amin ƣa nƣớc, không
chứa cystein và tryptophan, có vùng xoắn α và có khả năng chịu nhiệt. Chúng
thay thế vị trí nƣớc trong tế bào và thực hiện các chức năng khác nhau nhƣ: cô
lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủy protein biến tính và điều chỉnh
áp suất thẩm thấu. Sự biểu hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại
phân tử của nó cho thấy nó có vai trò trong bảo vệ cây trồng chống chịu sự
mất nƣớc [12]. Protein LEA đƣợc tạo ra hàng loạt trong giai đoạn muộn của
quá trình hình thành phôi.
LEA đƣợc chia thành 6 nhóm: nhóm 2- D19, nhóm 2- D11 (còn gọi là
dehydrin), nhóm 3- D7, nhóm 4- D113, nhóm 5- D29, nhóm 6- D95. Khi điều


14

kiện mất nƣớc xảy ra, LEA đƣợc tổng hợp với số lƣợng lớn, trong đó
dehydrin có thể chiếm tới 1% tổng số protein hòa tan của hạt. Ngày nay,
ngƣời ta đã phân lập đƣợc 30 gen khác nhau thuộc thành viên của nhóm gen
dehydrin ở các cây trồng khác nhau. Gen mã hóa protein dehydrin ở đậu
tƣơng đã đƣợc nghiên cứu tại một số phòng thí nghiệm trên thế giới và tới nay
đã có một số trình tự gen dehydrin đậu tƣơng và một số thực vật khác đƣợc
công bố trên ngân hàng trình tự gen quốc tế.
HSP (Heat Shock Protein) và môi giới phân tử (Chaperons)
HSP có mặt hầu hết ở các loài thực vật nhƣ: lúa mì, lúa mach, ngô,
đậu… chiếm khoảng 1% protein tổng số trong lá và có hầu hết ở các loài thực

vật. Sự xuất hiện của HSP có chức năng ngăn cản hoặc sửa chữa sự phá hủy
do stress nóng và mở rộng giá trị ngƣỡng nhiệt độ với sự chống chịu nhiệt độ
cao. Trong các tế bào thực vật HSP tế bào chất tập trung thành các hạt sốc
nhiệt (HSG- Heat Shock Granules). Ngƣời ta cho rằng HSG gắn kết trên các
RNA polymerase để ngăn cản sự phiên mã tổng hợp mRNA trong quá trình
stress nóng. Sau khi gặp sốc nóng, các hạt này phân tán và liên kết dày đặc
với các ribosome hoạt động sinh tổng hợp protein. HSP xuất hiện trong các
quá trình sinh trƣởng bình thƣờng, các giai đoạn biệt hóa mô và cả trong thời
kỳ sinh trƣởng của thực vật. Ngoài ra, chúng đƣợc tổng hợp thêm trong điều
kiện cực đoan của môi trƣờng [5].
Dựa trên khối lƣợng phân tử, HSP có thể chia thành 6 nhóm: HSP110,
HSP90, HSP70, HSP60, HSP20, HSP8,5. Trong nhóm HSP có rất nhiều đại
diện của chất môi giới phân tử (MGPT) là HSP70, HSP60 nhƣng cũng có
HSP không phải là MGPT nhƣ HSP8,5 (Ubiquitin). Ubiquitin đƣợc xem là
chất bảo vệ tế bào, chúng có hoạt tính protease và thực hiện chức năng phân
giải các protein không có hoạt tính enzyme, ngăn chặn các protein này gây