Nghiên cứu giải mã trình tự hệ Genome của chủng Virus xoăn lá thuốc lá (TLCV) phân lập tại Việt Nam

Số hóa bởi trung tâm học liệu

i
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC





CAO DUY PHÚC




NGHIÊN CỨU GIẢI MÃ TRÌNH TỰ HỆ GENOME
CỦA CHỦNG VIRUS XOĂN LÁ THUỐC LÁ
(TLCV) PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM


Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60 42 0201


LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC


NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ VĂN SƠN

Thái Nguyên – 2013

Số hóa bởi trung tâm học liệu

i
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc tới TS. Lê Văn Sơn, Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ
sinh học - người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi trong
thời gian học tập và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà, ThS.
Phạm Thị Vân, Ks. Nguyễn Thị Thu Hiền, CN. Nguyễn Văn Đoài cùng tập thể
cán bộ Phòng công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt
tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian
làm khoá luận.
Tôi xin cảm ơn phòng đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo sau
đại học Đại học khoa học - Đại học Thái Nguyên đã luôn quan tâm, tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập.
Cuối cùng, tôi xin dành cho những người thân trong gia đình và bạn bè
lòng biết ơn sâu sắc, những người thân yêu đã luôn bên tôi, động viên và góp ý
cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận.
Tôi chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó./

Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Tác giả luận văn




Cao Duy Phúc

Số hóa bởi trung tâm học liệu
ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT

µg
microgam
µl
microlitre
bp
Base pair
CP
Coat protein (protein vỏ)
DNA
Deoxyribonucleic acid
dNTP
Deoxyribonucleotide triphosphate
E. coli
Escherichia coli
EDTA

Ethylene Diamine tetra-acetate acid
EtBr
Ethidium Bromide
et al
Đồng tác giả
Kb
Kilobase
LB
Luria and Bertani
PCR
Polymerase Chain Reaction
RNA
Ribonucleic acid
RNAi
RNA interference
RNase
Ribonuclease
SDS
Sodium dodecyl sulfate
TAE
Tris Acetate EDTA
Taq
Thermus aquaticus polymerase
v/p
vòng/phút

Số hóa bởi trung tâm học liệu
iii
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang
1.1
Một số bệnh virus hại cây trồng quan trọng trên thế giới và đã
đƣợc xác định có ở Việt Nam ……………………………………

4
1.2
Một số bệnh trên cây thuốc lá do virus gây ra……………………
11
2.1
Nguồn gốc các mẫu thuốc lá nghiên cứu…………………………
23
2.2
Trình tự và thông số của hai mồi…………………………………
25
2.3
Thành phần phản ứng PCR cặp mồi prV324N/prC889N………….
26
2.4
Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR cặp mồi prV324N/prC889N…….
26
2.5
Thành phần phản ứng PCR cặp mồi TYLCV-A-R………………
27

2.6
Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR cặp mồi TYLCV-A-R…………
27
2.7
Thành phần phản ứng ghép nối…………………………………….
29
2.8
Thành phần phản ứng colony-PCR………………………………
31
2.9
Chu kỳ nhiệt cho phản ứng colony-PCR…………………………
31
2.10
Thành phần phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme BamHI
32
2.11
Mã số, nguồn gốc đất nƣớc và cây chủ của một số thể phân lập,
chủng Begomovirus trên GenBank…………………

33
3.1
Kích thƣớc và vị trí các gen trên vòng DNA-A…………………
41
3.2
Hệ số tƣơng đồng và sai khác giữa trình tự nucleotit vòng DNA-A
của 3 thể phân lập HN, BG, LS với các trình tự trên ngân hàng gen
thế giới …………………


47

iv
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình
Tên hình
Trang
1.1
Cấu trúc genome của Begomovirrus có một vòng DNA (A) và
cấu trúc genome của TLCV có 2 vòng DNA (B)………

14
1.2
Cấu trúc vòng DNA-β ……………………………………………
17
1.3
Cây thuốc lá bị nhiễm bệnh xoăn lá ……………………………….
18
1.4
Bọ phấn Bemisia tabaci
20
2.1
Mô hình minh họa vị trí các mồi trên genome TLCV……………
25
2.2

Cấu tạo vector pBT ………………………………………………
28
3.1
Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ lá bị bệnh xoăn lá
35
3.2
Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân vòng DNA-A ……….………
36
3.3
Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli
chủng DH5α………………………………………………………

38
3.4
Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR…………………………….
38
3.5
Ảnh plasmid đã làm sạch để đọc trình tự ………………….………
39
3.6
Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid mang gen V1 và A bằng
BamHI

40
3.7
Kết quả so sánh trình tự nucleotit vòng DNA-A giữa 3 thể phân
lập HN, BG, LS …

44
3.8

Kết quả BLAST trình tự vòng DNA-A của thể phân lập HN……
45
3.9
Kết quả BLAST trình tự vòng DNA-A của thể phân lập BG……
46
3.10
Kết quả BLAST trình tự vòng DNA-A của thể phân lập LS………
46
3.11
Cây phát sinh chủng loại …………………………………………
49



Số hóa bởi trung tâm học liệu
v
MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn
i
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
ii
Danh mục các bảng
iii
Danh mục các hình
iv
Mục lục
v

MỞ ĐẦU
1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3
1.1. VIRUS THỰC VẬT
3
1.1.1. Các bệnh do virus thực vật gây ra hiện nay
3
1.1.2. Cách phòng chống bệnh do virus thực vật gây ra
5
1.1.3. Cấu trúc của virus thực vật
7
1.2. MỘT SỐ VIRUS GÂY BỆNH TRÊN CÂY THUỐC LÁ
8
1.2.1. Virus gây bệnh khảm thuốc lá (Tobacco mosaic virus, TMV)………
8
1.2.2. Virus gây bệnh khảm dƣa chuột (Cucumber mosaic virus, CMV)…
9
1.2.3. Virus gây bệnh héo đốm cà chua (Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV)
10
1.3. VIRUS XOĂN LÁ THUỐC LÁ (Tobacco leaf curl virus, TLCV)
12
1.3.1. Đặc điểm hình thái, cấu tạo và phân loại
12
1.3.2. Cấu trúc genome và chức năng của các protein
14
1.3.3. Triệu chứng và cơ chế lây bệnh
18
1.3.4. Một số nghiên cứu và ứng dụng hệ gen Begomovirus trong tạo cây
trồng chuyển gen kháng Begomovirus

20
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
23
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
23
2.1.1. Nguồn vật liệu
23
2.1.2. Chủng vi sinh vật, plasmid và các bộ kit
23
2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị
23

Số hóa bởi trung tâm học liệu
vi
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu
24
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
24
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số
24
2.2.2. Phản ứng PCR
25
2.2.3. Phƣơng pháp điện di phân tích DNA trên gel agarose
27
2.2.4. Phƣơng pháp thôi gel
28
2.2.5. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT
28
2.2.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng

phƣơng pháp sốc nhiệt

29
2.2.7. Phản ứng colony-PCR
30
2.2.8. Phƣơng pháp tách chiết plasmid
31
2.2.9. Phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme BamHI
32
2.2.10. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tự
tƣơng ứng trên GenBank

33
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
35
3.1. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ
NUCLEOTIDE ………………………………………………………………….

35
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
35
3.1.2. Kết quả nhân gen bằng phản ứng PCR
36
3.1.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
37
3.1.4. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng kỹ thuật colony-PCR
38
3.1.5. Tách plasmid tái tổ hợp và cắt kiểm tra sự có mặt của gen tách dòng
39
3.1.6. Kết quả xác định trình tự

41
3.2. ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN
44
3.2.1. Kết quả so sánh trình tự nucleotide
44
3.2.2. Đánh giá tính đa dạng của các thể phân lập BG, HN, LS thông qua
cây phát sinh chủng loại

48
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
52
TÀI LIỆU THAM KHẢO
53


1
MỞ ĐẦU
Lý do chọn đề tài
Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là cây công nghiệp ngắn ngày đƣợc trồng
nhiều nơi trên thế giới và có giá trị kinh tế cao. Không chỉ để sản xuất thuốc lá,
nó còn đƣợc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, axit hữu cơ, dùng làm
thuốc trừ sâu hay chiết xuất dầu thực vật từ hạt. Ngoài ra với khả năng dễ tái
sinh và chấp nhận gen ngoại lai thuốc lá còn đƣợc xem là cây mô hình quan
trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học cây trồng.
Tuy nhiên, với những đặc điểm sinh học của mình, thuốc lá là cây trồng
mẫn cảm với nhiều bệnh hại, đặc biệt là các bệnh do virus gây nên, ảnh hƣởng
nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng cây thuốc lá. Trong đó có bệnh xoăn
lá do virus xoăn lá thuốc lá (Tobacco leaf curl virus, TLCV) gây nên. Khi cây
mắc bệnh virus, thiệt hại về năng suất có thể lên tới 95-100%. Cho đến nay
chƣa có một loại thuốc bảo vệ thực vật nào có khả năng chống lại bệnh do virus

gây ra trên cây trồng. Con ngƣời chỉ có thể hạn chế tác hại của virus và kiểm
soát nó ở mức độ nhất định.
Ở Việt Nam, cây thuốc lá đang đƣợc trồng phổ biến ở các tỉnh miền núi và
trung du phía Bắc, các tỉnh Nam Trung Bộ, Tây Nguyên và miền Đông Nam Bộ
và đƣợc đánh giá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày, đem lại hiệu
quả kinh tế cao cho nông dân và thu nhập quốc gia. Song bệnh hại (đặc biệt là
bệnh do virus) cũng đang đe dọa nghiêm trọng đến năng suất và phẩm chất cây
thuốc lá. Nghiên cứu hiểu rõ vật liệu di truyền của virus tác nhân gây bệnh trên
cây thuốc lá là vấn đề rất cần thiết, kết quả này sẽ có định hƣớng trong phòng
chống đúng loại virus bằng việc tạo cây trồng chuyển gen kháng bệnh.
Hiện nay, với những tiến bộ trong lĩnh vực sinh học, ngƣời ta đã tạo ra
đƣợc một số loại cây trồng kháng đƣợc bệnh do virus gây ra thông qua biện
pháp tạo cây trồng chuyển gen mang các gen hoặc đoạn gen có nguồn gốc từ
chính virus gây bệnh [15]. Cho tới những năm cuối thế kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp
tóc (ihpRNA) hay kỹ thuật RNAi đƣợc xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu
hiệu nhất trong việc chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
2
Vì vậy, giải trình tự toàn bộ genome của TLCV cho từng vùng khác nhau
là cần thiết. Genome của nhiều chủng TLCV đƣợc phân lập từ các vùng khác
nhau trên thế giới nhƣ Hawaii, Mexico, Brazil, Thái Lan, Đài Loan, đã đƣợc
công bố chi tiết. Tuy nhiên thông tin về toàn bộ trình tự genome TLCV gây
bệnh trên cây thuốc lá ở Việt Nam chƣa nhiều, mà chủ yếu tập trung trên các
loài cây cà chua, ớt [20].
Xuất phát từ những cơ sở trên tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu giải mã
trình tự hệ genome của chủng virus xoăn lá thuốc lá (TLCV) phân lập tại
Việt Nam”.
Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định trình tự toàn bộ genome của virus xoăn lá thuốc lá (TLCV).

Nội dung nghiên cứu
- Tách chiết DNA tổng số của TLCV
- Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu
- Tách dòng gen
- Đọc trình tự gen và phân tích trình tự












Số hóa bởi trung tâm học liệu
3
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. VIRUS THỰC VẬT
1.1.1. Các bệnh do virus thực vật gây ra hiện nay
Cho tới nay, hơn 2000 virus đã đƣợc phát hiện và công nhận, trong đó
khoảng 1000 là các virus gây hại thực vật. Các virus thực vật nhìn chung không
làm chết cây nhƣng chúng ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sinh trƣởng, phát triển
của cây, năng suất và chất lƣợng nông phẩm. Nhiều trƣờng hợp, bệnh do virus
gây có thể là một trong các nguyên nhân chính cản trở sản xuất của một cây
trồng nào đó. Ở cây lâu năm, một số virus sau khi gây bệnh nặng trong mùa khi
có thời tiết và nhiệt độ ôn hòa, nhƣng khi nhiệt độ thấp hay quá cao thƣờng gây

nên hiện tƣợng mất triệu chứng (latent period) làm cho ngƣời sản xuất bị nhầm
lẫn, không phát hiện đƣợc cây bị bệnh và mức nguy hiểm của bệnh, chỉ đến lúc
nào đó cây không còn khả năng phục hồi theo chu kỳ bệnh nữa, hoàn toàn tàn
lụi, khi đó mới biết thì đã quá muộn.Virus cũng có thể gây nên những thiệt hại
nặng nề và nhanh chóng ngay trong vụ trồng của các cây thƣờng năm nhƣ Rice
grassy stunt virus gây bệnh lùn lúa cỏ, Rice tungro spherical virus và Rice
tungro bacilliform virus gây bệnh tungro (hại lúa), Tomato yellow leaf curl
virus gây bệnh xoăn vàng lá (hại cà chua) [44]. Các virus hại khoai mì đã từng
hủy diệt hàng chục vạn hecta ở châu Á và châu Phi [43] trong một thời gian
ngắn chƣa tới 30 ngày từ một cánh đồng xanh tƣơi trở thành vàng úa, chết lụi.
Thiệt hại quan trọng thứ hai của virus là ảnh hƣởng của bệnh tới phẩm
chất của các sản phẩm nông nghiệp. Hạt lúa bị bệnh virus thƣờng bị lép không
cho thu hoạch, trong trƣờng hợp đƣợc thu hoạch hạt thƣờng rất nhỏ và hạt gạo bị
đen, khi ăn có vị đắng. Khoai tây bị virus gây hại làm cho cây cằn cỗi, lá khảm
loang lổ, củ khoai nhỏ, hàm lƣợng tinh bột và các chất dinh dƣỡng đều thấp. Có
trƣờng hợp bệnh do một chủng đặc biệt của virus làm vỏ quả, củ có vết loét, bẩn
giảm giá trị thƣơng phẩm, nhƣ khi khoai tây bị nhiễm một chủng Potato virus Y
[7]. Ở cà chua bị xoăn lá, quả bé, múi khô và hoa rụng, năng suất và phẩm chất
đều rất thấp.
Comment [SCD1]: VIRUS

Số hóa bởi trung tâm học liệu
4
Citrus tristeza virus [41] hại cam quýt rất nặng tại vùng bờ biển Địa
Trung Hải, Trung Mỹ và Đông Nam Á Bệnh làm cho quả cam chín ép và rụng
sớm, quả còn non đã úa vàng vỏ, nƣớc cam nhạt không mùi vị.
Bệnh virus còn nguy hiểm do virus ký sinh bắt buộc trong tế bào cây ký
chủ. Vì vậy khi tế bào bị hủy hoại, chết, virus mới bị mất hoạt tính. Khi tế bào
non phát triển mạnh, virus cũng phát triển mạnh, tạo ra những triệu chứng rất
điển hình trên cây non hay bộ phận non của một cây. Chính vì vậy khi nhân

giống vô tính trong phòng thí nghiệm, virus có khả năng lây lan rất lớn trong
việc phát triển công nghệ sinh học và các vùng trồng trọt công nghệ cao.
Cho tới nay, 52 virus thực vật thuộc 52 loài đã đƣợc xác định ở Việt Nam
(Bảng 1.1), phần lớn đã đƣợc giải trình tự. Trong số này, đa số là các virus
thuộc 2 chi Begomovirus (22 virus) và Potyvirus (18 virus). Đây cũng là 2
chi virus thực vật lớn nhất với mỗi chi chiếm khoảng 20 % tổng số virus
thực vật toàn thế giới. Ngoài ra, nhiều virus có ý nghĩa kinh tế, chẳng hạn các
virus gây bệnh trên lúa nhƣ bệnh lùn xoắn lá (Rice ragged stunt virus, RRSV),
bệnh lúa cỏ hay còn gọi là bệnh vàng lùn (Rice grassy stunt virus), bệnh lúa lùn
sọc đen (Southern rice black streaked dwarf virus, SRBSDV) cũng mới đƣợc
xác định chính xác [20].
Bảng 1.1: Một số bệnh virus hại cây trồng quan trọng trên thế giới và đã
đƣợc xác định có ở Việt Nam
STT
Tên bệnh
1
Bệnh xoăn vàng lá cà chua do nhiều begomovirus.
2
Bệnh chùn ngọn chuối do banana bunchytop virus (BBTV).
3
Bệnh đốm hình nhẫn đu đủ, bầu bí do papaya ring spot virus (PRSV).
4
Bệnh tàn lụi cây có múi do citrus tristeza virus (CTV).
5
Bệnh khảm lá khoai tây trên khoai tây do potato virus Y (PVY).
6
Bệnh khảm lá cây họ đậu do bean common mosaic virus virus (BCMV).
7
Bệnh tungro hại lúa nhƣ bệnh tungro do phức hợp 2 virus là rice tungro
bacilliform virus (RTHN) và rice tungro spherical virus (RTSV).

8
Bệnh vàng lùn (lúa cỏ) hại lúa do rice grasy stunt virus (RGSV).
9
Bệnh lùn xoắn lá (táp lá) hại lúa do rice ragged stunt virus (RGSV).
10
Bệnh lùn sọc đen hại lúa, ngô do southern rice black streaked dwarf virus

Số hóa bởi trung tâm học liệu
5
(SRBSDV).
11
Bệnh vàng lụi (vàng tạm thời, vàng lá di động) trên lúa do rice yellow
stunt virus (RYSV).
1.1.2. Cách phòng chống bệnh do virus thực vật gây ra
Có nhiều biện pháp phòng trừ bệnh virus hại thực vật đã đƣợc áp dụng
nhƣ loại bỏ nguồn bệnh, tiêu diệt côn trùng môi giới, diệt cỏ dại, luân canh cây
trồng, dùng giống sạch bệnh hoặc giống chống bệnh, chịu bệnh. Dựa vào đặc
điểm của từng loài virus gây hại, đặc tính của cây trồng ngƣời ta đã đề ra những
biện pháp phòng trừ cho từng nhóm bệnh theo khả năng truyền lan và sự tồn tại
của nguồn bệnh.
*Sử dụng giống cây trồng có khả năng kháng bệnh virus
Phƣơng pháp này đem lại hiệu quả
tạo đƣợc cây sạch bệnh. Tuy nhiên biện pháp
giống kháng bệnh c
, năng suất và chất lƣợng của giống kháng
cũng là điều đáng lƣu tâm vì rất khó tích hợp đƣợc nhiều phẩm chất trong một
giống cây trồng.
*Sử dụng vật liệu giống sạch bệnh
Phƣơng pháp này áp dụng đối với các virus truyền qua vật liệu giống (hạt
giống, các cây nhân giống vô tính). Vật liệu giống sạch bệnh có thể đƣợc tạo ra

bằng một số cách nhƣ: Chọn giống từ nguồn sạch (ruộng không bị bệnh, khu
vực không bị bệnh), xử lý nhiệt, xử lý hóa chất để tiêu diệt virus tồn tại trên vỏ
hạt, nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, tạo giống in vitro, sử dụng hóa chất (ribavirin) để
tiêu diệt virus trong nuôi cấy mô.
*Biện pháp canh tác
Comment [SCD2]: in vitro

Số hóa bởi trung tâm học liệu
6
.
. Tuy nhiên, nhiều loại virus nhƣ TMV
lây truyền qua đƣờng cơ giới, virus lây lan trực
: chỉ cần 1
con rầy nâu/cây lúa đã có thể truyền virus lùn lúa cỏ (RGSV).
*Sử dụng giống kháng bệnh mang gen kháng của cây
Quan hệ gen-đối-gen: đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký
chủ có một gen tƣơng ứng qui định tính không độc trong ký sinh và 2 gen này
tƣơng tác đặc hiệu với nhau. Quan hệ gen-đối-gen cho tới nay đã đƣợc chứng
minh là tồn tại trong rất nhiều loại bệnh do hầu hết các nhóm tác nhân gây bệnh
(nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng, mollicus ) gây ra. Các gen cây ký chủ qui
định tính kháng đƣợc gọi chung là gen R (Resistance). Các gen ký sinh qui định
tính không độc của ký sinh đƣợc gọi chung là gen Avr (Avirulence). Tính kháng
của cây trồng tuân theo quan hệ gen-đối-gen đƣợc gọi là tính kháng gen-đối-gen.
Tính kháng gen-đối-gen thƣờng là tính kháng đặc hiệu ký chủ, tính kháng đơn
gen, tính kháng gen chủ, tính kháng không bền vững. Hậu quả của một phản ứng
kháng gen-đối-gen thƣờng là phản ứng siêu nhạy/apoptosis.
Cho tới nay, rất nhiều gen kháng R của cây đã đƣợc xác định. Sản phẩm
của các gen này gọi là các protein kháng R. Hiện nay, các protein kháng R đƣợc
chia thành 5 lớp dựa trên đặc điểm cấu trúc và vị trí hoạt động của chúng trong
tế bào ký. Các protein trong cùng lớp nhìn chung khá bảo thủ. Các protein kháng

R của cây chống virus phần lớn thuộc 2 lớp CNL và TNL. Đây là 2 lớp chiếm số
lƣợng lớn nhất trong tất cả các loại protein kháng R của thực vật. Cả 2 lớp CNL
và TNL còn đƣợc xếp vào chung một họ protein kháng gọi là họ NB-LRR. Số
lƣợng gen kháng của họ này đƣơc xem là chiếm số lƣợng lớn nhất trong các họ
protein.
*Sử dụng giống kháng bệnh dùng gen virus

Số hóa bởi trung tâm học liệu
7
Gen qui định tính kháng là gen virus. Tính kháng này đƣợc gọi là tính
kháng từ tác nhân gây bệnh, (Pathogen Derived Resistance, PDR). Tính kháng
PDR đƣợc chia làm 2 nhóm: (i) Tính kháng thông qua protein (của virus); (ii)
Tính kháng thông qua RNA (của virus)
(i) Tính kháng thông qua protein: Trong những năm 1980 - 1990, nhiều
nghiên cứu chuyển gen virus vào cây đã đƣợc thực hiện. Các gen virus có thể
khác nhau nhƣ gen CP, gen replicase, gen vận chuyển MP, gen thể vùi NIa/b của
potyvirus , tuy nhiên phần lớn là gen CP. Đặc điểm nhóm này là tính kháng
hình thành khi gen chuyển đƣợc biểu hiện thành protein trong cây chuyển gen.
Hai ví dụ điển hình là cây thuốc lá chuyển gen CP của TMV kháng đƣợc virus
TMV [33] và cây đu đủ chuyển gen CP của PRSV kháng đƣợc virus PRSV
(Golsalves et al., 2004).
(ii) Tính kháng thông qua RNA: tính kháng của virus thông qua RNA đã
đƣợc chứng minh là do cơ chế câm gen (RNA silencing) hay là cơ chế kiểm soát
RNA (RNA interference) của các sinh vật nhân chuẩn [15]. Việc phát hiện ra cơ
chế RNAi là cơ sở quan trọng cho kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng
kháng bệnh virus.
1.1.3. Cấu trúc của virus thực vật
Virus hại thực vật là những nucleoprotein rất bé nhỏ. Những virus dạng
cầu nhóm Luteovirus kích thƣớc chỉ từ 23-24 nm. Những virus dạng cầu nhóm
Ilarvirus có kích thƣớc biến động từ 26-35 nm. Hơn mƣời nhóm virus khác cũng

có kích thƣớc biến động trong khoảng 30-34 nm. Virus lớn nhất dạng cầu là
Tomato spotted wilt virus cũng chỉ có đƣờng kính 80 nm. Nhóm Rhabdoviridae
là virus dạng vi khuẩn to nhất (135-380 x 45-96 nm). Virus dài nhất là các virus
dạng sợi nhóm Closterovirus dài 2000 x 12 nm. Chúng nhỏ bé nhƣ vậy nên việc
tìm kiếm phát hiện đòi hỏi phải có những phƣơng pháp đặc biệt.
Virus có cấu tạo rất đơn giản, chúng có 2 thành phần chính là protein và
nucleic acid. Lõi nucleic acid ở bên trong đƣợc bao bằng một lớp vỏ protein
(capsid). Hầu hết virus thực vật có genome RNA sợi đơn mạch (+) và nhiều
dạng có capsid hình que, các protein capsomer hình xoắn. Ví dụ: Tobacco
mosaic virus (TMV) Genome TMV là RNA sợi đơn. Genome của chúng mã hoá
ít nhất 4 chuỗi polypeptid. Protein 130 và 180 kDa đƣợc dịch mã trực tiếp từ

Số hóa bởi trung tâm học liệu
8
cùng một codon bắt đầu trên RNA bộ gene. Hai protein khác, 30 kDa và protein
vỏ đƣợc dịch mã từ đoạn RNA. Protein 130 và 180 kDa liên quan với sao chép
virus, trong khi đó protein 30 kDa cần cho sự di chuyển của virus từ tế bào này
đến tế bào khác. Vì vậy 3 loại protein này cần cho sự nhân lên của virus trong
toàn bộ cây. Các virus DNA Virus thực vật có bộ gene DNA rất hiếm, chỉ gồm 2
nhóm: tuy nhiên 2 nhóm virus thực vật đƣợc nghiên cứu nhiều nhất có chứa
genome DNA: Cauliflower mosaic virus (CaMV) và gemini virus.
Cauliflower mosaic virus: CaMV đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm
Caulimovirus. Đây là nhóm virus dạng cầu, chứa genome DNA vòng tròn, mạch
kép, kích thƣớc khoảng 8 kb. Caulimovirus gây ra một số bệnh làm thiệt hại
kinh tế cấy trồng. Chúng có phổ vật chủ hạn chế, chỉ nhiễm cây 2 lá mầm.DNA
của CaMV có cấu trúc không bình thƣờng, có 3 điểm gián đoạn trên sợi kép, hai
điểm trên một sợi và một điểm trên sợi còn lại với những vùng trình tự overlap.
Ngoài ra DNA CaMV có ribonucleotide gắn với đầu cuối 5’ của điểm gián đoạn.
Từ các nghiên cứu ở CaMV [22], [30] cho rằng sao chép CaMV liên quan với
phiên mã ngƣợc qua trung gian RNA của bộ gene. Chu trình sao chép giống với

retrovirus và hepatitis B virus.
Gemini virus: Gemini virus là nhóm virus có phổ xâm nhiễm rộng, cả cây
một lá mầm và 2 lá mầm.Virus sọc vằn lá ngô (Maize streak virus, MSV) là một
gemini virus lây nhiễm qua lá, đƣợc truyền do côn trùng. Bộ gene của
geminivirus chứa phân tử DNA vòng tròn sợi đơn. Sao chép DNA virus đƣợc
nghĩ là xảy ra nhờ trung gian DNA và genome của virus sao chép cho nhiều bản
sao trong nhân của những tế bào tăng sinh nhanh. Virus gây ra sự ức chế sinh
trƣởng và lá có sọc vàng của những cây ngô bị nhiễm
1.2. MỘT SỐ VIRUS GÂY BỆNH TRÊN CÂY THUỐC LÁ
1.2.1. Virus gây bệnh khảm thuốc lá (Tobacco mosaic virus, TMV)
TMV thuộc loại Tobamovirus là một trong những virus gây hại trên thực
vật đƣợc mô tả sớm nhất bởi Mayer (1886). Tuy nhiên, bản chất bất thƣờng của
tác nhân gây bệnh vẫn không đƣợc nhận biết mãi đến những nghiên cứu của
Beijerinck (1898), TMV là virus đầu tiên đƣợc nhận biết. Từ đó, đã có nhiều
khám phá quan trọng về TMV, tác động tích cực đến sự phát triển của nghành
virus học. TMV phân bố rộng khắp thế giới và gây bệnh cho ít nhất 199 loài của
Comment [SCD3]: kDa
Comment [SCD4]: kDa
Comment [SCD5]: kDa
Comment [SCD6]: virus
Comment [SCD7]: Maize streak virus, MSV
Comment [SCD8]: Virus
Comment [SCD9]: Tobacco mosaic virus

Số hóa bởi trung tâm học liệu
9
30 họ thực vật [37]. TMV tấn công vào những cây có tầm quan trọng về kinh tế
nhƣ: cà chua, thuốc lá, ớt, cà tím gây thiệt hại nghiêm trọng. TMV là virus
đơn dƣơng (ssRNa) có hình cuộn xoắn, dạng que hoàn chỉnh của TMV có 2130
đơn vị capsid (capsomeres), cứ 16 capsomeres tạo thành một vòng xoắn. Mỗi

capsomeres có 158 amino acid và có trọng lƣợng 1800 Daltons. Virion có
chiều dài 300 mm và đƣờng kính là 18mm. Các tiểu đơn vị protein liên kết
chặt chẽ tạo thành cấu trúc dạng xoắn (độ khoảng 2,3 nm hay 16 + 1/3 tiểu đơn
vị/vòng) xung quanh một ống trụ có bán kính khoảng 2nm. Một sợi đơn RNA
dài 6395 nucleotide, có cấu trúc xoắn tƣơng tự (49 nucleotide/vòng hay 3
nucleotide/tiểu đơn vị) có bán kính khoản 4nm, và liên kết với bề mặt trong của
tiểu đơn vị protein. Virus có thể phân tách thành acid nucleic và vỏ protein và
cũng có thể hợp nhất lại thành dạng virus gây bệnh bền vững.
TMV có thể gây bệnh trên rất nhiều loại cây trồng và cây dại khác nhau
nhƣng nhiều nhất là trên cây thuốc lá. Đây là bệnh rất phổ biến trên cây thuốc lá,
gây hại nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng của lá thuốc, nhất là đối với
thuốc lá sợi vàng. Bệnh còn có tên là bệnh hoa lá vàng. Bệnh có thể tấn công
cây con, cây trƣởng thành và cả cây đời tái sinh. Bệnh nặng và phân bố rộng ở
nhiều nơi và vào bất kỳ mùa vụ nào trong năm. Bệnh xuất hiện càng sớm thì
càng ảnh hƣởng đến năng suất. Tuy nhiên, phẩm chất của lá thuốc thƣờng bị tác
hại nghiêm trọng hơn so với tác hại về năng suất: lá thuốc bị bệnh, sau khi sấy,
lá sẽ bị nâu đen, dòn, dễ bị nát vụn ra, không có mùi vị thơm ngon và hút nặng.
Khi cây bị bệnh các lá non đều biến màu thành dạng khảm bao gồm các
vùng xanh nhạt xanh đậm không đều xen lẫm nhau, hình loang lổ nhƣ da ếch,
hay còn gọi là dạng khảm. TMV đƣợc lan truyền bằng đƣờng cơ giới do tiếp xúc
virus thâm nhập vào các tế bào qua vết thƣơng và qua khí khổng lá, thân hoặc
rễ. TMV rất bền nhƣ ở dạng kết tủa cồn, ở lá khô virus vẫn còn hoạt tính gây
bệnh sau một năm.
1.2.2. Virus gây bệnh khảm dƣa chuột (Cucumber mosaic virus, CMV)
CMV thuộc loại Cucumovirus, họ Bromoviridae đƣợc Price phát hiện lần
đầu tiên vào năm 1934 ở Mỹ. Loài virus này phân bố khắp nơi trên thế giới, phổ
biến ở vùng có khí hậu ôn hòa. CMV là loại virus thực vật có phổ gây bệnh rộng
nhất với số loại cây có thể bị lây nhiễm lên đến 1000 loài [18], [29] bao gồm 85
Comment [SCD10]: Cucumber mosaic virus,
CMV

Số hóa bởi trung tâm học liệu
10
họ thực vật. CMV có khả năng thích ứng cao, biến đổi hệ gen rất nhanh nên nó
trở thành mối đe dọa cho nông nghiệp thế giới. Quan sát dƣới kính hiển vi điện
tử CMV có dạng hình cầu, đƣờng kính 28-30nm, trọng lƣợng phân tử từ 5,0-
6,7.10
6
Da. Virion của CMV không có vỏ, có nhiều loại virion nhƣng kích thƣớc
tƣơng đối giống nhau. Genome của CMV bao gồm 3 sợi RNA đơn dƣơng
(RNA1, RNA2 và RNA3) chứa 5 khung đọc mở (ORF): ORF 1a và 2a nằm trên
RNA 1 và 2, tách biệt và là những thành phần của enzym sao chép replicase;
ORF 2b là một gen gối lên ORF 2a, nằm trên subgenome RNA4A và mã hóa
một suppressor của quá trình câm gen sau phiên mã [9]. ORF 3a và CP nằm trên
RNA3, trong đó ORF 3a mã hóa cho protein 3a-protein di chuyển của virus
(MP) còn ORF CP mã hóa cho protein vỏ (CP); CP đƣợc biểu hiện từ
subgenome RNA4 [29]. Trong ba RNA của CMV, RNA3 xảy ra sự tái tổ
hợp thƣờng xuyên hơn RNA1 và RNA2. Vì vậy có rất nhiều nghiên cứu dựa
trên RNA3 để đánh giá bảng đa dạng di truyền và xây dựng cây phát sinh của
chủng CMV. Đầu tận cùng 3’ của 4 loại RNA 1-4 có trình tự tƣơng tự nhau và
chia sẻ một cấu trúc bậc hai giống nhƣ tRNA. Virus có thể chứa nhứng phân tử
RNA vệ tinh sợi đơn, nhỏ (332-405 nucleotide), nó cần thiết cho sự sao chép của
CMV, phụ thuộc vào CMV để có hoạt tính sinh học. Đến nay xác định đƣợc
trình tự nucleotide của hơn 40 RNA vệ tinh.
Khi cây bị bệnh có biểu hiện các lá non ngả màu vàng nhạt, lá nhỏ lại, các
ngọn bị chùn lại, không phát triển đƣợc. Trên các mặt lá có biểu hiện các vết
khảm loang lổ, màu sắc chỗ đậm, chỗ nhạt. Ngoài ra còn có những biểu hiện
khác nhƣ: Phiến lá nhăn nheo, lồi lõm, do các gân lá bị kìm hãm sinh trƣởng
trong khi thịt lá vẫn phát triển, kích thƣớc lá bị thu nhỏ lại. Bệnh nặng thì cây
cằn cỗi, chết dần từ ngọn xuống.

1.2.3. Virus gây bệnh héo đốm cà chua (Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV)
TSWV là virus thuộc loại Tospovirus họ Bunyaviridae, đƣợc phát hiện lần
đầu tiên vào năm 1915 khi gây thiệt hại lớn trên cà chua trồng ở Australia.
TSWV có phổ ký chủ rất rộng, trên 600 loài và 70 họ thực vật, trải dài trên khắp
các lục địa. Trong số đó, cỏ dại là nguồn chứa TSWV chính [2]. Tospovirus
đƣợc đánh giá là một trong mƣời nhóm virus gây bệnh cây nghiêm trọng nhất.
Virus thuộc họ này có vật liệu di truyền là ssRNA. Genome của TSWV gồm ba

Số hóa bởi trung tâm học liệu
11
phần: Một sợi RNA âm tính và hai sợi ambisene. Ba sợi RNA này khác nhau về
kích thƣớc và đƣợc gọi là Large (L), Middle (M), Short (S). Mỗi RNA đƣợc bao
bọc bởi nhiều bản copy của 1 tiểu đơn vị Nucleocapside (N) và 10 – 20 bản sao
của protein lớn (L) là polymerase của virus [5]. Giữa các đoạn L, M, S có trình
tự kết thúc nhƣ nhau. TSWV hình cầu, đƣờng kính 80 – 110 nm. TSWV đƣợc
truyền từ cây này sang cây khác thông qua nhiều loài bọ trĩ khác nhau.
Cây nhiễm TSWV có triệu chứng chung là xuất hiện các vòng tròn đồng
tâm, những đốm héo trên lá non do sự hoại tử của các mô, có đốm lấm
chấm. Đầu tiên những đốm này có màu vàng, nhƣng sau đó những vùng bị chết
sẽ chuyển sang màu nâu đỏ. Từ cây con đến cây trƣởng thành đều có thể bị
TSWV tấn công. Khi bị nhiễm virus, cây trồng bị cằn cỗi, còi cọc, chồi phát
triển nghiêng về một bên (ne ngọn). Hình thái của cây thay đổi: Lá cây nhăn
nheo, vặn vẹo, nhƣ bóp nát, thân cây bị uốn cong, ngã, rủ xuống, phát triển bất
thƣờng. Cây bị bệnh không phát triển trong nhiều tuần, lá rụng dần và chết. Cây
trồng bị nhiễm bệnh vào giai đoạn đang phát triển thì có thể không ra quả hoặc
có quả nhƣng rất nhỏ, có các đốm nhỏ hay các vòng hoại tử hay thể khảm trên
vỏ quả. Đặc điểm này làm giảm đi giá trị cảm quan khi sử dụng hay dùng
thƣơng phẩm. Tuy nhiên, triệu chứng này có thể giống với các bệnh do các virus
khác, vi khuẩn, nấm hay stress môi trƣờng gây ra. Vì thế cách chẩn đoán bệnh
theo triệu chứng bên ngoài chỉ là cách xác định bệnh nhất thời nên có thể không

chính xác. Bên cạnh một số virus kể trên còn rất nhiều loài virus khác gây bệnh
trên cây thuốc lá và gây thiệt hại đáng kể thể hiện ở bảng dƣới đây
Bảng 1.2: Một số bệnh trên cây thuốc lá do virus gây ra
STT
Tên bệnh
Tên virus gây bệnh
1
Khảm linh lăng
Alfalfa mosaic virus (virus khảm linh lăng)
2
Quăn ngọn cúc tần
Beet curty top virus (virus gây bệnh quăn ngọn cúc tần)
3
Ngọn cây bụi
Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (virus gây biến nạp gân
thuốc lá) và tobacco bushy top virus (virus ngọn cây bụi thuốc lá)
4
Khảm cà chua
Cucumber mosaic virus (virus gây bệnh khảm dƣa chuột)
5
Vàng hoại tử rau diếp
Vàng hoại tử rau diếp (trong Nicotiana glutinosa)
6
Còi cọc cây lạc
Peanut stunt virus

Số hóa bởi trung tâm học liệu
12
7
Bệnh hình hoa hồng

Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (virus gây bệnh biến
dạng gân lá thuốc lá) và tobacco mottle virus (virus gây đốm thuốc
lá)
8
Kỵ axit thuốc lá
Tobacco etch virus (virus gây bệnh kỵ axit thuốc lá)
9
Xoăn thuốc lá
Tobacco leaf curl virus (virus gây xoăn thuốc lá)
10
Khảm thuốc lá
Tobacco mosaic virus (virus gây bệnh khảm thuốc lá) và Satellite
tobacco mosaic virus (virus gây bệnh khảm thuốc lá vệ tinh)
11
Hoại tử thuốc lá
Tobacco necrosis virus (virus gây hoại tử thuốc lá)
12
Bung hạt thuốc lá
Tobacco rattele virus (virus gây bung hạt thuốc lá)
13
Đốm vòng thuốc lá
Tobacco ring spot virus (virus gây bệnh đốm vòng thuốc lá)
14
Sọc thuốc lá
Tobacco streak virus (virus gây bệnh sọc thuốc lá)
15
Còi cọc thuốc lá
Tobacco stunt virus (virus gây bệnh còi cọc thuốc lá)
16
Vằn gân thuốc lá

Tobacco vein mottling virus (virus gây bệnh vằn gân thuốc lá)
17
Héo đốm cà chua
Tomato spotted wilt virus (virus gây bệnh héo đốm cà chua)
18
Viền gân lá
Potato virus (virus Y khoai tây)
19
U vết thƣơng
Wound tumor virus (virus gây bệnh khối u vết thƣơng)
(Nguồn:

1.3. VIRUS XOĂN LÁ THUỐC LÁ (Tobacco leaf curl virus, TLCV)
1.3.1. Đặc điểm hình thái, cấu tạo và phân loại
Virus xoăn lá thuốc lá-Tobacco leaf curl virus (TLCV) là một trong
những virus gây bệnh trên các cây họ cà ở nhiều vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới
trên thế giới. Đƣợc Storey phát hiện đầu tiên vào năm 1931.
TLCV thuộc chi Begomovirus, họ Geminiviridae. Họ này gồm có 4 chi
lớn đó là Begomovirus, Curtovirus, Mastrevirus và Topocovirus phân biệt nhau
bởi cấu trúc genome, vector truyền bệnh và cây chủ ký sinh. Geminiviridae là họ
virus gây bệnh thực vật lớn thứ hai với khoảng trên 300 loài đã đƣợc xác định.
Begomovirus là chi lớn nhất trong họ với khoảng 266 loài chủ yếu lây truyền
thông qua vector truyền bệnh là loài bọ phấn Bemisia tabaci [16]. Ngƣời ta đã
phát hiện khoảng 18 loài gây bệnh xoăn lá và 11 loài gây bệnh xoăn vàng lá [23].

Số hóa bởi trung tâm học liệu
13
Hiện nay số loài mới phát hiện ngày càng nhiều có thể do sự tái tổ hợp lại giữa
các chủng virus.
TLCV có dạng hình chày, kích thƣớc khoảng 18 x 60nm. Lớp protein vỏ

có trọng lƣợng khoảng 28-34 đvC, gồm hai capsom giống nhau, mỗi capsom
gồm 5 phân tử protein (Murphy et al., 1994). Khi soi dƣới kính hiển vi thấy các
hạt virion thuần khiết luôn ở dạng cầu ghép đôi. Mỗi hạt trong cặp chỉ chứa một
trong hai loại DNA có trình tự nucleotide khác nhau.
Những loài Begomovirus phát hiện trƣớc đây có hệ gen gồm các gen
trùm nằm trên cùng một vòng DNA-A sợi đơn kích thƣớc khoảng 2,7 kb (thể
monopartite). Sau đó, ngƣời ta phát hiện nhiều chủng virus có hệ gen gồm 2
vòng DNA sợi đơn tách biệt với kích thƣớc xấp xỉ nhau khoảng 2,6 - 2,8 kb là
DNA-A và DNA-B (thể bipartite). Gần đây, ngƣời ta còn phát hiện một số loài
thuộc nhóm một vòng gen ngoài vòng DNA-A còn có một hoặc hai vòng DNA
vệ tinh (DNAβ và DNA1) với kích thƣớc xấp xỉ một nửa DNA-A có tác dụng
tăng cƣờng biểu hiện triệu chứng bệnh trên cây chủ [8]; [11]; [20].
Dựa vào hệ thống phát sinh loài và sự sắp xếp các gen trong genome,
Begomovirrus đƣợc chia làm hai nhóm chính: (1) nhóm virus OldWorld (OW)
gồm những virus có nguồn gốc phát sinh từ các vùng Đông bán cầu, Châu Phi,
Châu Âu và một số khu vực thuộc Châu Á và (2) nhóm virus NewWorld (NW)
có nguồn gốc phát sinh ở Tây bán cầu và Châu Mỹ [28]. Tất cả các virus thuộc
nhóm NW đều là thể bipartite trong khi cả hai thể monopartite và bipartite đều
xuất hiện trong nhóm OW. Bên cạnh đó, DNA-A của các virus bipartite trong
nhóm NW đều thiếu khung đọc ORF của AV2 [40]. Protein vỏ của chúng mang
một motif (vùng cấu trúc) có tên là PWRsMaGT ở đầu 5’ trong khi nhóm OW
thì không có. Hầu hết các dẫn chứng về phát sinh chủng loại đều cho rằng các
virus NW phát sinh sau OW từ sau thời kỳ phân tách lục địa của Châu Mỹ từ
Gondwara [35]. Tuy nhiên, gần đây các nhà khoa học đã phân lập một số chủng
virus thuộc khu vực OW nhƣng có sự tƣơng đồng chặt chẽ với virus NW. Điều
này gợi ý rằng những virus NW có thể có mặt trong OW từ trƣớc thời kỳ phân
tách lục địa [20].

Comment [SCD11]: Đơn vị Cacbon

Số hóa bởi trung tâm học liệu
14
1.3.2. Cấu trúc genome và chức năng của các protein
Hệ gen của Begomovirus gồm 6 gen chức năng (Hình 1.1) đó là các gen
CP (V1), preCP (V2), C1, C2, C3, C4. Các gen trong hệ gen của Begomovirus
có thể nằm trên cùng một vòng DNA-A hoặc hai vòng DNA-A và DNA-B riêng
biệt ngăn cách với nhau bởi một vùng liên gen (IR-intergenic region) có độ dài
khoảng 200 nucleotide. Trên đó chứa điểm khởi đầu sao chép và vùng điều
khiển cho sự tái bản vòng gen virus theo cả hai hƣớng. Dạng trình tự điển hình
nhất trong vùng IR là hai trình tự bảo thủ lặp lại đảo ngƣợc của TAATATT/AC
đƣợc định vị trên một cấu trúc vòng có liên quan tới việc tái bản sợi DNA mới
và một trình tự lặp cần thiết cho việc nhận biết và bám vào của protein Rep
trong quá trình phiên mã [25].
(1) Gen CP mã hóa cho protein vỏ AV1 (coat protein - CP) có khối lƣợng
phân tử xấp xỉ 30 kDa cần thiết cho tạo vỏ ngoài virus, sự vận chuyển và nhận ra
vector truyền nhiễm; Protein vỏ có chức năng liên kết và bao bọc sợi DNA đơn,
nó khoanh vùng nhân tế bào bị lây nhiễm và thƣờng đƣợc kết hợp với hạch nhân
[32]. Trình tự cần thiết cho chức năng protein vỏ liên quan đến sự lây nhiễm của
TLCV đƣợc xắp xếp ở phía dầu N. Còn yếu tố quyết định cho việc tổ hợp tiểu
đơn vị CP đƣợc định vị ở cả đầu N và C. Bên cạnh đó, CP còn giữ vai trò đảm
bảo hệ thống dịch chuyển của hạt virion thông qua hệ mạch của cây chủ, protein
vỏ virus có thể tƣơng tác với protein GroEl của vector và giúp cho sự lây nhiễm
hiệu quả nhờ vector truyền bệnh.
(2) Gen C1 (rep) mã hóa protein tái bản AC1 (protein Rep) có trọng
lƣợng khoảng 40 kDa cần thiết cho quá trình sao chép DNA genome virus bằng


Hình 1.1. Cấu trúc genome của Begomovirrus có một vòng DNA (A) và cấu

trúc genome của TLCV có 2 vòng DNA (B)
(A)
(B)

Số hóa bởi trung tâm học liệu
15
việc nhận biết điểm khởi đầu origin đƣợc định vị trong vùng IR. Rep là protein
đa chức năng vừa khởi đầu, kết thúc tổng hợp DNA virus, đồng thời gây ra sự
tích lũy nhân tố phiên mã vật chủ trong tế bào lây nhiễm. Những nghiên cứu ban
đầu trên Begomovirus cho thấy AC1 có 3 motif bảo thủ là motif I, II và III ở đầu
N của protein Rep là cần thiết cho hoạt động chức năng. Motif I (FLTY) cần
thiết cho quá trình bám dsDNA đặc hiệu trong khi motif II (HLH) là một vị trí
bám sửa có thể liên quan với protein tƣơng thích và phân cắt DNA [3]. Motif III
(YxKD/E) là một vị trí xúc tác cho phân cắt DNA. Trong tái bản DNA virus,
protein Rep liên kết đặc hiệu với dsDNA tại một trình tự bảo thủ trong cấu trúc
vòng của sợi con mới và hoạt động nhƣ tác nhân mở xoắn DNA virus trong suốt
quá trình tái bản sợi mới [24], [27]. Bên cạnh hoạt động xúc tác, motif chức
năng phía đầu N cũng gián tiếp liên kết với trình tự đặc hiệu của dsDNA và đảm
bảo sự nhận dạng các thành phần genome cùng họ đến một Rep đã định.
Trong quá trình hoạt động, protein Rep tƣơng tác với các protein khác. Sự
hình thành các phân tử protein Rep cùng họ cần thiết cho sự liên kết với ssDNA
và hoạt động của helicase [27]. Rep tƣơng tác với protein AC3 trong việc tăng
cƣờng tích lũy DNA virus và tƣơng tác với protein vỏ trong việc giảm hoạt động
phân tách và kết nối in vitro. Bên cạnh đó, Rep liên kết với một vài protein tế
bào chủ liên quan đến biểu hiện gen bao gồm PCNA (proliferating cell nuclear
antigen - Protein tích lũy phiên mã) [4], RPA (protein bám sợi đơn), histon H3
và một số protein liên quan đến phân bào.
(3) Gen C2 mã hóa protein AC2 (protein hoạt hóa phiên mã - TrAP
protein) có trọng lƣợng khoảng 15 kDa. AC2 chứa một trình tự cấu trúc định vị
nhân (NLS-nuclear localization signal), một hạch trung tâm với vùng cấu trúc

dạng ngón tay kẽm đƣợc cấu thành bởi chất lắng histidin và cystein, và một tiểu
phần hoạt hóa có tính chất acid riêng biệt phía đầu C [38]. AC2 hoạt động nhƣ
một nhân tố phiên mã cần thiết trong quá trình biểu hiện hệ gen virus tạo sản
phẩm phục vụ trong giai đoạn cuối của quá trình lây nhiễm.
AC2 là một protein đa chức năng mà sự tƣơng tác của nó với các protein
khác có thể làm thay đổi hoạt động của một số protein hay phức hệ protein trong
tế bào chủ và tự làm ảnh hƣởng đến hoạt động của nó. AC2 điều khiển biểu hiện
gen virus bằng cách làm tăng cƣờng khả năng biểu hiện của protein vỏ và tƣơng

Số hóa bởi trung tâm học liệu
16
tác với các protein gen nhân. AC2 hỗ trợ tăng cƣờng hoạt động phiên mã của
các promoter chiều sense trên DNA-A và promoter của HN1, BC1 trong DNA-
B của Begomovirus bipartite. AC2 không cần thiết cho quá trình tái bản DNA và
trong một số trƣờng hợp nó thậm chí không cần thiết cho sự lây nhiễm ví dụ nhƣ
trƣờng hợp TYLCSV trong thuốc lá [44].
Gần đây, các nghiên cứu còn cho thấy protein AC2 có thể ức chế quá
trình câm gen (silencing). Sự ức chế silencing của AC2 có thể xảy ra dƣới hai
hình thức là phụ thuộc phiên mã và không phụ thuộc phiên mã. Trong cách thức
thứ nhất, AC2 liên quan đến hoạt động gen của tế bào chủ (ví dụ nhƣ WEL-1)
và có thể hoạt động nhƣ gen nội sinh, ức chế điều chỉnh của silencing. Trong
cách thức này, cần thiết có sự liên kết giữa NLS và tiểu phần hoạt động dạng
ngón tay kẽm với nhân tố hoạt hóa bám DNA (DNA-binding activities) [42].
Cách thức thứ hai không cần thiết tiểu phần hoạt động, các yếu tố có thể liên
quan với AC2 sẽ tƣơng tác với một adeosin kinase không hoạt động nhƣ ADK
(một enzyme chủ yếu định vị trong tế bào chất). Do ADK cần thiết cho sự tạo
sản phẩm của hoạt động chuyển dịch nhóm methyl trong S-adenosinmethionine
nên thiếu hụt ADK làm giảm hoạt động chuyển nhóm methyl nội bào. Mà
methyl hóa DNA hoàn toàn đến RNA đích hoặc promoter đích sẽ kết hợp với
quá trình điều hòa biểu hiện sau phiên mã và điều hòa phiên mã. Vì vậy, sự có

mặt của AC2 hoạt động là đích của quá trình RNA silencing có vai trò hoạt hóa
quá trình phiên mã gen CP, preCP và điều khiển biểu hiện gen của cả virus và tế
bào vật chủ.
(4) Gen C3 mã hóa protein AC3 khối lƣợng phân tử khoảng 16 kDa
(protein tăng cƣờng tái bản - REn protein) có vai trò hoạt hóa quá trình tái bản
và cùng với gen C1 tăng cƣờng khả năng phân chia hệ gen virus; Protein REn
không trực tiếp cần thiết cho sao chép DNA của virus, nhƣng nó có tác dụng làm
tăng tích lũy số lƣợng dsDNA và ssDNA của virus trong suốt quá trình lây
nhiễm và do đó gián tiếp ảnh hƣởng đến mức độ biểu hiện triệu chứng. Protein
REn hoạt động có thể tƣơng tác với một số protein nhƣ Rep, PRB và với chính
nó. Điều này có ý nghĩa cho sự tồn tại của một mạng lƣới phức tạp của các mối
tƣơng tác chức năng giữa Rep, REn, và PRB. Protein REn cũng tƣơng tác với
một số protein mã hóa của tế bào chủ là PCNA và pRBR.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
17
(5) Gen C4 đƣợc nằm trùm trong gen C1 trên vòng DNA-A nhƣng khác
khung đọc mã hóa cho protein AC4 có khối lƣợng khoảng 12 kDa. Trình tự
amino acid của nó có độ bảo thủ kém nhất trong các protein của Begomovirus.
AC4 có chức năng điều khiển chu kỳ sống và tham gia vào vận chuyển virus.
Những thí nghiệm trƣớc đây với TGMV (Tomato golden mosaic virus) đã chỉ ra
rằng C4 không cần thiết cho lây nhiễm virus [14] nhƣng bằng các thí nghiệm đột
biến với C4 của TYLCSV (Tomato yellow leaf curl sardina virus) và ToLCV đã
chứng tỏ chức năng sinh học thích hợp của nó nhƣ là một yếu tố lây nhiễm nhân
tạo.
(6) Gen V2 (preCP) mã hóa cho protein AV2 kích thƣớc khoảng 13 kDa
(protein vận chuyển - MP protein) liên quan đến biến đổi hình thái virus và vận
chuyển virus giữa các tế bào trong cây chủ. Đột biến xảy ra trong gen này dẫn
đến nhiễu loạn tỷ số ssDNA/dsDNA và ảnh hƣởng đến biểu hiện bệnh trên cây
chủ [32]. Những khám phá gần đây cho thấy trong các chủng Begomovirus

monopartite, ngoài DNA-A có thể có một hoặc hai vòng DNA sợi đơn với kích
thƣớc xấp xỉ một nửa DNA-A đƣợc gọi là
DNA vệ tinh (gồm DNA-β và DNA1).
DNA-β (Hình 1.2) đƣợc phát hiện lần đầu
tiên trong chủng virus gây bệnh xoăn lá
phân lập từ Astraulia vào năm 1997 với
kích thƣớc khoảng 1350 nucleotide [13].
Trình tự vòng DNA-β khá bảo thủ. Trên
đó bao gồm một vùng mã hóa cho protein
βC1 kích thƣớc khoảng 14 kDa gồm 118
amino acid, một vùng rất giàu adenin (A-
rich) khoảng 240 nucleotide và một vùng
vệ tinh (SCR) khoảng 220 nucleotide có
trình tự rất bảo thủ ở hầu hết các DNA-β hiện biết. Vùng SCR chứa cấu trúc
vòng stem-loop mang đoạn trình tự khởi đầu tái bản TAAGTATT/AC giống nhƣ
vùng liên gen (IR) của DNA-A [8].
Cơ chế phân tử liên quan đến chức năng phát sinh bệnh của vòng DNA-β
và protein βC1 trong virus vẫn chƣa rõ ràng. Tuy nhiên, DNA-β có tác dụng góp

Hình 1.2. Cấu trúc vòng DNA-β.
C1: vùng mã hóa protein βC1; A-
rich: vùng giàu adenin; SCR: vùng vệ
tinh.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
18
phần tăng cƣờng biểu hiện triệu chứng bệnh trên cây chủ. DNA- β có thể ảnh
hƣởng đến quá trình nhân bản virus bằng cách tạo sự thuận lợi cho việc mở rộng
phạm vi hoặc bằng cách làm bất hoạt gen của cây chủ [36].
DNA1 (hay còn gọi là DNA α) cũng giống DNA-β có trình tự rất bảo thủ

trong đó có chứa một đoạn gen mã hóa phức hợp protein tái bản có trọng lƣợng
khoảng 36 kDa, một trình tự giàu adenin khoảng 200 nucleotide và một điểm khởi
đầu tái bản nằm trên cấu trúc vòng sterm-loop chứa trình tự bảo thủ TAGTATT/AC
giống nhƣ những nanovirus khác. DNA1 có khả năng tự tái bản nhƣng cần sự trợ
giúp của virus cho quá trình biểu hiện và vận chuyển trong cây chủ. DNA1 hiện
chƣa xác định là có ảnh hƣởng lên sự biểu hiện bệnh của cây chủ [8].
1.3.3. Triệu chứng và cơ chế lây bệnh
Ở cây bị bệnh sẽ phát triển chậm chạp, cây còi cọc và lùn thậm chí ngừng
sinh trƣởng. Lá ngọn bị xoăn vào trong, méo mó biến dạng và thu nhỏ kích
thƣớc. Lá ngoài thì cúp xuống và cứng, có hiện tƣợng lá bị biến dạng nhƣ gân lá
trở nên dày, xoăn lại và các lá phía trên nhỏ cong queo (Hình 1.3). Do lá biến
dạng các mạch dẫn bị tắc, phá vỡ sự vận chuyển tinh bột trong lá, hình thành các
mạch dẫn mới xung quanh mô tƣợng tầng. Sự phát triển vô tổ chức làm lá biến
dạng sâu sắc mất đi sự khác biệt giữa mặt trên và mặt dƣới của lá. Hoa ít và
thƣờng bị thui, quả nếu có thƣờng khô, chín không đều và chất lƣợng kém.

Hình 1.3: Cây thuốc lá bị nhiễm bệnh xoăn lá
(Nguồn: