phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng steinernema sp.tđ3 ở tam đảo, vĩnh phúc có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
………… o0o…………






HOÀNG THỊ BÍCH






PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI
TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG
STENERNEMA SP.TĐ3 Ở TAM ĐẢO, VĨNH PHÚC CÓ KHẢ NĂNG
KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM

LUẬN ÁN THẠC SỸ SINH HỌC










Hà Nội, 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
………… o0o…………






HOÀNG THỊ BÍCH

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI
TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG
STENERNEMA SP.TĐ3 Ở TAM ĐẢO, VĨNH PHÚC CÓ KHẢ NĂNG
KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM







LUẬN ÁN THẠC SỸ SINH HỌC










Hà Nội, 2010
1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỞ ĐẦU
Ngày nay, nhờ sự có mặt của nhiều kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn
mạnh nên đã góp phần giải quyết được nhiều bệnh nhiễm trùng mắc phải. Tuy

nhiên tỷ lệ đề kháng kháng sinh của vi khuẩn đang ngày càng tăng cao (ở Mỹ:
khoảng 70%). Theo ước tính của các Trung tâm kiểm soát bệnh (Centers for
Disease Control - CDC) của Mỹ, hàng năm ở Mỹ có khoảng 90 000 ca tử
vong/ 2 triệu ca mắc bệnh nhiễm trùng [1].
Sự kháng thuốc của nhiều loại vi khuẩn ngày càng gia tăng đang là mối
lo ngại mang tính toàn cầu. Nhiều kháng sinh mà con người tìm ra nay không
còn công hiệu trong việc điều trị. Nhiều kháng sinh chỉ xuất hiện và sử dụng
trong một thời gian ngắn bị kháng, trong khi việc nghiên cứu tìm ra những
loại kháng sinh mới không thể thực hiện trong thời gian ngắn, nhất là tìm ra
những loại kháng sinh điều trị vi khuẩn kháng kháng sinh. Vì vậy, nhu cầu
khẩn cấp là cần có những thuốc kháng vi sinh vật mới để kiểm soát những căn
bệnh một cách có hiệu quả [2]. Chính vì vậy, ngoài những kháng sinh tổng
hợp, kháng sinh bán tổng hợp, kháng sinh tự nhiên đang có mặt trên thị
trường thì ngành công nghiệp dược phẩm đang tìm kiếm những chất kháng vi
sinh vật từ những nguồn gốc khác vừa có hiệu lực cao, vừa có hoạt phổ rộng
mà lại thân thiện với môi trường.
Các vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh với côn trùng
(Entomopathogenic Nematodes - EPN) đang là đối tượng nghiên cứu mới của
các nhà khoa học về khả năng diệt côn trùng gây hại và khả năng sinh kháng
sinh khi chúng có khả năng ngăn chặn các vi sinh vật khác xâm nhập vào xác
chết côn trùng vật chủ. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy sản phẩm trao đổi chất
thứ cấp của các vi khuẩn cộng sinh có khả năng kháng vi sinh vật hoạt phổ
rộng, ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn, nấm và các tế bào ung thư [6,15].
Việt Nam là đất nước có vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ấm,
mưa nhiều nên tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng có tính đa dạng khá
2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

cao. Hiện nay, khoảng hơn 40 chủng EPN đã được phân lập từ các vùng sinh
thái khác nhau của Việt Nam [3,8] và đây cũng là nguồn cung cấp vi khuẩn

cộng sinh có ý nghĩa khoa học không chỉ ở Việt Nam mà còn có ý nghĩa trên
thế giới trong việc nghiên cứu các chất kháng sinh mới phục vụ cho con
người, động vật, thực vật.
Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứ u về tuyế n trù ng rất có giá trị v à có
ý nghĩa khoa học trong xác định hình thái , đa dạ ng loà i nhưng chưa có nhiều
nghiên cứ u về vi khuẩ n cộ ng sinh vớ i tuyế n trù ng và các sản phẩm trao đổi
chất của chúng. Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài
Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký
sinh gây bệnh côn trùng Steinernema sp.TĐ3 ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc có
khả năng kháng khuẩn, kháng nấm.
Với mục tiêu:
- Phân lập vi khuẩn cộng sinh từ tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3 ở
Tam Đảo, Vĩnh Phúc.
- Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng vi
khuẩn phân lập được.
- Xác định một số ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng
kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng vi khuẩn cộng sinh.
- Tách chiết hoạt chất và thử khả năng kháng vi sinh vật kiểm định.
- Định loại vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3 bằng
phương pháp sinh học phân tử trên cơ sở phân tích đoạn gen 16S rDNA.
3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Chƣơng I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát chung về tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng
Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng là loài giun tròn (Nematodes)
có ích, ký sinh ở một số loài côn trùng có hại- làm suy yếu hoặc giết chết
những côn trùng này, nhưng lại rất an toàn đối với người, động vật và thực
vật [3].

Trong số hàng nghìn loài tuyến trùng ký sinh ở côn trùng thì chỉ có
nhóm Entomopathogenic nematodes (EPN) có khả năng vừa ký sinh vừa gây
bệnh cho côn trùng, gồm 2 giống Steinernema và Heterorhabditis (giống
Steinernema thuộc họ Steinernematidae và Heterorhabditis thuộc họ
Heterorhabditidae của ngành giun tròn.
Mặc dù các loài tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng thuộc giống
Steinernema và Heterorhabditis là những loài ký sinh bắt buộc ở côn trùng
nhưng chúng lại có một pha chuyên hóa tồn tại bên ngoài vật chủ côn trùng,
(thường là môi trường đất). Đó là ấu trùng tuổi 3, còn gọi là ấu trùng xâm
nhiễm (infective juveniles - IJs), là giai đoạn đặc biệt trong vòng đời phát
triển của nhóm tuyến trùng này. Ở giai đoạn này, IJs không cần dinh dưỡng
nhưng chúng lại có khả năng tồn tại lâu dài trong môi trường đất, khi chưa
gặp vật chủ. Đây là giai đoạn ấu trùng nằm chờ trong đất và sẵn sàng xâm
nhập vào vật chủ thích hợp để ký sinh, gây bệnh.
Khi tìm được vật chủ thích hợp, IJs xâm nhập vào cơ thể côn trùng qua
các lỗ mở tự nhiên như miệng, hậu môn hoặc lỗ thở hoặc một số dạng IJs
được trang bị mấu kitin dạng sừng có thể đục thủng thành cơ thể côn trùng tại
một nơi xung yếu là ranh giới giữa các đốt cơ thể để xâm nhập. Sau khi vào
cơ thể vật chủ, IJs nhanh chóng xâm nhập vào xoang máu, tại đây vi khuẩn
cộng sinh được giải phóng. Nhờ môi trường thích hợp là huyết tương vật chủ,
4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

vi khuẩn cộng sinh nhân nhanh số lượng và tạo ra độc tố gây chết vật chủ
trong vòng 24 -48h [3].
1.1.1. Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema
Tuyến trùng Steinernema sinh sản theo kiểu phân tính nhờ giao phối
giữa đực và cái, trứng con cái được thụ tinh bởi tinh trùng của con đực. Điều
này cũng có nghĩa là để sinh sản được trong cơ thể côn trùng vật chủ, tuyến
trùng cần xâm nhập cả IJs đực và IJs cái, để chúng phát triển thành cả đực và

cái trưởng thành, cho phép chúng có điều kiện ghép đôi trong vật chủ.
Ở giai đoạn đầu, con cái đẻ trứng vào cơ thể côn trùng và trứng nở
thành ấu trùng thế hệ 1. Các ấu trùng của thế hệ 1 không phát tán ra ngoài mà
ở lại bên trong xác chết cơ thể vật chủ để dinh dưỡng bằng chính các mô của
côn trùng vật chủ và phát triển nhanh chóng đạt đến giai đoạn trưởng thành
thế hệ 2. Trong trường hợp xác chết vật chủ vẫn còn nguồn thức ăn, thế hệ 2
tiếp tục giao phối và tiếp tục phát triển qua thế hệ 3, thậm chí cả thế hệ 4 bên
trong cơ thể vật chủ. Cuối cùng, khi nguồn dinh dưỡng đã hết, thế hệ cuối
cùng trong xác chết côn trùng dừng lại ở pha ấu trùng tuổi 2. Các ấu trùng này
bắt đầu chui ra khỏi xác chết côn trùng và phát tán ra môi trường bên ngoài và
trở thành IJs (tuổi 3) và từ đây chúng tiếp tục một chu kỳ phát triển mới với
côn trùng vật chủ mới.
1.1.2. Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Heterorhabditis
Không giống với các loài Steineinema, ở các loài tuyến trùng
Heterorhabditis, IJs khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng phát triển thành con
cái lưỡng tính (Hermaphroditis). Con cái này có khả năng sản sinh ra tinh
trùng cùng với trứng và tự thụ tinh để sinh sản. Từ thế hệ 2 trở về sau, IJs mới
phát triển thành con trưởng thành phân tính đực cái và sinh sản bằng hình
thức giao phối. Giai đoạn đầu của con cái cả lưỡng tính và phân tính, chúng
đẻ trứng (oviparous) nhưng ở giai đoạn sau khi con cái về già chúng đẻ trứng
5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

thai (oviviparous); lúc này ấu trùng nở ra bên trong cơ thể con mẹ và sử dụng
cơ thể mẹ làm nguồn thức ăn để phát triển thành ấu trùng tuổi 2, biến con cái
thành bọc chứa ấu trùng tuổi 2. Khi phá vỡ thành cơ thể con mẹ chui ra ngoài
trở thành ấu trùng cảm nhiễm (tuổi 3) chúng vẫn giữ lại vỏ cutin của ấu trùng
tuổi 2 [3].
1.2. Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN
Mỗ i ấ u trù ng xâm nhiễ m củ a tuyế n trù ng EPN (infective juveniles –IJs)

mang trong ruộ t củ a chú ng mộ t loà i vi khuẩ n cộ ng sinh chuyên hó a và chúng
đều gây bệnh cho côn trùng khi xâm nhập vào máu. Các nghiên cứu trong 20
năm qua từ tuyến trùng EPN cho thấy vi khuẩn Xenorhabdus cộng sinh trong
ruột của ấu trùng cảm nhiễm của Steinernema, còn với các loài giống
Heterorhabditis thì vi khuẩn cộng sinh thuộc giống Photorhabdus [15].
1.2.1. Vi khuẩn Xenorhabdus
Xenorhabdus là trực khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, hình que, kỵ khí
không bắt buộc. Chúng sinh trưởng ở nhiệt độ tối ưu là 28
0
C; một số chủng có
khả năng phát triển ở 40
0
C.
Xenorhabdus khác với các chi khác của họ Enterobacteriaceae là có
kích thước tế bào lớn 0,3 – 2 x 2 – 10 μm. Lên men đường glucose sinh acid
(không sinh khí) và một số đường khác ít lên men. Phản ứng catalase âm tính
và không có khả năng chuyển nitrat thành nitrit. Đa số các chủng có
deoxyribonuclease (DNase) và protease dương tính. Xenorhabdus có mối
quan hệ mật thiết với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng giống
Steinernema và có đặc tính miễn dịch.
Ở IJs của các loài Steinernema spp., VKCS nằ m trong mộ t cá i bọ c ở
phầ n trướ c củ a ruộ t , phía sau thực quản . Các tổ hợp tuyến trùng và vi khuẩn
này có tính chuyên hóa khá cao: mỗi loại tuyến trùng có thể tổ hợp với một số
6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

loài vi khuẩn, nhưng mỗi loài vi khuẩn chỉ tổ hợp với một loài tuyến trùng
nhất định (bảng 1.1) [33].
Bảng 1.1. Mối quan hệ giữa tuyến trùng và vi khuẩn cộng sinh
TT

EPN
VKCS
Tài liệu tham khảo
1
Steinernema
abbasi
Flavimonas
oryzihabitans
Elawad et al., 1998
2
S. affine
X. bovienii
Akhurst & Boemare, 1990
3
S. apuliae
X. kozodoii
Tailliez et al., 2006
4
S. arenarium
X. kozodoii
Tailliez et al., 2006
5
S. bicornutum
X. budapestensis
Tailliez et al., 2006
6
S. carpocapsae
X. nematophila
Akhurst & Boemare, 1990
7

S. ceratophorum
X. budapestensis
Tailliez et al., 2006
8
S. cubanum
X. poinarii
Tailliez et al., 2006
9
S. diaprepesi
X. doucetiae
Fischer-Le Saux et al., 1998
10
S. feltiae
X. bovienii
Akhurst & Boemare, 1990
11
S. glaseri
X. bovienii
Akhurst & Boemare, 1990
12
S. hermaphroditum
X. griffiniae
Tailliez et al., 2006
13
S. intermedium
X. bovienii
Poinar, 1990
14
S. karii
X. hominickii

Tailliez et al., 2006
15
S. kraussei
X. bovienii
Akhurst & Boemare, 1990
16
S. kushidai
X. japonica
Nishimura et al., 1994
17
S. longicaudum
X. ehlershii
Tailliez et al., 2006
18
S. monticolum
X. hominickii
Fischer-Le Saux et al., 1998
19
S. puertiricense
X. romanii
Tailliez et al., 2006
20
S. rarum
X. szentirmaii
Tailliez et al., 2006
21
S. riobravis
X. cabanillasii
Tailliez et al., 2006
22

S. scapterisci
X. innexi
Fischer-Le Saux et al., 1998
23
S. scarabaei
X. koppenhoeferi
Tailliez et al., 2006
24
S. siamkayai
X. stockiae
Tailliez et al., 2006
25
S. thermophilum
X. indica
Somvanshi et al., 2006
26
S. weiseri
X. bovienii
Tailliez et al., 2006
27
Heterorhabditis
bacteriophora
Photorhabdus
luminescens
Poinar, 1990
28
H. megidis
P. luminescens
Poinar et al., 1987

7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Bảng 1.1 cho thấy X. bovienii có quan hệ cộng sinh với 4 loài
Steinernema, trong khi X. poinarii với 2 loài, còn 3 loài vi khuẩn
Xenorhabdus khác chỉ có quan hệ cộng sinh với duy nhất 1 loài Steinernema.
Điều đó cho thấy tính chuyên hóa của tổ hợp tuyến trùng - vi khuẩn nhưng
cũng có tính đa dạng khá cao.
1.2.2. Vi khuẩn Photorhabdus
Photorhabdus có kích thước 0,5 -2 x 1- 10 μm, Gram âm, không sinh
bảo tử và di động bằng lông rung. Hô hấp kị khí không bắt buộc, nhiệt độ tối
ưu là 28
0
C; một số chủng phát triển ở 37- 38
0
C. Photorhabdus có phản ứng
catalase dương tính nhưng không khử nitrat (chủ yếu âm tính với một số loài
thuộc họ Enterobacteriaceae). Photorhabdus lên men glucose sinh axit, không
sinh khí và cũng có khả năng lên men đường Fructose, D- mannose, maltose,
ribose, và N – acetylglucosamine sinh axit, lên men glycerol yếu.
IJs củ a cá c loà i tuyế n trù ng Heterorhabditis spp., thì vi khuẩn cộng
sinh nằ m dả i rá c theo chiề u dà i củ a ruộ t , nhưng chủ yế u vẫ n là ở nử a trướ c
của ống ruột. Hầu hết các loài vi khuẩn giống Photorhabdus có khả năng tạo
sáng huỳnh quang sinh học [8].
1.2.3. Sự chuyển pha của vi khuẩn cộng sinh
Sự biến đổi pha là một đặc điểm phổ biến của vi khuẩn, đó là sự thay
đổi đảo nghịch cho phép vi khuẩn tránh được hàng rào miễn dịch của côn
trùng vật chủ hoặc sự nhiễm của thực khuẩn thể. Sự biến đổi pha cũng xuất
hiện ở các loài vi khuẩn giống Xenorhabdus và Photorhabdus.
Sự biến đổi pha trong Xenorhabdus được mô tả như là sự dị hình 2

dạng khuẩn lạc trên môi trường agar, các khuẩn lạc này khác nhau về màu
viền khuẩn lạc của chúng [22,26,31].
Sự biến đổi pha trong Xenorhabdus đã được nghiên cứu khá đầy đủ ở
X. nematophilus và xác định được các đặc trưng chính của sự biến đổi pha
8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

trong loài này [19]. Đặc trưng của pha I là nhuộm màu đường viền xanh (xanh
bromothymol và đỏ congo) và sản sinh các chất kháng sinh, lecithinese [26],
thể vùi protein và tua viền [16]. Ở pha II hoặc không có những đặc trưng như
ở pha I hoặc có những biểu hiện rất yếu. Các tế bào pha I lớn hơn và đa hình
hơn ở pha II [26].
Các nghiên cứu gần đây cho thấy vai trò của pha I là sản sinh các chất
kháng khuẩn, kháng nấm nhằm ức chế các vi sinh vật khác xâm nhập vào xác
chết côn trùng, do đó hạn chế sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng, dành nguồn
dinh dưỡng cho tuyến trùng. Ngoài ra, bằng cách thủy phân côn trùng bằng hệ
enzyme protease, lipase,… pha I có khả năng chuyển hóa cơ chất thành các
sản phẩm phù hợp hơn cho tuyến trùng tăng trưởng và sinh sản. Sự xuất hiện
của hiện tượng này trong các vi khuẩn cộng sinh của tuyến trùng EPN rất
mạnh mẽ cho thấy rằng nó là một yếu tố quan trọng trong mối tương quan
giữa tuyến trùng, vi khuẩn và côn trùng vật chủ. Tuy nhiên, giai đoạn biến thể
(pha II) chưa có những nghiên cứu rõ ràng về chức năng của chúng trong tổ
hợp tuyến trùng - vi khuẩn - côn trùng vật chủ [3].
Pha I và pha II có thể được duy trì như những dòng thuần chủng bằng
kỹ thuật nhân dòng thông thường [16].
1.3. Mố i quan hệ tương tá c giữ a tuyế n trù ng và vi khuẩ n cộ ng sinh
Quan hệ cộng sinh là một mối quan hệ sinh thái cực kỳ phổ biến trong
các quần xã sinh vật trong sinh giới. Nó đóng vai trò quan trọng trong việc
hợp thành các dạng sống chính trên Trái đất và tạo ra sự đa dạng sinh học vô
cùng phong phú này.

Tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh tương tác với nhau, mỗi bên
đều thực hiện những nhiệm vụ, chức năng riêng để sinh tồn và phát triển
nhưng lại giúp bên kia để tồn tại, tổ hợp này không thể tách rời và tồn tại độc
lập trong môi trường tự nhiên được.
9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.3.1. Vai trò của tuyến trùng
* Tuyến trùng làm vector vận chuyển vi khuẩn cộng sinh:
Khi xâm nhập vào vật chủ côn trùng các IJs đóng vai trò như vector vận
chuyển vi khuẩn cộng sinh vào bên trong vật chủ côn trùng, sau đó tuyến trùng
di chuyển thẳng vào xoang máu côn trùng và giải phóng vi khuẩn cộng sinh.
* Tuyến trùng bảo vệ vi khuẩn cộng sinh:
- Bảo vệ vi khuẩn cộng sinh ở môi trường ngoài côn trùng vật chủ,
bằng cách để vi khuẩn cộng sinh trong bọc chứa nằm trong ruột chúng do vi
khuẩn cộng sinh không thể tự tồn tại ở ngoài môi trường (đất, nước).
- Bảo vệ vi khuẩn cộng sinh ở trong cơ thể côn trùng: khi vi khuẩn
cộng sinh được giải phóng từ cơ thể tuyến trùng vào xoang máu của côn
trùng, thì theo phản ứng tự nhiên, côn trùng thường tiết ra một số chất kháng
thể (dạng protein) để hạn chế hoặc loại bỏ vi khuẩn cộng sinh , trong khi đó
nhờ tuyến trùng cũng có khả năng tiết ra một số chất làm trung hòa là làm mất
tác dụng kháng thể của các chất này. Nhờ vậy, tuyến trùng bảo vệ cho vi
khuẩn cộng sinh phát triển bình thường trong cơ thể côn trùng [3].
1.3.2. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh
* Vi khuẩn cộng sinh sản sinh độc tố giết chết côn trùng bị nhiễm:
Độc tố do vi khuẩn cộng sinh tiết ra một số protein độc có khả năng
nhiễm cho xoang máu côn trùng vật chủ và làm cho côn trùng vật chủ chết
một cách nhanh chóng trong vòng 24 – 48h. Như vậy, thời gian chết côn trùng
vật chủ khác nhau tùy loại tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn và cũng phụ thuộc
vào loại côn trùng vật chủ nhưng thường không chậm hơn 48h.

* Vi khuẩn cộng sinh cung cấp nguồn thức ăn cho tuyến trùng:
Khi mới bắt đầu xâm nhập vào cơ thể côn trùng, tuyến trùng đã sử
dụng vi khuẩn cộng sinh vừa được giải phóng từ cơ thể chúng và sinh sôi
trong xoang máu côn trùng như nguồn dinh dưỡng của chúng. Nhờ đó, các IJs
cũng nhanh chóng phát triển sang tuổi 4 và đạt đến trưởng thành. Từ thế hệ
10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

thứ hai tuyến trùng chuyển sang dinh dưỡng bằng mô côn trùng đã được vi
khuẩn hoạt hóa [8].
* Vi khuẩn cộng sinh hoạt hóa xác chết côn trùng:
Nhờ các enzyme do vi khuẩn sinh ra, các mô cơ thể côn trùng vật chủ
được hoạt hóa thành nguồn thức ăn thích hợp đối với tuyến trùng. Nhờ đó, từ
thế hệ 2 tuyến trùng sử dụng chính xác chết côn trùng đã được hoạt hóa như
nguồn thức ăn để tiếp tục phát triển, sinh sôi nảy nở các thế hệ tiếp theo.
Thông thường trong cơ thể côn trùng vật chủ, tuyến trùng có thể phát triển 2
đến 4 thế hệ, phụ thuộc vào sinh khối côn trùng vật chủ làm nguồn thức ăn
cho chúng.
* Vi khuẩn cộng sinh ngăn cản các vi khuẩn khác xâm nhập vào xác
chết côn trùng:
Vi khuẩn cộng sinh có khả năng sinh ra các hoạt chất kháng sinh để
ngăn cản tác nhân sinh học khác như nấm hoặc vi khuẩn xâm nhập và phát
triển trên xác chết côn trùng. Điều này có ý nghĩa là chúng có khả năng bảo
vệ nguồn thức ăn nguyên vẹn dành cho tuyến trùng cộng sinh với chúng.
Như vậy, có thể nói đây là một trong những mô hình cộng sinh hoàn
hảo giữa hai loài sinh vật trong tự nhiên. Mô hình cộng sinh này vừa chuyên
hóa cao đến mức sự tồn tại của loài này bắt buộc phải có sự hiện diện và cộng
sinh của loài kia và ngược lại.
1.4. Sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn cộng sinh
Sau khi xâm nhập vào huyết tương vật chủ, vi khuẩn cộng sinh sinh

trưởng và phát triển được là nhờ hệ enzyme như proteinase, lypase, có tác
dụng vừa gây độc đối với côn trùng vật chủ, vừa thuỷ phân nguồn dinh dưỡng từ
côn trùng tạo các sản phẩm trao đổi chất đơn giản, dễ hấp cho tuyến trùng [3].
Cùng với đó, các chất trao đổi thứ cấp của vi khuẩn cộng sinh mang
hoạt tính kháng khuẩn, ngăn cản các vi sinh vật khác xâm nhập vào xác chết
côn trùng, bảo vệ nguồn thức ăn cho tuyến trùng.
11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.4.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật
Sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn cộng sinh là những dẫn xuất indol,
xenorhabdin và xenocoumacins.
Xenorhabdin có hoạt tính kháng khuẩn [35], Xenorhabdin I, II, III, IV
và V là những chất kháng sinh và thuốc trừ sâu. Các chất này được tổng hợp
từ X. nematophila hay X. luminesce. Trong đó, xenorhabdin I và III được
phân lập từ X. bovienii ATCC 39497 nhờ sử dụng sắc ký cột. Những hợp chất
hoá học này tương ứng với xenomides I và III là đều có hoạt tính kháng
khuẩn và kháng nấm khi chúng lần lượt kháng lại Bacillus subtillis và Botrytis
cinerea [41,42].






Hình 1.1. Công thức cấu tạo của xenorhabdincin
12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nematophin đã được phân lập từ X. nematophila và phát hiện trong tất

cả các dạng của X. nematophilus có hoạt tính mạnh mẽ chống lại một loạt các
loài nấm và vi khuẩn.

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của nematophin
Vi khuẩn cộng sinh sản sinh ra những kháng sinh có kích thước phân tử
lớn và nhỏ. Kháng sinh phân tử nhỏ ức chế sự phát triển của nhiều loài vi
khuẩn và nấm, nhiều trong số đó quan trọng đối với nông nghiệp và y dược,
như Escherichia, Staphylococcus, Aspergillus và Botrytis. Trái lại, kháng
sinh phân tử lớn như bacteriocin ức chế sự phát triển của nhiều loài và chủng
có quan hệ gần gũi với Xenorhabdus và Photorhabdus [23]. Akhurst (1982)
cho thấy hoạt tính kháng sinh của Xenorhabdus spp. chống lại nhiều vi sinh
vật, gồm vi khuẩn gram dương Micrococcus, Staphylococcus và Bacillus, vi
khuẩn gram âm như Escherichia, Shigella, Enterobacter, Seratia, Proteus,
Erwinia, Flavobacterium và Pseudomonas, và nấm Candida và
Saccharomyces. Chen et al. (1994) quan sát hoạt tính kháng sinh mạnh ở dịch
nuôi cấy VKCS đối với nấm gồm Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum,
Fusarium solani, Mucor piriformis, Pythium coloratum, Pythium ultimum,
Penicillium spp., Rhizoctonia solani, Trichoderma pseudokingii và
Verticillium dahliae.
Sau khi các chất kháng sinh hydroxystilbenes và indoles được tách
chiết từ dịch nuôi cấy Photorhabdus và Xenorhabdus bởi Paul et al. (1981),
13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

nhiều chất kháng sinh được thông báo như xenorhabdins [36]; xenocoumacins
[40], xenorxides [34], xenomins và nematophin [35] (bảng 1.2).
Bảng 1.2. Danh mục các chất kháng sinh
và hoạt tính sinh học của chúng đƣợc biết từ Xenorhabdus spp.
Tên loài
Chất kháng sinh

Hoạt tính
Tài liệu tham khảo
X. nematophila
Xenocoumacin
1,2,3
McInemey et al., 1991a
Xenorhabdin
1,2,4
McInemey et al., 1991b;
Li et al.,1995
Bacteriocin
1
Boemare et al., 1992
Xenorhabdicin
1
Thaler et al.,1992
Nematophin
1,2
Li et al.,1997
Chitinase
2
Chen et al., 1996
X. bovienii
Indole derivatives
1,2
Paul et al., 1998;
Li et al.,1995
Xenorhabdins
1,2,4
McInemey et al., 1991b;

Li et al.,1995
Xenorcides
1,2
Chen et al., 1996
Bacteriocin
1
Boemare et al., 1992
Chitinase
2
Chen et al., 1996
X. beddingii
Bacteriocin
1
Boemare et al., 1992
Xenorhabdus
spp.
Xenorhabdins
1,2,4
McInemey et al., 1991a
Xenorcournacin
1,2,3
McInemey et al., 1991b
Ghi chú:
1: Kháng khuẩn
2: Kháng nấm
3: Ngừa u sơ
4: Diệt côn trùng


14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.4.2. Hoạt tính diệt côn trùng
Mc Inerney et al., (1991a) xác định 5 chất nguồn gốc từ dithiopyrolone,
xenorhabdins, từ dịch nuôi Xenorhabdus spp., và trong số đó xenorhabdin II
cũng có tác dụng diệt côn trùng.
Xenorhabdin II gây chết 100% cho ấu trùng Heliothis punctigera ở 150
g/ml

với liều LC
50
là 59,5 g/ml. Nó cũng làm giảm trọng lượng của ấu
trùng còn sống sót. Ở nồng độ 37,5 g/ml chỉ có 18,8% ấu trùng chết nhưng
giảm 64,7% trọng lượng của ấu trùng sống sót so với đối chứng.
1.4.3. Hoạt tính diệt tuyến trùng ký sinh thực vật
Hu et al.,(1995) thấy rằng dịch nuôi Xenorhabdus và Photorhabdus
trong môi trường nước thịt (TSB) có độc đối với ấu trùng giai đoạn 2 của giun
tròn ký sinh rễ Meloidogyne incognita, và đối với ấu trùng và con trưởng
thành của giun tròn ký sinh ở gỗ thông Bursaphelenchus xylophilus. Tác dụng
độc tố của dịch nuôi Xenorhandus spp. lên ấu trùng giai đoạn 2 và trứng của
M. incognita được công bố bởi Grewal et al., (1999). Các nghiên cứu khác
cho thấy indole và 3,5- dihydroxy-4- isopropylstilbene (ST) tách từ dịch nuôi
Photorhabdus luminescens cũng có hiệu lực diệt giun tròn thực vật [25]


Ở liều 100 g/ml, ST gây chết gần 100% cho ấu trùng giai đoạn 4 và
con trưởng thành của giun tròn Aphelenchoides rhytium và Bursaphelenchus
spp. và những giun tròn ăn vi khuẩn Canorhabditis elegans. Tuy nhiên, không
Hình 1.3. Công thức hoá học của 3,5- dihydroxy-4-
isopropylstilbene

15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

gây chết cho ấu trùng giai đoạn 2 của M. incognita hoặc ấu trùng cảm nhiễm
của giun tròn ký sinh côn trùng H. Megidis, thậm chí ở nồng độ 200 g/ml
của ST, Inodole gây chết cho một số loài giun tròn ở nồng độ 300 g/ml, và
gây liệt cho Bursaphelenchus spp. (300 g/ml), M. incognita (100 g/ml) và
Heterorhabditis spp. (400 g/ml).
Thành phần diệt giun tròn của các chất trao đổi chất thứ cấp được sản
sinh bởi Xenorhabdus và Photorhabdus gây ngạc nhiên về mối quan hệ cộng
sinh gần giữa giun tròn ký sinh thực vật và vi khuẩn cộng sinh. Bằng cách giết
chết hoặc đẩy lùi các loài giun tròn khác cạnh tranh cả về thức ăn và nơi sống,
EPN tăng cơ hội sống sót của chúng. Đặc biệt, quanh rễ thực vật mà các loài
giun tròn khác và côn trùng hay sinh sống, EPN sống sót sẽ tìm kiếm và sau
đó xâm nhập và phát triển trong côn trùng với ít sự cạnh tranh [11].
1.4.4. Một số hoạt tính khác
Xenocoumacins ngoài tác dụng kháng sinh còn có tác dụng chống độc
gây ra bởi stress. Hoạt tính dược học của xenocoumacins tương tự như
amicoumacins có tác dụng độc cấp tính với chuột [28].



Hình 1.4. Công thức cấu tạo của xenocoumacins

Dẫn xuất của dithiolopyrrolone, thiolutin có tác dụng chống ung thư ở
tế bào biểu mô khí quản của chuột bình thường. Tuy nhiên, chất này không có
hiệu quả ở tuyến vú của chuột [41]. Gần đây, một số dẫn xuất
16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

dithiolopyrrolone từ Xenorhabdus , cho thấy khả năng chống ung thư như ung
thư phổi, trực tràng, da, tuyến tiền liệt, vú và ung thư vòm họng [39].
1.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Glaser (1929) là người đầu tiên đã phát hiện tuyến trùng ký sinh ở bọ
cánh cứng Nhật Bản (Popillia japonica) ở New Jersey, Mỹ. Ông cũng là
người đầu tiên nhân nuôi thành công tuyến trùng Steinernema glaseri để
phòng trừ loài sâu hại này. Mặc dù vậy, trong thời gian này do sự bành trướng
của thuốc hoá học nên thành tựu quan trọng này của ông chưa được đánh giá
và ít được chú ý. Chỉ đến đầu những năm 1970, xuất hiện sự kháng thuốc của
sâu hại và các hậu quả môi trường do thuốc hoá học gây ra nên các tác nhân
sinh học, trong đó có tuyến trùng mới được quan tâm [3].
Ngày nay, các tuyến trùng EPN đang được quan tâm khoa học lớn
không chỉ vì chức năng là tác nhân kiểm soát sinh học, mà là vì tầm quan
trọng về y tế và nông nghiệp; tiềm năng của các sản phẩm trao đổi chất của vi
khuẩn cộng sinh của chúng.
Gần đây trên thế giới cũng có nhiều nghiên cứu về các sản phẩm trao
đổi chất từ vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN và ứng dụng của chúng
như: tìm ra các hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật, xác định công thức
hóa học của chúng, thử khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và ngăn ngừa sự
tăng sinh của dòng tế bào ung thư [29, 39].
Hơn 30 hoạt chất trao đổi thứ cấp thuộc các nhóm khác nhau đã tìm
thấy từ dịch nuôi cấy của Xenorhabdus và Photorhabdus. Những sản phẩm
trao đổi chất này không chỉ đa dạng về cấu trúc hóa học mà còn đa dạng về
hoạt tính sinh học đối với y học và nông nghiệp, như kháng khuẩn, kháng
nấm, côn trùng và giun tròn thực vật, chống viêm, chống ung thư và kháng
virus [29].
17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Các kháng sinh được sản sinh bởi vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng
EPN nhằm ngăn chặn các vi khuẩn khác xâm nhập để dành nguồn thức ăn cho
tuyến trùng. Các kháng sinh đang hoạt động chống lại vi khuẩn gram dương
và gram âm, và đã được thử nghiệm chống viêm vú phân lập từ bò sữa. Khả
năng kháng vi sinh vật của các chủng X. nematophila, X. budapestensis và X.
szentirmaii đã được thử nghiệm với bệnh viêm vú do Staphylococcus aureus,
Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae [39].
1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Nghiên cứu về tuyến trùng ở Việt Nam được bắt đầu từ năm 1997 và
đến nay đã đạt được một số thành tựu đáng kể. Các nhà khoa học đã điều tra,
phân lập, mô tả đặc điểm hình thái và sinh học, cơ chế xâm nhập và phát triển
của tuyến trùng EPN. Nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất tuyến trùng
EPN, bước đầu sản xuất chế phẩm sinh học tuyến trùng- thuốc trừ sâu sinh
học đáp ứng cho nền nông nghiệp nước nhà.
Cho đến nay ở Việt Nam đã phân lập được khoảng hơn 40 chủng từ các
vùng sinh thái khác nhau, một số loài đã được nghiên cứu về khả năng diệt
sâu hại để ứng dụng trong thực tiễn phòng trừ sinh học. Từ năm 1999, Viện
Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã bắt đầu sản xuất chế phẩm sinh học tuyến
trùng. Cho tới nay, đã sản xuất được 7 chế phẩm sinh học tuyến trùng và kết
quả thử nghiệm cho thấy những chế phẩm này có thể diệt được gần 30 loài
sâu hại khác nhau [8].
Tuy nhiên, những nghiên cứu về vi khuẩn cộng sinh và hoạt chất của
chúng ở Việt Nam còn rất ít. Nhóm nghiên cứu của Trịnh Hồng Thái và cs đã
nghiên cứu về proteinase do vi khuẩn Xenorhabdus sp. XS4 và Xenorhabdus
sp. CA. Kết quả cho thấy các vi khuẩn này đã tiết ra môi trường nuôi cấy các
proteinase, hoạt độ proteinase mạnh nhất ở pH 8 [12,13].
18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Dự án: “Genomic approaches to metabolite exploitation from
Xenorhabdus / Photorhabdus - GAME XP” là dự án giữa Việt Nam, Thái Lan,
CHLB Đức và Anh do EC tài trợ với mục đích nghiên cứu các hợp chất tự
nhiên từ chất tiết của vi khuẩn Xenorhabdus/Photorhabdus cộng sinh với
tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema và Heterorhabditis phục
vụ trong y dược. Ở Việt Nam, dự án sẽ tập trung phân lập, phân loại tuyến
trùng cùng với vi khuẩn cộng sinh và tách chiết các hoạt chất sinh học. Trong
khuôn khổ của dự án, Phan Kế Long & cs (2009) đã phân lập được một số
loài tuyến trùng, vi khuẩn cộng sinh ở một số vùng ở Việt Nam và cũng đã
xác định được hợp chất Diketopiperazin từ sản phẩm trao đổi chất thứ cấp của
vi khuẩn Xenorhabdus sp. cộng sinh với tuyến trùng Steinernema
robustispiculum TN 21[10].
Chính vì vậy, nghiên cứu về vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng và hoạt
chất sinh học của chúng có thể sẽ là hướng nghiên cứu mới có ý nghĩa khoa
học và thực tiễn trong y học và nông nghiệp.
19
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Chƣơng II
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Tuyến trùng
Tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3 ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc do phòng
Tuyến trùng học – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cung cấp.

Hình 2.1: Tuyến trùng (IJs) Steinernema sp.TĐ3
2.1.2. Ấu trùng Bướm sáp lớn
Ấu trùng Bướm sáp lớn (Galleria mellonella) đượ c nhân nuôi tại
phòng thí nghiệm Tuyến trùng học – Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật

Hình 2.2. Ấu trùng bƣớm sáp lớn Galleria mellonella
20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2.1.3. Vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ)
Các chủng vi sinh vật kiểm định được cung cấp từ phòng Vật liệu sinh
học - Viện Công nghệ sinh học , Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli ATCC 25922
Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923
- Vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtilis ATCC 27212
Staphilococcus aureus ATCC 12222
- Nấm sợi : Aspergillus niger (439)
Fusarium oxysporum (M42)
- Nấm men : Candida albicans (SH 20)
Saccharomyces cerevisiae (ATCC 7754)

2.1.4. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
* Hóa chất và dụng cụ
- Các hóa chất, dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu của các hãng
Merck (Đức), Biomedicals Inc (Mỹ), guangzhou Jinhuda Chemical (Trung
Quốc), Himedial Labiratiries Ltd. (Ấn Độ), BDH Chemicals Ltd. (Anh)
- Bộ sinh phẩm DNeasy Blood and Tissue Kit của hãng QIAgen dùng
để tách chiết DNA tổng số từ dịch chứa vi khuẩn.
- Bộ sinh phẩm MinElute của hãng QIAgen để tinh sạch sản phẩm PCR.
* Thiết bị
Nghiên cứu có sử dụng các thiết bị của phòng Khai thác chế biến tài
nguyên thiên nhiên, phòng Hóa sinh biển- Viện Hóa học các HCTN;
phòng Tuyến trùng học- Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật và phòng
Hệ thống học phân tử và di truyền học bảo tồn - Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật.

21
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- Bể ổn nhiệt
- Bộ điện di (Advance Tech, Nhật Bản)
- Cân phân tích 10
-4
g (Mettler Toledo)
- Kính hiển vi
- Kính hiển vi soi nổi
- Lò vi sóng
- Máy cô quay chân không
- Máy khuấy trộn Vortex (RotoLap, OSI)
- Máy lắc điều nhiệt
- Máy li tâm lạnh (Sorvall Biofuge Fresco)
- Máy ly tâm (Microcentrifuge- Sorvall, Mỹ)
- Máy PCR
- Máy soi chụp ảnh gel (Bio-Rad, Mỹ)
- Nồi hấp khử trùng (Nhật Bản)
- Tủ cấy vô trùng (Sanyo)
- Tủ lạnh, tủ lạnh sâu (-20
0
C), (-75
0
C) (Sanyo, Nhật Bản)
- Tủ nuôi ấm
- Tủ sấy
2.2. Môi trường
2.2.1. Môi trường phân lập vi khuẩn cộng sinh (Môi trường NBTA) [3]
Tryptone 1%, Cao nấm men 0,5%, NaCl 0,5%, Bromothymon Blue

(BTB) 0,0025%, Triphenyltetrazolium Chloride (TTC) 0,004%, Agar 1,5%,
pH7. Khử trùng ở 1atm/30 phút, để nguội môi trường < 50
0
C mới bổ sung TTC.
2.2.2.Môi trường nuôi cấy vi khuẩn cộng sinh (Môi trường LB)
Tryptone 1%, Cao nấm men 0,5%, NaCl 0,5%, Agar 1,5%, pH 7.
22
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Khử trùng ở 1atm/30 phút
2.2.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ)
* Môi trường thử hoạt tính vi sinh vật trên đĩa thạch [5]
- Môi trường thạch- thịt- pepton (MPA) (đối với vi khuẩn)
Cao thịt 0,3%, Pepton 1%, NaCl 0,5%, Agar 1,5%, pH 7
Khử trùng ở 1atm trong 30 phút
- Môi trường Sabouraud (đối với nấm)
Glucose 3%, Pepton 1%; Agar 1,5%; pH 5– 6.
Khử trùng ở 0,8 atm trong 30 phút
* Môi trường thử hoạt tính vi sinh vật theo phương pháp pha loãng liên
tục trên phiến vi lượng 96 giêng
- Môi trường nuôi vi khuẩn: Môi trường Eurgon Broth (Difco)
- Môi trường nuôi nấm: Môi trường Mycophil (Difco)
2.3. Các phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp xâm nhiễm tuyến trùng vào ấu trùng BSL [3]
Tuyến trùng xâm nhiễm (IJs) thường được bảo quản lạnh ở 12 -14
0
C
nên trước khi nhiễm nên để IJs ấm dần lên tới nhiệt độ phòng (20 – 24
0
C).

Tiến hành gây nhiễm khoảng 50-60 tuyến trùng/ấu trùng BSL. Để trong
tối ở 25-28
0
C. Sau 24, 48h. Thu những ấu trùng bướm sáp lớn đã chết để phân
lập vi khuẩn cộng sinh và thu tuyến trùng IJs bằng phương pháp Whitetrap để
giữ nguồn tuyến trùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
* Phương pháp whitetrap: Các xác ấu trùng BSL chết được để lên đĩa
đồng hồ, quấn parafilm và để trong tủ ấm 28
0
C trong khoảng 10-15 ngày, thu
ấu trùng cảm nhiễm, tinh sạch và bảo quản ở 12
0
C.
2.3.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn cộng sinh
Ấu trùng bướm sáp lớn chết sau 24 -48h được chuyển vào một cốc thủy
tinh và rửa bằng cồn 70 trong 5 -10 phút. Mổ xác chết bằng panh kẹp lột
23
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

nhẹ phần lưng của xác sâu, chú ý không làm vỡ ruột ấu trùng bướm sáp lớn
để tránh nhiễm. Dùng que cấy vòng đã vô trùng dưới ngọn lửa đèn cồn lấy
một giọt huyết tương rồi cấy zic zăc trên đĩa petri có chứa môi trường NBTA.
Nuôi cấy trong tủ ấm ở 30
0
C, sau 24 - 48 h quan sát khuẩn lạc thu được.
2.3.4. Xác định hình thái khuẩn lạc, tế bào VKCS
2.3.4.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc các biến thể của VKCS [26,31]
Cấy chấm điểm vào giữa đĩa thạch có chứa môi trường NBTA + 0,8%
Agar. Để trong tủ ấm từ 24 -48h, quan sát sự khác nhau giữa khuẩn lạc pha sơ
cấp và pha thứ cấp của vi khuẩn cộng sinh.

Vi khuẩn cộng sinh ở pha sơ cấp có tiêm mao, có khả năng di động
được nên có khả năng di chuyển trong môi trường thạch (0,8% Agar) còn pha
thứ cấp thì không có khả năng này.
2.3.4.2. Quan sát hình ảnh tế bào của vi khuẩn cộng sinh [3,5,6]
* Quan sát túi vi khuẩn cộng sinh trong cơ thể tuyến trùng
Tuyến trùng IJs sau khi tinh sạch được xử lý nhiệt bằng nước sôi ở 54-
60
0
C. Sau đó được cố định bằng một số hóa chất và làm tiêu bản. Quan sát
hình ảnh tuyến trùng và túi vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử.
* Làm tiêu bản giọt ép để quan sát hình dạng tế bào của vi khuẩn
Nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên phiến kính, dùng que cấy lấy vô
trùng một khuẩn lạc VKCS và hoà trộn đều. Đặt lamen lên và quan sát hình
dáng tế bào VKCS dưới kính hiển vi điện tử.
* Phương pháp nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến)
+ Pha hóa chất:
Dung dịch tím kế
tinh (Crystal
violet)
: 2g tím kết tinh hòa tan trong 20 ml ethanol 95%
0,8 g amomon oxalat hòa tan trong 80 ml nước cất