Nghiên cứu thu nhận, xác định đặc tính lignin peroxydase từ chủng aspergillus flavus và ứng dụng nâng cao chất lượng bột giấy bao gói

NGUYỄN THANH HẢO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

NGUYỄN THANH HẢO

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU THU NHẬN, XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH
LIGNIN PEROXYDASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS
FLAVUS VÀ ỨNG DỤNG NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG BỘT
GIẤY BAO GÓI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – 2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------------NGUYỄN THANH HẢO

NGHIÊN CỨU THU NHẬN, XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH
LIGNIN PEROXYDASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS FLAVUS VÀ
ỨNG DỤNG NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG BỘT GIẤY BAO GÓI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS.ĐẶNG THỊ THU

Hà Nội – 2011


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã
nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của các thầy cơ giáo, gia đình và
bạn bè.
Trước hết, tơi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. ĐẶNG THỊ THU Phịng Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học- Công nghệ
thực phẩm- Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã tận tình định hướng, hướng dẫn,
truyền cho tơi niềm đam mê nghiên cứu trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Quang Diễn, Bộ môn công nghệ xenluloza và
giấy, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội_người đã thiết kế và hướng dẫn tơi trong thí
nghiệm ứng dụng enzym trong xử lý bột giấy.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị nghiên cứu sinh, và
các bạn học viên, sinh viên phịng thí nghiệm hóa sinh và sinh học phân tử đã nhiệt
tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong q trình học tập và thực hiện
luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè và người
thân đã động viên, khuyến khích giúp tơi vượt qua những khó khăn trong suốt q trình
nghiên cứu.
Hà Nơi, ngày 30 tháng 09 năm 2011

Nguyễn Thanh Hảo

Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu luận văn khoa học của tôi. Các
kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực, các số liệu, tính tốn được là
hồn tồn chính xác và chưa được cơng bố trong bất kỳ các cơng trình nghiên cứu nào.
Mọi dữ liệu, hình ảnh, biểu đồ và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được
thu thập và sử dụng nguồn dữ liệu mở hoặc được trích dẫn rõ nguồn gốc.
Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm với sự cam đoan trên.
Hà Nội, ngày 30 tháng 09 năm 2011

Nguyễn Thanh Hảo


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A0: Anxtron (1A0= 10-10m)
CcP: Cytochrome c peroxydase
Da : Dalton (1Da= 6,17x10-24g)
kDa : kilo Dalton
LiP: Lignin peroxidase
MnP: Mangan Peroxydase
pI: Isoelectric point
FA: Ferulic Acid

PDA: Potato Dextro Agar
DDT: 1,1,1-trichloro-2,2-bis4-chlorophenylethane
PCP: Pentachlorophenol
VA: Veratryl alcohol
BOD: Biochemical oxygen Demand
COD: Chemical Oxygen Demand
WRF: white rot fungi (Nấm mục trắng)
w/v: weight/volume
v/v: volume/volume

 
 
 

i


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 
PHẦN I: TỔNG QUAN .................................................................................................. 2 
1.1.  Các Enzym Oxy hóa Lignin...................................................................................... 4 
1.1.1. 

Laccase [EC 1.10.3.2] ........................................................................................... 4 

1.1.2. 

Manganese peroxidase (MnP) [EC. 1.11.1.13] ..................................................... 6 

1.1.3. 

Lignin peroxidase (LiP) [EC. 1.11.1.14]............................................................... 7 

1.1.3.1.

Cấu tạo lignin peroxidase (LiP) [EC. 1.11.1.14] ...................................................... 8

1.1.3.2.

Tính chất của LiP.................................................................................................... 11

1.1.3.3.

Cơ chế phản ứng của LiP........................................................................................ 17

1.1.3.4.

Nguồn thu LiP ........................................................................................................ 18

1.1.3.5.

Các yếu tố ảnh hưởng tới điều kiện nuôi sinh tổng hợp LiP .................................. 20

1.1.3.6.

Ứng dụng của LiP................................................................................................... 24 

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 29 
2.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................................... 29 
2.1.1. Chủng vi sinh vật .................................................................................................... 29 
2.1.2. Bột giấy ................................................................................................................... 29 
2.1.3. Hóa chất .................................................................................................................. 29 
2.1.4. Thiết bị .................................................................................................................... 29 
2.1.5. Môi trường nghiên cứu............................................................................................ 30 
2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................................. 31 
2.2.1. Phương pháp vi sinh vật.......................................................................................... 31 
2.2.2. Định tên chủng SBC4-5 bằng phương pháp quan sát đặc điểm hình thái............... 32 
2.2.3. Tối ưu hóa điều kiện ni cấy bằng quy hoạch thực nghiệm ................................. 32 
2.2.4. Phương pháp hóa sinh ............................................................................................ 34 
2.2.4.1. Xác định hoạt độ LiP ..................................................................................................... 34
2.2.4.2. Thu chế phẩm LiP kỹ thuật bằng phương pháp lọc cut off ........................................... 34
2.2.4.3. Xác định protein tổng số theo phương pháp Lowry ...................................................... 35
2.2.4.4. Điện di Protein trên gel SDS-PAGE.............................................................................. 36

2.2.5. Phương pháp hóa học .............................................................................................. 37 

ii


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

2.2.5.1. Phương pháp xử lý bột giấy bằng enzym ...................................................................... 37
2.2.5.2. Xác định hàm lượng lignin bằng phương pháp Komarov, 1998 ................................... 37

2.2.5.3. Xác định độ khô tuyệt đối ............................................................................................. 38
2.2.5.4. Xác định độ trắng .......................................................................................................... 39

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................... 40 
3.1. Tuyển chọn nấm mốc sinh tổng hợp LiP cao............................................................. 40 
3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni sinh tổng hợp LiP từ
Aspergillus flavus ................................................................................................................. 42 
3.2.1. Ảnh hưởng của chế độ nuôi : tĩnh và lắc................................................................. 42 
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ Tween 80 ......................................................................... 42 
3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ Veratryl Alcohol.............................................................. 43 
3.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ Ammonium Tartrate (nguồn N) ...................................... 44 
3.2.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống ............................................................................... 45 
3.2.6. Ảnh hưởng của nồng độ Glucose ( nguồn C).......................................................... 46 
3.2.7. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy .......................................................................... 47 
3.3. Tối ưu hóa điều kiện ni Aspergillus flavus sinh tổng hợp LiP theo chương
trình phần mềm Design Expert 7 (DX7) .......................................................................... 48 
3.3.1. Xây dựng mơ hình thực nghiệm.............................................................................. 48 
3.3.2. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp LiP.................................................................. 52 
3.3.3. Kiểm tra tính chính xác của phương trình tối ưu .................................................... 53 
3.4. Khảo sát động thái quá trình lên men sinh tổng hợp LiP từ chủng nấm mốc
Aspergillus flavus ................................................................................................................. 54 
3.5. Thu chế phẩm enzym kỹ thuật bằng phương pháp lọc cut off 10kDa .................... 55 
3.6. Một số đặc tính của LiP kỹ thuật................................................................................ 56 
3.6.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính LiP ..................................................................... 56 
3.6.1.1. pH tối ưu của LiP........................................................................................................... 56
3.6.1.2. Khảo sát tính bền pH của LiP........................................................................................ 57

3.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính LiP ............................................................. 58 
3.6.2.1. Nhiệt độ tối ưu của LiP.................................................................................................. 58
3.6.2.2. Khảo sát tính bền nhiệt độ của LiP................................................................................ 58

3.7. Ứng dụng của LiP trong xử lý bột giấy:..................................................................... 59 
3.7.1. Ảnh hưởng của nồng độ LiP tới hiệu quả giảm Lignin trong bột giấy. .................. 59 

iii


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

3.7.2. Ảnh hưởng của nồng độ bột giấy tới hiệu quả giảm Lignin trong xử lý bột giấy... 61 
3.7.3. Ảnh hưởng của thời gian xử lý LiP tới hiệu quả giảm Lignin ................................ 62 
3.7.4. Tính chất cơ lý của bột giấy sau xử lý LiP.............................................................. 62 
3.7.5. Xác định mức giảm hóa chất trong quá trình tẩy trắng sử dụng LiP ...................... 64 

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................... 65 
4.1. KẾT LUẬN ................................................................................................................... 65 
4.2. KIẾN NGHỊ .................................................................................................................. 65 

PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 66 
TÀI LIỆU TIẾNG ANH ..................................................................................................... 66 
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT .................................................................................................... 72 

PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 73 

iv


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

BẢNG 1.1. Khối lượng phân tử và số lượng isozym LiP từ một số chủng nấm mốc ..................... 9 
BẢNG 1.2. Nhiệt độ và pH tối ưu của một số chủng nấm bậc cao ................................................ 15 
BẢNG 1.3. pI của một số chủng nấm bậc cao ................................................................................. 16 
BẢNG 1.4. Km và Vmax của LiP từ chủng Phanerochaete chrysosporium .................................. 16 
BẢNG 2.1.Các biến số và khoảng chạy của chúng ......................................................................... 33 
BẢNG 2.2. Ma trận thực nghiệm..................................................................................................... 33 
BẢNG 3.1. Tuyển chọn nấm mốc sinh tổng hợp LiP cao ............................................................... 40 
BẢNG 3.2. Các yếu tố ảnh hưởng nghiên cứu ................................................................................ 48 
BẢNG 3.3. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ............................................................................. 49 
BẢNG 3.4. Phân tích phương sai ANOVA của mơ hình ................................................................ 50 
BẢNG 3.5. Kết quả kiểm chứng ...................................................................................................... 53 
BẢNG 3.6. Tinh chế LiP từ Aspergillus flavus ............................................................................... 55 
BẢNG 3.7. Tính chất cơ lý học của bột giấy (Độ nghiền 500SR, định lượng 110g/m2) ................. 63 
BẢNG 3.8. Độ trắng của mẫu bột thân cây ngơ giảm hóa chất...................................................... 64 

v


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

HÌNH 1.1. Thành phần của các vật liệu Lignocellulose .................................................................. 2 
HÌNH 1.2. Cấu trúc hóa học của lignin ........................................................................................... 3 
HÌNH 1.3. Các tiểu phần cấu tạo nên phân tử lignin. ...................................................................... 3 
HÌNH 1.4. Cơ chế oxy hóa các tiểu phần phenol của lignin bởi laccase ........................................ 5 
HÌNH 1.5. Cơ chế oxy hóa các tiểu phần (non-phenolic)của lignin bởi laccase ............................ 6 
HÌNH 1.6. Chu trình xúc tác của manganese peroxidase ............................................................... 7 
HÌNH 1.7. Cấu trúc 3-D của LiP...................................................................................................... 8 
HÌNH 1.8. Phân bố điện tích trên bề mặt phân tử của LiP415......................................................... 13 
HÌNH 1.9. Chu kỳ xúc tác của LiP từ Phanerochaete chrysosporium ........................................... 17 
HÌNH 1.10. Chu trình oxy hóa các hợp chất vịng thơm của LiP .................................................... 18 
HÌNH 1.11. Chu trình oxy hóa liên kết aryl (Ar) của LiP ............................................................. 18 
HÌNH 2.1. Đường chuẩn Lowry ...................................................................................................... 36 
HÌNH 3.1. Đặc điểm hình thái của chủng SBC4-5 (Aspergillus flavus Link) ................................. 41 
HÌNH 3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi đến khả năng sinh tổng hợp LiP ................................... 42 
HÌNH 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ Tween80 đến khả năng sinh tổng hợp LiP ............................. 43 
HÌNH 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ V.A đến khả năng sinh tổng hợp LiP ..................................... 44 
HÌNH 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ Ammonium tartrate đến khả năng sinh tổng hợp LiP ............ 44 
HÌNH 3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến khả năng sinh tổng hợp LiP .................................. 45 
HÌNH 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ Glucose đến khả năng sinh tổng hợp LiP ............................... 46 
HÌNH 3.8. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp LiP ............................. 47 
HÌNH 3.9. Bề mặt đáp ứng của hoạt độ LiP .................................................................................... 52 
HÌNH 3.10. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu để biểu hiện LiP...................................................... 52 
HÌNH 3.11. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp LiP ........................................................... 54 
HÌNH 3.12. Điện di LiP ................................................................................................................... 56 
HÌNH 3.13. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ LiP............................................................................. 57 
HÌNH 3.14. Khảo sát tính bền pH của LiP ...................................................................................... 57 
HÌNH 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ LiP..................................................................... 58 

HÌNH 3.16. Khảo sát tính bền nhiệt của LiP ................................................................................... 59 
HÌNH 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ LiP tới hiệu quả giảm Lignin của bột giấy ........................... 60 
HÌNH 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ bột giấy tới hiệu quả giảm Lignin ........................................ 61 

vi


Luận văn thạc sỹ khoa học

Cơng nghệ sinh học

HÌNH 3.19. Ảnh hưởng của thời gian xử lý tới hiệu quả giảm Lignin........................................... 62 
HÌNH 3.20. Cấu trúc xơ sợi bột gỗ quan sát trên kính hiển vi điện tử quét .................................... 63 

vii


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

MỞ ĐẦU
Lignin peroxidase [EC 1.11.1.14] (LiP) là một loại enzym ngoại bào (Gold
and Alic, 1993). Họ LiP có chứa nhiều isozym, các isozym khác nhau đối với từng
chủng nấm về điều kiện nuôi cấy, khối lượng phân tử, điểm đẳng điện... LiP có thể
oxy hố các hợp chất lignin và liên quan đến lignin, như là phân cắt liên kết Carbon
α – Carbon β, liên kết aryl - carbon α, mở vòng thơm và dimethoxyl hoá. [39]
LiP được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp bao gồm công nghiệp tẩy
trắng giấy, tẩy màu của các thuốc nhuộm vải và loại bỏ các hợp chất phenol, hợp
chất đa vịng thơm. LiP cịn có tiềm năng làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường như

giảm poly-clo biphenyl (Joshi và Gold, 1993), poly- hydrocarbon thơm (Hofrichter
et at, 1998; Wolter. et at., 1997), thuốc nhuộm trong nước thải (Mc-Mullan et at,
2001; Stolz, 2001) và xử lý COD/BOD cao có trong chất thải giàu phenol [4].
Ngồi ra, LiP cịn ứng dụng trong nơng nghiệp như xử lý và phân tích nhanh dư
lượng các loại thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ có họ phenol (Kroschwitz, 1993;
Syracuse nghiên cứu Corp, 1992).
Chính vì tầm quan trọng và khả năng ứng dụng trên của của LiP, chúng tôi
đã tiến hành nghiên cứu đề tài :
“Nghiên cứu thu nhận, xác định đặc tính lignin peroxydase từ chủng Aspergillus
flavus và ứng dụng nâng cao chất lượng bột giấy bao gói”
Nội dung nghiên cứu gồm:
- Tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt độ LiP cao.
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp LiP (môi trường dinh
dưỡng: chất cảm ứng, nguồn Nitơ, nguồn Cacbon).
- Tối ưu hóa điệu kiện sinh tổng hợp LiP.
- Khảo sát động thái quá trình lên men sinh tổng hợp LiP.
- Thu chế phẩm kỹ thuật và nghiên cứu một vài đặc tính của LiP.
- Ứng dụng của LiP nhằm nâng cao chất lượng bột giấy bao gói.

Nguyễn Thanh Hảo

1

CB 090703


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

PHẦN I: TỔNG QUAN
Lignin là những hợp chất cao phân tử rất phức tạp, chiếm khoảng 15 - 25%
các vật liệu lignocellulose. Lignin được tìm thấy trong thành tế bào gỗ, trong một
phức hợp với cellulose, hemicellulose và pectin, liên kết cộng hóa trị với
hemicellulose, làm cho các polysaccharid kết hợp với nhau, tạo độ cứng cơ học cho
thành tế bào và cho cả thân cây. Chính sự sắp xếp và kết cấu của lignin quyết định
cấu trúc sợi của cây và ảnh hưởng đến tính chất của gỗ như màu sắc, độ bền, khả
năng chống mục và thậm chí cả mùi hương [53].

HÌNH 1.1. Thành phần của các vật liệu Lignocellulose

Lignin khơng bị phân hủy bởi enzym của động vật nói chung mà chỉ chịu tác
động của enzym do một số loài nấm và vi sinh vật sinh ra. Tuy vậy, lignin tham gia
vào cơ chế bảo vệ cây nhờ liên kết ngang với các thành phần khác của thành tế bào,
bằng cách hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzym của vi sinh vật với cellulose và
hemicellulose.

Nguyễn Thanh Hảo

2

CB 090703


Luận văn thạc sỹ khoa học

Cơng nghệ sinh học

HÌNH 1.2. Cấu trúc hóa học của lignin [13]

Lignin là hợp chất cấu trúc bậc 3 của vòng thơm polyphenol, bao gồm các
đơn phân phenylpropan, dẫn xuất của p-hydroxycinnamyl alcohol được dimethoxyl
hóa (syringyl), monomethoxyl hóa (guaiacyl) hoặc khơng được methoxyl hóa (phydroxyphenyl). Chúng được tích hợp vào lignin dưới dạng p-hydroxyphenyl
phenylpropan (ký hiệu là H), guaiacyl phenylpropan (ký hiệu là G) và syringal
phenylpropanoit (ký hiệu là S). Tùy theo từng loài thực vật mà tỷ lệ ba thành phần
này trong lignin khác nhau. Lignin là polyme của các phenyl propanoid phức tạp,
được cấu trúc từ ba loại rượu thơm: p-coumaryl, conifery và sinapyl, được gắn với
nhau bằng ít nhất 12 kiểu liên kết, ví dụ C-C, C-O-C, trong đó các kiểu liên kết arylglycol, aryl-aryl hoặc liên kết diaryl-este là phổ biến. Lignin tự nhiên có khối lượng
phân tử được ước tính khoảng 15.000 Da hoặc cao hơn [13].

HÌNH 1.3. Các tiểu phần cấu tạo nên phân tử lignin.

Nguyễn Thanh Hảo

3

CB 090703


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

Hầu hết các lignin bị phá hủy bởi các loại nấm mục trắng như Phanerochaete
chrysosporium, Phlebia radiata, Trametes versicolor, Bjerkandera adusta,
Chrysonilia sitophila thuộc loài nấm đảm basidiomycetes (Kirk & Farrell 1987;
Blanchette 1991), và một số trong đó là ascomycetes (Duran et al. 1987) hoặc
actinomycetes, như Streptomyces badius và Streptomyces flavovirens (Crawford et
al 1983;. Ramachandra et al. 1988). Trong nấm, phân huỷ sinh học lignin là một hệ
enzym. Các enzym phân hủy lignin (ligninolytic) bao gồm chủ yếu là lignin

peroxidase, manganese peroxidase và laccase [22]

1.1. Các Enzym Oxy hóa Lignin
1.1.1. Laccase [EC 1.10.3.2]
Laccase là một polyphenol oxidase chứa nguyên tử đồng trong trung tâm xúc
tác. Laccase có khả năng xúc tác phản ứng chuyển hóa hợp chất phenol thành các
gốc quinin và sau đó oxy hóa chúng thành quinon, phản ứng oxy hóa gắn liền với sự
khử phân tử oxy tạo thành nước. Ngoài ra laccase liên kết với các chất nhận điện tử
trung gian (mediator) có khả năng oxy hóa các hợp chất khơng có bản chất là
phenol (non-phenol). Laccase có khối lượng phân tử từ 60-80 kDa, tuy nhiên vẫn có
một vài ngoại lệ như laccase từ Monocilium indicum có khối lượng phân tử 100 kDa,
từ Agaricus biporus 100 kDa và Aspergillus nidulans có khối lượng phân tử 110 kDa.
Laccase tác dụng vào tiểu phần phenol của lignin dẫn đến sự oxy hóa của Cα,
cắt liên kết Cα-Cβ và liên kết aryl-alkyl. Laccase có khả năng khử một phân tử oxy
tạo thành hai phân tử nước trong khi thực hiện sự oxy hóa các hợp chất thơm như
polyphenol, methoxyl- substituted và các amin thơm. Q trình oxy hóa một điện tử
này dẫn đến việc hình thành gốc tự do ở vị trí oxy trung tâm, sau đó tiếp tục được
chuyển hóa thành quinon dưới sự xúc tác của laccase. Quinon và các gốc tự do có thể
tiếp tục q trình polyme hóa (hình 1.4).

Nguyễn Thanh Hảo

4

CB 090703


Luận văn thạc sỹ khoa học

Cơng nghệ sinh học

HÌNH 1.4. Cơ chế oxy hóa các tiểu phần phenol của lignin bởi laccase [40]

Cho đến năm 1990, laccase mới chỉ được biết đến với vai trò phân giải các hợp
chất phenol của lignin. Nhưng hiện nay các nhà khoa học đã nhận thấy dải cơ chất
của laccase có thể mở rộng đối với các tiểu phần khác khơng có bản chất phenol của
lignin (non-phenolic) khi có mặt chất trung gian (mediator) thích hợp. Các chất trung
gian thường là chất màu 2,2’-azino-bis 3-etylthiazolin-6 sunfonat (ABTS), guaiacol,
syringaldazine. ABTS, guaiacol, syringaldazine đóng vai trị là chất vận chuyển điện
tử trung gian và nó có khả năng oxy hóa các tiểu phần khơng có bản chất phenol
(non-phenolic) [40].
Cơ chế xúc tác của hệ thống laccase - mediator bắt đầu bằng việc laccase oxy
hóa chất trung gian, chuyển chất trung gian về dạng oxy hóa; sau đó các hợp chất
trung gian đã được oxy hóa tiếp tục thực hiện phản ứng oxy hóa khử với cơ chất tạo
sản phẩm (hình 1.5).
Nói chung laccase thường hoạt động phối hợp với các enzym khác, làm tăng
hiệu quả của quá trình phân giải. Các nghiên cứu vẫn đang được tiếp tục tiến hành để
làm sáng tỏ vai trò của laccase trong quá trình phân giải này, đặc biệt là trong quá
trình phân giải lignin. Sử dụng laccase đơn giản hơn so với peroxidase do laccase oxy
hóa các cơ chất chỉ kèm theo sự khử oxy (vốn có sẵn trong môi trường) thành nước,
khác với các peroxidase cần tới sự có mặt của các cofactor (như H2O2).
Nguyễn Thanh Hảo

5

CB 090703


Luận văn thạc sỹ khoa học

Cơng nghệ sinh học

HÌNH 1.5. Cơ chế oxy hóa các tiểu phần khơng có bản chất phenol (non-phenolic) của
lignin bởi laccase và ABTS[40]

1.1.2. Manganese peroxidase (MnP) [EC. 1.11.1.13]
MnP hoạt động như một phenoloxydase trên cơ chất phenolic bằng cách sử
dụng Mn3+/Mn2+ làm cặp oxy hoá khử trung gian. Nhiệm vụ chính của MnP là tham
gia vào phản ứng oxy hoá hợp chất phenol cũng như cấu trúc phenolic của lignin (có
- OH phenol tự do). MnP tấn cơng trực tiếp vào cấu trúc vịng thơm lignin, chuyển
hóa thành những gốc có trọng lượng phân tử thấp theo con đường oxy hóa khử Mn
gián tiếp [4]. Cơ chế xúc tác của MnP:
MnP + H2O2

MnPI + H2O

MnPI + Mn2+

MnPII + Mn3+

MnPI + R

MnPII + R+.

MnPII + Mn2+

MnP + Mn3+ + H2O

Mn3+ + R

Mn2+ + R+.

MnP được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy P.chrysosporium (Kuwahara và
cộng sự ,1984). MnP xuất hiện sớm hơn LiP khi nuôi cấy P.chrysosporium và có
nhiều nghiên cứu cho rằng đây là enzym chính trong hệ enzym phân hủy lignin. MnP
có thể oxy hóa các phần cấu trúc phenolic, như vậy nếu điều kiện thuận lợi MnP phối
hợp với LiP hình thành hệ enzym hoạt tính cao, có thể phân hủy vật liệu gỗ và phi gỗ
giàu lignin.

Nguyễn Thanh Hảo

6

CB 090703


Luận văn thạc sỹ khoa học

Cơng nghệ sinh học

MnP có trọng lượng phân tử khoảng từ 40 - 48 kDa và có điểm đẳng điện pI
2,9-7,0. Ngồi P. chrysosporium, MnP cịn được tìm thấy trong nấm mục trắng khác
T. versicolor, P. radiata, Ceriporiopsis cubvermis, Agarious bisporus, Nematoloma
frowadic.

HÌNH 1.6. Chu trình xúc tác của manganese peroxidase [4]

1.1.3. Lignin peroxidase (LiP) [EC. 1.11.1.14]
Lignin peroxidase là enzym thực hiện xúc tác các quá trình oxi hóa khác nhau
trong mối liên kết aryl của phức hợp lignin, cắt mối liên kết Cα-Cβ của nhánh bên

lignin, thực hiện oxi hóa VA và các cấu trúc tương tự tạo thành andehyt và ceton,
phân cắt mối liên kết intradiol của cấu trúc phenylglycol và hydro hóa nhóm benzylic
metylen. LiP lần đầu tiên được tìm thấy trong mơi trường ni cấy P. chrysosporium.
Hiện nay có thể tìm thấy enzym này trong một số loài nấm mục trắng khác như
Phlebia radiate, Phlebia tremellose, Trametes versicolor và xạ khuẩn Streptomyces
viridosporus, Thermomonospora fusca…
Sự hoạt động của LiP cần phải có sự tham gia của (H2O2) sinh ra từ các enzym
khác, ngoài ra cịn tìm thấy khả năng này với veratryl alcohol (VA), axit phenolic.
LiP phản ứng với cơ chất qua hai giai đoạn oxy hóa kế tiếp chuyển dịch một điện tử,
hình thành cation - gốc tự do trung gian. Do thế oxy hóa khử cao, LiP cũng có thể
oxy hóa đơn vị mắt xích của lignin là phenyl propan ở dạng phi phenolic.

Nguyễn Thanh Hảo

7

CB 090703


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

1.1.3.1. Cấu tạo lignin peroxydase (LiP) [EC. 1.11.1.14]

¾ Cấu trúc khơng gian của LiP
LiP có dạng hình cầu, với kích thước khoảng 50x40x40 A0. Phân tử LiP đơn
phân bao gồm 8 chuỗi xoắn lớn là A, B, D, F, G, H, I và N và 8 chuỗi xoắn nhỏ là
C, E, K, L, M, O, P và Q. Cấu trúc liên kết tổng thể của các Protein ở nhân bao gồm
từ 15 đến 275 gốc tự do hợp thành về cơ bản giống như CcP (cytochrome c

peroxidase) mặc dù ở mức độ tương đồng thấp hơn. Độ chênh lệch tổng thể của
nguyên tử Cα của LiP và CcP là 1.78 A0. LiP có thêm một đoạn peptide dài hơn
khoảng 50axit amin so với CcP. Đoạn peptide này có cấu trúc thứ cấp. Có 8 gốc
cystein tạo nên các cầu đi sunfit, mỗi cầu nối đầu C kết thúc của chuỗi peptide với
nhân của protein thông qua các gốc tự do từ 249 đến 317. LiP có hai điểm gắn kết
Canxi. LiP là một glycoprotein, có trình tự thống nhất là Asn-Gln-Ser ở đầu Nglycosyl hóa, [7], [25]; chủ yếu là đường mannose, glucose và N-Acetyl mannose
[28]. Thành phần carbohydrate của LiP chiếm 10 đến 45% trọng lượng phân tử so
với protein, và khoảng 15 đến 20% so với nấm mốc.

HÌNH 1.7. Cấu trúc 3-D của LiP
(Cấu trúc không gian được mô tả với xoắn màu xanh, 2ion Ca2+ màu tím, cầu đi sunfit màu
vàng, 4 nguyên tử đường, Tryptophan 171 và heme)

Nguyễn Thanh Hảo

8

CB 090703


Luận văn thạc sỹ khoa học

Cơng nghệ sinh học

¾ Khối lượng phân tử, số lượng isozym của lignin peroxydase
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng mỗi loài nấm mốc riêng biệt có thể cho nhiều
loại isozym LiP với khối lượng phân tử khác nhau (bảng 1.1).
BẢNG 1.1. Khối lượng phân tử và số lượng isozym LiP từ một số chủng nấm mốc

Số

lượng
Isozym

Khối lượng
phân tử
(kDa)

Tài liệu tham khảo

1

37

Miki và cộng sự, 2006 [52]

16

41 – 43

Johnhansson và Nyman [23]

1

42

Yadav và cộng sự, 2009 [33]

Phanerochaete
chrysosporium

H1, H2
H6
H7, H8
H10

38
43
42
46

Ming Tien và cộng sự, 1988
[36]

Aspergillus terreus

3

22 – 24

Aspergillus flavus

1
H2

40
43

H3

46

H4
LIG-I
LIG-II
LIG-III

47
68
50
47

Chủng
Trametes cervina
Trametes versicolor
chủng PRL 572
Gloeophyllum
sepiarium

Junghuhnia
separabilima

Chrysonilia sitophila

Kanayama và cộng sự, 2002
[26]
K.piontek và cộng sự, 2001 [25]
Vares và cộng sự, 1992 [48]

Ferret và cộng sự, 1992 [14]

Các isozym của Phanerochaete chrysosporium được mã hố bởi một họ các
gen có mối quan hệ gần nhau gọi là các gen lip. Mỗi gen lip đặc trưng cho một
protein từ 343 – 345 axit amin được khởi đầu bằng một trình tự dẫn khoảng 27 – 28
axit amin. Các protein được mã hố có trọng lượng phân tử khoảng 36.360 – 36.607
Da. Các khu vực mã hóa của gen lip ở P.chrysosporium BKMF-1767 bị phân cắt
bởi từ 8 đến 9 đoạn intron tương đối nhỏ khác nhau, có kích thước khoảng 50- 63bp
.Vùng mã hoá của những gen lip chứa khoảng 60-65% G + C cịn vùng khơng mã

Nguyễn Thanh Hảo

9

CB 090703


Luận văn thạc sỹ khoa học

Cơng nghệ sinh học

hố thì chứa khoảng 44-49% G+C [41]. Số lượng isozym là khác nhau giữa các loài
và ngay cả trong cùng một loài. Sự thay đổi điều kiện trong q trình ni cấy sinh
tổng hợp LiP có thể cho những isozym khác nhau của cùng một chủng nấm mốc.
Các isozym có thể khác nhau rõ rệt về độ bền pH, bền nhiệt độ, pH tối ưu và nhiệt
độ tối ưu, ái lực với cơ chất. Ngồi ra, giữa các isozym có thể khác nhau về tính
chất vật lý, mức độ glycosyl hố và loại carbohydrate.
LiP từ P.chrysosporium bao gồm một nhóm khá lớn isozym với khối lượng
phân tử dao động từ 38 – 43KDa và giá trị điểm đẳng điện nằm trong khoảng từ 3.3
đến 4.7 [29]. Tuy nhiên cũng có LiP từ nấm mốc Aspergillus terreus có khối lượng
phân tử 22 – 24 kDa [26]. Các isozym LiP thường được tinh chế từ mơi trường ni
cấy P.chrysosporium bằng sắc kí lỏng tách nhanh Protein (FPLC), sắc kí lỏng cao

áp (HPLC), sắc kí tương tác kị nước và sắc kí lọc gel [29] thu được số lượng các
isozym LiP khá phong phú từ thấp (2) đến cao (15) phụ thuộc vào môi trường nuôi
cấy [29]. Các Protein ngoại bào được tách chiết từ môi trường nuôi cấy chủng
P.chrysosporium BKMF – 1767 (ATCC 24725), (môi trường này với nồng độ Nitơ
thấp được xác định và chứa đựng đệm DMS_dimethyl succinate) đã được đặt tên
chuyên biệt là H1, H2….. H10, với chữ cái “H” nghĩa là các enzym ngoại bào có
chứa sắt “heme protein”. H1, H2, H6, H7, H8 và H10 đã được chứng minh là có
hoạt tính LiP bằng cách đo sự ơ xy hóa Veratryl Alcohol thành Veratraldehyde với
sự có mặt của H2O2 bằng máy so màu quang phổ [19], [46]. Trong khi đó H3, H4,
H5 và H9 được chứng minh là có hoạt tính MnP bằng cách đo sự ơ xy hóa Mn(II)
thành Mn (III) với sự có mặt của H2O2 bằng máy so màu quang phổ [29]. Những
nghiên cứu lập bản đồ peptide tiếp tục cho thấy rằng isozym H1 và H2 thuộc vào
một lớp; H6, H7, H8 thuộc về một lớp thứ hai và isozym H10 thuộc về một lớp thứ
ba. Đồng quan điểm với những kết luận này, Dass và Reddy [5] cho thấy, dựa trên
sự so sánh của trình tự đầu N (N-terminal sequence) (trình tự của 1 đến 10 axit amin
cuối cùng), H2 hình thành một phân lớp riêng biệt trong gia đình isozym LiP và H6,
H8 và H10 liên quan chặt chẽ với nhau mặc dù H10 xuất hiện ít liên quan đến H8
hơn các H6 isozym.

Nguyễn Thanh Hảo

10

CB 090703


Luận văn thạc sỹ khoa học

Cơng nghệ sinh học

¾ Cấu trúc trung tâm hoạt động của LiP
Trung tâm hoạt động của LiP tồn tại dưới dạng các túi ô xy hóa khử có chứa
heme. Trung tâm hoạt động được hình thành bởi 40 gốc axit amin nằm tại các xoắn
B, E, G, H, I và N, trong những sợi Beta b và e; và trong liên kết pép tít giữa xoắn
D/F, a/H, I/β của sợi b; b/c và c/K của sợi c. Heme được kết hợp ở cạnh gần bởi
nguyên tử Nitơ của His176 với chiều dài liên kết vào khoảng 2.15 A0. Heme được
liên kết với protein bằng liên kết hydro giữa những nhóm propionate với Arg43,
Ala180, Asn182, và Asp183. Đáng chú ý nhất là liên kết hydro mạnh có chiều dài
2.49 A0 giữa nhóm cacboxylate bên ngồi trên vịng pyrrole A và nhóm cacboxylate
của Asp183. Liên kết hydro thứ hai dài 2.84 A0 được hình thành giữa nguyên tử oxy
của nhóm cacboxylate thuộc nhóm propionate này với nguyên tử nitơ trong liên kết
peptit của Asp183. Nhóm propionate bên trong trên vịng pyrrole D liên kết hydro
với nhóm NH của Ala180 với khoảng cách là 2.98 A0. Liên kết còn lại của heme
với Protein là với Arg43 và Asn182, liên kết này khá yếu có khoảng cách khoảng
3.2A0. Phần lớn các khoang heme được hình thành là khơng phân cực, chỉ một vài
tương tác kỵ nước được tìm thấy giữa protein và nhóm ngoại. Heme khơng bằng
phẳng mà có hình dạng khá giống “yên ngựa” (saddle-like shape), với những
nguyên tử Nitơ của vòng pyrrole A và C hướng về phía gần với ngun tử Nitơ của
vịng pyrrole B và ngun tử Nitơ của vịng pyrrole D hướng về phía xa hơn của
vòng pyrrole B. Ion sắt trung tâm được phân cắt nhờ gốc histidine ở cách ít nhất
một mặt phẳng được hình thành bởi các vịng pyrrole [15], [17].
1.1.3.2. Tính chất của LiP

¾ Các chất ảnh hưởng tới khả năng ơ xy hóa khử của LiP
Hoạt tính của những enzym kim loại (metalloenzymes) xúc tác các phản ứng
ô xy hóa khử phụ thuộc vào nhiều yếu tố, ví dụ: khả năng tiếp cận bề mặt kim loại,
các cofactor, và tiềm năng ơ xy hóa khử. Sau đó là ảnh hưởng bởi môi trường
enzym và đặc biệt bởi sự liên kết của ion kim loại và đặc tính lưỡng cực của mơi
trường xung quanh. Ở các heme protein (Protein có trung tâm hoạt động là các phân
tử hemoglobin chứa sắt), về cơ bản có những trung tâm kim loại giống hệt nhau,

Nguyễn Thanh Hảo

11

CB 090703


Luận văn thạc sỹ khoa học

Cơng nghệ sinh học

nên có liên quan mật thiết giữa khả năng ơ xy hóa với cấu trúc đặc biệt này. Dưới
đây là một vài yếu tố ảnh hưởng tới khả năng ơ xy hóa của LiP.
a) Gốc Histidine ở tâm
Trên cơ sở khảo sát mơ hình của các hợp chất heme, Falk,1964 đã phát hiện
tính kiềm của phối tử histidine với khả năng ơ xy hóa .Ở các enzym thực vật,
nguyên tử Nitơ của vịng imidazol của His liên kết với nhóm NH2 của Asp thơng
qua liên kết hydro, vì vậy làm ổn định trạng thái ơ xy hóa cao của heme. Banci và
các cộng sự.,1991 [1] đã giả thuyết về khả năng ô xy hóa khử cao của LiP khi được
so sánh với CcP là do nhóm imidazol của His ở trung tâm hoạt động của enzym ít
hơn. Bộ ba Asp-His-Fe (có tính bảo thủ trong các enzym của phân họ thực vật)
được cho là một yếu tố trong việc điều chỉnh đặc tính imidazol của phối tử ở tâm
(Goodin & McRee, 1993). Ngược lại, các Globin có một liên kết hydro yếu giữa gốc
histidine và nhóm cacbonyl dọc theo trục, giải thích một phần khả năng ơ xy hóa
khác nhau của hai lớp heme protein. Ở LiP, mơ hình liên kết hydro giữa His ở tâm
và Asp lân cận gần như đồng nhất với CcP và các heme - enzym thực vật khác. Một
sự so sánh giữa LiP415 và CcP chỉ ra rằng một yếu tố quyết định khả năng ô xy hóa
có thể liên quan tới khoảng cách liên kết giữa Fe và nguyên tử Nitơ của His. Ở LiP,
khoảng cách này là 2.15A0, dài hơn so với ở CcP (1.95A0), ngắn hơn nếu so sánh
với MnP (2.28A0) (Sundaramoorthy et al.,1994). Trên quan điểm của thống kê,

người ta cho rằng sự khác nhau đó là khơng có ý nghĩa. Tuy nhiên, có một vài đặc
tính cấu trúc của phân tử LiP415 cho thấy độ dài liên kết Fe-N. Histidine ở tâm là
một phần của xoắn I2 được hình thành bởi các gốc từ 173 đến 178. Sự thay thế của
xoắn I2 ở LiP và MnP làm His ở tâm dịch chuyển ra xa khỏi liên kết yếu Fe-N, làm
cho các ion sắt sẽ thiếu điện tử nên khả năng ô xy hóa khử trở nên cao hơn.
b) Gốc Tryptophan171
Các isozym LiP là những enzym axit tính với pI ≤4 [31]. LiP có khả năng ơ
xy hóa ferrocytochrome c thậm chí thiếu sự có mặt của VA [50]. Các tác giả đề xuất
một tương tác tĩnh điện trực tiếp giữa hợp chất này với bề mặt của LiP. Các thí
nghiệm kiểm tra sự phân bố của các những axit amin có khả năng ơ xi hóa trên bề

Nguyễn Thanh Hảo

12

CB 090703


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

mặt LiP đã chỉ ra rằng các gốc tự do không được phân bố ngẫu nhiên trên bề mặt
của LiP mà được phân bố ở hai khu vực bề mặt đối diện nhau: Các gốc base được
phân bố ở bề mặt xung quanh các kênh truy cập tới các heme. Còn các gốc có tính
axit tích tụ ở bề mặt đối diện. Sự phân bố này được mơ tả như hình 1.8:
Các khả năng ơ xy hóa yếu trên bề
mặt được tơ màu đỏ, các khả năng ơ xy
hóa mạnh được tơ màu xanh. Heme và
một vài bề mặt tương tác kỵ nước ở vùng

phụ cận của Trp171 được miêu tả bằng
những liên kết.

HÌNH 1.8. Phân bố điện tích trên bề mặt phân tử của LiP415

Sự phân bố điện tích này dẫn đến hình thành một điện tử lưỡng cực với cực
dương của nó gần như hướng về phía heme và cực âm hướng về Trp171, cho thấy
vùng lân cận của Trp171 trở thành vùng liên kết cho các cytochrome và có khả năng
cho các hợp chất tích điện dương [3] ,Trp171 có hoạt tính ơ xy hóa khử và nó được
bao quanh bởi các gốc có tính axit, Trp171 là vị trí gắn kết cho VA và các cơ chất
có vịng thơm khác. Ba gốc axit xung quanh có tính bảo thủ trong các isozym LiP
đó là: Asp264, Glu168 và Glu250 [3]. Ngồi ra cịn có một số gốc phenylalanine
bên cạnh trp171, các gốc này được cho là tham gia vào các tương tác khơng phân
cực với các cơ chất có vịng thơm . Trp171 là một gốc có tính bảo thủ trong các
isozym LiP và nó là một gốc axit amin chủ yếu. Mặc dù LiP và MnP có sự tương
đồng tới 60% về axit amin nhưng khơng có gốc Trp nào được tìm thấy ở MnP [21].
Các nghiên cứu trên thể đột biến đã làm sang tỏ Trp171 là vị trí tương tác với
VA[10]. Trong thể đột biến (Trp171 bị thay thế bởi Phe và Ser) thì khơng có hoạt
tính với VA nhưng vẫn duy trì hoạt tính với hai loại thuốc nhuộm khác nhau, chỉ ra
rằng con đường dẫn truyền điện tử từ Trp171 tới các heme là thông qua Met172
.Nguyên tử Cacbon Bêta của Trp171 liên kết chặt chẽ với các heme. Trp171 được
xem như một phần của con đường vận chuyển điện tử và một vị trí nhận điện tử tới

Nguyễn Thanh Hảo

13

CB 090703

Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

heme. Các nghiên cứu này đã cung cấp những bằng chứng về sự tồn tại của hai vị trí
tương tác cơ chất khác nhau. Một là trong các kênh truy cập tới heme, một vị trí
nằm tại Trp171 hoặc vùng lân cận với nó.
c) Ion Ca2+
Có hai điểm gắn kết Canxi được tìm thấy ở LiP. Một ở vùng gần tâm và một
ở miền lân cận tâm. Tất cả đều nằm sau vị trí hoạt động của các gốc histidine, và
được phối hợp với bảy hoặc 8 nguyên tử ô xy trong phạm vi từ 2.34 đến 2.72 A0. Vị
trí gắn kết Canxi ở tâm được hình thành bởi một vùng lặp bao gồm các gốc từ
Asp194 tới Asp201 và bởi Ser177 nằm bên cạnh His176. Tám nguyên tử Ô xi liên
kết với ion Canxi có một khoảng cách trung bình là 2.5 A0. Vị trí gắn kết Canxi ở
miền lân cận tâm được hình thành bởi các gốc từ Gly66 và Ser70, một khu vực
được mở rộng giữa xoắn C và D1, bên cạnh His47 trong xoắn B. Hai nguyên tử
nước tham gia phối hợp 7 lần cùng nguyên tử trung tâm tạo thành một ngũ giác
‘bipyramid’. Kiểu liên kết này của Canxi được tìm thấy trong một số Protein khác
[7]. Chức năng của Ca2+ là góp phần làm cấu trúc liên kết của trung tâm hoạt động
trở lên vững chắc hơn. Khi Ser177 được liên kết với ion Canxi ở vùng gần tâm, sự
linh hoạt của gốc His176 bên cạnh khi liên kết với ion Fe của heme bị hạn chế hơn
so với ở CcP (khơng có ion Canxi). Canxi ở vùng gần tâm có thể tinh chỉnh cấu trúc
liên kết của trung tâm hoạt động, ví dụ như khoảng cách đặc thù giữa ion Fe và
histidine, được cho là ảnh hưởng tới tiềm năng ơ xy hóa khử.
¾ Tính đặc hiệu cơ chất của LiP
Tính đặc hiệu cơ chất của LiP thường thấp, bởi LiP có khả năng oxy
hóa dải cơ chất khá rộng. Một số cơ chất thường sử dụng khi nghiên cứu
khả năng oxy hóa của LiP như: guaiacol, Azure B, Veratryl alcohol, lignin.
LiP từ các loài vi sinh vật khác nhau thì cũng có dải cơ chất khác nhau. LiP
từ Neuropora crassa chỉ oxy hoá hiệu quả para và ortho-diphenol (Germann

và cộng sự, 1988). Nhưng LiP từ Cerrena unicolor oxy hoá các hợp chất
phenol ở vị trí meta với quy mơ lớn nhất trong khi LiP từ Trametes
versicolor oxy hoá hiệu quả các hợp chất phenol ở vị trí ortho và para [20].

Nguyễn Thanh Hảo

14

CB 090703