Khảo sát mức độ Methyl hóa vùng Promoter Gene Reck trong ung thư

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA
VÙNG PROMOTER GENE RECK
TRONG UNG THƯ

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH:VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy
SVTH: Nguyễn Thị Thúy Tài


Tp. Hồ Chí Minh, tháng 6/2014
LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian nghiên cứu, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại
học Mở TP.HCM, khoa Công nghệ sinh học đã giúp để em thực hiện đề tài này.
Đặc biệt em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY và
ThS. TRƯƠNG KIM PHƯỢNG đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và ân cần với
những lời khuyên quý báu trong suốt quá trình em thực hiện đề tài.
Em xin cảm ơn các thầy, (cô) ở phòng thí nghiệm Sinh học phân tử đã hướng dẫn
và giúp để em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em xin cảm ơn tới bố mẹ, gia đình, bạn bè đã luôn động viên, chia sẽ và giúp đỡ em
trong thời gian học tập và thực hiện đề tài.

Em xin chân thành cảm ơn!
Ngày , tháng 06, năm 2014
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Thúy Tài


Mục Lục

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i
DANH MỤC BẢNG iii
DANH MỤC HÌNH iv
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 3
I. Tổng quan bệnh ung thư 3
I.1. Ung thư 3
I.2. Nguyên nhân gây ung thư 7
I.3. Ung thư vú 8
I.4. Ung thư cổ tử cung 8
II. Sự biến đổi “epigenetics” và methyl DNA 9
II.1. Sự biến đổi “epigenetics” 9
II.2. Đảo CpG 9
II.3. Sự methyl hóa DNA 10
III. Tổng quan về gene RECK và protein RECK 12
III.1. Gene RECK 12
III.2. Cấu trúc protein 13
III.3. Cơ chế giảm kiểm soát của RECK trong ung thư 14
III.4. Tình hình nghiên cứu về methyl hóa gene RECK 15
IV. Các phương pháp nghiên cứu về sự methyl hóa DNA 17
IV.1. MSP (Methylation-Specific PCR) : 17
IV.2. Phương pháp BSP (Bisulfite Sequencing PCR) 18

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19
I. VẬT LIỆU 19
II. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
II.1. Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico 19
II.2. Khảo sát thực nghiệm quy trình MSP trên gene RECK 20


Chương III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 28
I. Kết quả khai thác dữ liệu và khảo sát in silico 28
I.1. Khai thác dữ liệu 28
I.2. Kết quả khảo sát in silico 31
II. Kết quả nghiên cứu thực nghiệm 41
II.1. Nội dung nghiên cứu thực nghiệm 41
II.2. Kết quả tách chiết DNA 42
II.3. Thực hiện phản ứng MSP sử dụng DNA bệnh phẩm 42
II.4. Thử nghiệm MSP trên các mẫu DNA bệnh phẩm ung thư vú và ung thư cổ tử
cung 44
II.5. Giải trình tự mẫu đại diện 50
Chuơng IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52
I. Kết luận 52
II. Đề nghị 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54



i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
WHO World Health Organization
IARC International Agenecy for Research on Cancer

NCBI National Center for Biotechnology Information
IUUC Hiệp hội phòng chống ung thư thế giới
RECK Reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs
SAM S-denosyl-L-methionine
BRCA Breast cancer susceptibility
DNMT Enzym methyltransferase
MMP Metalloproteinase matrix
ECM Extracellular matrix
TIMP Tissue inhibitor of metalloproteinase
EGF Epidermal Growth Factor
K-ras Kirsten-ras/ V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog
GPI Glycosylphosphatidylinositol
Asn Asparagin
SPIs Serpins
MSP Methylation-Specific PCR
BSP Bisulfite sequencing PCR
Q-MSP Quantitative methylation-Specific PCR
MS-SSCA Methylation-sensitive single-strand conformation analysis
OD Optical Density
ii

UV Ultraviolet, tia tử ngoại
PCR Polymerase Chain Reaction
Tm Nhiệt độ nóng chảy
RNA Ribonucleic acid
DNA Deoxyribonucleic acid
MF Mồi xuôi methyl
MR Mồi ngược methyl
UF Mồi xuôi unmethyl
UR Mồi ngựơc unmethyl

CCDN Cyclin D
NSAID Non-steroidal anti-inflammatory drug
ERK Extracellular signal-regulated kinase
HER-2/neu Human Epidermal growth factor Receptor
HDAC Histone deacetylase
TSA Trichostatin A
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid
HSC Hematopoietic Stem Cell
SCC Somatic Cell Count

iii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR
Bảng 3.1: Phương pháp sử dụng để khảo sát mức độ methyl hóa vùng promoter
gene RECK.
Bảng 3.2: Tỉ lệ methyl hóa gene RECK trong các loại ung thư
Bảng 3.3: Bộ mồi MSP (MR-MF; UR-UF)
Bảng 3.4: Kết quả đánh giá mồi MSP (MF1-MR1; UF1-UR1)
Bảng: 3.5: Kết quả đo OD
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát sự methyl hóa trên vùng promoter gen RECK đối
với 6 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 3 mẫu u sợi tuyến
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát sự methyl hóa trên vùng promoter gen RECK đối
với 15 mẫu bệnh phẩm xét nghiệm nhiễm HPV

iv

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Tình hình ung thư trên thế giới

Hình 1.2: Tỷ lệ mắc bệnh ung thư ở các khu vực trên thế giới
Hình 1.3: Methyl hóa ADN và điều hòa biểu hiện gene
Hình 1.4: Vị trí gene RECK
Hình 1.5 Chức năng kiểm soát của RECK
Hình 1.6: Cấu trúc protein RECK
Hình 1.7: Cơ chế giảm kiểm soát RECK trong ung thư
Hình 1.8. Phương pháp MSP
Hình 2.1: Chu kỳ nhiệt biến đổi bisufite
Hình 2.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Hình 3.1: Tỉ lệ các phương pháp sử dụng để khảo sát mức độ methyl hóa vùng
promoter gene RECK
Hình 3.2: Tần số methyl hóa gene RECK trung bình trong một số loại ung thư
Hình 3.3: Vị trí, cấu trúc gene RECK và promoter gene RECK
Hình 3.4: Trình tự đảo CpG3 và sự phân bố của một số nhân tố phiên mã
Hình 3.5: Vị trí bắt cặp của bộ mồi MSP (MR-MF; UR-UF)trên đoạn trình tự
đích
Hình 3.6: Kết quả Annhyb cặp mồi MF-MR trên vùng promoter của gene
RECK
Hình 3.7: Kết quả Annhyb cặp mồi UR-UF trên vùng promoter của gene
RECK
Hình 3.8: Kết quả điện di mẫu B2
Hình 3.9: Kết quả khảo sát gradient nhiệt độ trên mẫu B1
v

Hình 3.10: Kết quả khảo sát gradient nhiệt độ trên mẫu B2
Hình 3.11: Kết quả điện di mẫu B3
Hình 3.12: Kết quả điện di mẫu B4, B5, B6
Hình 3.13: Kết quả điện di mẫu BP4, BP5
Hình 3.14: Kết quả điện di mẫu C1, C2
Hình 3.15: Kết quả điện di mẫu: C3, C4, C5, C6

Hình 3.16: Kết quả điện di mẫu C9
Hình 3.17: Kết quả điện di mẫu C10, C11, C12
Hình 3.18: Kết quả điện di mẫu C13, C14, C15, C16
Hình 3.19: Kết quả giải trình tự.
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization –WHO),
ung thư là một trong những nguyên nhân chính gây tử vong và ảnh hưởng nghiêm
trọng đến sức khỏe con người trên toàn thế giới. Hiện nay, trong số hơn 200 dạng
bệnh ung thư khác nhau, ung thư vú và ung thư cổ tử cung là các loại bệnh ung thư
thường gặp nhất [63, 18]. Theo báo cáo của tổ chức Y Tế Thế giới WHO có khoảng
8.2 triệu người chết vì ung thư trong năm 2012 và hơn 70% số ca tử vong là ở các
nước có thu nhập thấp và thu nhập trung bình.
Gene RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs) nằm
trên NST 9 ( 9p13.3), có kích thước là 88.023 bp, mã hóa cho lớp màng glycoprotein
hình mỏ neo giúp ngăn chặn sự xâm lấn của khối u và sự hình thành mạch bằng cách
ức chế sự phân giải protein của Maxtri metalloproteinase -9,2,14 ( MMP-9, 2, 14)
[47]. Gene RECK biểu hiện nhiều ở các mô lành nhưng lại rất ít gặp ở những dòng tế
bào ung thư hay dòng nguyên bào sợi bị biến đổi bởi gene gây ung thư. Ở trạng thái
bình thường, RECK hoạt động có tác dụng kiềm chế khối u. Trong trường hợp vùng
promoter bị methyl hóa thì hoạt động của RECK bị ức chế hoàn toàn dẫn đến khối u
tăng sinh không kiểm soát và di căn sang các tế bào lành.
Trên thế giới, nhiều nghiên cứu mức độ methyl hóa vùng promoter của gene
RECK đã được công bố ở các loại ung thư khác nhau: ung thư vú, ung thư cổ tử
cung, ung thư phổi, [36, 32, 29 ]. Do vậy, nhằm tìm hiểu mức độ methyl hóa vùng
promoter gene RECK ở các tế bào ung thư (ung thư vú, ung thư cổ tử cung…) chúng
tôi thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp: “Khảo sát mức độ methyl hóa vùng
promoter gene RECK trong ung thư”. Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học để
xác định gene RECK có phải là dấu chứng sinh học tiềm năng trong tiên lượng, chẩn

đoán và hỗ trợ thông tin cho việc phòng chống và điều trị các bệnh ung thư nói
chung, cụ thể là bệnh ung thư vú và ung thư cổ tử cung.

2

Nội dung nghiên cứu:
 Khảo sát in silico
− Tìm hiểu thông tin về gene RECK và sự tương quan giữa mức độ methyl
hóa gene RECK đối với bệnh ung thư vú, ung thư cổ tử cung.
− Xác định các vị trí đảo CpG thuộc vùng promoter gene RECK.
− Thu thập, đánh giá hoặc thiết kế mồi cho phản ứng Methylation- specific
PCR nhằm khảo sát mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK ở các mẫu
bệnh phẩm (mẫu sinh thiết mô, mẫu máu…) của bệnh nhân ung thư vú và ung
thử cổ tử cung.
 Khảo sát thực nghiệm
− Khảo sát tính đặc hiệu, nhiệt độ lai tối ưu của bộ mồi unmethyl và methyl
trên vùng promoter gene RECK.
− Tiến hành khảo sát mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK ở một
số mẫu bệnh phẩm: mẫu sinh thiết mô vú từ các bệnh nhân mắc ung thư vú
(kèm theo thông tin và các chỉ tiêu lâm sàng, hóa mô miễn dịch) và mẫu mô vú
lành tính của các bệnh nhân mắc bệnh lý khác về vú nhưng không phải là ung
thư do Bộ môn Giải phẫu bệnh, ĐH. Y Dược TP. HCM cung cấp; mẫu DNA
tách chiết từ mẫu máu hoặc dịch phết tế bào âm đạo (kèm các chỉ tiêu lâm
sàng) được xác định nhiễm Human papilloma virus kiểu gene độc và lành do
công ty cổ phần công nghệ Việt Á cung cấp.

3

Chương I
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

I. Tổng quan bệnh ung thư
I.1.
Ung thư
“Ung thư” là thuật ngữ mô tả khoảng 200 loại bệnh với một vài đặc trưng, khởi phát
từ sự hình thành và diễn tiến, tăng trưởng ác tính của những tế bào bất thường trong bất
kỳ mô nào của cơ thể chủ. Các tế bào bất thường phân chia và phát triển “không kiểm
soát”, xân lấn ở các mô tại chỗ, di căn đến các mô ở xa và các bộ phận khác nhau của cơ
thể thông qua hệ thống bạch huyết và máu [1, 64].
Ung thư là loại bệnh lý rất phức tạp, đa căn nguyên với sự hình thành và diễn tiến
đa giai đoạn, bao gồm nhiều loại ung thư: bệnh ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư
đại trực tràng,… Cơ hội được điều trị hiệu quả và giảm nguy cơ tử vong đối với các loại
ung thư vú, ung thư cổ tử cung… nếu được phòng ngừa, tiên lượng, tầm soát và chẩn
đoán sớm ngay trong giai đoạn chưa hoặc không có triệu chứng.
I.1.1.
Tình hình ung thư trên thế giới

Hình 1.1: Tình hình ung thư trên thế giới [61]
4


Hình 1.2: Tỷ lệ mắc bệnh ung thư ở các khu vực trên thế giới [61]
Theo Global (2012), ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu
trên toàn thế giới. Trong năm 2012, trên thế giới có khoảng 14,1 triệu trường hợp ung thư
mới với khoảng 8,2 triệu trường hợp tử vong và 32,6 triệu người sống chung với ung thư.
Ở các nước kém phát triển có khoảng 57% (8 triệu) các trường hợp ung thư mới, 65%
(5,3 triệu) các ca tử vong do ung thư. Tỷ lệ mắc bệnh ung thư ở nam giới cao hơn nữ giới
gần 25%. Tỉ lệ mắc bệnh và tử vong cao nhất ở nam tại Trung và Đông Âu, thấp nhất ở
Tây Phi. Tỉ lệ mắc bệnh và tử vong ở nữ cao nhất tại Bắc Mỹ và Đông Phi, thấp nhất ở
Trung Mỹ và Nam Trung Bộ Châu Á.
Ung thư vú, ung thư cổ tử cung là các loại ung thư gây tử vong cao ở phụ nữ. Tỷ lệ

nhiễm HPV type độc (type 16, 18 ) chiếm 20% các ca tử vong ung thư ở các nước có thu
nhập thấp và trung bình. Bệnh ung thư vú và ung thư cổ tử cung chiếm hơn 60% tổng số
trường hợp mới được phát hiện/chẩn đoán trên thế giới. Chủ yếu tập trung ở châu Phi,
châu Á và Trung và Nam Mỹ với khoảng 70% các trường hợp tử vong do ung thư trên
thế giới. Tổng số trường hợp tử vong do bệnh ung thư trên toàn thế giới được WHO dự
đoán sẽ tiếp tục tăng lên hơn 14 triệu ca vào năm 2030.
5

Các khảo sát dịch tễ học ung thư vú cho thấy có tỷ lệ mắc ung thư vú phân bố theo
địa lý, phân bố theo tuổi và các yếu tố nguy cơ (cư trú, gia đình, bệnh học, sinh sản và
các yếu tố khác). [63]
I.1.2. Tình hình ung thư ở Việt Nam [67]
Theo thông tin của WHO (2010) và IARC (2010), tỷ lệ người bị ung thư ở Việt Nam
là trên 100,000 người thì có khoảng 137 bệnh nhân nam và 94 bệnh nhân nữ bị ung thư
hoặc tử vong.
Ở nữ giới, ung thư vú là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong. Năm 2010, có khoảng 5664
trường hợp ung thư vú với tỷ lệ 13,6 trường hợp trên 100.000 phụ nữ. Ở thành phố Hồ
Chí Minh và các tỉnh thành phía nam, hàng năm có 26 trường hợp mới được phát hiện
trên 100.000 phụ nữ. Bệnh ung thư vú phân bố theo độ tuổi bệnh nhân Việt Nam theo tỷ
lệ 12,9% (40-50 tuổi), 27,7% (45-54 tuổi), 18,5% (55-64 tuổi) và tỷ lệ thấp nhất là 12,9%
(trên 65 tuổi). [63, 65]
Tổ chức IARC (2008) công bố có 5174 trường hợp mới được phát hiện và 2472
trường hợp bị tử vong bởi ung thư cổ tử cung, ước tính chiếm 11,65% ở Đông Nam Á
(44.404 trường hợp), trung bình 11,7 trường hợp trên 100.000 phụ nữ. Từ năm 2008 đến
2010, tầm soát và phát hiện bệnh ung thư cổ tử cung ở 7 tỉnh thành Việt Nam cho thấy có
tỷ lệ 19,9 trường hợp mắc bệnh ở giai đoạn 1 và 21,4% ở giai đoạn 2. Nguyên nhân chính
là nhiễm HPV type độc (16,18). [ 65]
Theo phân bố địa lý, tại thành phố Hồ Chí Minh, ung thư cổ tử cung chiếm tỉ lệ cao
nhất đối với bệnh ung thư ở nữ giới. Tuy nhiên ở thành phố Hà Nội, ung thư vú chiếm tỷ
lệ cao nhất.

I.1.3.
Phân loại ung thư[71]
Ung thư được phân loại dựa vào các loại mô trong đó có nguồn gốc ung thư (loại mô
học) hoặc vị trí ung thư đầu tiên phát triển trong cơ thể như ung thư vú, ung thư cổ tử
cung, ung thư đại trực tràng. Dựa vào phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới 1981, nhóm
các tác giả của Mỹ đã đưa ra một bảng phân loại và đã được áp dụng tại Bệnh viện K Hà
6

Nội và Trung tâm ung bướu Thành phố Hồ Chi Minh từ năm 1993 trong chương trình
hợp tác với trường Đại học Wisconsin Hoa Kỳ và Hiệp hội Quốc tế phòng chống ung
thư:
− Ung thư biểu mô ống xâm nhập
− Ung thư biểu mô tuỷ
− Ung thư biểu mô biến thể tuỷ
− Ung thư biểu mô tiểu thuỳ xâm nhập
− Ung thư biểu mô biến thể tiểu thuỳ xâm nhập
− Ung thư biểu mô nhầy
− Ung thư biểu mô biến thể nhầy
− Ung thư biểu mô ống nhỏ
− Ung thư biểu mô biến thể ống nhỏ
− Ung thư biểu mô tại chỗ thể trứng cá
− Ung thư biểu mô tại chỗ không trứng cá
− Ung thư biểu mô tiểu thuỳ tại chỗ
− Ung thư biểu mô ống vi xâm nhập,…
 Ung thư biểu mô (carcinoma)
Ung thư biểu mô dùng để chỉ một khối u ác tính có nguồn gốc từ tế bào biểu mô và
niêm mạc bên trong hoặc bên ngoài của cơ thể như ống tiêu hóa hay các tuyến tiêu hoá.
Ung thư biểu mô, chiếm 80-90% của tất cả các trường hợp ung thư. Ung thư biểu mô ảnh
hưởng đến các cơ quan hoặc các tuyến có khả năng bài tiết, như tuyến vú sản xuất sữa,
phổi tiết chất nhầy, đại tràng, tuyến tiền liệt hoặc bàng quang.

U lympho có xu hướng phát triển trong hệ bạch huyết (lá lách, amidan, và tuyến ức).
 Ung thư mô liên kết (sarcoma)
Ung thư mô liên kết là nhóm ung thư xuất phát từ mô liên kết, xương hay cơ, gân,
sụn, và chất béo.

7

I.1.4.
Các yếu tố đặc trưng của bệnh ung thư [71]
1.4.1. Phân độ mô học (histologic grade)
Khối u được hình thành từ những tế bào phát triển và phân chia không kiểm soát,
khối u có thể lành tính (không phải ung thư) hay ác tính (là ung thư). Những tế bào ung
thư này xâm lấn và phá hủy các mô lân cận rồi lan sang những vùng khác của cơ thể (di
căn). Phân độ mô học là hệ thống xếp loại các tế bào ung thư dựa vào mức độ bất thường
về hình dạng thông qua quan sát dưới kính hiển vi và dựa vào tốc độ và phát triển và lan
rộng của chúng. Phân độ mô học dựa vào các yếu tố: xác định phân độ của khối u (cấu
trúc và kiểu phát triển của các tế bào). Những yếu tố đặc hiệu trong phân độ mô học tùy
thuộc vào loại ung thư. Theo cách đánh giá của Contesso và Elston, độ của u phụ thuộc
vào tổng số điểm được tính: độ 1: 3-5 điểm, biệt hoá cao; độ 2: 6-7 điểm, biệt hoá vừa; độ
3: 8-9 điểm, kém biệt hoá.
1.4.2. Giai đoạn
Giai đoạn của ung thư chỉ mức độ lan rộng hoặc mức độ nặng của ung thư dựa vào
những yếu tố như: vị trí của khối u nguyên phát, kích thước khối u, số lượng u, và hạch
bạch huyết di căn.
I.2.
Nguyên nhân gây ung thư
Ung thư là kết quả của sự tương tác giữa các yếu tố di truyền của người và các tác
nhân bên ngoài, bao gồm: tác nhân vật lý ví dụ như bức xạ tử ngoại và bức xạ ion hóa;
tác nhân hóa học như amiăng, các thành phần của khói thuốc lá, aflatoxin (chất gây ô
nhiễm thực phẩm) và thạch tín (một chất gây ô nhiễm nước uống); tác nhân sinh học như

nhiễm trùng virus, vi khuẩn hoặc ký sinh trùng. Bên cạnh đó, lão hóa là một yếu tố cơ
bản cho sự phát triển của ung thư, tỷ lệ mắc ung thư tăng lên đáng kể theo tuổi tác.
(WHO, 2012).

8

I.3.
Ung thư vú [1, 2]
Ung thư vú là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu cho phụ nữ trên thế giới. Tỷ lệ
ung thư vú ở đàn ông ít hơn 100 lần so với phụ nữ. Bệnh ung thư vú hết sức phức tạp về
nguyên nhân, sinh học và điều trị.
Các yếu tố của dịch tễ học bệnh ung thư vú bao gồm:
− Phân bố theo địa lý: tỷ lệ ung thư vú cao ở châu Âu và Bắc Mỹ, ở châu Á đang
gia tăng tỷ lệ mắc bệnh.
− Phân bố theo tuổi: tập trung ở độ tuổi 40-60 tuổi.
− Các yếu tố nguy cơ: cư trú, yếu tố gia đình, bệnh học, sinh sản (tuổi khi sanh lần
đầu, số lần sanh), tuổi mãn kinh, yếu tố khác (trọng lượng cơ thể, uống rượu, ).
Các phương thức tầm soát ung thư vú thông qua khám lâm sàng tuyến vú, chụp
nhũ ảnh. Tuy nhiên, chụp nhũ ảnh thông thường thực hiện ở những phụ nữ khoảng hơn
40 tuổi. Vì vậy, việc tầm soát, tiên lượng và chẩn đoán ở giai đoạn sớm ở những phụ nữ
bình thường (không có triệu chứng), ở tuổi mãn kinh có thể giảm tử suất của bệnh ung
thư vú.
I.4.
Ung thư cổ tử cung [1, 2]
Ung thư cổ tử ung ở dạng carcinôm là dạng bệnh gây tử vong đứng hàng thứ hai ở
phụ nữ. Ở những giai đoạn trễ, việc điều trị bệnh phức tạp, tốn kém, không hiệu quả.
Các yếu tố của dịch tễ học bệnh ung thư cổ tử cung bao gồm:
− Phân bố theo địa lý: tỷ lệ ung thư vú cao ở châu Âu và Bắc Mỹ, ở châu Á đang
gia tăng tỷ lệ mắc bệnh.
− Phân bố theo tuổi: các trường hợp bị ung thư cổ tử cung xâm lấn tập trung ở độ

tuổi 48-52 tuổi. Tuy nhiên, hiện nay có một số trường hợp mắc bệnh ở độ tuổi
nhỏ hơn 45 tuổi ở những quốc gia châu Âu, châu Mỹ, mặc dù đã có chương trình
tầm soát ở những quốc gia này.
− Các yếu tố nguy cơ: Nguy cơ ung thư cổ tử cung phát triển theo tuổi, tình trạng
xã hội, tiền sử hoạt động tình dục, hút thuốc và nhiễm virus Human Papilloma
virus kiểu gen độc (kiểu gen 16, 18 ). Yếu tố chủ yếu được các nhà khoa học ghi
9

nhận là tình trạng nhiễm virus HPV kiểu gen độc, nguy cơ cao (HPV 16, 18).
Đây là yếu tố then chốt dẫn đến sự phát triển của những sang thương tiền ung và
ung thư cổ tử cung xâm lấn.
Ung thư tế bào gai của cổ tử cung thường phát triển theo sau quá trình dị sản ở tầng
tế bào biểu mô và ung thư tại chỗ (CIN: cervical intraepithelial neoplasia). Khoảng 20%
các sang thương trên phát triển thành ung thư xâm lấn trong vòng 20 năm. CIN còn có
thể phát hiện dựa vào xét nghiệm tế bào bong. Do vậy, ung thư xâm lấn nếu được tầm
soát sớm sẽ có thể phòng ngừa và điều trị hiệu quả.
II. Sự biến đổi “epigenetics” và methyl DNA
II.1.
Sự biến đổi “epigenetics”
Epigenetics đựơc định nghĩa là sự thay đổi di truyền trong sự biểu hiện của gene
liên quan đến những thay đổi cấu trúc DNA nhưng không liên quan đến thay đổi trình tự
DNA và được di truyền một cách ổn định từ thế hệ này sang thế hệ khác[37]. Epigenetics
bao gồm sự methyl hóa DNA, biến đổi histone và microRNAs[10].
Methyl hóa DNA là một quá trình liên quan đến việc bổ sung một nhóm
methyl(CH3) vào các nucleotide DNA cytosine hoặc adenine [23]. Một số thay đổi
methyl hóa điều hòa biểu hiện gene là di truyền và gây ra sự hòa gene. Methyl hóa DNA
cũng đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của gần như tất cả các loại ung thư
[24]. Methyl hóa DNA ở vị trí 5 của cytosine có tác dụng cụ thể trong việc giảm biểu
hiện gene và đã được tìm thấy trong tất cả các vật có xương sống được kiểm tra [36]. Có
khoảng 60% đến 90% các vị trí nucleotide C trong các cặp CpG bị methyl hóa ở động vật

có vú [3,50].
II.2.
Đảo CpG
Đảo CpG là chuỗi ngắn của DNA có chiều dài 0,5 kilobase đến một vài kilobase
[6], trong đó "p" chỉ ra sự liên kết phosphodiester giữa nucleotide cytosine và guanine
[42] . Các đảo CpG thường được tìm thấy trong ở vùng 5-promoter kéo dài đến exon đầu
10

tiên của nhiều gene giữ nhà (house-keeping gene) và gene đặc trưng cho mô (tissue-
specific genes) [11, 31].
II.3.
Sự methyl hóa DNA
Sự methyl hóa bất thường (vượt mức hoặc giảm) không chỉ giới hạn vài gene mà có
thể trải dài cả bộ gene người [34, 19, 54]. Họ gene DNMTs (DNMTs: DNMT1, DNMT3a,
và DNMT3b, DNML3L) giữ vai trò mã hóa cho nhóm protein DNA methyltransferases
xúc tác quá trình methyl hóa DNA bằng việc tác động chuyển một nhóm methyl từ S-
denosyl-L-methionine (SAM) vào carbon ở đầu 5’ dinucleotide CpG.
Trong các mô bình thường, sự methyl hóa các đảo CpG ở vùng promoter dẫn đến hai
cơ chế điều hòa biểu hiện gene: (1) Ức chế các yếu tố điều hòa biểu hiện gene gắn vào
vùng khởi động do gốc CH3 gắn vào Cytosin (cơ chế này được minh họa trong hình
1.3), (2) Sự gắn đặc hiệu các protein với CpG methyl hóa dẫn đến biến đổi histon (mất
acetyl) và làm cấu trúc sợi chromatin co lại, cuối cùng dẫn đến các yếu tố phiên mã
không gắn được vào vùng đó của DNA. [26]
Sự methyl hóa bất thường, bao gồm methyl hóa vượt mức – hypermethylation (xảy ra
trên nhóm gene đè nén khối u, làm chức năng các gene có lợi này bị bất hoạt) hay giảm
methyl hóa vượt mức – hypomethylation (xảy ra trên nhóm oncogene làm kích hoạt chức
năng các gene bất lợi này) là các cơ chế chính đã được ghi nhận [55,56]. Hậu quả của sự
methyl hóa bất thường ở các đảo CpG là dẫn đến sự kích hoạt biểu hiện gene ở các nhóm
gene sinh ung (onco-gene) hoặc bất hoạt sự biểu hiện gene ở các nhóm gene ức chế khối u
(tumor supressor gene). Hiện tượng bất hoạt sự biểu hiện gene có thể do quá trình giảm ái

lực hay hủy bỏ hoàn toàn khả năng gắn kết của các yếu tố phiên mã (transcription factors)
vào vùng DNA bị methyl hóa hoặc tương tác trực tiếp với DNMTs, histone deacetylase,
methyltransferase hay các nhân tố đồng ức chế phiên mã khác. [1, 45, 7]
11


Hình 1.3: Methyl hóa ADN và điều hòa biểu hiện gene. [57]
A) Hai nucleotid CpG ở vùng promoter không methyl hóa, cho phép thực hiện
phiên mã trong các tế bào bình thường.
B) Phiên mã bị chặn bởi tăng methyl hóa trong vùng promoter.
Sự methyl hóa DNA bất thường đã và đang là hướng nổi bật được các nhà khoa học
tập trung nghiên cứu nhằm đưa ra các phương pháp tiên lượng, chẩn đoán sớm các bệnh
ung thư, trong đó có ung thư vú [52]. Trong nhiều nghiên cứu khoa học ghi nhận sự
methyl hóa bất thường tại vị trí thuộc các đảo CpG vùng promoter của những gene ức chế
khối u, các gene điều chỉnh chu trình tế bào hoặc các gene sinh khối u liên quan đến sự
hình thành, phát triển khối u, dẫn đến di căn ở các bệnh ung thư [10, 22, 37, 48, 52]. Bên
cạnh đó, hiện nay, khuynh hướng sử dụng thuốc epigenetic, chất ức chế methyl hóa, chất
ức chế HDAC đơn lẻ, kết hợp với nhau hoặc với phương pháp hóa trị liệu đã được đưa
vào các thử nghiệm lâm sàng để điều trị ung thư [37,48]. Bởi vậy, sự methyl hóa DNA
bất thường đã và đang là hướng nổi bật được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu
12

nhằm tìm ra dấu chứng sinh học tiềm năng để tiên lượng, chẩn đoán sớm các bệnh ung
thư nói chung, trong đó có ung thư vú và ung thư cổ tử cung.
III. Tổng quan về gene RECK và protein RECK
III.1. Gene RECK
Gene RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs) nằm trên
NST 9 ( 9p13.3), có kích thước là 88.023 base, bao gồm 21 exon và intron 20, với 13
SNPs [7]. Là một gene biểu hiện nhiều ở các mô bình thường nhưng lại rất ít gặp ở những
dòng tế bào ung thư hay dòng nguyên bào sợi bị biến đổi bởi gene gây ung thư. [47]

Hình 1.4: Vị trí gene RECK [72]
Gene RECK mã hóa cho protein RECK là một màng neo glycoprotein có chức năng
quan trọng trong ngăn cản các đợt di căn của khối u nhờ vào sự kiểm soát metalloproteinase
matrix (MMP-2, MMP-9 và MMP- 14 ) và ức chế sự hình thành mạch máu. Ảnh hưởng
trong việc hình thành khối u được thực hiện chủ yếu thông qua các mối quan hệ với MMP
[38]. MMP không chỉ làm suy biến extracellular matrix (ECM) các thành phần ngoại bào và
màng cơ bản, mà nó cũng ảnh hưởng đến những thay đổi trong quá trình phát triển, quá
trình tự giết, và di cư của các tế bào khỏe mạnh. Thông qua việc sửa đổi hoặc phá hủy các
ECM, MMP tham gia vào quá trình di chuyển các tế bào khối u [18].
13


Hình 1.5 Chức năng kiểm soát của RECK [66]
III.2.
Cấu trúc protein [28]
Theo mô tả của Takahashi và cộng sự [49], cấu trúc tổng thể (Hình 1.6) bao gồm
hai khu vực kỵ nước ở hai đầu, 5 cysteine lặp đi lặp lại gần nhóm NH2 cuối, hai khu vực
(EGF)- like ở giữa và ba khu vực ức chế hoạt động serine protease. Nhóm -COOH cuối
cho phép glycosylphosphatidylinositol (GPI) gắn vào màng tế bào.

Hình 1.6: Cấu trúc protein RECK [49]
14

Khu vực có sự lặp đi lặp lại của 6 cysteine năng quan trọng, nó chứa một số
glycosylation ở các vị trí asparagin (Asn) residues. Những vị trí này cần thiết cho sự
tương tác với MMP-9 và MMP-2.
Vùng EGF-like có tương đồng yếu với các trình tự protein EGF, chúng có thể liên
kết với các thụ thể EGF và kích thích phân bào, ảnh hưởng đến sự phát triển tế bào, độ
bám dính, và sự tương tác protein [12].

Vùng nằm ở trung tâm của cấu trúc protein là ba doman serine- protease inhibitor-
like (Hình 1.6). SPIs (serpins) là các protein ức chế hoạt động của protease do phản ứng
bẫy (trapping reactions) và phản ứng đảo ngược gắn chặt (reversible tight binding
interactions). Metalloproteinase matrix (MMP) là một lớp các protease được tiết ra bởi
các tế bào khối u, làm giảm các protein của ECM và cho phép di căn, vùng domain SPI-
like có một vai trò quan trọng trong sự ức chế MMP.
RECK chủ yếu neo vào màng tế bào trong cơ thể thông qua các khu vực kỵ đầu
COOH và tương tác GPI. Protease serine được biết là được gắn vào màng tế bào thông
qua GPI và có một số vai trò quan trọng trong truyền tín hiệu nội bào [39]. Điều này làm
tăng khả năng RECK cũng có chức năng trong quá trình truyền tín hiệu nội bào [39] [49].
III.3.
Cơ chế giảm kiểm soát của RECK trong ung thư [32]
Việc phát hiện ra RECK và khả năng chống lại MMP có ý nghĩa lớn trong điều trị
ung thư. RECK ức chế cả di căn và hình thành mạch máu, và nó đã được xác nhận trong
nhiều nghiên cứu là có khả năng kiểm soát trong nhiều khối u [17]. Sự giảm ức chế hoạt
động của MMP được gây ra bởi sự giảm kiểm soát của RECK tác động biểu hiện bởi K-
ras [17]. Có hai cơ chế liên quan đến K-ras. Đầu tiên là qua trung gian của quá trình
methyl hóa các đảo CpG trong promoter RECK. RAS gây ung thư làm tăng sự gắn kết của
DNA DNMT3b methyltransferase với promoter của RECK và sự gắn kết này gây ra
methyl hóa promoter, tạo ra một sự hỗn độn làm giảm sự biểu hiện gene [13]. Cơ chế thứ
hai gây giảm kiểm soát của RECK là thông qua các vị trí mục tiêu SP1 trên các trình tự
promoter RECK, lý thuyết này giả định rằng RAS tạo điều kiện cho prhosporylation hoặc
15

sửa đổi khác của yếu tố Sp1/Sp3, làm tăng liên kết với các vị trí SP1 trong vùng promoter
của gene RECK và do đó làm giảm các hoạt động sao chép của RECK. Lý thuyết này
được xác nhận bởi các kết quả của Chang và cộng sự [14].


Hình 1.7: Cơ chế giảm kiểm soát RECK trong ung thư [14]

III.4.
Tình hình nghiên cứu về methyl hóa gene RECK
Năm 1998, một công bố tiêu biểu của Takahashi và cộng sự [49] đã chứng minh
gene RECK có khả năng kìm hãm sự xâm lấn khối u bằng cách ức chế sự hoạt động của
MMP-9. Đến năm 1999, R.M. Sasahara và cộng sự đã cho thấy rằng trong trường hợp vị
trí mục tiêu Sp1/Sp3 trên các trình tự promoter RECK bị phong tỏa thì hoạt động kiểm
soát của RECK trong các khối u giảm [47].
Năm 2001, Oh J. và cộng sự ghi nhận gene RECK ức chế MMP-9, MMP-2, MT1-
MMP và ngăn cản sự hình thành của khối u và di căn [40]. Công trình nghiên cứu của
16

Jonathan CM. (2007) và cộng sự đã đưa ra 2 cơ chế dẫn đến sự giảm kiểm soát của
RECK trong các khối u, một trong số đó là sự methyl hóa vùng promoter của gene [28].
Bên cạnh đó, nhóm khoa học nghiên cứu P.L.E. M van Lent và cộng sự (2004) [41],
Tokuhiro Kimura và cộng sự (2010) [51], Kato K. và cộng sự (2008) [29] đã công bố
những nghiên cứu điển hình về mức độ biểu hiện mRNA của gene RECK trong tế bào
của một số bệnh ung thư và trong tế bào lành nhằm chứng minh vai trò kiểm soat của
gene RECK trong sự hình thành và phát triển khối u.
Năm 2007, Cho CY. và cộng sự đã khảo sát mức độ methyl hóa vùng promoter
gene RECK trên 25 bệnh nhân ung thư kết tràng ở Trung Quốc bằng phương pháp MSP
và đã ghi nhận được 44% (11/25) mẫu bị methyl hóa [15]. Năm 2008, Kato K và cộng sự
đã công bố kết quả khảo sát mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK ở 4 mẫu của
4 dòng tế bào: HSC3, HSC4, SCC9, SCC25 bằng phương pháp MSP tại Nhật Bản ở ung
thư vòm họng [29]. Đến năm 2010, tại Trung Quốc cũng bằng phương pháp MSP, Yun-
Yi Du và cộng sự (2010) đã khảo sát trên ung thư dạ dày ở 3 loại mô khác nhau: 47,5%
(19/40) ở mẫu mô khối u nguyên phát, 27,5% (11/40) mẫu niêm mạc bình thường liền
kề, 57,1% (12/21) mẫu hạch di căn [58]. Năm 2011, Victoria K. Hill và cộng sự sử dụng
27 BeadChips- PCR khảo sát trên 14 mẫu bệnh ung thư vú tại Mỹ [53]. Motofumi
Tanaka và cộng sự (2011) cũng công bố kết quả nghiên cứu mức độ methyl hóa vùng
promoter gene RECK trên 75 mẫu bệnh ung thư kết tràng bằng phương pháp

Pyrosequencing [36]. Changsong Zhang và cộng sự (2012) công bố kết quả nghiên cứu
trên 74 mẫu bệnh ung thư gan của bệnh nhân Trung Quốc bằng phương pháp MSP [16].
Tuy nhiên, chúng tôi chưa tìm thấy công bố nào tại Việt Nam hiện về nghiên cứu
gene RECK và khảo sát mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK ở bất kỳ loại bệnh
ung thư nào kể cả ung thư vú. Do vậy, chúng tôi hướng đến mục tiêu tròn nghiên cứu này
là xác định mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK trong các loại ung thư.