Phát triển hệ thống tái sinh In Vitro nhằm phục vụ chuyển gen ở Cây Lạc (Arachis Hypogaea L.)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM





PHẠM VIỆT HẢI





PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO
NHẰM PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY LẠC
(ARACHIS HYPOGAEA L.)






LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2013






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM




PHẠM VIỆT HẢI

PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO
NHẰM PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY LẠC
(ARACHIS HYPOGAEA L.)



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60 42 01 21




Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu










THÁI NGUYÊN – 2013

THÁI NGUYÊN – 2013
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



THAI NGUYEN UNIVERSITY
THE COLLEGE OF EDUCATION






PHAM VIET HAI




DEVELOPMENT OF REGENERATION SYSTEM IN
VITRO TO SERVE THE GENE TRANSFER IN PEANUT
CULTIVARS (ARACHIS HYPOGAEA)


MASTER THESIS IN BIOLOGY
Specialyty: GENETICS
Code: 60 42 01 21

Scientific supervisor: Prof. CHU HOANG MAU Ph.D.










THAI NGUYEN – 2013






THAI NGUYEN – 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai
công bố.



Tác giả luận văn





Phạm Việt Hải

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ii

LỜI CẢM ƠN


Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng
dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu
này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm - Đại
học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sau Đại học, Ban chủ nhiệm khoa Sinh –
Kỹ thuật Nông nghiệp và các thầy cô giáo, cán bộ của Khoa đã quan tâm giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Tâm, TS. Vũ Thị Thu Thuỷ,
NCS Nguyễn Thị Thu Ngà, chị Trần Thị Hồng, chị Đào Thu Thủy và các thầy cô
Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh – Kỹ thuật Nông nghiệp,
Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
Tôi xin cảm ơn Trung tâm nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ, Viện cây lương
thực và cây thực phẩm - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã cung cấp các
giống lạc làm vật liệu cho các thí nghiệm của đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, mợ, anh chị và các em trong
gia đình tôi đã giúp đỡ, động viên tôi rất nhiều trong quá trình học tập của mình.

Tác giả luận văn

Phạm Việt Hải





Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iii


MỤC LỤC

Lời cam đoan i
Lời cảm ơn iii
Mục lục iiii
Những chữ viết tắt v
Danh mục các bảng vi
Danh mục các hình viii
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng I. Tổng quan tài liệu 3
1.1. Cây lạc 3
1.1.1. Nguồn gốc, phân bố, phân loại, đặc điểm sinh học cây lạc 3
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của cây lạc…… ……………… 5
1.1.3. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và Việt Nam 7
1.2. Hệ thống tái sinh in vitro ở cây lạc 11
1.2.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

1.2.2. Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy
mô tế bào thực vật Error! Bookmark not defined.12
1.2.3. Tái sinh cây 13
1.2.4. Nghiên cứu hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở cây lạc 15
1.2.5. Hệ thống tái sinh và chuyển gen gián tiếp ở cây lạc ……………… 18
Chƣơng II. Nguyên liêu và phƣơng pháp nghiên cứu 23
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 23
2.1.1. Nguyên liệu 23
2.1.2. Hóa chất và thiết bị 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu 23

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iv
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro 24
2.2.2. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu. 30
Chƣơng III. Kết quả và thảo luận 31
3.1. Ảnh hưởng của nồng độ các chất đến kết quả khử trùng hạt 31
3.2. Kết quả tái sinh cây lạc từ nách lá mầm 32
3.2.1. Môi trường tạo sự nảy mầm cho hạt lạc 32
3.2.2. Môi trường cảm ứng chồi ở nách lá mầm 32
3.2.3. Môi trường kéo dài chồi của hai giống lạc 38
3.2.4. Môi trường ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh 40
3.2.5. Nhận xét về môi trường tái sinh chồi từ nách lá mầm. 41
3.3. Kết quả tái sinh từ mô sẹo phôi trục hạt lạc 42
3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi lạc 42
3.3.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi lạc 45
3.3.3. Môi trường tạo rễ của chồi tái sinh từ mô sẹo 48
3.3.4. Nhận xét về môi trường tái sinh cây lạc từ mô sẹo phôi 49
3.4. Kết quả tái sinh thông qua sự hình thành phôi soma 49

3.4.1 Môi trường cảm ứng tạo cụm phôi soma của phôi trục hạt lạc 49
3.4.2. Môi trường tái sinh cây từ phôi soma 53
3.4.3. Khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh từ phôi soma 56
3.4.4. Nhận xét về môi trường tái sinh cây lạc từ phôi soma 57
3.5. Ra cây và chế độ chăm sóc 57
3.6. So sánh hiệu quả tái sinh từ ba hệ thống sinh khác nhau trên cùng một
giống lạc…………………………………………………………………… 59
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO 63




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

v



NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT



2,4D 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid
BAP 6 - Benzyl Amino Purin
cs Cộng sự
DNA Deoxyribonucleic acid
EM Môi trường phát triển phôi soma
GA3 Gibberellic acid
GM Môi trường nảy mầm hạt

IAA ß – indol axetic acid
IBA Indole butyric acid
KN Kinitin
MS Murashige – Skoog (1962)
NAA Naphthyl acetic acid
PM Môi trường tiền cảm ứng phôi soma
RIM Môi trường cảm ứng ra rễ của chồi
RM Môi trường ra rễ cho phôi soma
SEM Môi trường kéo dài chồi
SIM Môi trường cảm ứng tạo chồi
SM Môi trường nảy mầm phôi soma
TB Trung bình






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

vi



DANH MỤC CÁC BẢNG


Bảng
Tên bảng
Trang

Bảng 1.1
Tình hình sản xuất lạc trên thế giới ( 2002 - 2007)
7
Bảng 1.2
Các quốc gia sản xuất lạc nhiều nhất trên thế giới
9
Bảng 1.3
Diễn biến sản xuất lạc ở nước ta
10
Bảng 1.4
Diện tích, năng suất, sản lượng lạc của các vùng trọng
điểm ở Việt Nam năm 2009
11
Bảng 1.5
Một số báo cáo chuyển gen ở cây lạc thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens (trước năm 2000).
20
Bảng 1.6
Một số báo cáo chuyển gen ở cây lạc (năm 2000-2009)
22
Bảng 2.1
Thành phần các loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ
thống tái sinh cây từ nách lá mầm
26
Bảng 2.2
Thành phần các loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ
thống tái sinh cây từ phôi soma
29

Bảng 3.1

Ảnh hưởng của nồng độ BAP và tổ hợp BAP với NAA
đến khả năng cảm ứng tạo chồi
35
Bảng 3.2
Ảnh hưởng của tác động gây thương tổn đến khả năng
tạo đa chồi trên môi trường cảm ứng tạo chồi tốt nhất
37

Bảng 3.3
Ảnh hưởng của BAP và tổ hợp của BAP với NAA đến
khả năng kéo dài chồi
39
Bảng 3.4
Hiệu quả kích thích ra rễ cho lạc của NAA và IBA
40

Bảng 3.5
Ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo của các
giống lạc
42
Bảng 3.6
Khối lượng mô sẹo của các giống lạc ở các mức nồng
44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

vii
độ 2,4-D
Bảng 3.7
Ảnh hưởng của BAP và tổ hợp BAP với NAA đến tỷ lệ

tái sinh chồi từ mô sẹo (%)
46
Bảng 3.8
Ảnh hưởng của BAP và tổ hợp BAP với NAA đến khả
năng tạo chồi ở mô sẹo lạc sau 4 tuần tái sinh
48
Bảng 3.9
Ảnh hưởng của nồng độ khác nhau của 2,4-D đến khả
năng cảm ứng phôi soma của các giống lạc (%)
50
Bảng 3.10
Ảnh hưởng của BAP và tổ hợp BAP với NAA đến khả
năng tái sinh cây của phôi soma sau 8 tuần
53
Bảng 3.11
Hiệu quả tái sinh của các hệ thống tái sinh
59

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

viii



DANH MỤC CÁC HÌNH


Hình
Tên hình
Trang
Hình 2.1
Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
24
Hình 3.1

Hạt giống L26 nuôi cấy trên môi trường GM sau 7 ngày
32
Hình 3.2
Hình ảnh giống L23 nuôi cấy trên môi trường cảm ứng
chồi SIM
34
Hình 3.3
Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng cảm
ứng tạo chồi của các giống lạc sau 6 tuần nuôi cấy
36
Hình 3.4
Mảnh lá mầm cảm ứng tạo đa chồi sau khi gây thương
tổn và không gây tổn thương
38
Hình 3.5
Chồi được tách ra khỏi cụm đa chồi để nuôi kéo dài chồi
ở giống lạc L23
39
Hình 3.6
Hình ảnh cây lạc ra rễ trên môi trường bổ sung 0,3mg/l
NAA (A) và 0,3mg/l IBA (B)
41
Hình 3.7
Hình ảnh mô sẹo phôi lạc sau 10 ngày nuôi cấy trên môi
trường có bổ sung 12mg/l 2,4D của giống L23 (A) và
L26 (B)
44
Hình 3.8
Hình ảnh chồi tái sinh trên mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy
47

Hình 3.9
Vùng phôi trục có khả năng cảm ứng phôi soma sau khi ủ
trên môi trường tiền cảm ứng phôi soma (PM) chứa
20mg/l 2,4-D (mũi tên)
51
Hình 3.10
Phôi soma trưởng thành ( L23) với lá mầm và rễ mầm
đầy đủ
52
Hình 3.11
Phôi soma tái sinh trên môi trường nảy mầm có chứa
0,3mg/l BAP
54
Hình 3.12
Phôi soma phát triển bị dị thường mọc lá thật trên môi
trường nảy mầm SM
56
Hình 3.13
Cây tái sinh từ phôi soma với bộ rễ hoàn chỉnh
57

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ix
Hình 3.14
Sự sinh trưởng của cây tái sinh trong ống nghiệm
58


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1
MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày được trồng phổ
biến ở nước ta và nhiều vùng trên thế giới. Sản phẩm thu từ hạt lạc có giá trị dinh
dưỡng cao nên lạc đã được sử dụng làm thực phẩm cho người, chế biến thức ăn
cho gia súc và dùng làm nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp chế biến khác.
Những năm gần đây, việc tổng kết kinh nghiệm thực tiễn trong canh tác và
nhân giống thông thường đã góp phần cải thiện đáng kể năng suất lạc. Tuy nhiên,
do tính chất áp dụng giới hạn của nó, nhiều đặc điểm nông sinh học quan trọng
vẫn chưa được cải thiện như: khả năng chống côn trùng, tuyến trùng, sâu bệnh phá
hại, kháng các loại virus, vi khuẩn, nấm gây bệnh; khả năng chống chịu của giống
trước tác động bất lợi của các tác nhân phi sinh học như: nóng, hạn, mặn, lạnh,
thuốc diệt cỏ,… Ngoài ra, một vấn đề khác cũng cần được quan tâm đó là việc
nâng cao chất lượng dinh dưỡng trong hạt lạc bằng sự tăng cường thành phần của
các loại amino acid không thay thế và các loại acid béo chưa no. Việc kết hợp giữa
chọn giống truyền thống với công nghệ sinh học hiện đại thực sự là chìa khóa cho
việc cải thiện, nâng cao hay tạo ra các giống lạc có khả năng chống chịu tốt hơn
với điều kiện bất lợi của ngoại cảnh đồng thời vẫn giữ lại các phẩm chất tốt sẵn có
của giống như năng suất và chất lượng cao, đây là điều rất khó hoặc không thể
thực hiện được bằng phương pháp lai tạo giống truyền thống.
Chuyển gen là kỹ thuật cho phép đưa một hay một số gen nhất định nào đó
vào hệ gen của cây chủ được quan tâm để tạo ra những cây trồng biến đổi gen
nhằm cải thiện một số đặc tính hay tính trạng theo hướng có lợi cho con người.
Chuyển gen đang là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng, đã được tiến hành thực
nghiệm trên nhiều đối tượng cây trồng như: cà chua, ngô, bông, lúa, đậu tương
và đã được ứng dụng ở nhiều nước trên thế giới. Trong đó, chuyển gen gián tiếp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
thông qua vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens (A. Tumefaciens) tỏ ra có ưu thế
hơn các kỹ thuật chuyển gen khác do ít tốn kém, quy trình đơn giản, nhanh chóng,
dễ dàng áp dụng trên nhiều đối tượng cây trồng. Ở nước ta việc chuyển gen nhờ vi
khuẩn A. tumefaciens vào cây trồng đã được tiến hành trên các đối tượng cây lúa,
thuốc lá, đậu tương, cà chua còn đối với cây lạc, việc nghiên cứu phát triển hệ
thống tái sinh và chuyển gen vẫn đang là điều khá mới mẻ. Từ những lý do trên,
chúng tôi đã chọn đề tài: “Phát triển hệ thống tái sinh in vitro nhằm phục vụ
chuyển gen ở cây lạc (Arachis hypogaea L.)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng quy trình tái sinh đa chồi tối ưu in vitro từ nách lá mầm lạc. Ra rễ, tạo
cây hoàn chỉnh và chuyển cây lạc tái sinh in vitro ra môi trường tự nhiên.
- Xác định môi trường tối ưu tái sinh in vitro cây lạc từ mô sẹo phôi trục và từ
phôi soma có nguồn gốc từ phôi trục hạt lạc, so sánh hiệu quả của các hệ thống tái
sinh khác nhau trên cùng một giống lạc.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu điều kiện khử trùng tối ưu cho hạt lạc sử dụng trong các thí nghiệm
nuôi cấy mô in vitro.
- Khảo sát môi trường tạo đa chồi từ nách lá mầm, môi trường kéo dài chồi, ra rễ
và tạo cây hoàn chỉnh.
- Khảo sát môi trường tạo mô sẹo từ phôi trục hạt lạc, tái sinh cây từ mô sẹo, ra rễ
và tạo cây lạc hoàn chỉnh in vitro.
- Khảo sát môi trường cảm ứng phôi soma, tái sinh cây lạc hoàn chỉnh từ phôi soma.
- Tìm điều kiện tốt nhất chuyển cây lạc tái sinh in vitro ra môi trường tự nhiên
- Đánh giá hiệu quả tái sinh của các hệ thống tái sinh khác nhau ở cây lạc.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY LẠC
1.1.1. Nguồn gốc, phân bố, phân loại, đặc điểm sinh học cây lạc
Cây lạc (Arachis hypogaea L.) tên tiếng Anh là peanut, groundnut. Ở Việt
Nam, lạc còn có cái tên khác là đậu phộng, đậu phụng. Lạc có nguồn gốc ở Nam
Mỹ, từ vùng đất này hạt của nó đã được đưa đi đem trồng ở nhiều nơi trên thế
giới. Nó nhanh chóng thích ứng với các vùng nhiệt đới, Á nhiệt đới, các vùng có
khí hậu ẩm và đã trở thành một loại cây trồng phổ biến trên thế giới và Việt Nam
[4]. Các tài liệu nghiên cứu về lạc đều cho rằng cây lạc có thể được nhập từ Trung
Quốc vào nước ta từ thế kỷ XVII – XVIII [7].
Loài lạc trồng có tên khoa học là Arachis hypogaea L., có bộ nhiễm sắc thể
2n= 40, thuộc họ đậu Fabacaea, phân họ cánh bướm Papillionaceae, chi: Arachis,
dạng cây thảo hàng năm. Phân loại dưới loài của loài lạc trồng gồm 2 loài phụ với
4 thứ như sau:
- Loài phụ hypogaea ssp gồm 2 thứ:
+ Thứ Hypogaea: Dạng Virginia (Gregory;1951); (trồng ở vùng Bolivia,
Amazon).
+ Thứ Hirsuta (trồng ở Peru).
- Loài phụ Pastigiata ssp gồm 2 thứ:
+ Thứ Patigiata: Dạng Valencia.
+ Thứ Vulgaris: Dạng Spanish (Gregory,1951), (trồng ở Guaranian, Goias
và Minas Gerais; Tây bắc Bzaxin).
Ở Việt Nam, các giống lạc được tuyển chọn từ nhiều nguồn khác nhau và
chúng đều thuộc dạng Spanish, có tập tính sinh trưởng thành cụm [3].
Về đặc điểm hình thái, cây lạc có các bộ phận chính là: Rễ, thân, lá, hoa và
quả:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
Rễ cây lạc thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và rễ bên. Bộ rễ hoàn chỉnh
có thể ăn sâu 18cm – 30cm và rộng khoảng 30cm – 40cm. Rễ lạc có đặc điểm
không có biểu bì, không có lông hút thật. Sau khi gieo từ 15 – 30 ngày, những
nốt sần đầu tiên xuất hiện do loại vi khuẩn Rhizobium cộng sinh với hệ rễ,
lượng nốt sần đạt cực đại vào thời kỳ ra hoa – hình thành quả và hạt. Tại nốt
sần xảy ra quá trình cố định đạm từ nitơ không khí và cung cấp chất dinh
dưỡng cho cây [3], [6], [7].
Thân cây lạc mềm thuộc loại thân thảo ít gỗ. Khi còn non thân thường
tròn và đặc, khi thân già có hình góc cạnh và rỗng giữa. Thân cây lạc thường
cao 15 – 70cm, trên thân có lông với số lượng và màu sắc tùy giống. Tốc độ
tăng trưởng của thân tăng dần và đạt cao nhất ở thời kỳ ra hoa rộ. Cây lạc
phân cành ngay từ gốc với nhiều cấp (1,2,3 ) và chia làm hai loại cành: cành
sinh dưỡng và cành sinh sản. Cành cấp 1 được mọc từ gốc thường có nhiều
hoa, cành cấp 2 được mọc từ cành cấp 1 và thường có ít hoa hơn. Số cành/cây
khác nhau tùy theo giống và có ảnh hưởng trực tiếp đến số hoa và quả của cây
[2], [5], [6], [7].
Lá lạc thuộc lá kép lông chim chẵn, gồm 2 đôi lá chét. Cuống lá dài 4-
9cm, ở chân lá kép và lá chét có mô tế bào có khả năng trữ nước, làm lá ban
ngày xòe ra, ban đêm cụp lại. Số lượng lá của một cây thay đổi tùy thời vụ,
giống và chế độ chăm sóc. Hai lá mầm có vai trò cung cấp chất dinh dưỡng
cho cây ở giai đoạn đầu. Hai lá kèm hình mũi mác có nhiệm vụ bảo vệ mầm,
lá thật có màu xanh thẫm. Diện tích lá đạt tối đa ở thời kỳ hình thành quả và
hạt nhưng lại giảm nhanh và có thể đạt giá trị âm vào thời kỳ chín. Khi hoa tắt
thì lá không mọc nữa. Hoa tắt được vài ngày bộ lá chuyển sang màu vàng. Lúc
quả chín bộ lá chuyển sang màu đen và rụng [6], [7].
Hoa lạc mọc ở nách lá thành từng chùm từ 3-5 hoa/chùm. Khi cây có từ 9-10

lá thật thì hoa nở, hoa tự thụ phấn nghiêm ngặt, tỷ lệ ngoại phấn 0,25%. Khi hoa
nở là đã thụ phấn xong, sau đó cuống nhụy mọc dài, nghiêng xuống, đầu bầu nhụy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
cắm vào đất. Như vậy hoa nở trên cành còn làm quả ở dưới đất. Quá trình phân
hóa hoa kéo dài nên quá trình nở hoa cũng kéo dài [6], [7].
Quả lạc là loại quả khô hình kén, thường có 2 hạt có thể có 1 hoặc 3 hạt. Quả
lạc bao gồm gốc quả, mỏ quả và eo quả. Eo rõ hay không rõ, vỏ quả có gân hay
không có gân là đặc điểm khác nhau giữa các giống [6], [7].
Căn cứ vào thời gian sinh trưởng của cây lạc, người ta chia thành giống chín
sớm (thời gian sinh trưởng 90-105 ngày) và chín muộn (140-160 ngày). Nhiệt độ
thích hợp cho cây lạc ra hoa là 24-33
0
C, nhiệt độ giới hạn dưới cho hạt nảy mầm
là 12
0
C và cho thụ tinh là 17
0
C. Về ánh sáng, các giống lạc trồng ở Việt Nam
thuộc chủng Spanish không mẫn cảm với độ dài ngày và thích hợp với điều kiện
ánh sáng ít. Thời kỳ nảy mầm, ánh sáng làm giảm tốc độ hút nước của hạt và giảm
sự sinh trưởng của rễ phôi và trụ phôi. Đất thích hợp nhất cho trồng lạc là đất có
màu sáng, thoát nước nhanh, dễ vỡ, lượng canxi, lân, chất hữu cơ vừa phải, mùn ít
hơn 2%, pH= 6,0-6,4. Cây lạc cần các nguyên tố khoáng đa lượng như: N, P, K,
Ca, Mg, S và vi lượng như: Bo, Mo, Cu, Mn, Zn,Fe. Yêu cầu độ ẩm đối với lạc
tương đối cao, từ 60 – 70%, lương mưa phân bố đều. Cây lạc chỉ có khả năng chịu
hạn tương đối ở một số thời kỳ sinh trưởng nhất định, ngoài ra thiếu nước đều ảnh
hưởng xấu đến năng suất lạc [1], [6], [7].

1.1.2. Giá trị dinh dƣỡng và giá trị kinh tế của cây lạc
Sản phẩm thu từ hạt lạc rất có giá trị về mặt dinh dưỡng, hạt lạc có tỷ lệ dầu
rất lớn (43-55%), tỷ lệ protein cao (25-28%) [46]. Trong dầu lạc, các loại axit béo
chưa no chiếm một lượng lớn (khoảng 80%) đây chính là loại dầu thực phẩm rất
tốt không chứa choresterol nên việc sử dụng chúng có tác dụng phòng chống một
số bệnh huyết áp cao, béo phì, hiện tượng xơ vữa mạch máu, Bên cạnh đó, trong
hạt lạc còn chứa 8 amino acid không thay thế và các loại vitamin quan trọng khác
như vitamin E, B, D, PP Vì giá trị dinh dưỡng cao như vậy nên lạc là một trong
những cây thực phẩm quan trọng trong trong đời sống của người dân [1], [5], nó

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
có thể được sử dụng trực tiếp (quả non luộc, quả già rang, nấu ) hoặc ép làm dầu
ăn thực vật hoặc làm nguyên liệu trong các ngành công nghiệp chế biến.
Gần đây ngành công nghiệp thực phẩm phát triển, người ta đã chế biến rất
nhiều mặt hàng thực phẩm có giá trị từ lạc như rút dầu, bơ lạc, pho mát lạc, sữa
lạc, kẹo lạc Bên cạnh đó cũng phải kể đến việc lạc còn được sử dụng trong chăn
nuôi, từ lạc người ta có thể sử dụng khô dầu, thân lá xanh và cả cám vỏ quả lạc để
làm thức ăn cho gia súc, góp phần quan trọng trong việc phát triển chăn nuôi. Khô
dầu lạc là nguồn thức ăn giầu protein, hiện nay khô dầu lạc trên thế giới đứng
hàng thứ 3 trong các loại khô dầu thực vật dùng trong chăn nuôi (sau khô dầu đậu
tương và bông). Thân lá lạc (sau thu hoạch quả) làm thức ăn xanh trong chăn nuôi
đại gia súc. Vỏ quả lạc cũng có thể nghiền thành cám, cám vỏ quả lạc có thành
phần dinh dưỡng tương đương với cám gạo dùng trong chăn nuôi rất tốt [1], [5].
Ngoài giá trị sử dụng như là một nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng đối với
người và gia súc, cây lạc còn là một cây trồng có giá trị bồi dưỡng và cải tạo đất
trong hệ thống luân canh, đặc biệt là trên đất bạc màu nghèo dinh dưỡng. Cây lạc
là cây trồng có khả năng thích ứng rộng, có khối lượng sinh khối cao, thân lá lạc là
nguồn phân xanh quan trọng, có thể cày vùi ngay tại ruộng hoặc ủ làm phân. Điều

đặc biệt quan trọng là ở rễ lạc có nốt sần do vi khuẩn cố định đạm Rhizobium tạo
nên, có khả năng cố định nitơ khí quyển tổng hợp thành đạm. Nhờ khả năng cố
định đạm này mà sau khi thu hoạch thành phần hóa tính của đất trồng được cải
thiện rõ rệt, lượng đạm trong đất tăng (sau một vụ, lạc sẽ để lại trong đất 40-60kg
N/ha) và khu hệ vi sinh vật hiếu khí trong đất được tăng cường có lợi đối với cây
trồng vụ sau. Lạc cũng là cây trồng có khả năng tạo ra tính đa dạng hoá cho sản
xuất nông nghiệp bằng các hình thức trồng thuần, xen canh, gối vụ để nâng cao
hiệu quả cho sản xuất nông nghiệp [4].
Về mặt kinh tế, cây lạc là cây công nghiệp ngắn ngày, một trong những cây
trồng kinh tế chủ yếu trên thế giới. Khoảng 75% lạc sản xuất toàn cầu được sử
dụng để chiết xuất dầu và còn lại 25% được tiêu thụ làm thực phẩm. Ở nước ta,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
hạt lạc là mặt hàng nông sản xuất khẩu đem lại lợi nhuận cao, nó là mặt hàng nông
phẩm quan trọng xếp thứ 18 về giá trị hàng hóa trong tổng số 20 mặt hàng thực
phẩm và nông sản quan trọng nhất của cả nước [48]. Chính vì có giá trị dinh
dưỡng và giá trị kinh tế cao nên cây lạc luôn là một trong những chương trình
được ưu tiên phát triển trong nước.
1.1.3. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và Việt Nam
Trong các cây họ đậu, lạc có diện tích, sản lượng đứng thứ hai sau đỗ tương
và được trồng khắp các châu lục, phần lớn lạc được canh tác ở các vùng nhiệt đới
và Á nhiệt đới của thế giới. Trong năm 2001, tổng diện tích trồng lạc của thế giới
là trên 24,8 triệu ha và sản xuất hơn 32,8 triệu tấn, với năng suất trung bình tương
đương với 1.32 tấn mỗi ha [67]. Tuy nhiên từ năm 2002 đến 2007 đã có những sự
thay đổi liên tục về diện tích gieo trồng, năng suất và sản lượng lạc trung bình thu
được. Trong những năm từ 2002 - 2007 diện tích đất trồng lạc của thế giới có xu
hướng giảm nhưng năng suất trung bình và sản lượng thu được lại tăng lên trông
thấy. Năm 2002 diện tích trồng lạc khoảng 23.518,30 triệ u ha , năng suất trung

bình là 14,15 tạ/ha, sản lượng đạt 33.265,30 triệu tấn. Năm 2004 diện tích tăng đột
biến lên tới 26.375,76 triệ u ha, năng suất tăng nhẹ lên 13,67 tạ/ha, sản lượng đạt
36.057,28 triệ u tấn. Đến năm 2007 diện tích đất trồng lạc giảm xuống đột ngột chỉ
còn khoảng 23.105 triệ u ha, nhưng năng suất lại tăng cao đạt 16,08 tạ/ha và sản
lượng đạ t 37.114,13 triệ u tấn [49] (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới ( 2002 - 2007)
Năm
Diện tích
(triệu ha)
Năng suất
(tạ/ha)
Sản lƣợng
(Triệu tấn)
2002
23.518,30
14,14
33.265,30
2003
26.181,84
13,49
35.327,94
2004
26.375,76
13,67
36.057,28
2005
25.217,20
14,47
36.492,14
2006

22.122,99
15,73
34.779,14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
2007
23.105,41
16,08
37.114,13
(Nguồn: Số liệu thống kê FAOSTAT, 2008).
Tính đến năm 2009, lạc được trồng trên gần 23,95 triệu ha trên toàn thế giới
với tổng sản lượng là 36,45 triệu tấn và năng suất trung bình là 1,52 tấn/ha. Các
nước đang phát triển ở Châu Á, Châu Phi và Nam Mỹ chiếm trên 97% diện tích
trồng và sản xuất khoảng 95% tổng sản lượng lạc toàn cầu. Trong đó Châu Á đang
dẫn đầu với 50% diện tích trồng và 64% sản lượng toàn cầu, tiếp theo là châu Phi
với diện tích trồng chiếm khoảng 46% và sản lượng chiếm khoảng 28%, Nam Mỹ
chiếm một phần nhỏ còn lại [48]. Trong các nước trồng lạc phải kể đến thì Trung
Quốc là nước có sản lượng lạc lớn nhất thế giới, thứ hai là Ấn Độ, thứ ba là
Nigeria, Mĩ đứng ở vị trí thứ tư còn Việt Nam đứng thứ 10 trong bảng xếp hạng
các quốc gia sản xuất lạc lớn nhất trên thế giới [49] (bảng 1.2).
Diện tích trồng lạc ở Đông Nam Á không nhiều, chỉ chiếm 12,61% diện tích
thu hoạch và 12,95% sản lượng lạc của toàn Châu Á. Trong số các nước có trồng
lạc ở khu vực này thì Myanmar là nước có diện tích trồng và sản lượng lạc lớn
nhất, tiếp theo là Indonesia, thứ ba là Việt Nam. Về năng suất, nhìn chung năng
suất lạc trong khu vực còn ở mức thấp, trung bình là 1,17 tấn/ha. Malaysia là nước
có diện tích trồng lạc không lớn (khoảng 6000 ha) nhưng năng suất cao nhất khu
vực, trung bình đạt 2,33 tấn/ha [17] .
Ở Việt Nam, do cây lạc là cây trồng nhiệt đới và á nhiệt đới, hơn nữa yêu cầu

về đất đai không quá khắt khe nên nó được trồng rộng rãi hầu hết ở các tỉnh, thành
trong cả nước. Theo số liệu thống kê năm 2010 của tổng cục thống kê (bảng 1.3),
từ năm 2000 đến năm 2009 diện tích trồng lạc ở nước ta chỉ dao động trong
khoảng 244,9 đến 269,6 nghìn ha, nhưng năng suất và sản lượng lạc không ngừng
tăng. Năm 2000, diện tích trồng lạc là 244,9 nghìn ha, năng suất trung bình lúc đó
là 14,5 tạ/ha, sản lượng chỉ đạt 355,3 nghìn tấn. Đến năm 2009 diện tích trồng lạc
ở nước ta cũng chỉ khoảng 245 nghìn ha, nhưng năng suất trung bình đã tăng lên
tới 20,85 tạ/ha, sản lượng đạt 510,9 nghìn tấn [11].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9


Bảng 1.2. Các quốc gia sản xuất lạc nhiều nhất trên thế giới
Xếp hạng
Quốc gia
Sản lƣợng (tấn)
1
China
14.764.841
2
India
5.510.000
3
Nigeria
2.969.260
4
United States of America
1.674.500

5
Myanmar
1.362.070
6
Senegal
1.032.650
7
Sudan
942.000
8
Indonesia
777.888
9
Argentina
605.491
10
Viet Nam
525.100
11
Ghana
485.100
12
Cameroon
457.000
13
Chad
413.062
14
United Republic of Tanzania
385.480

15
Burkina Faso
330.624
(Nguồn: Số liệu thống kê FAOSTAT, 2009)

Cũng theo số liệu thống kê năm 2010 của cục thống kê Việt Nam hiện nay có
5 vùng trồng lạc chính (Bảng 1.4). Trong đó vùng Bắc Trung Bộ và duyên hải

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10
miền Trung có diện tích lớn nhất (108,1 nghìn ha) năng suất đạt 19,49 tạ/ha gần
bằng năng suất trung bình của cả nước, sản lượng lớn nhất so với cả nước đạt
210,7 nghìn tấn. Vùng Đồng Bằng Sông cửu Long, có diện tích trồng lạc thấp nhất
chỉ khoảng 12.6 nghìn ha nhưng năng suất đạt 33.09 tạ/ha - cao nhất so với cả
nước tuy nhiên sản lượng đạt thấp (41,7 nghìn tấn) do diện tích ít. Vùng Trung du
và miền núi phía Bắc có năng suất thấp nhất so với cả nước (17,17 tạ/ha) [11].
Bảng 1.3. Diễn biến sản xuất lạc ở nước ta
Chỉ tiêu
Năm
Diện tích
(nghìn ha)
Năng suất
(tạ/ha)
Sản lƣợng
(nghìn tấn)
2000
244,9
14,50
355,30

2001
244,6
14,84
363,10
2002
246,7
16,23
400,40
2003
243,8
16,66
406,20
2004
263,7
17,79
469,00
2005
269,6
18,15
489,30
2006
246,7
18,75
462,50
2007
254,5
20,03
510,00
2008
255,3

20,77
530,20
2009
245,0
20,85
510,90
(Nguồn: Niên giám thống kê 2004-2010)

Nhìn chung năng suất lạc nước ta còn thấp do chất lượng giống, trình độ canh
tác hạn chế và đặc biệt do những tác động của biến đổi khí hậu toàn cầu đã ảnh
hưởng tới năng suất cây trồng nói chung và cây lạc nói riêng [7]. Các vùng sản
xuất lạc của nước ta lại không đồng đều về mặt điều kiện tự nhiên cũng như trình
độ sản xuất (nhất là về mặt thâm canh để tăng năng suất) vì thế năng suất cao tập
trung chủ yếu ở vùng đồng bằng sông Hồng, đồng bằng sông cửu Long, Đông
Nam Bộ và Vùng Bắc Trung Bộ và duyên hải miền Trung.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11



Bảng 1.4. Diện tích, năng suất, sản lượng lạc của các vùng trọng điểm ở Việt năm 2009
Vùng
Diện tích
(nghìn ha)
Năng suất
(tạ/ha)
Sản lƣợng

(nghìn tấn)
Cả nước
245
20,85
510,9
Đồng bằng sông hồng
31,4
23,18
72,8
Trung du và miền núi phía Bắc
50,5
17,17
86,7
Bắc Trung Bộ và duyên hải miền
Trung
108,1
19,49
210,7
Tây Nguyên
17,5
17,31
30,3
Đông Nam Bộ
24,9
27,59
68,7
Đồng Bằng Sông cửu Long
12,6
33.09
41,7

(Nguồn: Niên giám thống kê năm 2010)

1.2. HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO Ở CÂY LẠC
1.2.1. Cơ sở tế bào học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Tất cả các tế bào của một cơ thể đều mang bộ máy thông tin di truyền
giống nhau. Do đó chúng có tiềm năng tổng hợp nên các protein giống nhau.
Các tế bào được lấy từ bất kỳ mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh
sinh trưởng, lá mầm, đoạn thân, rễ…) đều có thể được kích thích để tái sinh
thành cây hoàn chỉnh đặc trưng cho loài, phát triển và ra hoa kết quả bình
thường, thông qua phát sinh cơ quan hoặc hình thành phôi vô tính, miễn là chúng
được nuôi cấy trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp và bổ sung các chất kích thích
sinh trưởng cần thiết [57]. Các loại mô đã phân hoá tách từ cơ thể thực vật có
khả năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, hoặc là chúng phát triển
thành tế bào mô sẹo (callus). Đó là loại tế bào không phân hoá, phân chia liên
tục và có khả năng phân hoá thành phôi, chồi để tạo cây hoàn chỉnh. Khả năng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
đó gọi là tính toàn năng của tế bào. Tính toàn năng là chính là cơ sở của kỹ thuật
nuôi cấy mô tế bào, là cơ sở của công nghệ tế bào thực vật đang ngày càng phát
triển và hoàn thiện.
1.2.2. Ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến quá trình nuôi
cấy mô tế bào thực vật
Người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở thực vật đó là
auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic. Những chất này được phân thành
các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý, tuy nhiên về
chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo và hỗ trợ nhau. Còn một số
nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất định. Trong nuôi cấy mô tế
bào người ta thường sử dụng ba nhóm chất điều tiết sinh trưởng là dẫn xuất của

auxin, cytokinin và giberelin [16], [18].
Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lý
học thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất. Auxin là những hoocmon thực vật
có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hoá cơ quan, kiểu
tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hoá màng tế bào. Nhóm
auxin bao gồm các chất sau: 2,4 Diclorophenoxy axetic axit (2,4D), α –
naphtylaxetic axit (NAA), Indolaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độc nhưng
có tác dụng kích quá trình phân chia tế bào và thường được sử dụng nhiều nhất,
NAA có tác dụng tạo rễ cho cây con [16], [18].
Nhóm giberelin là nhóm được phát hiện qua nghiên cứu bệnh nấm lúa von.
Nó tác động làm tế bào dãn ra và phân chia, làm cây lùn có thể cao lên được, như
ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng. Đại diện cho nhóm này là
axit giberilic (GA3), được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp[16], [18].
Nhóm cytokinin là nhóm chất hoá học có ảnh hưởng quyết định đến kích
thích phân chia tế bào. Đại diện cho nhóm cytokinin gồm: Kinetin; 6 – Benzyl
amino purine (BAP); 6- Dimethylalylamino purine (2iP); Zeatin. Hiện nay một thế
hệ mới của chất điều hòa sinh trưởng, chẳng hạn như thidiazuron (TDZ) - một

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13
cytokinin thuộc các phenylureas, đang nổi lên như là một thay thế thành công cho
tái sinh trực tiếp với tần số cao của phôi vô tính [44][61].
Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây
nhưng gần đây nó mới được coi là một hoocmon thực vật. Ethylen thường được sử
dụng để làm chín quả ở chuối, ra hoa đồng loạt ở dứa, nó cũng ảnh hưởng đến
quá trình phân bào. Đối với cà chua trong điều kiện ethylen nồng độ cao sẽ kéo
dài khoảng ra rễ của thân [16], [18].
Axit absixic là hợp chất ức chế sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởng đến
tính ngủ nghỉ của hạt, mầm và rụng lá, tăng cường ra hoa cho một số cây ngắn

ngày thông qua hiệu quả tổng hợp ARN và protein [16], [18].
1.2.3. Tái sinh cây
Tái sinh cây được xem là khâu mấu chốt quyết định thành công trong nuôi cấy
mô và chuyển gen ở thực vật, nhiều nhà nghiên cứu thực nghiệm thu được các tế bào
sống sót nhưng lại không tái sinh được cây hoàn chỉnh. Nguyên nhân là chưa xác
định một cách đầy đủ đặc điểm quá trình phân hoá hình thái của sự tái sinh cây.
Rudrabhatla Sairam (2005) đã tổng hợp các kết quả nghiên cứu phát triển kỹ thuật tái
sinh ở cây một lá mầm và cây hai lá mầm và cho rằng sự tái sinh cây có thể được
thực hiện bằng nuôi cấy in vitro từ phôi soma hoặc từ một bộ phận khác độc lập trên
cơ thể và điều đó còn phụ thuộc vào genotype của giống [71].
Tái sinh thực vật trong ống nghiệm thông qua hai con đường đó là: “Phát
sinh cơ quan” (organogenesis) điều này có thể xảy ra do sự phát triển chồi trực
tiếp trên bề mặt của mẫu mô nuôi cấy [55] hoặc có thể bị xen giữa bởi một giai
đoạn mô sẹo còn gọi là sự phát sinh chồi từ mô sẹo [21] và con đường thứ hai đó
là “Hình thành phôi vô tính” (embryogenesis), nơi mà thường có một tế bào hoặc
một cụm nhỏ các tế bào trải qua sự phản biệt để tạo phôi soma (phôi vô tính) phát
triển thành cây hoàn chỉnh tương tự như phôi hữu tính (phôi zygotic). Sự phát sinh
cơ quan hoặc hình thành phôi vô tính có thể xảy ra trực tiếp từ mẫu mô đem nuôi
cấy hoặc gián tiếp thông qua sự hình thành một mô sẹo phản biệt hóa từ mẫu mô