Bước đầu xây dựng quy trình phát hiện đồng thời các tác nhân vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm gây bệnh cho con người bằng phương pháp PCR kết hợp Reverse Dot Lot

B GIÁO DO
I HC M TP.HCM
KHOA CÔNG NGH SINH HC




KHÓA LUN TT NGHIP
Tên đ tài:
U XÂY DNG QUY TRÌNH PHÁT HING
THI CÁC TÁC NHÂN VI KHUN T CÁC MU BNH
PHM GÂY BI B
PHÁP PCR KT HP REVERSE DOT LOT

KHOA CÔNG NGH SINH HC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SHPT



GVHD: ThS. NG
SVTH : NGUYN TR
MSSV : 1053010486
Khóa : 2010  2014



Tp. H Chí Minh, tháng 5 nm 2014


Nguyn Trng Nghĩa i


Em xin chân thành cy Cô Khoa Công ngh Sinh Hng
i hc M n tình dy bo em trong nha qua, truyt
nhng kin th i.
Em kính gi li cn Cô Lê Hun tình c
vn, truyt cho em nhng kin thc chuyên môn b ích.
Em xin chân thành c    c Thu      
 tài khóa lun tt nghi
                

 tài khóa lun 

 



 
các anh ch, các
b em
thc hi tài khóa lun tt nghip này.

 tài khóa lun

Sinh viên

Nguyn Tr


Nguyn Trng Nghĩa ii


Kí hiu vit tt Din gii
A Adenine
AMP Adenosin 3,5-cyclic mono phosphat
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
BP Baird Parker
Bp Base Pair
C Cytosine
cAMP Cyclic Andenosine monophosphate
cDNA complementary DNA
CFU Colony Forming Unit
DNA Deoxyribonucleic acid
EIEC Enteroinvasive E.coli
EPEC Enteropathogenic E.coli
ETEC Enterotoxigenic E.coli
G Guanidine
IDT Integrated DNA technologies
IMViC Indole, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate
ISA Iso-sensitest agar
ITS Internal Transcribed Spacer
LB Labile heat
LPS Lippolysaccharide
MR Methyl Red
mRNA messenger RNA
NCBI National Center for Biotechnology Information
OD Optical density
PCR Polymerase Chain Reaction
pH Potential Hydrogen

RDB Reverse dot blot


Nguyn Trng Nghĩa iii

rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic Acid
RNA Ribonucleic acid
rRNA ribosomal Ribonucleic Acid
S Semi-conserved
SEs Staphylococcal enterotoxins
SNP Single nucleotide polymorphism
ST Stable heat
T Thymin
Ta Temperature annealing
TLTK Tài liu tham kho
Tm Temperature melting
TMB 3,3,5,5- tetramethylbenzidine
tRNA Transfer Ribonucleic Acid
U Universal
UV Ultraviolet, tia t ngoi
V Variable
VP Voges Proskauer
VTEC Verotoxigenic E.coli



Nguyn Trng Nghĩa iv


Bng I.1. Bng th nghim sinh hóa phân bit nhóm vi khun gây b ng

rut[25] 14
Bng II.1. Thành phn phn  16S_R. 28
Bng II.2. Chu k nhit cho phn 16S_F  16S_R. 29
Bng II.3. Thành phn phn 23S_F  23S_R. 29
Bng II.4. Chu k nhit cho phn  23S_R 29
Bng III.1. Các vùng gen s dng trong phát hin vi sinh vt gây bnh 33
Bng III.2. Các k thut sinh hc phân t s d   nh nhanh các vi
khun gây bnh 34
Bng III.3. Các cp mi s dng trong nghiên cu 35
Bng III.4. Các mu dò s dng trong nghiên cu mu dò 36
Bng III.5. Bng thông s vt lí ca mi da vào phân tích IDT 44
Bng III.6. Bng ch s OD ca 5 mu DNA tách chit t vi khui ch
 57
Bng III.7. Ch s OD ca 15 mu DNA tách chi 57
Bng III.8. V trí chm mu dò trên màng lai 62
Bng III.9. Thông tin mu bnh phm s dng trong nghiên cu 82
Bng III.10. Kt qu cy trang (s khun lc) và m t bào CFU/ml 83





Nguyn Trng Nghĩa v


Hình I.1. Hình thái t bào E.coli[75] 3
Hình I.2. Hình thái t bào Staphylococcus aureus[76] 5
Hình I.3. Hình thái t bào Salmonella[77] 6
Hình I.4. Hình thái t bào Shigella[78] 7
Hình I.5. Hình thái t bào Vibrio cholera[79] 8

Hình I.6. Hình thái t bào Y. enterocolitica[80] 9
 16
Hình I.8. Minh h 22
Hình III.1. Kt qu BLAST mi 16S_F 38
Hình III.2. Kt qu BLAST mi 16S_R 39
Hình III.3. Kt qu kho sát kh t cp ca cp mi 16S_F  16S_R bng
công c Annhyb. 40
Hình III.4. Kt qu BLAST mi 23S_F 41
Hình III.5. Kt qu BLAST mi 23S_R 42
Hình III.6. Kt qu kho sát kh t cp ca cp mi 23S_F  23S_R bng
công c Annhyb. 43
Hình III.7. Kt qu BLAST mu dò SAL 45
Hình III.8. Kt qu kho sát kh  t cp ca mu dò SAL bng công c
Annhyb. 46
Hình III.9. Kt qu BLAST mu dò SHI 47
Hình III.10. Kt qu kho sát kh ng bt cp ca mu dò SHI bng công c
Annhyb. 48
Hình III.11. Kt qu BLAST mu dò SAU 49
Hình III.12. Kt qu kho sát kh  t cp ca mu dò SAU bng công c
Annhyb. 50
Hình III.13. Kt qu BLAST mu dò VCH 51
Hình III.14. Kt qu kho sát kh  t cp ca mu dò VCH bng công c
Annhyb. 52


Nguyn Trng Nghĩa vi

Hình III.15. Kt qu BLAST mu dò YER 53
Hình III.16. Kt qu kho sát kh  t cp ca mu dò YER bng công c
Annhyb. 54

Hình III.17. Kt qu BLAST mu dò ECO 55
Hình III.18. Kt qu kho sát kh  t cp ca mu dò ECO bng công c
Annhyb. 56
Hình III.19. Kt qu n di kho sát nhi lai ca cp mi 16S_F  16S_R 58
Hình III.20. Kt qu n di sn phm PCR các mu vi khui din vi cp mi
16S rDNA. 60
Hình III.21. Kt qu n di sn phm PCR ca chng E. coli vi cp mi 23S
rDNA. 61
Hình III.22. Kt qu phn ng lai RDB trên chng chun Staphylococcus aureus. 62
Hình III.23. Kt qu lai RDB trên chng chun Yersinia enterocolitica. 63
Hình III.24. Kt qu lai RDB trên chng chun Salmonella spp. và Shigella spp. 63
Hình III.25. Kt qu n di sn phm PCR các mu bnh phi din vi cp
mi 16S_F  16S_R. 66
Hình III.26. Kt qu phn ng lai RDB trên mu bnh phm s 3 66
Hình III.27. Kt qu n di sn phm PCR các mu bnh phi din vi cp
mi 23S_F  23S_R. 67
Hình III.28. Kt qu minh hng phát hin vi khun ca phn ng RDB trên
mu bnh phm nhim Staphylococcus aureus 69
Hình III.29. Kt qu n di sn phm PCR các mu hn hp 3 loài vi khun khác
nhau 70
Hình III.30. Kt qu lai RDB trên mu hn hp 3 loài vi khun khác nhau. 70






Nguyn Trng Nghĩa vii



LI C i
DANH MC CH VIT TT ii
DANH MC BNG BIU iv
DANH MC HÌNH V v
MC LC vii
T V 1
PHN I. TNG QUAN TÀI LIU 3
I.1. C V CÁC NHÓM VI KHUN GÂY BNG GP .
3
I.1.1. Escherichia coli 3
I.1.1.1. m hình thái 3
I.1.1.2. ng 3
I.1.1.3. Thông tin b gen 3
I.1.1.4. Phân loi 4
I.1.2. Staphylococcus aureus 4
I.1.2.1. m hình thái 5
I.1.2.2. ng 5
I.1.2.3. Thông tin b gen 6
I.1.3. Salmonella spp. 6
I.1.3.1. m hình thái 6
I.1.3.2. ng 6
I.1.3.3. Thông tin b gen 6
I.1.4. Shigella spp. 7
I.1.4.1. m hình thái 7
I.1.4.2. ng 7
I.1.4.3. Thông tin b gen 8
I.1.5. Vibrio cholerae 8
I.1.5.1. m hình thái 8


Nguyn Trng Nghĩa viii

I.1.5.2. ng 8
I.1.5.3. Thông tin b gen 9
I.1.6. Yersinia enterocolitica 9
I.1.6.1. m hình thái 9
I.1.6.2. c m ng 10
I.1.6.3. Thông tin b gen 10
I.2. THÔNG TIN VÙNG GEN 16S VÀ 23S rDNA 10
I.2.1. Gen 16S rDNA 10
I.2.2. Gen 23S rDNA 12
I.3. CÁC K THUT PHÁT HIN VI SINH VT GÂY BNH CHO CON
I 12
I.3.1. K thunh danh truyn thng [25] 12
I.3.2. K thut sinh hc phân t hii 15
I.3.2.1. K thut PCR[2][12] 15
I.3.2.2. Multiplex PCR [12] 19
I.3.2.3.  19
I.3.2.4.  20
I.4. CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CU PHÁT HIN NHANH CHÓNG
NG THI TÁC NHÂN VI SINH VT GÂY BNH 22
PHN II. VT LIU 25
II.1. VT LIU 25
II.2. U 25
II.2.1. Thu thp d liu và kho sát in silico 25
II.2.2. Thu thp d liu 25
II.2.3. Kho sát in silico 25
II.2.3.1.  gen mc tiêu 16S  23S rRNA 25
II.2.3.2. p mi 25
II.2.3.3. p m 26

II.2.4. Kho sát thc nghim 26
II.2.4.1. Tách chit DNA 26


Nguyn Trng Nghĩa ix

II.2.4.2. Kim tra chng DNA thu nhn b
ph 27
II.2.4.3. Phn ng PCR: 28
II.2.4.4. n di: 30
II.2.4.5.  30
II.2.4.6. Kh nhy c-RDB 31
II.2.4.7. Kho sát kh ng thi nhiu tác nhân vi khun gây
bnh 32
PHN III. KT QU VÀ THO LUN 33
III.1. KT QU THU THP D LIU VÀ KHO SÁT IN SILICO 33
III.1.1. Thu thp d liu 33
III.1.2. Kt qu kho sát in silico 34
III.1.2.1. Thu th cp mi, mu dò 34
III.1.2.2. Kho sát h cp mi 36
III.1.2.3. Kho sát b mu dò 45
III.2. KT QU THC NGHIM 56
III.2.1. Tách chit DNA 56
III.2.2. Kt qu kho sát nhi lai ca mi 16S rDNA 58
III.2.3. Kt qu khui ca cp mi 16S_F  16S_R trên các chng vi
khui chng 59
III.2.4. Kt qu khui ca cp mi 23S_F  23S_R trên chng E. coli .
60
III.2.5. Kt qu lai RDB trên các chng vi khui chng 61
III.2.6. Kt qu thc nghim trên mu bnh phm 64

III.2.7. Kh nhy cPCR-RDB 67
III.2.8. Kt qu phát hing thi các chng vi khun gây bnh 69
PHN IV. KT LU NGH 71
IV.1. KT LUN 71
IV.2.  NGH 71
TÀI LIU THAM KHO 72


Nguyn Trng Nghĩa x

PH LC 82



Nguyn Trng Nghĩa 1

 
Nhóm vi khun gây bnh truyn nhim bao gm nhng nhóm vi khun gây
nhing rut, gây nhing hô hn
ph bin gây bng rut và gây ng c thc phm: Staphylococcus aureus,
Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio cholerae và
Yersinia enterocolitica Các loài vi khun này gây ng nghiêm trng cho
sc khi vi các loi bnh: tiêu chy, nhing rut, nhim
trùng huyt, ri lon thn kinh, viêm màng não,
Hin nay, ti các phòng xét nghim ti các bnh vin  Vi 
pháp truyn thc s dng rt ph bim là
d thc hin và chi phí thp, tuy nhiên còn nhiu hn ch n nhiu thi gian
thc hi chính  b ngoi nhim trong quá trình nuôi cy, gây
    u tr. Vì vy, vic phát hin nhanh các tác nhân gây bnh
nhiu cn thit, giúp hn ch c s lây lan ca chúng và h tr c

lu tr n cho bnh nhân. Hin nay, nhiu
n nhanh vi khun gây bnh nhi
d- n di, Real time PCR, Multiplex PCR, PCR kt hp gii trình
tt hp lai Reverse Dot Blot (PCR - 
thy nh  t tri v thi gian, s chính xác và phát hi ng thi
nhiu tác nhân gây bnh nhim trùng cùng lúc (Fiss et al., 1992; Xing et al., 2009),
u tr n và kp thi cho bnh
 u tr cho bnh nhân.
Vì vy, s tìm hiu và thit lp quy trình phát hing thi 6 chng vi khun
gây b ng rut: Staphylococcus aureus, Escherichia coli O157:H7,
Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica là cp thit.
Nhm góp phu qu trong vic phát hing thi
và chính xác các tác nhân vi khun gây bnh nhi tr
 u tr n cho bnh nhân, chúng tôi thc hi tài
khóa lun tt nghiu xây dng quy trình phát hing thi các tác


Nguyn Trng Nghĩa 2

nhân vi khun t các mu bnh phm gây bi b
pháp PCR kt hp Reverse Dot Lot


Nguyn Trng Nghĩa 3

  
I.1. 
I.1.1. Escherichia coli
I.1.1.1. 
Vi khun Escherichia coli thuc h

Enterobateriaceae, E. coli là trc khun ngn
t 2-3 µm, Gram âm, không to bào t, có kh
ng nh tiên mao  xung quanh. [10]
I.1.1.2.  
E. coli có kh   ng trong
khong 5 - 40
o
C và t 37
o
C pH trong
khong 5,5  8 và thích hp nht là 7,2  7,4. [10]
Chúng thuc nhóm vi khun k khí tùy ý, có kh t
s lon, levulose, galactose, ramnose, manit kèm
ng adonit và inozit.
 iE.coli  
khác [10]
o E. coli có indol (+).
o hyl (M): E. coli hyl (+).
o es Proskauer (V): E. coli -).
o E. coli 
citrat âm tính.
 E.coli không  ure, không sinh H
2

Trn Th  (2012)n trong tht (ln, bò, gà)  mt
s huyn ngoi thành Hà Ni có cha vi khun E. coli ( bao gm E. coli O157: H7),
gây ng c thc phm, tiêu chy [7]. Ngoài ra vi khuc tìm thy
trong mu phân ca trâu, 
I.1.1.3. 
Hình I.1. Hình thái t bào

E.coli[75]


Nguyn Trng Nghĩa 4

B gen ca Escherichia coli c khong 5,59 Mb, t l %GC chim
khong 50,4%, vùng gen 16S rRNA dài khong 1542 bp, mã hóa cho 7 locus khác
nhau: rrsA, rrsB, rrsC, rrsD, rrsE, rrsG, rrsH và vùng gen 23S rRNA dài khong
2903 bp.
I.1.1.4. i
Vi khun E. coli c chia làm nhiu serotype khác nhau da trên cu trúc
kháng nguyên thân O, kháng nguyên giáp mô K, kháng nguyên lông H và kháng
nguyên bám dính F. Bng phn t các nhà khoa hc 250
serotype O, 89 serotype K, 56 serotype H và mt s serotype F. [59]
Nhng chng E. coli gây bc xp vào nhng nhóm sau: [58]
- EPEC (enteropathogenic E. coli      

eae (attaching and effacing, A/E) và tir (translocated intimin receptor) mã hóa cho

- ETEC (enterotoxigenic E. coli

: F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F17, F18, F41,
F42, F165 và 

- EIEC (enteroinvasive E. coli
     
MDa. Các gen trên plasmid này mã hóa cho c     
(
Shigella sen.
VTEC (verotoxigenic E. coli) sn xut c t Shiaga-like toxin (Slt), còn gi

là Shiga toxin hay Verotoxin (VT). H c t Stl gm 2 nhóm chính là Stx1 và Stx2
mt dòng có th có 1 hoc 2 loi hoc c 2. Ngoài ra còn có gen eae và tir. Trong
nhóm này serotype O157:H7 chim khong hp gây bnh t VTEC
trên toàn th gii.
I.1.2. Staphylococcus aureus


Nguyn Trng Nghĩa 5

I.1.2.1. 
Staphylococcus aureus thuc nhóm vi khuu, x
hoc      ng, sng trong
u kin hiu khí hoc k khí tùy nghi. [10]
I.1.2.2. 
  ng BP (Baird Parker) khun
l   a S. aureus    
bóng, lng kính 1-1,5 mm, quanh khun lc
có vòng sáng rng 2-5 mm (do kh  
potassium tellurite K
2
TeO
3
và kh y phân
  trng ca lethinase) [10].

Vi khun phát
trin  nhi 7
o
C - 48
o

C (thích hp nht là
37
o
C) và pH t 4 - 9.3 (thích hp nht là pH
7.0-7.5). [10]
S. aureus có phn ng DNase, catalase
(+), phosphase (+), có kh        mannitol, trehalose,
sucrose. Tt c các dòng S. aureus u mn cm vi Novobiocine. [10]
Hu ht các chng t c u sn xu c men penicillinase (beta 
lactamase). Men này phá hu vòng beta  lactam, cn ca các kháng
 Penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh
này mt tác dng. [10]
S. aureus c t rut Enterotoxin trong thc phm và gây hi chng shock
c t do chúng to ra siêu kháng nguyên trong máu. [40]
c t Enterotoxin ca S. aureus c gi là Staphylococcal enterotoxins
(SEs). Bao gc tng hp
 nh trên 15
o
c bit tng hp nhiu khi vi khung  35-37
o
C và
TSST-c tit ra gây hi chng sc nhic t
cu (TSS). [74]
Amit Kumar và cng s (2011)y S. aureus trong thc phm  ch Solan
 , gây bnh  i.[8]
Hình I.2. Hình thái t bào
Staphylococcus aureus[76]


Nguyn Trng Nghĩa 6

I.1.2.3. 
B gen ca S. aureus   c kho    l %GC
khong 32,8%, vùng gen 16S rRNA dài khong 1555 bp và 23S rRNA dài khong
2923 bp (Staphylococcus aureus subsp. aureus NCTC 8325).
I.1.3. Salmonella spp.
I.1.3.1. 
Salmonella ssp. là trc khun Gram âm,
c t 2-3 ng nh tiêm mao (tr
S. gallimarum và S. pullorum), sng k khí tùy ý,
không to bào t chúng phát trin tt  nhi 6
 42
o
C, thích hp nht  37
o
C, pH thích hp t 6
 9 và t 7,2. [10]
I.1.3.2. 
Salmonella spp.   m sinh hóa:
nitrate      
(-), indol âm tính (-), VP âm tính (-), có kh  y phân maltose, lactose,
glucose
Theo h thng ca Kauffman White, da trên kháng nguyên thân O, kháng nguyên
tiêm mao H và kháng nguyên b mt V, Salmonella spp. c chia ra khong 2463
kiu huyt thanh (serotypes). Ngoài ra ging Salmonella spp. c chia làm hai
loài: S. enterica và S. bongori. S. bongori gm tt c các kiu huyt thanh
(serotype) ca loài ph s V, và S. enterica c chia làm 6 loài ph : I, II,
IIIa, IIIb, IV và VI. Salmonella spp. có th to ra hai lo c t: Enterotoxin và
Cytoxin. [10]
BS. typhi và S. paratyphi Bnh viêm d dày

rut do các loài: S. typhimurium, S. enteritidis, S. anatum, S. budapest gây ra. [10]
Trn Ngc Bích (2012)   u và cho bit rng Salmonella spp.
c tìm thy trong mu tht, mu trng, mu phân ca vt, vt xiêm, ngvi
khun gây ng c thc phm  tnh Hu Giang, Vit Nam. [6]
I.1.3.3. 
Hình I.3. Hình thái t bào
Salmonella[77]



Nguyn Trng Nghĩa 7

B gen ca Salmonella spp. c kho l %GC
khong 52,2 (Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. ATCC
9150), vùng gen 16S rRNA dài khong 1366 bp và 23S rRNA dài khong 2904 bp.
I.1.4. Shigella spp.
I.1.4.1. 
Shigella spp. hay còn gi là trc khun l, là
nhóm vi khun Gram âm, không sinh bào t, không
c t bào t 1  2 µl, hô hp k khí
không bt but. [10]
I.1.4.2. 


 khí tùy
 40
o
C, pH  6,5  
37
o

C, pH 7  
<5
o

o

o

kh[10]
Shigella spp. 
   Shigella         

không sinh H
2
[10]
Chi Shigella  nhóm loài: [23]
- S. dysenteriae 

- S. flexneri 
- S. boydii 

S. sonnei           

Hình I.4. Hình thái t bào
Shigella[78]


Nguyn Trng Nghĩa 8



 [1]
Hà Vinh (2011) Shigella 
[1]
I.1.4.3. 
B gen ca Shigella sppc kho l % GC
khong 50,7, vùng gen 16S rRNA dài khong 1542 bp và 23S rRNA dài khong
2904 bp (Shigella sonnei Ss046).
I.1.5. Vibrio cholerae
I.1.5.1. 
Vibrio cholerae là vi khun Gram âm (-),
, không sinh nha
bào, có chiu rng khong 0.7-1.0 µm và dài
khong 1.5-c nh m,
hô hp k khí tùy nghi. [10]
I.1.5.2. 
Vi khun V. cholerae phát tri c 
nhi  t 15
o
 n 45
o
C và trong khong
pH t 6-10, tuy nhiêu kin cho vi khun V. cholerae t là nhi
35
o
n 37
o
C và pH vào khong 8-9. Ngoài ra, vi khun còn có th phát trin trong
ng  mn cao (mui NaCl 6%). [10]
V. cholera   m sinh hóa: có kh    oxydase (+),
không sinh H

2
S, không có kh i ure và s dng D-glucose làm ngun
C chính. Sn xut nhiu loi enzyme: amylase, gelatinase, chitinase và DNase. [10]
V. cholera c chia thành 206 serotypes khác nhau và ni bt là 2 serotypes
O1 và O139, là hai tác nhân gây bnh dch t c gi là V. cholerae - O1 và
V. cholerae non - O1 [53]. Có s n gia 2 serotype này, giúp phân
bit d dàng: serotype O139 có mt nan mng, còn O1 thì không có nan này. V.
cholerae O1 to khun lc trong còn V. cholerae O139 thì có khun lc [53].
Hình I.5. Hình thái t bào Vibrio
cholera[79]


Nguyn Trng Nghĩa 9

LPS (lippolysaccharide) ca serotype O1 thì mm và chui O139 thì
semirough và ng
Vi khun V. cholera c t t c t có cu trúc
gng phân t là 27 000 dalton, mang
 c hiu và mt cu ni A2 có
tác d-cyclic mono phosphat).
Dm các quynh kháng nguyên A, B, C ca kháng nguyên
thân O, V. cholerae - c phân thành 3 type huyt thanh (serotype) sau:
- 
- 
- 
Serotype O139 là chng huyt thanh mc thù.
Phy khun t (V. cholera) xâm nhn
 màng nhày ph niêm mc rut non. Nguc b nhim V. cholerae, các loi
rau s  c v sinh k   i hi sn không nu k là nhng
ngun lây nhim bnh chính. [5]

Nguyn Th Xuân Trang và cng s (2012), tìm thy V. cholerae trong mu
tôm và nhuyn th thu thp  ng Nai và Thành ph H Chí Minh, Vit Nam. [5]
I.1.5.3. 
V. cholera c b gen khong 4.03 Mb, thành phn %GC là 47.5,
vùng trình t c khong 1535 bp và vùng trình t 23S rRNA
dài 2887 bp (Vibrio cholerae O1 biovar El Tor
str. N16961)
I.1.6. Yersinia enterocolitica
I.1.6.1. 
Yersinia enterocolitica    
âm, hình  khí tùy
        
25
o
   
o
     
Hình I.6. Hình thái t bào Y.
enterocolitica[80]


Nguyn Trng Nghĩa 10

[14]
I.1.6.2.  
- 44
0
C 
và  kh


 [10]
Y. enterocolitica           


2
S. [10]
Da trên kh     m sinh thái và s phân b a lý Y.
enterocolitica c chia thành 5 nhóm: 1A, IB, 2, 3, 4, và 5. Y. enterocolitica bao
gm 60 serotypes: IA (O:5; O:6, 30; O:7, 8; O:18; O:46), IB (O:8; O:4; O:13a, 13b;
O:18; O:20; O:21), 2 (O:9; O:5, 27), 3 (O:1,2,3; O:5,27), 4 (O:3), và 5 (O:2,3).
   m nhiu nht là O:3 (biogroup 4) , O:8 (biogroup 1B), O:9
(biogroup 2) , và O:5,27 (biogroups 2 và 3).
Nguy  y và cng s (2011), phát hi c vi khun Y.
enterocolitica trong thc phm bao gm hi sn, tht gà, s  
Vit Nam. [4]
I.1.6.3. 
B gen ca Y. enterocolitica c khong 4.68 Mb, %GC vào khong
c vùng 16S rRNA khong 1489 bp và 23S rRNA khong 2994 bp
(Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica 8081).
I.2. THÔNG TIN VÙNG GEN 16S VÀ 23S rDNA
I.2.1. Gen 16S rDNA
Vùng trình t 16S rDNA là gen mã hóa cho trình t 16S rRNA, có chiu dài
khong 1540 bp [61]. Vùng gen này có cc bit do nó có th hình thành cu
trúc bc 2 và to thành 4 trung tâm chn gp li nh
nhng liên kt b tr t nhng nh n cp
ng không hoàn chnh và có nhn phng, li lên [71]. Vùng trình
t 16S rDNA c ghi nh  ng h ti    [64],


Nguyn Trng Nghĩa 11

c s dng ph bin trong nhng công trình nghiên cu khoa hc
v nh danh [71][64], phân lon các loài vi khun mi
[54] c ng dng rc y hc.
Hin nay, gen 16S rDong
nghiên cu mi quan h gia các cng vi sinh vt [21]. Chúng có s ng
bn sao rt ln trong b gen ca vi sinh vt. [29][71]
Trên vùng trình t gen 16S rDNA, các nhà khoa hc các
vùng bt bin U (universal) là các vùng có s bii rt ít gia các loài (bo tn 
c loài) và các vùng siêu bing V (hypervariable) là nhng vùng có s khác
nhau gia các loài, các chng thuc loài hoc nhóm loài [58]. Vùng siêu bing
c chia thành 9 vùng khác nhau, mi vùng có chiu dài khong 18 - 20 bp, và
gia 2 vùng trên có nhng vùng có bi   c gi là vùng bán bo tn S
(semi-conserved). [16]
 Vùng V1 có kích 
Streptococcus spStaphylococcus aureus và
Staphylococcus không sinh enzyme coagulase.
     Escherichia spp. và Shigella spp. Vùng
Staphylococal và Streptococal
trong chi Clostridium    
chia ra làm 3 vùng có 13   
              
Haemophilus     
 
Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium 
       Mycobacterium fortuitum, Nocardia spp.,
Propionibacterium acnes và Rhodococcus equi.     
Enterobacteriacea: K. pneumonia và E. aerogenes.
          ng 58bp, có  
       Enterobacteriaceae: Escherichia spp.,

Shigella spp. và Salmonella spp.


Nguyn Trng Nghĩa 12

 

I.2.2. Gen 23S rDNA
Vùng gen 23S rD   c khong 2900bp [35]. Theo Uzuka và
cng s (2004), vùng 23S rDNA th hin s bing gi 16S
rDNA [65] thit k m (universal primer) da trên vùng
bo tn và mi/mu dò chuyên bit (specific primer/probe) da trên vùng bing
ca trình t 23S rD phân bic các nhóm vi khun gây bng rut.
[35][65]
Theo Uzuka và cng s, vùng 23S rDn vic kháng
kháng sinh phân t vòng ln (macrolide antibiotic) [65].Vic thit k các mi/mu
dò chuyên bit trên vùng 23S rDNA là rt hu ích trong chn
kháng thuc.[65]
I.3. 

I.3.1. [25]
Vinh danh và phân loi vi sinh vu dm hình thái,
sinh lý, sinh hóa vi sinh vt: nhum t bào, hình dng t bào khun lc, kh 
ng, nhu cng, kh 
Da trên phn ng sinh hóa: ngoài vic dm hình thái, các
nhà khoa hc còn s dng thêm các phn   phân loi vi sinh vt.
Nhng phn ng dùng trong vinh danh vi sinh vt:
 




       





Nguyn Trng Nghĩa 13

 e cytochrome oxidase
 giây 
tiên.
   e    
NH
4
và CO
2
. NH
4
 

  


 e tryptophanase


 m MR (
Methyl Red 


 m VP (Voges  Proskeure
              


         e    
nitrat thành nitrit, NH
3
, N
2
-


  



 e gelatinase phân
 
o
C.


Nguyn Trng Nghĩa 14

 
              


Phân bit theo serotype huyt thanh: nguyên tc ca vào
nhóm quynh kháng nguyên trên t bào vi sinh vt (b mt t bào tiên mao hoc

protein v).
Phân bit bng loi hot cht kháng khun: Bacteriocin bn cht là peptid
kháng kh chng li vi sinh vt .
nh danh vi khun bao gm:
- 
- 
- - 
- 
Bng I.1. Bng th nghim sinh hóa phân bit nhóm vi khun gây bng
rut[25]
Loài vi khun
VP
MR
Indole
Kh
nitrate
Catalase
Kh 
ng
E. coli
-
+
+
-
+
+
S. aureus
-
+
+

+
+
-
Salmonella spp.
-
+
-
+
+
+
Shigella spp.
-
+
+
-
+
-
V. cholerae
-
+
+
+
+
+
Y. enterocolitica
-
+
-
+
+

-
Chú thích: VP: th nghim Voges  Proskaeur, MR: th nghim Methyl Red, (+) phn -)
phn ng âm tính
      n th     
   ng quy trình xét nghi ng quy [25]. Tuy nhiên,
n thng có mt s hn ch: tiêu tn thi gian, tiêu tn v môi