Tinh sạch Protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus subtilis XL62, ứng dụng thử nghiệm chế phẩm BCF trên mô hình In Vitro

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
o0o




LÊ THANH HOÀNG




TINH SẠCH PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG
Bacillus subtilis XL62, ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM BCF
TRÊN MÔ HÌNH IN VITRO






LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
o0o



LÊ THANH HOÀNG



TINH SẠCH PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG
Bacillus subtilis XL62, ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM BCF
TRÊN MÔ HÌNH IN VITRO



Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30




Học viên : Lê Thanh Hoàng
Hướng dẫn khoa học: TS Đỗ Thị Tuyên

Luận văn được thực hiện tại Phòng CNSH Enzyme, Viện CNSH



Hà Nội - 2012


i
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị
Tuyên, Phó trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học,
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, sửa
luận văn và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và làm việc.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền Đình Thi, Trưởng phòng Công
nghệ sinh học Enzyme, Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học
và Công nghệ Việt Nam, đã tạo mọi điều kiện về hóa chất, thiết bị, thời gian cho tôi
thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ
sinh học đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá trình thực nghiệm cũng như
chia sẽ những kinh nghiệm chuyên môn.
Tôi xin cảm ơn Phòng đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo sau đại học
Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè và đồng
nghiệp đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong suốt thời gian học tập.

Hà Nội, tháng 11 năm 2012
Học viên



Lê Thanh Hoàng


ii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

CÁC TỪ VIẾT TẮT
AFC
Antifungal compound
APS
Ammonium persulphate
B. subtilis
Bacillus subtilis
BCF
Biological Control Fungi
CFU
Conoly-Forming Unit
DEAE-cellulose
Dimethylaminoethyl-cellulose
ĐC
Đối chứng
F. oxysporum
Fusarium oxysporum
kDa

Kilo Dalton
M
Marker
MIC
Minimum inhibitory concentration
OD
Optical density
PAGE
Polyacrylamide gel electrophoresis
Pr
Protein
R. solani
Rhizoctonia solani
SDS
Sodium dodecyl sulfate
TB
Trung bình
TEMED
N,N,N’,N’,- Tetramethyl ethylene diamine
TN
Thí nghiệm
v/v
Volume/volume
w/v
Weight/volume




iii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
CÁC TỪ VIẾT TẮT ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC HÌNH v
DANH MỤC BẢNG vi
MỞ ĐẦU 1
1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Khái quát về chất đối kháng sinh trưởng nấm 3
1.2 Vai trò của vi khuẩn Bacillus trong kiểm soát sinh học 4
1.2.1 Đại cương về vi khuẩn B. subtilis 4
1.2.2 Ứng dụng của các chủng Bacillus trong kiểm soát sinh học 5
1.3 Nghiên cứu chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh trên thế giới 7
1.3.1 Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính kháng nấm 8
1.3.2 Sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ nấm 9
1.4 Nghiên cứu chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh ở Việt Nam 10
1.4.1 Nghiên cứu các biện pháp sinh học phòng trừ nấm bệnh 10
1.4.2 Nghiên cứu sản xuất và thương mại các chế phẩm phòng trừ nấm 12
2 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17
2.1 Vật liệu và hóa chất 17
2.1.1 Chủng giống 17
2.1.2 Hóa chất 17
2.1.3 Các loại đệm và dung dịch 17
2.1.4 Môi trường 18
2.1.5 Thiết bị thí nghiệm 18
2.2 Phương pháp nghiên cứu 19
2.2.1 Lên men chìm nuôi cấy vi sinh vật 19
2.2.2 Xác định hoạt tính kháng nấm 19

iv
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2.2.3 Xác định ảnh hưởng của dinh dưỡng và các yếu tố hóa lý 20
2.2.4 Tách chiết và tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm 21
2.2.5 Điện di SDS-PAGE 22
2.2.6 Xác định hàm lượng protein tổng số 23
2.2.7 Xác định tính chất protein tinh sạch 23
3 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25
3.1 Tính kháng nấm của hoạt chất ngoại bào từ B. subtilis XL62 25
3.1.1 Hoạt tính kháng nấm của dịch lọc tế bào từ B. subtilis XL62 25
3.1.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy 27
3.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 30
3.1.4 Ảnh hưởng của pH nuôi cấy ban đầu 31
3.1.5 Ảnh hưởng của tốc độ lắc 34
3.2 Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm 35
3.2.1 Tinh sạch qua sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose 35
3.2.2 Tinh sạch qua sắc ký lọc gel Biogel P100 36
3.3 Đánh giá tính chất của protein tinh sạch 41
3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 41
3.3.2 Ảnh hưởng của proteinase K 42
3.3.3 Khả năng ức chế sợi bào tử nấm 42
3.4 Sản xuất và thử nghiệm chế phẩm BCF 43
3.4.1 Sản xuất chế phẩm BCF quy mô phòng thí nghiệm 43
3.4.2 Thử nghiệm chế phẩm BCF trên mô hình in vitro 45
4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48
4.1 Kết luận 48
4.2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50
PHỤ LỤC 54



v
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc chủng B. subtilis XL62 trên môi trường PDA 4
Hnh 2.1. Quy trì nh tinh sạ ch protein khá ng nấ m từ chủng B. subtilis XL62 22
Hình 3.1. Động thái sinh trưởng của B. subtilis XL62 trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau
28
Hình 3.2. Hoạt tính ức chế sinh trưởng F. oxysporum của B. subtilis XL62 trong các môi trường
khác nhau 29
Hình 3.3. Hoạt tính ức chế sinh trưởng R. solani của B. subtilis XL62 trong các môi trường khác
nhau 29
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sinh trưởng của B. subtilis XL62 30
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên hoạt tính ức chế sinh trưởng F. oxysporum và R.
solani 31
Hình 3.6. Mật độ tế bào B. subtilis XL62 trong môi trường MT4 và MT2 với các giá trị pH ban
đầu khác nhau 32
Hình 3.7. Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu lên hoạt tính ức chế F. oxysporum 33
Hình 3.8. Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu lên hoạt tính ức chế R. solani 33
Hình 3.9. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của chủng XL62 34
Hình 3.10. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên hoạt tính ức chế sinh trưởng nấm F. oxysporum và R.
solani 35
Hnh 3.11. Sắ c ký đồ c ác phân đoạn qua cột sắc k trao đi ion DEAE -cellulose (A); Hoạt tính
kháng F. oxysporum của các đỉnh protein sau khi qua cột DEAE-52 cellulose (B) 36
Hnh 3.12. Sắ c ký đồ (A) và điệ n di đồ (B) các phân đoạn tinh sạch qua cột Biogel ở peak 1. 37

Hnh 3.13. Hoạt tính kháng nấm các phân đoạn tinh sạch ở peak 1 sau khi qua cột Biogel. 37
Hnh 3.14. (A) Sắ c ký đồ qua cộ t Biogel P 100; (B) điệ n di đồ cá c phân đoạ n tinh sạ ch qua cộ t
Biogel ở peak 2. 38
Hnh 3.15. Hoạt tính kháng nấm F. oxysporum các phân đoạn tinh sạch peak 2. 38
Hình 3.16. Sắc k đồ các phân đoạn qua cột Biogel P100 (A); Điện di đồ các phân đoạn tinh sạch
trước và sau khi qua cột Biogel ở peak 3 (B). 39
Hình 3.17. Hoạt tính kháng nấm F. oxysporum của các phân đoạn tinh sạch ở peak3. 39
Hình 3.18. Hoạt tính kháng F. oxysporum và R. solani của protein tinh sạch ở peak 3. 40
Hình 3.19. Hoạt tính kháng R. solani của protein tinh sạch từ B. subtilis XL62 ở peak 3. 40
Hình 3.20. Ảnh hưởng củ a nhiệ t độ lên hoạ t tính kháng nấm F. oxysporum (A) và R. solani (B). 42
Hình 3.21. Ảnh hưởng của proteinase K đến hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A) và R. solani
(B). 42
Hình 3.22. Khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử F. oxysporum của protein tinh sạch từ B. subtilis
XL62 quan sát trên kính hiển vi quang học. 42
Hình 3.23. Lên men sản xuất chế phẩm BCF trên quy mô 20 lít/mẻ 44
Hình 3.24. Hoạt tính ức chế F. oxysporum (A,C) và R. solani (B,D) của chế phẩm BCF dạng đơn
(A,B) và dạng đa (C,D) sau 5 ngày thí nghiệm. 46
Hình 3.25. Hoạt tính ức chế F. oxysporum (A) và R. solani (B) của chế phẩm BCF dạng lỏng cô
đặc 10 lần sau 5 ngày thí nghiệm. 46



vi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC BẢNG
Bng 2.1. Thành phần các loại đệm và dung dịch 17
Bng 2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 18
Bng 2.3. Danh sách các thiết bị thí nghiệm được sử dụng 18
Bng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ dịch lọc tế bào B. subtilis XL62 lên sinh trưởng của F.

oxysporum 26
Bng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ dịch lọc tế bào B. subtilis XL62 lên sinh trưởng của sợi R.
solani 26
Bng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dịch lọc tế bào B. subtilis XL62 lên sinh trưởng của hạch R.
solani 26
Bng 3.4. Sự biến động giá trị pH môi trường dinh dưỡng trong quá trình nuôi cấy 31
Bng 3.5. Tóm tắt quá trình tinh sạch protein kháng nấm từ B. subtilis XL62 ở peak 3 khi qua các
bước tinh sạch 39
Bng 3.6. Khả năng ức chế F. oxysporum và R. solani của dịch nuôi cấy chủng B. subtilis XL62,
sau các ngày lên men khác nhau. 44
Bng 3.7. Hoạt tính ức chế R. solani và F. oxysporum của chế phẩm BCF sau 5 ngày thử nghiệm 46
Bng 3.8. Hoạt tính ức chế R. solani và F. oxysporum của chế phẩm BCF cô đặc 10 lần sau 5 ngày
thử nghiệm 46
Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm

1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỞ ĐẦU
Chấ t đố i khá ng sinh trưở ng nấ m (antifungal compounds, AFC) là những chất có
khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm đặc biệt là nấm gây bệnh ở cây
trồ ng như lạ c , cà chua , đậ u tương , cây cà phê . Các protein v à peptide có hoạt tính
kháng nấm đều được tách chiết phần lớn từ động vật, thự c vậ t, vi khuẩ n và nấ m.
Dựa trên cấu trúc hoặc chức năng , các protein và peptide có khả năng khá ng nấm
được phân loại thành nhiều lớp khác nhau, chẳng hạn như chitinase và chitinase-like
protein, ribonuclease, chất ức chế protease. Peptide kháng nấm đầu tiên được tách
chiết từ B. subtilis là iturin và bacillomycin. Chúng có cấu trúc peptidolipid mạch vòng
và có khả năng kháng nấm và tan huyết.
Các chủ ng Bacillus đã được biết đến với vai trò quan trọng trong việc kiểm soát
bệnh cây trồng. Chúng có khả năng sinh tng hợp nhiều hợp chất kháng nấm khác

nhau như các chất kháng sinh , lipopeptide, bacillomycin, iturin, mycosubtilin và
fengycin. Mộ t số chủ ng B. subtilis đã được ứ ng dụng để kiểm soát bệnh cây trồng do
nấm gây ra , chúng có ph biến trong đất , chịu được nhiệt độ cao , sinh trưở ng nhanh
trong môi trườ ng lỏng và có nhiề u bào tử.
Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam, việc sử dụng các chế phẩm sinh học
thay thế một phần thuốc hóa học để phòng trừ một số bệnh cây trồng do vi sinh vật gây
ra đang là xu hướng chủ yếu. Chế phẩm sinh học diệt nấm có nguồn gốc từ vi khuẩn
đối kháng có tác dụng tích cực đối với nông nghiệp, ưu việt hơn so với việc dùng
thuốc hóa học. Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng để diệt nấm gây
hại trên cây trồng sẽ mang lại những lợi ích lâu dài cho người sản xuất như: làm tăng
năng suất của cây trồng, giảm chi phí đầu tư, làm đất không bị bạc màu, thân thiện với
môi trường sinh thái, không ảnh hưởng đến sức khỏe của con người và vật nuôi, góp
phần quan trọng trong việc phát triển nền nông nghiệp hữu cơ bền vững và hiệu quả.
Việc nghiên cứu phòng trừ nấm bệnh cây trồng bằng các chế phẩm sinh học đã
được hình thành và phát triển ở Việt Nam nhưng vẫn còn nhiều hạn chế. Các chế phẩm
dưới dạng tinh sạch tách chiết từ vi sinh vật mới nghiên cứu chủ yếu ở trong phòng thí
nghiệm và quy mô sản xuất thử nên giá thành còn cao. Các sản phẩm trên thị trường
Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm

2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

chủ yếu là các sản phẩm có chứa tế bào vi sinh vật đối kháng nên thời gian hữu hiệu
ngắn, hiệu quả không cao. Mặt khác, các sản phẩm sử dụng tế bào mang nguy cơ gây
bệnh rất lớn cho con người. Vì vậy, phát triển sản phẩm sinh hóa đạt độ tinh sạch cao
để phòng chống nấm bệnh cây trồng là một vấn đề rất cấp thiết. Trong quá trình
nghiên cứu, chúng tôi đã phân lậ p và tuyển chọn được chủng B. subtilis XL62 có khả
năng ức chế mạnh các nấ m gây bệnh cây trồng như F. oxysporum và R. solani. Xuất
phát từ những l do trên và tình hình nghiên cứu ở Việt Nam, tôi đã thực hiện đề tài
luận văn: "Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus subtilis

XL62, ứng dụng thử nghiệm chế phẩm BCF trên mô hình in vitro" trong khuôn kh
đề tài "Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm BCF phòng chống bệnh cây trồng do
nấm Fusarium sp. và Rhizoctonia solani" do TS. Nguyễn Ngọc Dũng làm chủ nhiệm
với các mục tiêu: (1) Tinh sạch được protein từ B. subtilis XL62 có hoạt tính kháng
nấm, (2) Thử nghiệm khả năng ức chế F. oxysporum và R. solani của chế phẩm BCF
trên mô hình in vitro.
Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm

3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Khái quát về chất đối kháng sinh trưởng nấm
Chấ t đố i khá ng sinh trưở ng nấ m là nhữ ng chấ t có khả năng ứ c chế sự sinh trưở ng
hoặc tiêu diệt sự phát triển của các loại nấm. Các chất này đã được ứng dụng để phòng
và chữa trị các bệnh do nấm gây ra, đặ c biệ t là các loại nấ m gây bệ nh hại trên cây
trồ ng. Các protein và peptide có hoạt tính kháng nấm đều được tách chiết phần lớn từ
độ ng vậ t (Iijima et al., 1993; Wang, Ng, 2002), thự c vậ t (Benhamou et al., 1993; Joshi
et al., 1998; Lam et al., 2000), vi khuẩ n (Delcambe et al., 1977; Kim, Chung, 2004;
Moyne et al., 2004) và nấm (Lam, Ng, 2001; Wang, Ng, 2004). Trong các nguồn trên
thì các chất AFC tách chiết từ đối tượng vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn thuộc chi
Bacillus được quan tâm đến nhiều nhất. Các chủng Bacillus có nhiều các đặc tính quý
như: dễ nuôi cấy, ph biến, sinh trưởng nhanh trong môi trường lỏng, cho nhiều bào tử
và đặc biệt là chúng có khả năng sinh tng hợp nhiều chất AFC cùng lúc.
Các protein và peptide có khả năng kháng nấm được phân loại theo nhiều cách
khác nhau, dựa vào cơ chế tác động có thể phân thành 3 loại đó là loại tác động vào
vách tế bào nấm: ức chế sự tng hợp chitin và glucan, loại tác động vào màng tế bào
nấm: các chất gắn dính hay ức chế sự tng hợp ergosterol của nấm và loại tác động
vào quá trình tng hợp protein và acid nucleic của nấm. Dựa trên cấu trúc hoặc chức
năng, các protein và peptide có khả năng khá ng nấm được phân loại thành nhiều lớp

khác nhau, chẳng hạn như chitinase và chitinase-like protein (Benhamou et al., 1993;
Lam et al., 2000), ribonuclease (Liu et al., 2007), chất ức chế protease (Joshi et al.,
1998). Peptide kháng nấm đầu tiên được tách chiết từ chủng B. subtilis là iturin và
bacillomycin. Chúng có cấu trúc peptidolipid mạch vòng và có khả năng kháng nấm
và làm tan huyết (Latoud et al., 1986). B. subtilis cũng chính là đối tượng vi khuẩn
được quan tâm nghiên cứu đến nhiều nhất hiện nay, chủng này sinh tng hợp rất nhiều
các polypeptide có hoạt tính kháng nấm và cho thấy tiềm năng trong việc kiểm soát
các bệnh hại cây trồng do nấm gây ra cũng như trong việc sản xuất các chế phẩm sinh
học phòng trừ nấm.
Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm

4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.2 Vai trò của vi khuẩn Bacillus trong kiểm soát sinh học
1.2.1 Đại cương về vi khuẩn B. subtilis
1.2.1.1 Lịch sử phát triển
B. subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi t chức y học
Nazi của Đức. Lúc đầu , chủng được sử dụng để phòng bệnh lị cho các bệnh sĩ Đức
chiến đấu ở Bắc Phi. Đến năm 1949, khi Henry và các cộng sự tách được chủng thuần
khiết của B. subtilis thì chúng mới được dùng để điều trị các bệnh về rối loạn tiêu hóa.
Ngày nay, vi khuẩn B. subtilis đã trở nên ph biến và được sử dụng rộng rãi trong y
học, thực phẩm, và đặc biệt là kiểm soát sinh học trong nông nghiệp.
1.2.1.2 Đặc điểm phân loại
Theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn B. subtilis thuộc:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae

Chi: Bacillus
Loài: B. subtilis
1.2.1.3 Đặc điểm phân bố
Vi khuẩn B. subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đường ruột, chúng được
phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất nước Phần lớn chúng tồn tại
trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10- 100 triệu CFU/g.
1.2.1.4 Đặc điểm hình thái
B. subtilis là trực khuẩn hình que, hai đầu tròn, Gram dương, kích thước từ 0,5- 0,8
µm x 1,8- 3 µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, 8- 12 lông. Sinh bào tử
nhỏ hơn vi khuẩn và nằm giữa tế bào. kích thước từ 0,8- 1,8 µm. Phát triển bằng cách
nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ấm, tia tử
ngoại, phóng xạ

Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc chủng B.
subtilis XL62 trên môi trường PDA
Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm

5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.2.1.5 Đặc điểm nuôi cấy
Điều kiện phát triển khi nuôi cấy là môi trường hiếu khí, nhiệt độ nuôi cấy tối ưu là
37C. Mặc dù là vi khuẩn hiếu khí nhưng B. subtilis có khả năng phát triển trong môi
trường thiếu oxy. pH thích hợp nhất khi nuôi cấy với pH = 7,0- 7,4. Trên môi trường
thạch đĩa: khuẩn lạc chủng có dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm
màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3- 5 mm. Sau 1- 4 ngày thì bề mặt
nhăn và chuyển sang màu hơi sẫm (Hình 1.1). Trên môi trường thạch nghiêng: chủng
dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa gợn sóng. Trên môi trường lỏng: chủng phát triển làm
đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vấn mây ở đáy, khó tan đều khi
lắc lên.

1.2.2 Ứng dụng của các chủng Bacillus trong kiểm soát sinh học
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy các chủ ng Bacillus có vai trò quan trọng trong việc
kiểm soát bệnh cây trồng do nấm gây ra . Mộ t số chủ ng B. subtilis đã được ứ ng dụng
để kiểm soát bệnh hại cây trồng , chúng có ph biến trong đất , chịu được nhiệt độ cao ,
sinh trưở ng nhanh trong môi trườ ng lỏng và có nhiề u bào tử (Hwang, Chakravarty,
1992; Asaka, Shoda, 1996; Wulff et al., 2002; Okigbo, 2005).
Các chủng B. subtilis có khả năng sinh tng hợp nhiều hợp chất kháng nấm khác
nhau như các chất kháng sinh, lipopeptide, bacillomycin, iturin, mycosubtilin và
fengycin (Peypoux et al., 1986; Ongena et al., 2005; Ongena, Jacques, 2008; Kim et
al., 2010).
Douville và cộng sự (1992) đã nghiên cứu ảnh hưởng và cơ chế tác động của vi
khuẩn B. subtilis trên nấm Colletotrichum trifolii, tác nhân gây bệnh thán thư trên cỏ
linh lăng (Medicago sativa) trong cả điều kiện in vivo và in vitro. Trong điều kiện
nhiệt độ phòng, khi nghiên cứu tác động của dịch lọc tế bào của B. subtilis đã làm
giảm đáng kể tỷ lệ mắc bệnh và mức độ nghiêm trọng trên cỏ linh lăng từ 56% xuống
còn 16% và tương ứng từ 2,0 xuống 1,2. Trong điều kiện nghiên cứu in vitro, khi
nghiên cứu tác động của dịch lọc thô lên men của chủng B. subtilis đã làm giảm mạnh
sự nảy mầm của bào tử nấm gây bệnh. Hợp chất đã được tìm ra gây nên hiệu quả ức
chế của vi khuẩn B. subtilis lên nấm C. trifolii là kháng sinh thuộc họ iturin, iturin D
(Douville, Boland, 1992).
Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm

6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Kumar và cộng sự (2009) đã phân lập được chủng B. subtilis MTCC 8114 trong
một số mẫu đất vườn, hoạt tính vòng ức chế nấm khi thử nghiệm bằng phương pháp
cấy chấm điểm là 14- 16 mm và 22- 24 mm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
đối với nấm Microsporum fulvum và Trichophyton. Sau khi tối ưu môi trường nuôi
cấy, đã tìm ra được nguồn dinh dưỡng là dịch chiết bột đậu tương, pH 7,0, nhiệt độ

37C và thời gian lên men 48 giờ là điều kiện thích hợp cho sản xuất kháng sinh của
chủng vi khuẩn này. Phân tích dữ liệu ph FITR đã xác định hợp chất thuộc nhóm
pedtide kháng nấm, nồng độ ức chế tối thiểu MIC của kháng sinh kháng nấm là 135 -
145 µg/ml (Kumar et al., 2009).
Bệnh thán thư do nấm bệnh Colletotrichum gloeosporioides gây ra làm giảm năng
suất và chất lượng đến nhiều loại cây trồng như hồ tiêu, quất, xoài và nhiều loại cây
trồng khác, gây tn thất nặng nề đến lợi ích thương mại trên thế giới. Trong quá trình
phân lập một số chủng vi khuẩn từ đất, Kim và cộng sự (2010) đã tìm ra được chủng
B. subtilis CMB32 có tiềm năng trong việc kiểm soát chủng nấm bệnh C.
gloeosporioides, sử dụng phương pháp khối ph MALDI-TOF để phân tích, kết quả đã
cho thấy chủng B. subtilis CMB32 có khả năng sinh tng hợp ra 3 loại peptide kháng
nấm: iturin A, fengycin và surfactin A (Kim et al., 2010).
Mendizabal và cộng sự (2012) đã tìm ra chủng B. subtilis CPA-8 có năng kiểm soát
bệnh thối rễ do nấm bệnh Monilinia spp. gây ra trên cây đào. Thí nghiệm ức chế sự
tăng trưởng bằng cách sử dụng hoạt chất từ dịch nuôi cấy tế bào được chiết xuất bằng
butanol đã cho thấy kết quả ức chế mạnh đối với nấm M. laxa và M. fructicola. Hoạt
chất kháng nấm từ chủng B. subtilis CPA-8 đã được xác định là fengycin, giống
lipopeptide và có hoạt tính kháng nấm mạnh (Mendizábal et al., 2012).
Yiu-Kowk và cộng sự (2012) đã phân lập được chủng B. subtilis D1/2 từ đất canh
tác có khả năng ức chế nấm F. graminearum. Hoạt động kháng nấm của chủng vi
khuẩn này do một loại polypeptide ngoại bào và đã được xác định là fengycin. Ứng
dụng chủng vi khuẩn trên trồng ngô và lúa mì để kiểm soát bệnh thối tai và tàn rụi đầu
do nấm Fusarium gây ra, kết quả là đối với lúa mì thì bệnh tàn rụi đầu đã được kiểm
soát hoàn toàn, trên cây ngô thì bệnh thối tai đã giảm đi một nửa. Mặc dù chưa kiểm
soát được triệt để trên cây ngô, nhưng có thể thấy chủng B. subtilis D1/2 có tiềm năng
Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm

7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

rất lớn trong việc kiểm soát bệnh hại cây trồng và sản xuất chế phẩm kháng nấm (Yiu-
Kwok et al., 2012).
Theo nghiên cứu gần đây nhất, Malfnova và cộng sự (2012) khi sử dụng phương
pháp sắc k lỏng khối ph đã phát hiện tới 8 loại hợp chất polypeptide mạch vòng có
hoạt tính kháng nấm trong dịch chiết ngoại bào của chủng B. subtilis HC8. Dựa vào
thời gian lưu và khối lượng phân tử, đã xác định được các hợp chất kháng nấm này
đều thuộc 3 họ kháng sinh lớn đó là iturin, fengycin và surfactin. Trong đó thì họ
kháng sinh fengycin cho kết quả tác động mạnh nhất đến việc ức chế sự phát triển của
nấm đối kháng. B. subtilis HC8 được xác định là chủng đầu tiên có khả năng sinh tng
hợp ngoại bào cả 3 họ kháng sinh lớn, đây là chủng vi khuẩn có tiềm năng rất lớn
trong kiểm soát dịch bệnh hại cây trồng do nấm gây nên (Malfanova et al., 2012).
1.3 Nghiên cứu chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh trên thế giới
Hàng năm trên thế giới, bệnh hại cây trồng gây ra những tn thất to lớn cho sản
xuất nông nghiệp. Tính đến năm 2005 thì có khoảng 14% các khoản thiệt hại trên thế
giới hoàn toàn là từ các bệnh hại cây trồng gây ra, và hơn 50% các bệnh hại cây trồng
là do nấm gây ra với hàng tỷ euro thiệt hại mỗi năm (Agrios, 2005). Trong các loại
bệnh hại cây trồng thì bệnh do nấm Fusarium và Rhizoctonia gây ra chiếm tỉ lệ tương
đối lớn. Nấm bệnh gây bệnh chết héo mạch dẫn và bệnh thối thân, thối rễ, lở c rễ ở
nhiều loại cây rau quả và cây lương thực như lạc, cà chua, khoai tây, đậu
tương…(Kim, Chung, 2004).
Việc sử dụng ngày càng nhiều các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong nông
nghiệp sẽ ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường, dẫn đến mất cân bằng trong quần thể vi
sinh vật đất có ích, tạo môi trường bất lợi đối với các sinh vật có ích phát triển, và tạo
điều kiện để nấm bệnh, các loài côn trùng có hại kháng thuốc hơn, đồng thời cũng tiêu
diệt các loài thiên địch có ích. Dư lượng thuốc diệt nấm, thuốc trừ sâu hóa học còn lại
trên sản phẩm nông nghiệp và trên đất sẽ làm ô nhiễm vào nguồn nước ngầm, gây ra
tác hại nghiêm trọng đối với sức khỏe của người và vật nuôi. Vì vậy ở một số nước
phát triển, thuốc diệt nấm có nguồn gốc hóa học bị hạn chế hoặc cấm sử dụng
(Gerhardson, 2002).
Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm

8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Chính vì vậy, xu hướng quay trở lại nền nông nghiệp hữu cơ với việc tăng cường
sử dụng chế phẩm sinh học trong canh tác và bảo vệ cây trồng đang là xu hướng chung
của Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung. Chế phẩm sinh học trong sản xuất nông
nghiệp có nhiều ưu điểm: không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người và
vật nuôi, cân bằng sinh thái trong môi trường đất, không làm thoái hóa đất mà còn góp
phần tăng độ phì nhiêu của đất, tăng năng suất cây trồng, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả
năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các
loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học khác.
Do những nguyên nhân trên mà con người quan tâm đặc biệt tới việc nghiên cứu và
sản xuất các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh. Hiện nay trên thế giới, các
nghiên đều tập trung mạnh về hóa sinh, di truyền và bản chất của các hợp chất do vi
sinh vật tạo ra có khả năng hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của các loại vi sinh vật
có hại.
1.3.1 Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính kháng nấm
Các chủng Bacillus
Rất nhiều loài thuộc chi Bacillus đã được biết đến với khả năng sinh tng hợp đa
dạng về chức năng và cấu trúc các chất chuyển hóa thứ cấp. Việc sản xuất các chất
chuyển hóa có hoạt tính đối kháng vi sinh vật là một trong những yếu tố quyết định
đến khả năng kiểm soát các bệnh hại cây trồng. Những chất chuyển hóa có thể là hợp
chất ribosome như subtilin (Zuber et al., 1993), subtilosin A (Babasaki et al., 1985),
TasA (Stover, Driks, 1999), và sublancin (Paik et al., 1998). Các peptide kháng sinh
nhỏ không phải từ ribosome như họ surfactin: surfactin và lichenysin; họ kháng sinh
iturin : iturin A, C, D, và E, bacillomycin D, F, L, và mycosubtilin; họ kháng sinh
fengycin: fengicin và plipastatin; các aminopolyol như zwittermycin A (Sarangi et al.,
2009).
Trong chi Bacillus thì B. subtilis là loài có khả năng sinh tng hợp nhiều loại hoạt

chất có hoạt tính đối kháng vi sinh vật nhất. Loài này thườ ng tng hợp các loại peptide
kháng sinh nhỏ không phải từ ribosome (<2.000 Da) có hoạ t tính khá ng nấ m , chẳng
hạn như iturin (Stein, 2005; Christopher et al., 2011), surfactin (Carrillo et al., 2003;
Ali et al., 2010), fengycin, bacilysin (Loeffler et al., 1986; Li et al., 2012),
Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm

9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

bacillomycin (Peypoux et al., 1980), mycosubtilin (Peypoux et al., 1986), và
mycobacillin (Sengupta et al., 1971). B. subtilis hầ u như cũng sinh tổ ng hợ p ra rấ t
nhiề u loạ i protein (Moyne et al., 2004; Liu et al., 2007). Tuy nhiên , mộ t số ít trong
tổ ng số cá c loạ i protein trên đã đượ c công bố là có hoạ t tính kháng nấm.
Các chủng Pseudomonas, Burkholderia và các chủng khác
Các chủng Pseudomonas sinh tng hợp nhiều chất đối kháng sinh trưởng nấm khác
nhau. Nhiều chủng sinh tng hợp các chất kháng sinh như phenazine, 2,4-
diacetylphloroglucinol, pyrrolnitrin, pyoluteorin, hoặc siderophore. Chủng P. syringae
sinh tng hợp syringomycin, syringostatin và syringotoxin, có hoạt tính kháng nấm.
Syringomycin là các lipodepsipeptide nhỏ và trong số các peptide kháng nấm vi khuẩn
tiềm năng đã được phát hiện ra. Syringomycin-E (SE) là peptide ph biến nhất. SE diệt
nấm A. flavus, A. fumigatus, A. niger, F. moniliforme, và F. oxysporum, giá trị LD95
đạt 7,8 µg/ml đối với A. flavus và các giá trị LD95 với 1,9 µg/ml đối với các chủng
nấm khác (Segre et al., 1989; De Lucca et al., 1999).
Chủng Burkholderia là một vi sinh vật đất ph biến và rất nhiều chủng đã được
phát hiện có khả năng sinh tng hợp ra lượng lớn các chất AFC như cepacin,
altericidin, pyrrolnitrin, xylocandin (còn được gọi là cepacidine). Cepacidine là các
glycopeptide từ B. cepacia và có tác dụng cộng hưởng hơn là amphotericin B và hoạt
động kháng nhiều nấm gồm Candida sp., A. niger, Cryptococcus neoforman, và F.
oxysporum (Lee et al., 1994; Lim et al., 1994).
Chủng Streptomyces tendae có khả năng sinh tng hợp ra nikkomycin, không độc

đối với tế bào động vật có vú, là một họ của các chất kháng nấm peptidyl nucleoside.
Nikkomycin X và Z được sinh tng hợp ở nồng độ ức chế tối thiểu (MICs) 0,77 và 0,1
µg/ml, tương ứng, kháng lại Coccidiodes immitis với MIC cao hơn 8 và 30 µg/ml,
tương ứng, kháng lại Blastomyces dermatitidis (Hector et al., 1990).
1.3.2 Sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ nấm
Trên thực tế, đã có nhiều chế phẩm từ các hoạt chất vi sinh vật được thương mại
hóa. Ballad là một chế phẩm từ chủng B. pumilus QST 2808 của hãng AgraQuest, là
sản phẩm mới năm 2005, có thể sử dụng cho khoai tây, đậu tương, ngũ cốc B.
pumilus sinh tng hợp một hợp chất đường amino chống nấm mà ngăn sự hình thành
Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm

10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

của các thành tế bào mới và làm rối loạn trao đi chất tế bào, dẫn đến phá hủy tế bào
và diệt thể gây bệnh cây trồng. Ballad cũng tạo ra các rào cản vi khuẩn trên bề mặt lá,
ngăn thể gây bệnh như nấm gây rỉ sắt và mốc sương từ khi hình thành trên thực vật.
Thuốc này có ph sử dụng rộng. Được ghi vào danh sách chất kiểm soát gỉ sắt
(gồm cả gỉ sắt trên cây đậu tương châu Á), mốc sương, mốc lông tơ và bệnh bạc lá.
1.4 Nghiên cứu chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh ở Việt Nam
Ở Việt Nam, các nghiên cứu lại tập trung nhiều vào việc sản xuất các chế phẩm
phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng dùng làm thuốc bảo vệ thực vật. Hầu hết các nghiên
cứu đã thực hiện tập trung vào sản xuất các sản phẩm sinh học chứa các chủng nấm
đối kháng (chủ yếu là các chủng Trichoderma) hoặc vi khuẩn đối kháng (chứa B.
subtilis). Các chế phẩm thương mại phần lớn chứa các chủng nấm đối kháng ở dạng
phân bón.
1.4.1 Nghiên cứu các biện pháp sinh học phòng trừ nấm bệnh
Nghiên cứu biện pháp sinh học phòng chống nấm bệnh cây đã được quan tâm và
thực hiện ở một số cơ sở nghiên cứu trong nước trong những năm vừa qua: Viện Công
nghệ sinh học và Viện Sinh học nhiệt đới (Viện KH&CNVN), Viện Bảo vệ thực vật và

Viện Th nhưỡng và nông hóa (Bộ NN&PTNT), Đại học Nông lâm Tp HCM, Đại học
Cần Thơ.
Các công bố cho thấy, các nhóm vi sinh vật như Trichoderma (Trần Thị Thuần,
1997; Đào Kiều Dung, 1999; Nguyễn Kim Vân, 2003; Trần Thị Thuần et al., 2004),
Bacillus (Nguyễn Ngọc Dũng et al., 2005; Nguyễn Ngọc Dũng, Nguyễn Minh Anh,
2007; Trần Phương Thảo et al., 2007), Pseudomonas (Nguyễn Minh Anh et al., 2003;
Nguyễn Ngọc Dũng et al., 2003; Nguyễn Thị Tuyết Nhung et al., 2004; Nguyễn Thị
Tuyết Nhung et al., 2006) huỳnh quang và Serratia (Lê Thị Hồng Minh et al., 2005)
đã được phân lập, tuyển chọn và được đánh giá là những tác nhân tiềm tàng cho phát
triển các chế phẩm BCF để phòng chống nấm bệnh cây.
Việc nghiên cứu ứng dụng các vi sinh vật đối kháng nấm bệnh cây đã được thực
hiện rất sớm ở Việt Nam và đạt được những thành tựu sau: i) Sử dụng vi sinh vật đối
kháng nấm như một sinh vật chức năng trong sản xuất sinh bón hữu cơ vi sinh; ii) Các
Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm

11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

chế phẩm lên men xốp sử dụng nhóm vi nấm Trichoderma. Có vài chục công trình
nghiên cứu sử dụng các chủng nấm Trichoderma để phòng trừ nấm gây bệnh cây
trồng.
Kết quả tìm biện pháp sinh học đề phòng trừ nấm R. solani bằng cách dùng nấm
đối kháng Trichoderrna viride đã được nhóm nghiên cứu của Nguyễn Kim Vân thử
nghiệm cho thấy: Nấm T. viride có hiệu lực ức chế cao nấm R. solani trong điều kiện
phòng thí nghiệm và thí nghiệm bán đồng ruộng làm giảm mức độ thiệt hại của nấm R.
solani gây bệnh thối cải bắp (Nguyễn Kim Vân, 2003).
Có thể sử dụng chế phẩm sinh học nấm đối kháng Trichoderma viride để phòng trừ
bệnh lở c rễ hại cây trồng cạn, hiệu quả phòng trừ bệnh cao 86% (trên cây cà chua) và
78% (trên cây dưa chuột) trong điều kiện thí nghiệm chậu vại.
Nấm đối kháng Trichoderma spp. có khả năng hạn chế sự phát sinh và gây hại của

bệnh lở c rễ hại bông. Quy trình phòng trừ tng hợp bệnh lở c rễ hại bông có tác
dụng hạn chế tốt khả năng phát sinh, phát triển và gây hại của nấm R. solani trong điều
kiện vụ Đông xuân 2005/2006 tại Quảng Nam. Tỷ lệ cây chết do bệnh trên mô hình
khoảng 1% nhưng đối chứng gần 20%.
Trong điều kiện phòng thí nghiệm, một số chủng nấm Trichoderma spp. có khả
năng đối kháng tốt đối với nấm R. solani; có hiệu quả đối kháng cao đối với nấm F.
oxysporum gây bệnh trên cây bắp trên môi trường dinh dưỡng. Trong điều kiện nhà
lưới, áp dụng Trichoderma spp. (HG02 & HG04), liều lượng (10 g/kg đất) có khả năng
phòng trừ tốt bệnh đốm vằn trên cây lúa R. solani, tương tự áp dụng Trichoderma spp.
(AG01 & HG02), liều lượng (10 g/kg đất) có khả năng phòng trừ tốt bệnh chết cây con
trên bắp (R. solani).
Đặc biệt, trong những năm qua, chế phẩm Antiforhis có tác dụng phòng chống
bệnh thối rễ, lở c rễ cây trồng do nấm F. oxysporum và R. solani có nguồn gốc từ
trong đất đã được phát triển trên cơ sở sử dụng hỗn hợp các chủng P. fluorescens, P.
chlororaphis và chủng B. pumilus tại Phòng vi sinh vật học đất, Viện CNSH. Chế
phẩm đã được khảo nghiệm trên diện hẹp trong điều kiện in vivo tại Viện bảo vệ thực
vật (Bộ NN&PTNT); kết qủa cho thấy chế phẩm Antiforhis cho hiệu quả giảm bệnh
gần bằng hoặc tương đương các hóa chất diệt nấm, tuỳ theo từng chất. Kết qủa khảo
Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm

12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

nghiệm trên đồng ruộng cũng cho thấy, việc tưới chế phẩm Antiforhis đều có tác dụng
làm giảm tỷ lệ cây con và cây trồng bị chết do bệnh thối rễ trên cây dưa ăn qủa các
loại, cây cải bắp, cây cà chua và cây ớt ngọt. Hiện nay, chế phẩm Antiforhis đã được
đăng k giấy phép sử dụng.
Một vài công bố đề cập tới sản phẩm trao đi chất của tế bào có hoạt tính ức chế
sinh trưởng nấm bệnh cây, như chất iturin từ Bacillus.
Trong thời gian qua, tại Phòng vi sinh vật học đất (Viện CNSH), một số chủng vi

khuẩn thuộc nhóm Burkholderia và Chryseomonas đã được phân lập từ các mẫu vật
khác nhau ở Việt Nam. Thử khả năng đối kháng nấm F. oxysporum và R. solani của
các chủng này đã được tiến hành. Kết quả cho thấy, các chủng này có khả năng sinh
tng hợp các chất ngoại bào với hoạt lực ức chế sinh trưởng hay nẩy mầm của bào tử
nấm rất mạnh. Mặc dù vậy, các chủng này không thể sử dụng ở dạng tế bào để làm tác
nhân phòng chống nấm bệnh cây, do các nhà khoa học nhận thấy, sự tương đồng về di
truyền giữa chủng B. cepacia có nguồn gốc từ bệnh nhân và chủng có nguồn gốc từ đất
tự nhiên là 100%. Cũng vì l do này, ở Mỹ, bắt đầu từ năm 2004, tất cả các giấy phép
sử dụng các chủng B. cepacia và các sản phẩm chứa B. cepacia đều bị thu hồi. Năm
2006, hai bệnh nhân bị tử vong đầu tiên trên thế giới do nhiễm vi khuẩn
Chryseomonas ở Maroc đã được t chức Y tế thế giới thông báo. Tuy vậy, các chủng
như vậy rất có  nghĩa công nghệ sinh học bởi những đặc tính hữu ích của chúng, nếu
con người biết cách khai thác.
1.4.2 Nghiên cứu sản xuất và thương mại các chế phẩm phòng trừ nấm
Ngoài những chế phẩm sinh học đã được sản xuất hàng loạt và thương mại hóa,
hiện nay nhiều đề tài nghiên cứu và dự án vẫn đang được thực hiện để tìm ra và thử
nghiệm các chế phẩm sinh học khác có khả năng phòng trừ nấm gây hại cây trồng có
hiệu quả cao.
Khoa Nông nghiệp và sinh học ứng dụng, trường ĐH Cần Thơ đã công bố 2 chế
phẩm sinh học Biobac và Biosar để phòng trừ bệnh đốm vằn và cháy lá thường gặp
trên lúa. Biobac được sản xuất từ một chủng vi khuẩn có sẵn ở địa phương, có khả
năng tiêu diệt và ức chế sự phát triển của sợi nấm gây bệnh đốm vằn. Biosar là sản
phẩm được chiết xuất từ một số loài thực vật, có khả năng kích thích tính kháng bệnh
Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm

13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

cháy lá lúa (đạo ôn) do nấm Pyricularia gây ra. Hai chế phẩm này đều không gây ô
nhiễm môi trường. Biobac và Biosar đã được thử nghiệm trên cây lúa ở Tiền Giang,

An Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ cho kết quả tốt. Hiện các nhà khoa học đang tiếp tục
hoàn thiện sản phẩm, xây dựng quy trình công nghệ để chuyển giao cho các cơ sở sản
xuất nhằm cung ứng rộng rãi cho nông dân.
Phạm Việt Cường (Liên hiệp Khoa học sản xuất CNSH và Môi trường, Viện Công
nghệ sinh học) đã thực hiện một dự án “Hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm vi
sinh vật đối kháng phòng bệnh thối rễ cho cây cà phê, bông vải vùng miền Trung, Tây
Nguyên” với các mục tiêu: Hoàn thiện được công nghệ lên men và sản xuất chế phẩm
đối kháng tác nhân gây bệnh thối rễ trên cà phê, bông vải và một số cây trồng cạn
khác, phục vụ phát triển kinh tế xã hôi và góp phần bảo vệ nền nông nghiệp sạch bền
vững ở Miền trung Tây Nguyên; Hoàn thiện được công nghệ lên men thu nhận chế
phẩm vi sinh vật đối kháng; Sản xuất được lượng chế phẩm phục vụ 5000 ha cây bông
và cây cà phê.
Viện Công nghệ sau thu hoạch đã tạo ra chế phẩm sinh học iturin A, có hoạt tính
kháng nấm cao và ức chế sự tạo độc tố aflatoxin (một chất gây ung thư). Nghiên cứu
này được các nhà khoa học của Viện Công nghệ sau thu hoạch triển khai từ nhiều năm
nay. Kết quả, họ đã phân lập từ hệ thống vi sinh vật của đất và lá cây chủng vi khuẩn
B. subtilis 61s, có khả năng sinh iturin A với hoạt tính kháng nấm cao. Từ chủng vi
sinh vật này, tạo ra chế phẩm sinh học iturin A. Thử nghiệm trên thực tế cho thấy, chế
phẩm này có hoạt tính kháng nấm cao đối với các loại nấm sinh độc tố, nấm gây bệnh
cho thực vật như bệnh đạo ôn, bệnh khô vằn. Iturin A còn ức chế sự tạo độc tố
aflatoxin là một chất gây ung thư. Vì là một chế phẩm sinh học, nên iturin A không
gây bệnh cho người và gây ô nhiễm môi trường như các chất bảo quản hoá học khác.
Hiện tại, quy trình sản xuất chế phẩm iturin khép kín đã được các nhà khoa học nghiên
cứu thành công, có thể đưa vào sản xuất đại trà.
Theo quyết định số 49 ra ngày 27/3/2008 Bộ NN&PTNT, một số đơn vị ở Việt
Nam đã sản xuất và thương mại các chế phẩm vi sinh vật đối kháng như Trichoderma
spp với tên thương mại TRiB1 (3,2 x 10
9
bào tử/g) dùng để phòng trừ bệnh héo do
nấm Rhizoctonia, Sclerotium, Fusarium hại cà chua, khoai tây, đậu đỗ, thuốc lá, hồ

Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm

14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

tiêu do Viện bảo vệ thực vật sản xuất, Trico-ĐHCT (10
8
bào tử/g) phòng trừ bệnh
vàng lá thối rễ do F. solani hại cây có múi; chết cây con hại dưa hấu, bí đỏ, lạc, điều
do Công ty TNHH nông sản ND ĐH Cần Thơ sản xuất, chế phẩm Vi-ĐK (10
9
bào
tử/g) phòng trừ bệnh thối rễ hại sầu riêng, lở c rễ hại cà chua, chết nhanh hại tiêu do
Công ty Thuốc sát trùng Việt Nam sản xuất.
Promot Plus WP (Trichoderma spp. 5x10
7
bào tử/g) phòng trừ thối gốc, thối hạch
hại bắp cải; chết cây con hại cải thảo; Promot Plus DD (Trichoderma koningii 3x10
7

bào tử/g + Trichoderma harzianum 2x10
7
bào tử/g) phòng trừ đốm nâu, đốm xám hại
chè; thối hạch, thối gốc hại bắp cải do Doanh nghiệp Tư nhân TM Tân Quy sản xuất.
NLU-Tri (Trichoderma virens T.41, 10
9
cfu/g) phòng trừ chết rạp cây con/ cải
ngọt, dưa chuột; héo rũ trắng gốc/ cà chua do Trường ĐH Nông lâm TP Hồ Chí Minh
sản xuất.
Biobus 1.00 WP (Trichoderma viride) phòng trừ thối gốc, thối hạch, lở c rễ/ bắp

cải; héo vàng, lở c rễ, mốc sương/ cà chua, khoai tây; thối nhũn, đốm lá/ hành; thán
thư/ xoài; xì mủ/ sầu riêng; rỉ sắt, nấm hồng, thối gốc rễ, lở c rễ/ cà phê; chấm xám,
thối búp/ chè; chết nhanh, thối gốc rễ/ hồ tiêu do Công ty TNHH Nam Bắc sản xuất.
Công ty TNHH An Hưng Tường sản xuất nhiều chế phẩm Trichoderma spp. đối
kháng phòng trừ bệnh nấm cây trồng như Bio-Humaxin Sen Vàng 15DD, Bio-
Humaxin Sen Vàng 6SC, Fulhumaxin 5.15 SC, Fulhumaxin 5.65 SC, Fulhumaxin 6.15
SC.
Bio-Humaxin Sen Vàng 15DD (10% 105 cfu/ml Trichoderma spp. + 5% K-
humate) phòng trừ bệnh đạo ôn, khô vằn, lem lép hạt, vàng lá hại lúa. Bio-Humaxin
Sen Vàng 6SC (10% 105 cfu/ml Trichoderma spp. + 5% K-humate) phòng trừ nghẹt
rễ ở lúa, khoai tây, sắn, các loại cây rau, cây ăn quả, cây công nghiệp và cây hoa.
Fulhumaxin 5.15 SC (1% 10
6
cfu/ml Trichoderma spp. + 3% K-humate + 1%
fulvate + 0,05% chitosan + 0,1% vitamin B1) phòng trừ đạo ôn, khô vằn, vàng lá, lem
lép hạt/ lúa; rỉ sắt, đốm lá, phấn đen/ ngô; thối đen/ khoai lang; mốc sương, ghẻ sao,
héo rũ, héo xanh/ khoai tây; sương mai/ khoai môn; rỉ sắt, đốm lá, lở c rễ/ lạc; rỉ sắt,
thán thư, sương mai, đốm lá/ đậu tương; rỉ sắt, thán thư, sương mai/ đậu xanh.
Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm

15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Fulhumaxin 5.65 SC (1% Trichoderma spp. 10
6
cfu/ml + 3,5% K-humate + 1%
Fulvate + 0,05% chitosan + 0,1% vitamin B1) phòng trừ thối hạch, thối nhũn, sưng rễ,
lở c rễ, chết rạp cây con trên các loại cây rau và cây hoa.
Fulhumaxin 6.15 SC (1% Trichoderma spp. 10
6

cfu/ml + 4% K-humate + 1%
fulvate + 0,05% chitosan + 0,1% vitamin B1) được dùng để chống các bệnh mốc xanh,
loét, thối gốc, chảy gôm, nấm hồng, thán thư, sương mai, cháy lá, thối quả trên các loại
cây ăn quả và cây công nghiệp.
Trung tâm Công nghệ sinh học Tp HCM đã nghiên cứu và sản xuất thành công chế
phẩm sinh học BIMA chứa vi nấm Trichoderma 5x10
6
bào tử/gam là loại nấm đối
kháng có tác dụng cao trong việc thúc đẩy quá trình phân huỷ chất hữu cơ và có nhiều
tác dụng, được dùng cho các loại cây trồng chống được các loại nấm bệnh cây trồng
gây bệnh thối rễ, chết yểu, xì mủ (R. solani, F. solani, Phytophtora, Sclerotium rolfsii).
Như vậy trên thị trường Việt Nam, các loại sản phẩm sinh học phòng trừ bệnh nấm
R. solani và Fusarium chủ yếu là các sản phẩm có chứa nấm đối kháng. Tất cả các sản
phẩm này đều chứa chủng nấm Trichoderma. Các nghiên cứu phòng trừ nấm bệnh cây
bằng các tác nhân sinh học đã được hình thành và phát triển ở Việt Nam tuy nhiên vẫn
còn nhiều hạn chế.
Các sản phẩm này chỉ mới dừng lại ở mức độ sử dụng tế bào vi sinh vật sống làm
tác nhân ức chế sinh trưởng của nấm bệnh có nguồn gốc từ trong đất. Nghĩa là các sản
phẩm này có thời gian hữu hiệu ngắn, không quá 12 tháng và chỉ có tác dụng phòng
trừ những nấm bệnh cây có nguồn gốc từ trong đất. Mặc dù tác dụng phòng trừ nấm
bệnh cây có nguồn gốc từ không khí của các sản phẩm vừa nêu chưa được đề cập tới,
nhưng chắc chắn hiệu quả của chúng sẽ không cao, vì sự tồn tại trên bề mặt lá, hoa,
quả của tế bào sống gặp ít điều kiện thuận lợi hơn so với điều kiện vùng rễ cây trồng
(tác động trực tiếp của ánh sáng mặt trời, độ ẩm thấp, gió lớn).
Một hạn chế khác của các sản phẩm sử dụng tế bào là không thể sử dụng những
chủng vi sinh vật có khả năng ức chế rất mạnh sinh trưởng của nấm bệnh cây, nhưng
mang nguy cơ gây bệnh rất lớn cho con người, chẳng hạn như các chủng thuộc loài vi
khuẩn B. cepacia. Cuối cùng vấn đề không gian, nghĩa là chúng đòi hỏi phải có chỗ để
chứa lớn hơn, trọng lượng chế phẩm lớn hơn vì các sản phẩm (dạng giá thể xốp hay
Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm

16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

dạng lỏng) còn ở thể thô sơ, mang theo nhiều giá thể, kèm theo đó giá thành vận
chuyển sẽ gia tăng.
Để đáp ứng mở rộng phạm vi ứng dụng chế phẩm sinh học diệt nấm, gia tăng thời
gian bảo quản, giảm thiểu về không gian và khai thác tối đa tài nguyên vi sinh vật đối
kháng nấm bệnh cây, phát triển sản phẩm sinh hóa phòng chống nấm bệnh cây là một
đòi hỏi tất yếu. Có một sản phẩm sinh hóa như vậy còn cho phép mở rộng diện ứng
dụng bảo quản nông sản sau thu hoạch và xuất khẩu. Xa hơn nữa, một sản phẩm sinh
hóa đạt độ tinh sạch cao cho phép nghĩ tới sử dụng làm thuốc điều trị bệnh cho con
người do nhiễm trùng nấm.
Luận văn thạc sỹ Sinh học thực nghiệm

17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Vật liệu và hóa chất
2.1.1 Chủng giống
Chủng vi khuẩn B. subtilis XL62 được phân lập ở Việt Nam và đăng k trên
GenBank với mã số FJ465166; Chủng nấm bệnh F. oxysporum và R. solani từ bộ sưu
tập giống của Phòng Bệnh cây, Viện Bảo vệ thực vật, Từ Liêm, Hà Nội cung cấp.
2.1.2 Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết. Các hóa chất như:
DEAE (Heldelberg, Đức), SDS (Sigma, Mỹ), APS, TEMED, D-glucose (Merck, Đức),
màng lọc Minisart (Biotech, Việt Nam), agar (Việ t Nam), cao nấm men, peptone được
mua từ ICN (Mỹ). Một số nguyên liệu dùng thay thế nguồn carbon và nitơ như tinh bột
khoai tây, bột đậu tương được mua ở ngoà i thị trườ ng (Việt Nam).

2.1.3 Các loại đệm và dung dịch
Các loại đệm và dung dịch sử dụng trong thí nghiệm được pha theo các bài báo đã
công bố có thành phần và nồng độ được tóm tắt ở bảng 2.1.
Bng 2.1. Thành phần các loại đệm và dung dịch
Đệm/dung dịch
Thành phần, nồng độ
Dung dịch Bradford stock
100 ml 95% ethanol, 350 mg serva blue G, 200
ml 88% phosphoric acid
Dung dịch Bradford working
425 ml H
2
O, 15 ml 95% ethanol, 30 nl 88%
phosphoric acid, 30 ml dung dịch bradford gốc
Dung dịch nhuộm PAGE
0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue, 30%
(v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid
Dung dịch tẩy PAGE
30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid
Đệm điện di protein
20 mM Tris-HCl, 192 mM glycine, 0,1% SDS,
pH 8,8
Dung dịch A
Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8
Dung dịch B
Đệm 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8
Dung dịch C
30% acrylamide, 0,8% bis-acrylamide
Dung dịch D
10 % SDS

Dung dịch APS
10% ammonium persulfate