ứng dụng pcr đa mồi đặc hiệu xác định mức độ methyl hóa các promoter điều hòa biểu lộ gen ebna1 trong các mẫu sinh thiết bệnh nhân ung thư vòm mũi họng

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tỷ lệ ung thư vòm mũi họng (UTVMH) thay đổi rất khác nhau ở các quần thể
dân cư và các vùng địa lý khác nhau trên thế giới. Nơi có tỷ lệ ung thư vòm cao
nhất là miền Nam Trung Quốc và Grơnlen, trong khi ở châu Âu lại có tỷ lệ rất
thấp. Các nước đông nam Á, trong đó có Việt nam có tỷ lệ UTVMH trung bình.
Virut Epstein-Barr (EBV), các yếu tố môi trường khác và sự nhạy cảm di truyền
đều cho là liên quan đến nguyên nhân ung thư vòm mũi họng và EBV là yếu tố
được nghiên cứu nhiều nhất.
EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu mô không
biệt hóa và tồn tại các thể nhiễm tiềm ẩn I và II, trong đó EBV biểu lộ các gen
quan trọng là EBNA1, LMP1 và 2. EBNA1 giúp duy trì bộ gen EBV trong tế bào
chủ, trong khi LMP1 lại là một gen có chức năng quan trọng liên quan đến dẫn
truyền tín hiệu, chống lại sự chết theo chương trình của tế bào và có khả năng sinh
ung thư trong các tế bào bị nhiễm. Các gen này nằm xa nhau trong bộ gen và được
biểu lộ nhờ những promoter khác nhau. EBNA1 được biểu lộ trong các thể nhiễm
tiềm ẩn nhờ sự hoạt hóa các promoter, bao gồm Cp, Wp và Qp. Tuy nhiên trong
ung thư vòm mũi họng hai promoter Cp và Wp không hoạt động mà chỉ có Qp điều
hòa biểu lộ gen EBNA1.
Ngoại di truyền được cho là có vai trò rất quan trọng trong điều hòa biểu lộ
gen, chúng bao gồm methyl hóa ADN vùng promoter, sửa chữa histon và
nucleosom. Mức độ methyl hóa xảy ra ở các vị trí CpG của ADN tại vùng
promoter và exon1 có vai trò trong điều hòa biểu lộ gen, có thể làm giảm biểu lộ
hoặc không biểu lộ hoàn toàn một gen mà bình thường vẫn được biểu lộ. Việc xác
định mức độ methyl hóa vùng khởi động của một gen có ý nghĩa quan trọng trong
tìm hiểu cơ chế bệnh sinh của bệnh liên quan đến chức năng gen đó trong nhiều
quá trình bệnh lý như ung thư, đồng thời dấu ấn này cũng góp phần trong chẩn
2
đoán sớm trong ung thư. Ngoài ra, việc làm mất methyl hóa có tác dụng làm gen
hoạt động trở lại và thực hiện chức năng của chúng, giúp cho việc điều trị những
rối loạn hay bệnh lý khác nhau.

Hiện nay, nhờ những tiến bộ của sinh học phân tử người ta có thể xác định
được mức độ methyl hóa của một gen đặc hiệu hay toàn bộ bộ gen. Các kỹ thuật
này dựa vào những nguyên lý khác nhau, có những kỹ thuật rất phức tạp, nhưng có
những ký thuật đơn giản và thông dụng. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR đặc hiệu
methyl hóa theo nguyên lý xử lý ADN bằng phương pháp bisulfite để xác định
mức độ methyl hóa các promoter Wp, Cp và Qp liên quan đến biểu lộ gen EBNA1,
đồng thời phát triển PCR đa mồi đối với các promoter đó. Việc phát triển PCR đa
mồi đặc hiệu methyl hóa giúp ích cho nghiên cứu ngoại di truyền ở mức độ ADN
của nhiều gen, đặc biệt là các gen ức chế ung thư.
Đề tài này nhằm mục đích sau:
1. Tìm điều kiện tối ưu cho một phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa cho các
promoter Wp, Cp và Qp của EBV, sử dụng các nguyên liệu là các tế bào dòng.
2. Ứng dụng PCR đa mồi đặc hiệu xác định mức độ methyl hóa các promoter điều
hòa biểu lộ gen EBNA1 trong các mẫu sinh thiết bệnh nhân ung thư vòm mũi họng.
1. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.Tình hình ung thư vòm mũi họng trên thế giới và Việt Nam.
Ung thư vòm mũi họng (UTVMH), một khối u phát triển từ các tế bào biểu
mô nằm ở vị trí cửa mũi sau và vòm họng, là loại đứng hàng đầu trong số các ung
3
thư vùng đầu mặt cổ, với tính chất dịch tễ học khá đặc biệt là liên quan tới địa lý.
Tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi trên thế giới có thể xếp thành 3 vùng rất khác nhau:
Khu vực có tỷ lệ mắc cao nhất là miền Nam Trung Quốc và Grơnlen với tỷ lệ mới
mắc từ 30 - 40/100.000 dân/năm. Ngược lại, vùng có tỷ lệ mắc thấp, gồm châu
Âu, Mỹ chỉ từ 0,7 - 1/100.000 dân/ năm. Còn lại là vùng có tỷ lệ mắc trung bình
nhưng ngày càng có xu hướng tăng lên, đó là vùng Bắc Phi, vùng biển Caribee và
đông nam Á với tỷ lệ từ 8 - 12/100.000 dân (23,39)Ở Việt nam UTVMH đứng
hàng thứ 5 trong các ung thư nói chung và đứng hàng đầu trong các ung thư ở
vùng đầu mặt cổ [4]
1.2. Những yếu tố nguy cơ liên quan đến UTVMH
1.2.1. Vai trò của virut Epstein-Barr .

Virut Epstein-Barr (EBV), là một trong các yếu tố môi trường và được
nghiên cứu nhiều nhất cho thấy có liên quan chặt chẽ của nó với UTVMH. Người
ta phát hiện thấy EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư
biểu mô không biệt hóa (UCNT) và EBV được phát hiện là từ tế bào UTVMH chứ
không phải từ lympho thâm nhiễm đã được chứng minh từ chuột trụi lông được
truyền khối u lấy từ bệnh nhân UTVMH, khối u này không chứa lympho thâm
nhiễm (Klein và cs 1974) [trích từ 89]. Ngoài ra, các sản phẩm gen của EBV là
EBER, EBNA1 và LMP-1,-2 đã được xác định ở hầu hết các mẫu sinh thiết
UTVMH hoặc ở tổn thương quá sản tại biểu mô vòm họng gồm những dòng tế bào
tiền ác tính nhiễm EBV. Điều này phù hợp với giả thuyết cho rằng EBV là một
trong những yếu tố khởi phát trong cả quá trình nhiều bước dẫn đến sự phát triển
của UTVMH [124].
Ngoài việc phát hiện EBV và sản phẩm của nó trong khối u vòm họng,
người ta cũng xác định được các kháng thể chống EBV trong huyết thanh bệnh
nhân. Lượng kháng thể IgG và IgA trong huyết thanh bệnh nhân UTVMH cao hơn
8 - 10 lần so với những bệnh nhân ung thư đầu mặt cổ khác hoặc người khỏe về
4
lâm sàng (Henle và cs 1970, 1973; Klein và cs 1970) [trích từ 89 c.binh]. Đặc biệt
IgA/VCA (kháng nguyên vỏ của EBV), một xét nghiệm sử dụng rộng rãi, thường
qui ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam [6],[8],[7],[13],[18],[25],
[156] , có giá trị để theo dõi và phát hiện nguy cơ mắc UTVMH, đồng thời cũng có
giá trị là một dấu ấn quan trọng theo dõi tái phát sau điều trị bệnh khi nó tăng
cao( ref). Người ta cho rằng sự tái hoạt hóa, sao chép và nhân lên của EBV là hiện
tượng xảy ra trong suốt quá trình phát triển của UTVMH và nó tương quan với
nồng độ IgA/VCA [89].
1.2.2. Môi trường sống và thói quen sinh hoạt
Nhiều tác giả đã đề cập đến môi trường sống như khí hậu, bụi, khói ô nhiễm
liên quan đến UTVMH, nhưng được nói đến nhiều nhất là tập quán ăn uống. Nhiều
nghiên cứu bệnh - chứng được tiến hành đã thu được những kết quả phù hợp với ý
kiến cho rằng, tập quán ăn cá mối của người Trung Quốc (vùng Quảng Đông) là

nguyên nhân quan trọng gây UTVMH, mối liên quan này lớn hơn nếu ăn cá muối
ngay từ nhỏ. Dùng cá muối hàng ngày có thể làm tăng tỷ lệ UTVMH lên 1.8 đến
7.5 lần. Sử dụng thuốc là cây cỏ cũng liên quan đến UTVMH thông qua hoạt hóa
EBV hoặc trực tiếp thông qua ảnh hưởng đến tăng trưởng đến các tế bào chuyển
dạng do EBV. Các bằng chứng khác như hút thuốc lá hoặc dùng formadehyde có
giá trị thấp trong bệnh sinh ung thư vòm họng.
1.2.3. Yếu tố di truyền
Người ta thấy rằng người Trung Quốc sinh ra ở Bắc Mỹ có một tỷ lệ mắc
thấp hơn so với những người sinh ra ở đất nước Trung Quốc, nhưng tỷ lệ mắc
chuẩn vẫn cao hơn dân số nói chung [2]. Điều đó cho thấy rằng yếu tố di truyền có
vai trò trong bệnh sinh của UTVMH. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu mối liên quan
giữa HLA và UTVMH cho thấy có tăng nguy cơ mắc UTVMH với tăng tần suất
các kháng nguyên A11, A2, B17 và liên kết mất cân bằng A2-B17, A11- B17 [13],
5
[20]. Việc xác định các gen khác liên quan với tính cảm thụ bệnh lý cũng đã được
nghiên cứu : CYP 2E1 (chuyển hóa nitrosamine), glutathion transferase M1 [111],
[153]. Cơ chế tác động của chúng cho đến nay vẫn chưa được rõ ràng, song điều
hiện nay đã và đang được khẳng định là sự phát triển UTVMH là do sự phối hợp
tác động của 3 yếu tố môi trường sống, EBV và HLA
1.3. Virut Epstein-Barr
1.3.1. Sinh học của EBV
Trên thực tế, hơn 90 % người trưởng thành trên thế giới nhiễm EBV và nó
tồn tại lâu dài trong cơ thể nhiễm. Việc lây nhiễm EBV chủ yếu thông qua nước
bọt và ở lứa tuổi rất sớm của đời sống con người mà thường không có triệu chứng.
Ngoài ra, EBV có thể được lây nhiễm qua máu, tổ chức và cũng có thể qua sữa của
mẹ truyền sang con, thậm chí là thông qua quan hệ tình dục. EBV nhân lên trong
tuyến nước bọt, sau đó qua biểu mô vòm họng rồi xâp nhập vào tế bào lympho B
qua thụ thể CD21 trên bề mặt tế bào. Sau khi đi vào nhân tế bào, EBV tồn tại ở
dạng vòng là chủ yếu và tự nhân lên nhờ nguyên liệu của tế bào. Tuy nhiên, EBV
cũng tích hợp vào DNA của nhiễm sắc thể tế bào chủ, ví dụ ở tế bào dòng

Namalwa, nó tích hợp vào nhiẽm sắc thể ở vị trí 1p35. Ở thể nhiễm tiềm ẩn trong
lympho B, EBV biểu lộ rất ít kháng nguyên, hơn nữa với số lượng tế bào nhiễm
quá thấp (1 tế bào lympho B/1ml máu) do đó EBV khó bị tiêu diệt bởi hệ miễn
dịch. Khi ở thể dung giải, EBV nhân lên nhiều và giải phóng ra ngoài rồi lại nhiễm
vào các tế bào lympho khác, chúng đến tuyến nước bọt và hình thành chu kỳ nhân
lên trong cơ thể.
Với những tế bào biểu mô không biểu lộ rexeptơ CD21, người ta cho rằng
virut có thể vào bằng những cách sau: Khả năng thứ nhất: có thể xảy ra là sự tiếp
cận giữa tế bào biểu mô vòm họng và tế bào nhiễm EBV. Tế bào B đi vào chu trình
dung giải, bung ra các bản sao của virus, cung cấp một số lượng lớn các hạt virus
mới cho các tế bào khác trên một diện rộng (Bayliss và Wolf 1980,1981) [trích từ
6
89]. Và khả năng thứ hai: virus vào tế bào biểu mô bởi hiện tượng thực bào qua
trung gian rexeptơ với IgA (Sixbey và Yao, 1992) [trích từ 89]. Ngoài ra, phân tử
MHC lớp II cũng có thể là con đường chính virus xâm nhập vào tế bào biểu mô [10].
Ngoài các tế bào lympho B và tế bào biểu mô, đôi khi EBV còn bị tấn công bởi các tế
bào máu khác như đai thực bào, lympho T hoặc tế bào diệt tự nhiên (Nature Killer cell).
1.3.2. Cấu trúc của EBV
EBV thuộc loại virut herpes, gamma-1, chiều dài bộ gen của nó khoảng 172-
kb và ADN là chuỗi đôi, GC chiếm 60% tổng số nucleotid. Suốt chiều dài của gen
có thể chia làm 4 vùng chính: 1 chuỗi ngắn duy nhất (US- short unique ), 1 chuỗi
lặp ( IR- internal repeat), 1 chuỗi dài duy nhất (UL - long unique ) và 1 chuỗi lặp
cuối cùng ( TR - terminal repeat ). EBV hình thành phân tử DNA dạng vòng ở tế
bào bị nhiễm bởi đầu TR của nó.(hình 1A). Khi xử lý EBV của dòng tế bào B95-8
bằng emzym cắt giới hạn BamHI, các đoạn gen tạo ra được ký hiệu theo bảng chữ
cái và theo thứ tự kích thước giảm dần. (hình 1B). Thuật ngữ sử dụng cho từng
đoạn như sau: Theo mỗi chữ là ký hiệu cho từng đoạn ( A, B …), đọc trực tiếp
( trái hoặc phải) và số bắt đầu theo thứ tự (1,2,3…) ví dụ như BARF0, BARF1.
EBV của dòng tế bào B95-8 được giải trình tự gen đầu tiên, và có mã số tại ngân
hàng gen là V01555 [1].

Các EBV sản xuất khoảng 100 kháng nguyên khác nhau (các phân tử protein
lớn) trong thể dung giải của nó, ngược lại, chỉ có khoảng 10 kháng nguyên được
sản xuất trong các thể nhiễm tiềm ẩn [2]
Hình 1. Sơ đồ cấu trúc của EBV
BamHI
IR
UL
TR
US
TR
7
C
B
AA
EBER1&2: EBV Early RNA
EBNA1-6: EBV Nuclear Antigen
LMP1&2: Latent Membrane Protein
1.3.3. Thể tiềm ẩn của EBV
Giống như tất cả các virut herpes, EBV có thể tồn tại dạng không hoạt động
trong tế bào bị nhiễm. Ở thể này, EBV biểu lộ 12 gen, nhưng chỉ có 10 gen trong
số này được phiên mã để tổng hợp protein, bao gồm 6 loại protein là kháng nguyên
nhân (EBV Nuclear Antigen ): EBNA1, 2,,3A,3B,3C, -LP; 3 loại protenin màng
tiềm ẩn ( Latent Membrane Protein): LMP1, 2A, 2B; 2 loại RNA không mã hóa
(EBV Early RNA) : EBER1&2. Có bốn thể tiềm ẩn được phân loại dựa trên sự
biểu lộ gen của virut ( được liệt kê theo bảng dưới) [11].
Bảng 1:
Thể tiềm ẩn Biểu lộ gen
EBV
Người thường và các bệnh
liên quan

0 EBER1 & 2
LMP2A +/-
Người thường
I EBER1 & 2
EBNA1
U lympho Burkitt,
NPC
8
II EBER1 & 2
EBNA1
LMP1
LMP2A&2B
NPC, U lympho loại Hodgkin
U lympho tế bào T, ung thư
tuyến nước bọt…
III EBER1&2
EBNA1- 6
LMP1
LMP2A & B
U lympho sau ghép tạng. U
lympho ở bệnh nhân AIDS, bạch
cầu đơn nhân nhiễn khuẩn,
DLBCL?
1.3.4. Các gen EBVcủa thể nhiễm tiềm ẩn
1.3.4.1. EBNA1
Protein EBNA1 của EBV thuộc dòng tế bào B95-8 có trọng lượng khoảng
66-95 kDa và chiều dài là 641 axit amin. Kích thước này được thay đổi ở các
chủng khác nhau do sự khác nhau ở đoạn lặp lại glycin- alanin (Gly-Ala) [58]. Các
cấu trúc cơ bản của EBNA1 được chia thành bốn vùng rõ ràng: một vùng cơ bản
nằm ở đầu N gồm 89 acid amin, vùng lặp lại Gly-Ala gồm 239 acid amin, vùng cơ

bản ngắn và một vùng gắn DNA ở đầu C có chiều dài từ 459-641 [59, 60] (Hình 3).
EBNA1 là protein biểu lộ ở tất cả các tế bào nhiễm EBV [61-64] và nó đóng
một vai trò quan trọng trong việc duy trì episom của EBV (dạng vòng) trong nhân
tế bào chủ, cũng như chức năng phiên mã của virut [65, 66]. Vùng gắn ADN của
protein EBNA1 tương tác với hai vùng nằm ở vùng oriP của prômôtơ Cp, bao gồm
gia đình lặp đi lặp lại FR (Family of Repeat) có chứa 20 đoạn nucleitid có trình tự
lặp, đoạn DS (Dyat Symetry) có 4 vị trí gắn, và một vùng có hai vị trí gắn xuôi
chiều của Qp.
Hình 2. Cấu trúc của EBNA1
9
Liên kết EBNA1 với vùng FR có ái tính cao nhất so với DS và Qp và khi
gắn với FR thì nó điều hòa phiên mã các gen EBNA. Các gen này được biểu lộ
dưới sự kiểm soát của prômôtơ Cp hay các prômôtơ Wp. EBNA1 cũng có thể liên
kết với các intron đầu tiên xuôi chiều của prômôtơ Qp làm tự điều hòa biểu lộ
protein EBNA1 [72]. Ở các thể nhiễm tiềm ẩn I và II, các prômôtơ Cp không hoạt
động và biểu lộ của EBNA1 được thực hiện bởi Qp. Cp không hoạt động do các
yếu tố phiên mã và methyl hóa ADN [73, 74].
1.3.4.2. EBNA2
Protein EBNA2, có trọng lượng phân tử từ 75-105 kDa. Do có trình tự gen
khác nhau ở các chủng EBV mà người ta xếp thành EBNA2A và EBNA2B, cũng
là dấu ấn quan trọngđể xếp loại EBV typ I và typ II [78]. Các protein EBNA2A và
EBNA2B chứa 484 và 443 axit amin một cách tương ứng và giống nhau về trình tự
khoảng 57% [79, 80]. EBNA2 là một trong những protein virut đầu tiên được biểu
lộ ở các tế bào lympho B bị nhiễm, xuất hiện 24-48 giờ sau khi nhiễm EBV ở nuôi
cấy tế bào in vitro[81]. Protein này là mộtchất kích hoạt phiên mã gen đặc hiệu của
virut và tế bào bao gồm cả những gen như CD21, CD23, Bcl-2 và c-myc [82, 83],
và là cần thiết cho sự bất tử của tế bào B trong in vitro [84, 85] . EBNA2 không
gắn trự tiếp với ADN, nhưng tác động thông qua các protein in khác như RBP-JK),
PU1 các protein các tế bào khác.
1.3.4.3. Gia đình EBNA3 ( EBNA3A, 3B và 3C)

Các gen trong gia đình EBNA3 bao gồm EBNA3A, 3B và 3C nằm ở giữa bộ
gen EBV, có cấu trúc exon-intron tương tự và có trọng lượng phân tử từ 140-180
kDa. Các chuỗi acid amin EBNA3A, 3B và 3C giữa EBV typ 1 và II có giống
nhau ở 84%, 80% và 72% một cách tương ứng [89]. Các protein này hoạt động có
chức năng phiên mã và cũng có thể tương tác với các protein RBP-JK [90].
10
1.3.4.4. EBNA-LP
Các protein EBNA dẫn đầu EBNA-LP có kích thước khác nhau từ 20-130 kDa, là
kết quả của hoạt động prômôtơ Wp . Cùng với EBNA2, EBNA-LP là một trong
những protein đầu tiên biểu lộ sau nhiễm EBV vào tế bào lympho B in vitro
1.3.4.5. LMP1
Protein LMP1 được phiên mã từ vùng BNLF1 nằm ở gần cuối đầu 3'của bộ gen
EBV và có trọng lượng khoảng 60-66kD, tùy thuộc vào chủng virus [104, 105]. Ở
chủng EBV của tế bào dòng B95-8, protein này có ba vùng, (i) một vùng đầu N
gồm 24 axit amin, (ii) sáu vùng xuyên màng kỵ nước được kết nối bởi ba vòng
bên ngoài và hai vòng nội bào (iii) một vùng đầu C có 200 acid min bao gồm hai
lĩnh vực chức năng quan trọng[104, 106] được gọi là vùng hoạt hóa CTAR1 (C-
Trminal Activation Region1: aa194-232) và CTAR2 ( aa 351-386).
LMP1 tham gia ba chức năng chính là chuyển dạng , di căn và chống lại
chết theo chương trình LMP1 được coi là sản phẩm của một gen sinh ung thư vì
nó có thể làm chuyển dạng các nguyên bào sợi động vật gặm nhấm, biến đổi tế
bào Rat-1 trong ống nghiệm để tăng trưởng độc lập, và là tumorigenic ở chuột
nude [109]. Biểu hiện của LMP1 cũng tác động ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng
trưởng của tế bào biểu mô, ức chế sự biệt hóa của chúng, gây biến đổi hình thái
của một số dòng tế bào biểu mô [110, 111], và làm tăng biểu hiện của các yếu tố
tăng trưởng biểu bì (EGFR [112].
1.3.4. 6. LMP2A/2B
LMP2 được mã hóa bởi chỗ ghép nối hình thành dạng vòng của EBV [119]. LMP2
có hai loại là LMP2A và LMP2B, được phiên mã từ hai prômôtơ khác nhau và chỉ
khác là LMP2A có thêm đoạn 119 acid amin ở đầu N tận còn LMP2 thì không có.

Mặc dù chưa biết được chức năng cụ thể của LMP2B, nhưng việc biểu hiện mạnh
mẽ của nócho thấy rằng nó đóng vai trò quan trọng trong sinh học của EBV [120].
11
Trong khi chức năng của LMP2A đã được kiểm tra trong các tế bào B Tuy nhiên,
protein này biểu lộ ở một tỷ lệ thấp trong các khôi u vòm họng.
1.4. Yếu tố ngoại di truyền trong UTVMH
Ngoại di truyền là nghiên cứu các cơ chế làm không biểu lộ gen mà không
liên quan đến sự thay đổi trình tự nucleotid của gen. Những biến đổi ngoại di
truyền có thể di truyền được từ thế hệ tế bào này sang tế bào khác. Khi nói đến
ngoại di truyền người ta thường nhấn mạnh 3 yếu tố là: methyl hóa ADN, sửa chữa
histon và nucleosom. Các thay đối này là độc lập với nhau và methyl hóa xảy ra ở
mức độ ADN trong khi 2 yếu tố còn lại diễn ra ở mức độ protein.
1.4.1. Methyl hóa ADN và điều hòa biểu lộ gen.
Methyl hóa ADN là sự kiện diễn ra do một nhóm CH3 liên kết đồng hóa trị
với vị trí cacbon số 5 của Xytosin nằm ở vị trí hai nu cleotid Xytosin-Guanin viết
tắt là CpG (p là liên kết phosphodiester). Khi CpG tập hợp nhiều trong khoảng
200bp tại một ví trí nào đó trong gen có GC chiếm hơn 50% thì người ta gọi là đảo
CpG. Khoảng 10-15% CpG ở động vật có vú nằm ở vùng đảo CpG và đảo CpG
thường xuất hiện ở vị trí vùng prômôtơ và exon1của khoảng 40% các gen của động
vật có vú. Cơ chế gắn gốc CH3 vào ADN trong quá trình phân bào nhờ các enzym
methyltransferase (DNMT). Có 4 loại DNMT được xác định ở động vật có vú và
cả 4 enzym đều chuyển nhóm CH3 từ S-adenosyl methionin sang ADN. Trong các
mô bình thường các đảo CpG thường không methyl hóa. Khi chúng bị methyl hóa
ở vùng khởi động dẫn đến hai cơ chế điều hòa biểu lộ gen: Một là, ức chế các yếu
tố điều hòa biểu lộ gen gắn vào vùng khởi động do gốc CH3 gắn vào Xytosin, cơ
chế này được minh họa trong hình (?). Hai là, có các protein gắn đặc hiệu với CpG
methyl hóa làm mất axetyl của histon và làm cấu trúc sợi chromatin co lại , cuối
cùng dẫn đến các yếu tố phiên mã không gắn được vào vùng đó của DNA (Hình ?).
12
Hình

Chú thích (Hình ): Một cơ chế không biểu lộ gen bởi methyl hóa ADN.
A: Hai nucleotid CpG ở vùng prômôtơ không methyl hóa, cho phép phiên
mã xảy ra trong các tế bào bình thường.
B: Phiên mã bị chặn bởi tăng methyla hóa trong vùng prômôtơ.
Do đó sự methyl hóa ADN của các gen trong các tế bào ung thư hiện nay là
một mục tiêu hấp dẫn điều trị và là một kiến thức mới trong lĩnh vực chẩn đoán
13
phân tử, tức là, phát hiện sớm bệnh bằng sử dụng PCR để xác định methyl hóa
ADN. [ luận án]
1.4.2. Methyl hóa ADN các promotor của EBNA1
EBNA1 được biểu lộ trong tế bào nhiễm nhờ sự hoạt hóa của các promoter
khác nhau ở những thể tiềm ẩn khác nhau (Wp, Cp và Qp) và chu kỳ dung giải
(Fp). Ở chu kỳ dung giải, EBNA1 biểu lộ do promoter Fp hoạt hóa, trong khi các
promoter khác không hoạt động. Ngược lại, trong thể nhiễm tiềm ẩn Wp, Cp và Qp
được hoạt hóa, tuy nhiên phụ thuộc vào từng thể nhiễm tiềm ẩn I, II hay III. Ở thể
nhiễm tiềm ẩn I và II chỉ có Qp hoạt động, còn thể nhiễm tiềm ẩn III, cả hai
promoter Wp và Cp hoạt động. Hai promoter này hoạt động luân phiên và Wp
được hoạt động trước ở một thời gian ngắn, sau đó mới chuyển sang Cp hoạt động
lâu dài hơn
Hình 4. Các vùng promotor của EBV điểu khiển phiên mã.
Việc các
promoter đóng hoặc mở được thực hiện bởi các yếu tố khác nhau, trong đó có
methyl hóa các CpG vùng promoter. Ở thể nhiễm tiềm ẩn I và II, các promoter Wp
14
và Cp bị đóng lại, do đó EBV chỉ biểu lộ EBNA1 do Qp như trong trường hợp
UTVMH. Tuy nhiên, người ta vẫn chưa biết tại sao trong ung thư vòm mũi họng
EBV lại chỉ có biểu lộ một số gen như đã nêu, khác với trong một số ung thư liên
quan đến EBV. Nghiên cứu về methyl hóa giúp tìm hiều cơ chế biểu lộ gen, đồng
thời nó cũng là những dấu ấn giúp cho chẩn đoán cũng như điều trị liên quan đến

ngoại di truyền vì rối loạn này có thể được sửa chữa nhờ những chất hóa học được
bổ sung vào tế bào .
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu.
15
-Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1/2011 đến tháng 10/2011.
- Mẫu được thu thập tại Khoa xạ trị tổng hợp, Bệnh viện K Hà Nội.
- Các kỹ thuật được tiến hành tại Phòng thí nghiệm của bộ môn Miễn dịch –
Sinh lý bệnh; Labo Trung tâm Y - Sinh học, Trường Đại học Y Hà Nội; Khoa Giải
phẫu bệnh - Bệnh viện K Hà Nội.
2.2. Đối tượng nghiên cứu.
2.2.1. Nhóm bệnh nhân
2.2.2. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân.
- Bệnh nhân mới nhập viện, được chẩn đoán xác định là UTVMH dựa vào
triệu chứng lâm sàng và kết quả giải phẫu bệnh trên mô sinh thiết lấy từ khối u
vòm họng.
Các bệnh nhân được chọn vào nghiên cứu này được xếp loại giai đoạn từ II
đến IVB với T
1-4
N
0 – 3
M
0
theo cách phân loại T. N. M và giai đoạn lâm sàng của
Hiệp hội quốc tế chống ung thư năm 1997
- Tiêu bản mô sinh thiết.
Những tiêu bản mô sinh thiết tươi và tiêu bản mô sinh thiết đúc farafin của
bệnh nhân đã được chẩn đoán là UTVMH thể không biệt hóa.
2.2.3. Tiêu chuẩn loại trừ.
- Các thể mô bệnh học khác ngoài UCNT

- Các bệnh nhân ở giai đoạn 1 hoặc đã có di căn.
- Bệnh nhân đến khám định kỳ
2.3. Phương pháp và chỉ tiêu nghiên cứu:
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu:
- Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang
- Trình tự kỹ thuật cần thực hiện:
+ Thiết kế mồi.
+ Chiết tách AND, ARN, Protein.
+ Xử lý AND bằng Bisulfite
16
+ Chạy kỹ thuật PCR đơn mồi.
+ Chạy kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu.
2.3.2. Biến số và chỉ số nghiên cứu:
2.3.3. Phương pháp thu thập thông tin
- Quan sát và ghi kết quả xét nghiệm
- Hồi cứu thông tin từ hồ sơ bệnh án và điền phiếu theo mẫu (phụ lục kèm theo)
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được làm sạch trước khi nhập vào máy tính. Xử lý số liệu bằng
phần mềm chương trình SPSS 15.0 với các test thống kê thích hợp trong y học
2.5. Sơ đồ nghiên cứu
RT-PCA
CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ
Tách chiết mẫuMẫu
ProteinARNADN
CDNABisulfite
MMSPMSP
PCR
17
CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN
18

CHƯƠNG 5. DỰ KIẾN KẾT LUẬN
19
KHUYẾN NGHỊ
20
KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU
21
1. Tiến độ về thời gian
Các hoạt động triển khai 1,2,3 4,5,6,7 8 9 10 11,12
Nghiên cứu tài liệu và viết, bảo
vệ đề cương
Thu thập số liệu
Nhập số liệu
Xử lý số liệu
Viết báo cáo và bảo vệ
2.Dự trù kinh phí
Công việc Thành tiền
1.Chuẩn bị đề cương
- Công thu thập tài liệu tham khảo
- Photo tài liệu tham khảo
- Hoàn thiện đề cương
500.000đ
200.000đ
100.000đ
200.000đ
2. Thu thập số liệu
- Triết tách mẫu
28.000.000
4000.0000
22
- Hóa chất và sinh phẩm:

+ Bisufite
+ DNTPs
+ Enzym (Buffer)
+ Mồi
8000.000/1kit
7.500.000
5000.000/250 mẫu
3.500.000/40 Nucleotid
4. In ấn tài liệu 1.000.000đ
5. Chi phí phát sinh 500.000đ
Tổng số tiền 30.000.000đ
.
Phạm Thụy Liên, Lê Vũ Anh và Cs (2002), "Một vài đặc điểm dịch tễ học của
bệnh nhân ung thư vòm họng ở Miền bắc Việt nam", Y học thực hành, 4(8),
tr.3-8.