phát triển hệ thống tái sinh từ mô sẹo phục vụ chọn dòng chịu hạn ở cây đậu tương [glycine max (l.) merrill]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu tương là loại cây trồng chiến lược của nhiều quốc gia trên thế giới.
Hạt đậu tương có hàm lượng các chất dinh dưỡng cao, chứa 40% - 50%
protein, 18% -25% lipit, chứa nhiều loại axit amin cần thiết (lizin, triptophan,
metionin, xystein, lozin ) và nhiều loại vitamin (B1, B2, C, D, E, K ), là
nguồn năng lượng cần thiết cho cuộc sống con người.
Cây đậu tương có thời gian sinh trưởng ngắn, hệ rễ có nốt sần mang vi
khuẩn cố định đạm nên cây đậu tương thường được trồng luân canh với lúa và
ngô để tăng vụ và cải tạo đất bạc màu. Với những giá trị to lớn đó mà cây đậu
tương được trồng phổ biến ở nhiều nơi từ vùng ôn đới đến vùng nhiệt đới, từ
55
0
vĩ Bắc đến 55
0
vĩ Nam, từ vùng thấp hơn mực nước biển cho đến vùng
cao trên 2000m so với mực nước biển với diện tích khoảng hơn 74,4 triệu ha
[4], [9]. Trong đó, chúng được trồng nhiều nhất ở Mỹ, Braxin, Argentina,
Trung Quốc, Ấn Độ.
Ở Việt Nam cây đậu tương được gieo trồng ở cả 7 vùng nông nghiệp
trên cả nước. Các giống đậu tương ở nước ta hiện nay rất phong phú gồm các
giống đậu tương nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tương đột biến và tập đoàn
các giống đậu tương địa phương. Các giống đậu tương địa phương đa dạng và
phong phú cả về kiểu hình và kiểu gen, đây là nguồn nguyên liệu để chọn tạo
giống đậu tương mới cho năng suất và chất lượng phù hợp với mục tiêu chọn
giống [9].
Tạo giống đậu tương mới có năng suất cao, kháng bệnh, chống chịu với
các điều kiện bất lợi do biến đổi khí hậu luôn được các nhà tạo giống quan

tâm. Bên cạch các phương pháp truyền thống, phương pháp tạo giống bằng
công nghệ sinh học đã và đang là phương pháp mang lại hiệu quả cao trong
công tác chọn giống cây đậu tương với các tính trạng mong muốn. Ở Việt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

2
Nam, tạo giống đậu tương bằng công nghệ sinh học mới đang bắt đầu được
quan tâm nghiên cứu. Một trong những công cụ quan trọng của tạo giống
bằng công nghệ sinh học là kĩ thuật chọn dòng tế bào soma, với tần suất tạo
biến di truyền ngẫu nhiên trong khoảng 10
-5
- 10
-8
, nuôi cấy mô sẹo được xem
như là nguồn vật liệu phong phú cho việc chọn dòng tế bào có tính chống
chịu ở cây trồng (Lê Trần Bình và cs, 1997) [1] .
Vì vậy, phát triển hệ thống tái sinh là một trong các khâu quan trọng
trong việc ứng dụng công nghệ sinh học để cải tạo giống theo hướng tăng
cường khả năng chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi của cây đậu
tương. Xuất phát từ lí do trên chúng tôi đã lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ
là: Phát triển hệ thống tái sinh từ mô sẹo phục vụ chọn dòng chịu hạn ở
cây đậu tương [Glycine max (L.) Merrill].
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tạo dòng đậu tương từ mô sẹo chịu mất nước bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu điều kiện tối ưu khử trùng hạt sử dụng trong nuôi cấy in vitro.
- Khảo sát môi trường tạo mô sẹo phôi hạt đậu tương.
- Đánh giá khả năng chịu hạn của đậu tương bằng kỹ thuật thổi khô mô sẹo ở
các ngưỡng thổi khô khác nhau: 3, 5, 7 (giờ).
- Khảo sát môi trường tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh

- Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá sự thay đổi hệ gen của các dòng đậu
tương tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước.
- Thiết lập sơ đồ hình cây và xác định khoảng cách di truyền giữa các dòng
đậu tương nghiên cứu.
- Tuyển chọn các dòng đậu tương ưu tú để tiếp tục theo dõi, đánh giá ở các
thế hệ tiếp sau.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG
1.1.1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng
Đậu tương có tên khoa học là (Glycine Max (L.) Merrill) thuộc họ đậu
(Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoidace) có bộ NST 2n = 40, có
nguồn gốc từ Trung Quốc là loại cây trồng hàng năm không thấy xuất hiện ở
loài hoang dại. Các giống đậu tương địa phương của nước ta hiện nay được
du nhập từ Trung Quốc đã từ lâu [4].
Cây đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày, khó có thế tìm thấy loại cây
nào có tác dụng nhiều mặt và hiệu quả kinh tế cao như cây đậu tương. Về
thực phẩm hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao 40% - 50% protein,
18% - 25 % lipit và 20% gluxit [9]. Protein của đậu tương có phẩm chất tốt
nhất trong các loại protein của thực vật, có đầy đủ và cân đối các loại axit
amin cần thiết. Lipit của đậu tương chúa tỷ lệ lớn các axit béo chưa no, có hệ
số đồng hóa lớn (98%), chỉ số iot cao (120- 137) có tác dụng phòng chống
bệnh biếu cổ cho người, đặc biệt đối với vùng trung du và miền núi. Hạt đậu
tương còn chứ nhiều khoáng và có khả năng cung cấp năng lượng khá lớn
(4.710kcal), cho nên người ta đã chế biến hạt đậu tương thành hơn 600 sản
phẩm khác nhau [9].
Đậu tương là cây trồng lấy hạt, là cây cung cấp dầu quan trọng nhất

trong các cây lấy dầu. Hiện nay qua thống kê của FAO cho thấy từ năm 1980
trở lại đây sản lượng đậu tương thế giới đã tăng lên 2 lần chủ yếu nhờ vào
tăng năng suất và diện tích. Trong vòng 20 năm qua diện tích gieo trồng tăng
nhanh, năng suất bình quân tăng khá cao 23 tạ/ha. Các nước sản xuất đậu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

4
tương đứng đầu thế giới: Mỹ, Brazin, Argentina và Trung Quốc chiếm
khoảng 90-95% tổng sản lượng đậu tương trên thế giới [9].
Ở Việt Nam, đậu tương được trồng trên cả 7 vùng nông nghiệp, trong
đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất là 46,6%, đồng bằng
Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%,
đồng bằng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% và vùng Duyên hải miền
Trung 1,6% [9]. Cây đậu tương chiếm một vị trí rất quan trọng trong nền
nông nghiệp nước ta, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo, kinh tế
chưa phát triển.
Tuy nhiên, việc sản xuất đậu tương ở trong nước vẫn chưa được đầu tư
cao, năng suất còn thấp, do vậy nghiên cứu cải tiến các đặc điểm nông học
của các giống địa phương và tạo giống mới có năng suất cao, thích nghi với
điều kiện sinh thái ở những vùng khác nhau bằng phương pháp truyền thống
kết hợp với hiện đại sẽ đáp ứng được yêu cầu của thực tiễn đặt ra và đó cũng
là chiến lược quan trọng về sự phát triển cây đậu đỗ ở nước ta.
1.1.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học của cây đậu tƣơng
Cây đậu tương là cây trồng cạn thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, thân,
lá, hoa, quả và hạt. Rễ đậu tương là rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ phụ, trên rễ có
nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả năng cố định đạm
của không khí tạo thành đạm dễ tiêu [4]. Các công trình nghiên cứu cho thấy
những giống có khả năng cộng sinh và có đủ nốt sần thường làm cho hàm
lượng protein cao, cho nên trồng cây đậu tương có tác dụng cải tạo đất. Thân
cây đậu tương là thân thảo, ít phân cành dạng bụi, lá đậu tương là lá kép với 3

lá chét, nhưng đôi khi cũng có 4-5 lá chét. Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa
đậu tương nhỏ, không hương vị, có màu tím, tím nhạt hoặc trắng, hoa mọc từ
nách lá hoặc ngọn, quả đậu tương thuộc loại quả ráp, thẳng hoặc hơi cong, có
nhiều lông khi chín có màu vàng hoặc xám. Hạt đậu tương không có nội nhũ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

5
mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn. Hạt có hình tròn hoặc bầu dục,
tròn dài, tròn dẹt, ovan vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm,
xanh, nâu, đen đa số là hạt màu vàng. Khối lượng hạt rất đa dạng dao động từ
20-400 mg/ hạt. Màu sắc rốn hạt ở các giống là khác nhau, đây là một biểu
hiện đặc trưng của giống. Cây đậu tương có 2 loại hình sinh trưởng: sinh
trưởng hữu hạn và sinh trưởng vô hạn, thời gian sinh trưởng thường chia ra
nhóm chín sớm, trung bình và muộn.
Theo thời gian sinh trưởng, các nhà chọn giống đậu tương cho rằng các
giống chín rất sớm (75-90 ngày), các giống chín sớm (90-100 ngày), các
giống chín trung bình (100-110 ngày), loại chín muộn trung bình (110-120
ngày), các giống chín muộn (130-140 ngày), các giống chín rất muộn (140-
150 ngày) thời gian sinh trưởng là một yếu tố rất quan trọng để lựa chọn cây
trồng luân canh xen vụ. Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện
ngoại cảnh. Trong tập đoàn giống đậu tương có những giống chỉ trồng vào vụ
hè, có những giống chỉ trồng vào vụ đông, có những giống trồng ở vụ xuân hè
và có những giống trồng thích hợp với vụ thu đông [9].
Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng là cây có nhu cầu
về nước cao hơn các loại cây khác và thuộc nhóm cây chịu hạn kém. Đó là do
trong hạt và cây đậu tương có hàm lượng protein và lipit rất cao, để tổng hợp
1kg chất khô cần 500 – 530 kg nước, trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về
nước của cây đậu tương cũng khá cao 50%, trong khi đó ở ngô chỉ là 30%,
lúa là 20% [9].
Hạn là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong tự nhiên dẫn đến tình

trạng thiếu nước đặc biệt đối với thực vật. Khái niệm về hạn được dùng để chỉ
sự thiếu nước do môi trường gây nên trong suốt quá trình hay trong từng giai
đoạn làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây. Những cây
trồng có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương đối ổn định
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

6
trong điều kiện khô hạn được gọi là cây chịu hạn. Khi nghiên cứu về đặc tính
chịu hạn của cây đậu tương về phương diện sinh lý và di truyền đã cho thấy
rằng các đặc tính này liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hóa keo của chất
nguyên sinh, đặc điểm của quá trình trao đổi chất. Tính chịu hạn của cây đậu
tương là tính trạng đa gen. Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau: như
sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm tương đối, cũng như bản chất di
truyền của từng giống có khả năng sử dụng nước tiết kiệm trong quá trình
sinh trưởng và phát triển của cây. Căn cứ vào đặc điểm này, đậu tương được
chia thành hai nhóm:
- Nhóm chịu được mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây.
- Nhóm chịu được sự thiếu nước trong tất cả các giai đoạn phát triển
của cây.
1.2. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT
TRONG CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG
1.2.1. Cơ sở khoa học của chọn dòng tế bào soma
Cơ sở khoa học đầu tiên của chọn dòng tế bào thực vật là tính toàn
năng của tế bào thực vật. Mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều là
khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Điều này đã
được các nhà khoa học chứng minh qua nhiều thí nghiệm nuôi cấy mô và tế
bào thực vật.
Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số
lượng lớn các tế bào không đồng nhất. Vì thế quần thể tế bào nuôi cấy có thể
xem như quần thể thực vật mà ở đó cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen,

kiểu hình và tuổi. Khi những tế bào được tái sinh thành cây sẽ thể hiện thay
đổi ở mức độ cơ thể. Những biến đổi di truyền tự phát xảy ra trong quá trình
nuôi cấy mô tế bào được Larkin và Scowcroft (1982) gọi là ―biến di sinh
dưỡng‖ hay ―biến dị soma‖. Giải thích về sự xuất hiện biến dị soma trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

7
điều kiện in vitro có rất nhiều ý kiến khác nhau. Theo Skirvin và CS (1994),
sự xuất hiện biến dị soma có thể là sự rối loạn trong phân bào nguyên nhiễm
gây ra bởi các chất kích thích sinh trưởng hoặc sự có mặt của một số chất
trong môi trường nuôi cấy. Sự hình thành biến dị soma cũng có thể là do đột
biến về số lượng hoặc cấu trúc nhiễm sắc thể, sự tái tổ hợp trong phân bào
nguyên nhiễm[13], sự phát huy tác dụng của các yếu tố di truyền vận động, sự
methyl hóa ADN…[1]. Các loại mô đã phân hóa tách từ cơ thể thực vật có
khả năng tái sinh trực tiếp thành cây, ngoài ra chúng có khả năng phát triển
trực tiếp từ tế bào mô sẹo (callus).
Trong các phương thức nuôi cấy phổ biến hiện nay thì nuôi cấy mô
sẹo được nghiên cứu trên nhiều đối tượng hơn cả. Mô sẹo là loại tế bào chưa
phân hóa, phân chia liên tục, có khả năng phân hóa thành phôi, chồi và cây
hoàn chỉnh. Mô sẹo được hình thành qua nuôi cấy in vitro từ các cơ quan sinh
dưỡng của thực vật. Trong môi trường chứa chất điều hòa sinh trưởng nhóm
auxin, điều kiện nuôi cấy thích hợp mô sẹo có thể hình thành và duy trì thông
qua cấy chuyển và tái sinh. Các mô sẹo sau khi xử lý bởi điều kiện cực đoan
thì khả năng sinh trưởng và tái sinh cây tăng lên rõ rệt [35]. Nhiều nghiên cứu
cho thấy, cây tái sinh từ mô sẹo có những biến đổi di truyền phong phú [16].
Tuy nhiên, với mỗi loại cây nhất thiết phải nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy tối
ưu thích hợp cho việc đánh giá hoặc tái sinh cây. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng
tới khả năng tái sinh của cây như nguồn gốc mô sẹo [23], mức bội thể của mô
sẹo, thành phần và nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thực vật được bổ
sung vào môi trường nuôi cấy. Theo Lê Trần Bình và CS (1995) dưới tách

động của điều kiện cực đoan ở một mức độ và thời gian nhất định những mô
hay tế bào thường chết, những tế bào có sức sống mới sống sót và cho hiệu
quả tái sinh cao [3]. Để đạt được hiệu quả trong chọn dòng bằng nuôi cấy mô
sẹo người ta phải sử dụng các khối mô có kích thước nhỏ và đều nhau nhằm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

8
hạn chế sự chọn lọc không triệt để do kích thước lớn và không đồng nhất của
khối mô sẹo ban đầu.
1.2.2. Ảnh hƣởng của các chất điều hòa sinh trƣởng đến quá trình nuôi
cấy mô tế bào thực vật
Hiện nay người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất kích thích sinh
trưởng ở thực vật đó là: auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, absixic acid.
Những chất này được phân thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu
trúc và chức năng sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác
động chồng chéo lẫn nhau. Còn là một số nhóm khác điều khiển từng giai
đoạn sinh trưởng nhất định. Trong nuôi cấy mô người ta thường sử dụng ba
nhóm chất điều hòa sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin.
Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh
lý học thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất. Auxin là những hoocmon
thực vật có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hóa cơ
quan, kiểu tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hóa màng
tế bào. Chính chức năng này đã được người ta sử dụng và đánh giá hoạt tính
của nó, ví dụ bằng cách đo phần kéo dài lá mầm cây yến mạch trồng trong
điều kiện tối sẽ biết được hoạt tính của auxin. Nhóm auxin bao gồm các chất
sau: 2,4 Diclorophenoxyacetic acid (2,4-D), α - Naphtylacetic acid (α-NAA),
Indolacetic acid (IAA), trong đó 2,4- D dễ gây độc nhưng có tác dụng kích
thích quá trình phân chia tế bào nên thường được sử dụng nhiều nhất [16]. α -
NAA có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính
của enzym và ảnh hưởng mạnh đến quá trình trao đổi nitơ, tăng khả năng tiếp

nhận và sử dụng các chất trong môi trường, α-NAA có tác dụng tạo rễ cho
cây non mạnh hơn các auxin khác [16]
Nhóm giberelin là nhóm được phát hiện qua nghiên cứu bệnh lúa von,
nó tác động làm tế bào dãn và phân chia, làm cây lùn có thể cao được như
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

9
ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng. Đại diện cho nhóm
này là giberilic acid (GA3), chất này được sử dụng rộng rãi trong nông
nghiệp.
Nhóm cytokinin là nhóm chất kích thích sinh trưởng có tác dụng làm
tăng phân chia tế bào. Các cytokinin chính được dùng trong nuôi cấy mô là
kinetin và 6- benzyl aminopurin (BAP) được phát hiện trong những nghiên
cứu liên quan đến nuôi cấy mô.
Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển
nhưng gần đây chúng mới được coi là hoocmon thực vật. Ethylen thường
được sử dụng để làm quả chín đồng loạt ở chuối, ra hoa đồng loạt ở dứa, ảnh
hưởng đến quá trình phân bào [16].
Abscisis acid (ABA) thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng, có tác
dụng làm tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều
kiện ngoại cảnh bất lợi [16], vì vậy ABA được đưa vào môi trường tái sinh
cây và mang lại hiệu quả nhất định.
1.2.3. Hệ thống nuôi cấy để chọn dòng tế bào có khả năng chống chịu
Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật chọn dòng tế bào thực vật là hiện
tượng các tế bào thực vật khi được nuôi cấy ở tế bào mô sẹo trong điều kiện
in vitro chúng thường có những biến đổi di truyền tự phát, được gọi chúng là
biến dị của tế bào soma (biến dị soma). Xử lý mô sẹo bằng các tác nhân phi
sinh học trong điều kiện phòng thí nghiệm cho phép chọn ra những dòng tế
bào thích hợp theo định hướng chọn lọc. Tuy vậy, đối với mỗi loài thực vật
người ta phải nghiên cứu trạng thái nuôi cấy thích hợp cho việc chọn dòng.

Đến nay đối với chọn dòng tế bào chịu stress ở một số loài thực vật như lúa,
lạc, đậu, ngô. . . người ta đã sử dụng một số hệ thống nuôi cấy sau đây:
Nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo là khối các tế bào mô mền có cấu trúc
thấp, chưa phân hóa, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

10
truyền cao. Mô sẹo thu được bằng nuôi cấy in vitro những cơ quan bộ phận
khác nhau của thực vật như thân, lá, rễ, hoa. . .trong môi trường chứa chất
điều hòa sinh trưởng là nhóm auxin và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Mô
sẹo có thể duy trì trong môi trường nuôi cấy bằng cách cấy chuyển có định
kỳ, tuy nhiên trong thực nghiệm thấy rằng: i) mô sẹo qua cấy chuyển nhiều
lần có ảnh hưởng không tốt đến khả năng tái sinh cây; ii) tăng tính biến
động di truyền của mô.
Các tế bào di truyền có tính ổn định di truyền khá thấp. Nhiều tác giả
đã công bố nhận được cây tái sinh từ mô sẹo thông qua nhiều lần cấy chuyển
có sự thay đổi nhiễm sắc thể (dị bội, đa bội) và những biến đổi di truyền khác.
Vì vậy việc nhân nhanh và duy trì tính đồng nhất di truyền thông qua nuôi cấy
mô sẹo cần thận trọng đối với nhiều loại thực vật và nhất là chỉ sử dụng mô
sẹo sơ cấp để tái sinh cây hoàn chỉnh thông qua con đường tạo phôi vô tính.
Mặt khác những cây tái sinh từ mô sẹo với những biến đổi di truyền phong
phú lại có ý nghĩa trong việc chọn giống và như vậy vật liệu di truyền của cây
trở lên phong phú hơn (Lê Trần Bình và CS) [1] [2] [3], (Bùi Bảo Hoàn) [6].
Nuôi cấy tế bào huyền phù: Nuôi cấy tế bào huyền phù là nuôi cấy tế
bào đơn (single cell) hoặc cụm nhỏ tế bào (cell agregate) trong môi trường
lỏng. Các tế bào này cũng được tạo ra từ mô sẹo có nguồn gốc thân, lá, rễ,
hoa, phôi…Muốn thu được những tế bào huyền phù nhỏ, cần sàng lọc liên tục
qua các loại sàng có mắt lọc nhỏ (< 0,5 mm). Để đạt được nuôi cấy huyền phù
tương đối đều nhau cần phải sàng lọc ít nhất hàng chục lần, như vậy thời gian
cần thiết để thiết lập được môi trường nuôi cấy huyền phù ít nhất là 2-3 tháng.

Đây là điều trở ngại trong nghiên cứu với thực vật vì thời gian nuôi cấy dài
các tế bào huyền phù sẽ mất khả năng tái sinh cây. Lúc đó việc chọn dòng sẽ
gặp khó khăn để ứng dụng cho thực tiễn tạo giống. Vì vậy chỉ trong trường
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

11
hợp nhất định, khi tác nhân chọn lọc bắt buộc phải tác động lên toàn bộ bề
mặt tế bào thì hệ thống nuôi cấy huyền phù mới được áp dụng.
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào đơn có ưu điểm trong chọn dòng vì các tế
bào có kích cỡ tương đối đồng đều nhau dưới tác động của điều kiện chọn lọc
các dòng tế bào sẽ được chọn lọc một cách tương đối triệt để. Điều đáng quan
tâm là khả năng tái sinh của cây của các tế bào đơn là rất thấp, nhiều nghiên
cứu chỉ thu được các dòng tế bào chọn lọc, nhưng không thu được cây tái sinh
(Dix và CS, 1990) [33]. Mặ dù vậy cũng đã có một số cây tái sinh từ nuôi cấy
tế bào huyền phù đã được công bố như cây lúa, cây thuốc lá…(Bertin và CS,
1995) [27].
Nuôi cấy tế bào trần: Tế bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao
bọc (cell wall) chỉ còn lại khối nguyên sinh chất được bao bọc bổi màng
nguyên sinh chất được gọi là tế bào trần (protoplast). Tế bào trần có thể
tách từ nhiều bộ phận khác nhau của cây nhưng chủ yếu là lá, mô sẹo, tế
bào đơn và phôi.
Các protoplast sau khi tách được nuôi cấy trong môi trường thích hợp
thì tái tạo thành tế bào, phát triển thành mô sẹo và tái sinh thành cây hoàn
chỉnh. Vì trong giai đoạn chưa có thành tế bào các protoplast rất mẫn cảm với
các chất trong môi trường dinh dưỡng vì vậy trong môi trường nuôi cấy giảm
bớt các chất vơ cơ.
Nhìn chung hạn chế lớn nhất trong nuôi cấy tế bào trần là khả năng tái
sinh thấp đặc biệt lầ cây thuộc họ hòa thảo. Cho đến nay đã có khoảng 70 loại
cây trồng đã tách và nuôi cấy tế bào trần nhưng việc tái sinh chưa được nhiều.
Tuy nhiên hiện nay, nhiều tác giả tiếp tục công bố những thành công trong nuôi

cấy tế bào trần, đặc biệt ở lúa. Abdul và cs (1991) tách và tái sinh cây hoàn
chỉnh từ tế bào protoplast từ mô phôi non ở lúa dại (Oryza rufipogon) [22].
Ứng dụng có ý nghĩa nhất của nuôi cấy protoplast là tạo cây soma, tạo cây lai
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

12
tế bào chất thông qua dung hợp tế bào trần và hiện nay ứng dụng nhiều là để
biến nạp gen.Việc chọn dòng chống chịu sử dụng phương pháp nuôi cấy
protoplast còn ít được sử dụng và hầu như chưa có thành công nào đề cập đến
vấn đề này.
1.2.4. Các phƣơng thức chọn dòng tế bào
Chọn dòng trực tiếp: Thông qua ưu thế về sinh trưởng hay khác biệt
thấy được về mầu sắc có thể chọn dòng tế bào từ quần thể tế bào. Tế bào nuôi
cấy trong dịch lỏng hoặc mô sẹo đều có thể sử dụng phương pháp này.
Mô sẹo được chọn lọc trực tiếp trên môi trường có nồng độ thích hợp
của các tác nhân chọn lọc như PGE (polyethylene glycol), NaCl… hoặc xử
lý các tác nhân vật lý (tia rơnghen, tia anpha, tia beta. . .) với cường độ nhất
định. Những tế bào sống sót sẽ được nhận biết thông qua quá trình sinh
trưởng hay sự khác biệt thấy được về màu sắc. Kiểu chọn lọc này được sử
dụng nhiều trong chọn dòng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh phi sinh
học [15], [31]. Ngươì ta có thể chọn lọc theo kiểu bậc thang có hạn chế, bởi
vì các mô sẹo sóng sót sau quá trình chọn lọc là những mô sẹo được trải qua
quá trình huấn luyện. Vì vậy, có thể chọn lọc các dòng có khả năng chống
chịu thực sự cần có các phân tích tiếp theo. Phương pháp chọn trực tiếp
thường được ứng dụng để chọn dòng chống chịu và những dòng cho sản
phẩm thứ cấp.
Chọn gián tiếp: Trong trường hợp này, đặc điểm của dòng được chọn
là kết quả biểu hiện khuyết tật của tế bào trên môi trường chứa tác nhân chọn
lọc. Thí dụ điển hình là chọn dòng thiếu enzym nitratreductaza (NR). Trong
môi trường chứa ClO

3
những tế bào có chứa NR sử dụng ClO
3
như NO
3
và
khử thành clorit. Clorit tác dụng như một độc tố cho nên những tế bào không
có NR mới sống sót [40], [42].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

13
Chọn tổng thể: Các tế bào dị dưỡng thực vật thường được xử lý bằng
phương thức xử lý đột biến và nuôi trên môi trường có nhiều yếu tố dinh dưỡng
cần thiết có khi lại chính là yếu tố gây đột biến. Ví dụ: đột biến lặn chịu được S-
2- aminpethyl cystein xuất hiện sau khi xử lý đột biến phôi nuôi cấy.
1.2.5. Tái sinh cây từ tế bào nuôi cấy in vitro
Hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy mô và tái sinh cây là khâu quan trọng đầu
tiên trước khi thực sự bắt tay vào công việc chọn dòng tế bào. Theo Raghava
và Nabors (1985) để hoàn thiện kỹ thuật này cần chú ý những vấn đề sau:
(1) Nguồn mẫu vật nuôi cấy có các tế bào sinh trưởng với tốc độ nhanh
(mô phân sinh, đỉnh sinh trưởng, mô phôi).
(2) Môi trường và điều kiện nuôi cấy: pH, chế độ chiếu sáng, nhiệt độ…
(3) Nồng độ và tỷ lệ thích hợp auxin và cytokinin.
(4) Số lần cấy chuyển.
(5) Tỷ lệ khối mô sẹo với thể tích môi trường.
(6) Sự có mặt của các yếu tố bắt buộc ở môi trường chọn lọc [46]
Tái sinh cây được xem là khâu quyết định thành công trong chọn dòng tế
bào. Nhiều tác giả sau khi chọn được dòng tế bào đột biến từ nuôi cấy mô sẹo
đã không tái sinh được thành cây hoàn chỉnh. Đến nay đã có nhiều công trình
nghiên cứu khả năng tái sinh cây trên nhiều đối tượng cây trồng có ý nghĩa

kinh tế như lúa nước, lúa mỳ, củ cải đường [15], [26]. Nguồn gốc mô sẹo là
một yếu tố ảnh hưởng lớn đến khả năng tái sinh cây [6],[15]. Theo Wong và
CS (1983), mức độ bội thể của mô sẹo cũng là nguyên nhân gây ra sự khác
nhau trong quá trình tái sinh cây. Mô sẹo đơn bội từ đoạn thân hay mảnh lá của
Datura innoxia tạo chồi nhanh hơn mô sẹo cùng loại cây lưỡng bội [26].
Khả năng tái sinh cây chịu ảnh hưởng lớn bởi thành phần và nồng độ
các chất kích thích sinh trưởng thực vật bổ sung vào môi trường nuôi cấy.
Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo có hiệu quả cao ở nhiều đố tượng cây trồng
khi bổ sung các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin. Theo
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

14
nghiên cứu của Dix (1990), mô sẹo có khả năng phân hóa tốt trên môi trường
MS cơ bản có bổ sung α-NAA (0,4mg/l), BAP (10mg/l). Sau khi chuyển sang
môi trường MS cơ bản không có chất kích thích sinh trưởng các mô này vẫn
có khả năng tái sinh cao [33].
Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy, khả năng sinh trưởng và tái sinh
cây của mô sẹo sau khi xử ở các điều kiện cực đoan tăng rõ rệt [3], [10], [15],
[37]. Theo Lê Trần Bình và CS (1995), nguyên nhân của hiện tượng này dưới
tác động của các điều kiện cực đoan ở một mức độ nhất định và thời gian nhất
định những mô hay tế bào yếu thường chết, còn những tế bào có sức sống cao
mới sống sót và cho hiệu quả tái sinh cao [3]
1.2.6. Một số nghiên cứu về đánh giá khả năng chống chịu và chọn dòng
tế bào soma bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã đạt được những thành công
nhất định trong việc nghiên cứu khả năng chống chịu của cây trồng. Nguyễn
Hoàng Lộc (1992) sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo thuốc lá kết hợp với tiền
xử lý abscisic acid, manitol và saccharose đã thu được các dòng thuốc lá SC1,
SC2, SC3 có khả năng chịu mất nước trên 90% trọng lượng tươi. Adkins và
CS (1995) đã chọn được dòng lúa chịu hạn từ mô sẹo của giống lúa Khao

Dawk Mali 105 với việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy PEG 8000 [28]. Lê
Trần Bình và các cộng sự khác (1995,1998) đã nghiên cứu khả năng chịu
lạnh và chịu khô ở mô sẹo lúa của các giống lúa có nguồn gốc sinh thái khác
nhau [2], [3].
Bằng phương pháp thổi khô mô sẹo các giống lúa CR203, CH113, Lốc,
X11, C70 Đinh Thị Phòng (2001) đã thu được 271 dòng mô và 900 dòng cây
xanh có khả năng chịu hạn và làm nguyên liệu cho chọn lọc [30]. Nguyễn Thị
Tâm (2004) khi xử lý mô sẹo của các giống lúa CR203, CS4, ML107, CN2,
ĐH60 ở nhiệt độ cao (40
0
- 42
0
) đã tạo ra được 197 dòng mô có khả năng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

15
chịu nóng và 520 dòng cây xanh [17]. Rudrabhatla Sairam và CS (2005) đã
tổng hợp các kết quả nghiên cứu phát triển kỹ thuật tái sinh ở cây một lá mầm
và cây hai lá mầm. Các kết quả nghiên cứu tái sinh cây ở đậu xanh từ phôi
soma và từ mắt lá mầm phục vụ chuyển gen cũng đã được công bố bởi
Jayanti Sen và Spra Guha Mukherjee (1998) [44].
Hiện nay sử dụng kỹ thuật tạo biến dị soma vào việc chọn lọc các dòng
mô sẹo chịu mất nước để tạo dòng đậu tương chịu hạn đang được các nhà
khoa học quan tâm nghiên cứu. Tuy nhiên, đối với cây đậu tương việc tái sinh
từ ống nghiệm gặp rất nhiều khó khăn, đặc biệt là kỹ thuật tái sinh cây từ mô
sẹo. Những nghiên cứu tái sinh cây từ phôi non có nguồn gốc từ mô lá mầm
đậu tương của Ranch và đồng tác giả (1985) [45], Wennuan Liu và đồng tác
giả (1992) [51], đề cập đến hai yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh của phôi
soma, xác định nguồn gốc của phôi soma trong hệ thống tái sinh và kết luận
việc tạo phôi soma từ lá mầm và hệ thống tái sinh có hiệu quả cao đã được

công bố. Nguyễn Thị Thư và đồng tác giả đã nghiên cứu sự tái sinh cây in
vitro qua phôi soma từ lá mầm hạt chưa chín ở cây đậu tương [21], Xiaohui
Song và đồng tác giả (2010) [54] nghiên cứu xác định QTL tiềm ẩn khả năng
sinh phôi soma từ phôi non. Năm 2009, Chao Yang và đồng tác gỉa đã nghiên
cứu sự phát triển phôi soma và tái sinh cây ở các giống đậu tương của Trung
Quốc cho thấy trên 98 giống đậu tương có 12 giống có tần số tạo phôi soma
từ 0,0% đến 85,7% được lựa chọn để nâng cao hiệu quả phôi soma và tái sinh
thực vật. Kết quả cho thấy nồng độ manitol, acid abscisic (ABA) và tuổi cấy
phôi đã ảnh hưởng đến hiệu quả tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma, nhưng có
sự khác biệt giữa các kiểu gen của cây đậu tương [30]. Muruga Loganathan
và đồng tác giả (2010) đã tái sinh thành công cây đậu tương thông qua phôi
soma trực tiếp từ đỉnh chồi của phôi non [43].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

16
1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD ĐỂ ĐÁNH GIÁ CÁC DÒNG CHỌN
LỌC
1.3.1. RAPD
Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình chiều dài các phân
đoạn ADN được nhân bản nhờ các mồi ngẫu nhiên có kích thước 10bp, do
hai nhóm nghiên cứu của Williams và CS (1990) [52] và Welsh và
McClelland (1991) [50] đồng thời xây dựng. Đây là một kỹ thuật phát hiện
chỉ thị di truyền dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Kỹ thuật
RAPD là phương pháp tương đối đơn giản trong đánh giá hệ gen thực vật,
nó không những khắc phục được nhược điểm của phương pháp chọn giống
truyền thống mà còn góp bảo tồn nguồn gen cây trồng và nâng cao hiệu quả
chọn lọc.
Các yếu tố cần thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm: ADN khuôn
(DNA template); Đoạn mồi (primer): chỉ sử dụng một mồi đó là mồi
oligonucleotit có trật tự nucleotit ngẫu nhiên và có chiều dài khoảng 10

nucleotit, trong đó C + G chiếm hơn 60%; ADN - polymerase (Taq
polymerase): hoạt động của Taq polymerase phụ thuộc vào Mg
2+
, nồng độ
dNTP, pH, nhiệt độ biến tính ADN; Bốn loại deoxyribonucleotit triphotphat
(dNTP): ATP, TTP, CTP, GTP; Ion Mg
2+
.
Phản ứng RAPD được tiến hành qua 3 giai đoạn: (1) Giai đoạn biến tính
ADN: ở nhiệt độ 95
0
C trong khoảng 30-60 giây làm cho hai mạch khuôn
ADN tách nhau. (2) Giai đoạn tiếp hợp mồi: khi nhiệt độ hạ xuống 32-40
0
C
mồi tiếp hợp và bám vào sợi ADN khuôn. (3) Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ
được nâng lên 72
0
C thì các đoạn mồi đã bắt cặp với các mạch đơn sẽ được
kéo dài với sự tham gia của Taq polymerase.
Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân đoạn ADN khuôn
được nhân lên thành hai, các đoạn ADN được nhân bản trong mỗi chu kỳ lại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

17
được coi là ADN khuôn cho mỗi chu kỳ nhân bản tiếp theo. Vậy sau k chu kỳ
nhân bản sẽ tạo ra 2
k
các đoạn ADN giống đoạn ADN khuôn ban đầu. RAPD
có thể thực hiện từ 40 - 45 chu kỳ. Như vậy, thành phần và các bước của phản

ứng RAPD dựa trên cơ sở của phản ứng PCR chỉ khác ở chỗ nồng độ Mg
2+

trong thành phần của phản ứng cao hơn, mồi đơn ngắn (10bp) có thể tiếp hợp
ở nhiều vị trí trong ADN và kết quả nhân bản được số đoạn ADN từ hai phân
đoạn ADN trở lên. Mỗi đoạn ADN được nhân có kích thước 100-5000bp.
Sử dụng kỹ thuật RAPD không cần biết trình tự đoạn ADN cần nghiên
cứu, quy trình tiến hành nhanh, chỉ cần một lượng nhỏ ADN khuôn và chỉ cần
một bộ mồi có thể được sử dụng với các loài khác nhau. Kỹ thuật RAPD có ưu
điểm ở chỗ sử dụng các mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotit, quá trình nhân bản
ADN là ngẫu nhiên. Đoạn mồi này có thể bám vào bất kỳ vị trí nào có trình tự
nucleotit bổ sung trên phân tử ADN hệ gen. Với đặc điểm là ngắn nên xác suất
đoạn mồi có được điểm gắn trên phân tử ADN khuôn là rất lớn. Tùy vào nhóm,
loài thực vật hay vi sinh vật mà các đoạn mồi ngẫu nhiên được thiết kế chuyên
dụng. Theo lý thuyết, số lượng các ADN được nhân bản phụ thuộc vào độ dài,
vị trí của các đoạn mồi, kích thước và cấu trúc ADN genome. Thông thường
mỗi đoạn mồi ngẫu nhiên sẽ tạo ra từ 2 - 10 sản phẩm nhân bản [52]. Kết quả
là sau khi điện di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện được sự khác nhau trong phổ
các phân đoạn ADN được nhân bản. Sự khác nhau đó gọi là tính đa hình. Hiện
tượng đa hình các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên xuất hiện là do có sự
biến đổi trình tự nucleotit tại vị trí các đoạn mồi liên kết. Sản phẩm khuếch đại
được phân tích bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide và nhuộm
bằng hóa chất chuyên dụng sẽ phát hiện được sự khác nhau trong phổ các phân
đoạn AND được nhân bản. Vì vậy, tính đa hình thường được nhận ra do sự có
mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản [52].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

18
1.3.2. Ứng dụng kỹ thuật RAPD để phân tích các dòng chọn lọc
Hiện nay, kỹ thuật RAPD đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong

nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử. Người ta đã dùng kỹ thuật này để thiết
lập bản đồ di truyền phân tử [48], [49], nhận dạng các giống cây trồng, phát
hiện quan hệ phát sinh chủng loại đối với nhiều loại cây trồng, đánh giá sự
thay đổi genome của các dòng chọn lọc, đánh giá hệ gen của giống và sự đa
dạng di truyền của tập đoàn giống [41], [38], [52].
Từ khi ra đời kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng rộng rãi cho nhiều đối
tượng khác nhau như: đậu xanh, lúa, lạc, chuối, ngô, đậu tương trong việc
đánh giá đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài [19], phân
tích và đánh giá bộ genome thực vật nhằm xác định những thay đổi của các
dòng chọn lọc ở mức độ phân tử [15].
Để đánh giá sự thay đổi di truyền của các dòng lúa tái sinh từ mô sẹo
chịu mất nước, Lê Xuân Đắc, Đinh Thị Phòng đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên
để chỉ ra sự sai khác ở mức độ phân tử giữa các đối tượng này [5]. Đánh giá
tính đa dạng của một số giống lạc trong tập đoàn giống chống chịu bệnh gỉ sắt
[19], với 11 đoạn mồi ngẫu nhiên, tác giả đã nhận được 109 phân đoạn ADN,
trong đó có 66 phân đoạn đa hình, chiếm 60,6%. Điều này cho thấy, trong
phạm vi của mỗi phản ứng RAPD giữa 33 giống lạc nghiên cứu khác nhau về
cấu trúc ADN, mức sai khác từ 4% đến 18%. Kết quả phân tích ADN cho thấy
các giống lạc ở cùng một vùng địa lý, sinh thái được tập trung thành từng
nhóm, giữa các giống chống chịu bệnh gỉ sắt của tập đoàn giống ICRISAT và
các giống năng suất trong nước không nằm trong cùng một nhánh. Vì thế có
thể lựa chọn các cặp bố mẹ mong muốn để phục vụ cho công tác lai giống. Với
10 mồi ngẫu nhiên, Nguyễn Thị Tâm (2004) đã cho thấy các dòng lúa chọn lọc
tạo ra từ mô sẹo lúa chịu nhiệt giống CR203, CS4, ML107 đã có những thay
đổi ở mức độ phân tử [17]. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) nghiên cứu đa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

19
dạng di truyền của một số giống đậu xanh cho thấy trong 5 mồi ngẫu nhiên chỉ
có 3 mồi RA31, RA45, RA46 cho kết quả đa hình, hệ số tương đồng giữa các

giống dao động từ 0,41- 0,80 [18]. Tương tự như vậy, để phân biệt các loài phụ
đối với lúa và các loại cây trồng như ngô, đu đủ, hành tây, xoài, cỏ đinh lăng
nhiều tác giả đã sử dụng kỹ thuật RAPD để thiết lập sơ đồ hình cây biểu thị
mối quan hệ giữa các đối tượng nghiên cứu.
Kỹ thuật RAPD còn là một công cụ rất có hiệu quả trong việc tìm ra
các chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay các loài khác nhau. Moretzohn
và CS (2004) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của lạc và mối quan hệ với
dạng dại của chúng trên cơ sở phân tích các vùng siêu biến của hệ gen [41].
Kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong những năm gần đây để
phân tích di truyền hệ thống sinh học. Nó là phương pháp hiệu quả trong việc
xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền
và lập bản đồ di truyền.
Ở đậu tương, Li và cs (2002) đã phân tích 10 giống đậu tương trồng và
đậu tương dại ở bốn tỉnh của Trung Quốc đã bổ sung dữ liệu về sự đa dạng
chỉ thị phân tử RAPD của các giống đậu tương này [39]. Sự đa dạng di truyền
của các cây đậu tương dại (Glycine soja Siebold et Zucc.) ở vùng Viễn Đông
của nước Nga cũng đã được đánh giá ở mức phân tử bởi Seitova và cs (2004)
[47]. Những nghiên cứu về sự đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể đậu
tương ở Hàn Quốc của Gyu-Taek Cho và cs (2008) [30], ở Nhật Bản của
Xingliang Zhou và cs (2002) [55], ở Canada của Yong-Bi Fu (2007) [57] đã
được công bố. Các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật phân tử để đánh giá tính đa
dạng di truyền của cây đậu tương của Brown-Guedira và cs (2000) [29],
Yiwu Chen và Randall (2005) [56], Yiwu Chen và cs (2006) [56]. Ở Việt
Nam, Chu Hoàng Mậu và cs (2002) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để phân tích
sự sai khác về hệ gen giữa các dòng đậu tương đột biến với nhau và với giống
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

20
gốc, tạo cơ sở cho chọn dòng đột biến có triển vọng [12], Vũ Thanh Trà và cs
(2006) đã sử dụng kỹ thuật SSR để đánh giá tính đa dạng di truyền của các

giống đậu tương địa phương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt [20].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

21
Chƣơng 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Nguyên liệu thực vật
Hai giống đậu tương là ĐVN5 và ĐVN6 do trung tâm thực nghiệm
đậu đỗ, Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam chọn tạo. Đặc điểm của các
giống đậu tương như sau:
Giống ĐVN5: Giống đậu tương ĐVN5 được chọn từ tổ hợp lai hữu
tính giữa Cúc Tuyền x Chaing Mai. ĐVN5 thuộc nhóm chín trung bình sớm,
có thời gian sinh trưởng 84 ngày ở vụ Đông, 88-92 ngày ở vụ Xuân và vụ Hè.
Giống ĐVN5 có khả năng sinh trưởng khỏe, chống bệnh khá, chống đổ,
chống hạn tốt. Giống ĐVN5 có chiều cao trung bình (40,8-77,9cm), số quả
trung bình (21- 40,2 quả/cây), khối hạt trung bình (M1000 hạt =140,3-
179,7g), hàm lượng protein tương đối cao (37,62%). Giống ĐVN5 cho năng
suất cao và ổn định qua cả 3 vụ gieo trồng Xuân, Hè, Đông, năng suất đạt 35-
40 tạ/ha.
Giống ĐVN6: Giống ĐVN6 được chọn từ tổ hợp lai hữu tính giữa
AK-03 x DT96. ĐVN6 thuộc nhóm chín trung bình sớm, có thời gian sinh
trưởng ở vụ Xuân là 90-92 ngày, vụ hè và vụ đông là 80-84 ngày có thể
trồng được cả 3 vụ Xuân, Hè và Đông. Giống ĐVN6 sinh trưởng khỏe,
cứng cây, chiều cao trung bình từ 40-60cm, chống đổ và chống bệnh tốt,
chống hạn kém, khối lượng hạt trung bình (M1000 hạt =170-180g), hàm
lượng protein cao đạt 41,5%. Năng suất của giống đạt 22-30 tạ/ha.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

22
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Các chất kích thích sinh trƣởng: 2,4 Diclorophenoxyacetic acid (2,4-
D), α - Naphtylacetic acid (α-NAA), Giberilic acid (GA3), 6- Benzyl
aminopurin (BAP).
Các hóa chất chuyên dụng khác: Ethanol 70% - 100%, khoáng đa
lượng, vi lượng, vitamin, agar, các hoá chất được mua của hãng Invitrogen:
dNTP, Buffer, Taq ADN polymeraza, mồi, EDTA, TAE, TE, CTAB. . . .
Các hóa chất dùng để phân tích có nguồn gốc từ Anh, Đức, Trung Quốc.
2.1.2.2. Thiết bị
Cân phân tích và cân điện tử (Đức, Thụy Sỹ), máy li tâm lạnh (Hettich, Đức),
máy quang phổ Biomate 3 (Mỹ), tủ sấy (Carbolite, Anh), tủ lạnh sâu, máy đo
pH, buồng cấy vô trùng (Nuare, Mỹ), nồi khử trùng (ToMy, Nhật), máy soi
chụp gel, máy PCR
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát









Hạt đậu tương
Tạo mô sẹo từ phôi hạt
Xử lý mất nước mô sẹo
Tái sinh cây từ mô sẹo chịu mất nước

Trồng ngoài đồng
ruộng
Phân tích hệ các gen của các dòng đậu
tương ưu việt của thế hệ R
0
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

23
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thuộc Khoa
Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, phòng thí
nghiệm Sinh học phân tử và Công nghệ gen thuộc Viện Khoa học sự sống –
Đại học Thái Nguyên. Các dòng cây xanh tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước
được trồng trong vụ xuân 2010 tại phường Quan Triều, Thành phố Thái
Nguyên.
2.2.2. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro và chọn dòng chịu hạn
2.2.2.1. Tạo mô sẹo từ hạt đậu tƣơng
- Khử trùng hạt: Hạt đậu tương được rửa 2 lần bằng nước cất vô trùng
sau đó lắc trong cồn 70% trong 1 phút, rửa sạch bằng nước cất vô trùng rối ngâm
trong dung dịch Javen 60% trong 15 phút. Sau đó tráng nước cất 3 lần và ngâm
trong nước cất vô trùng 2 giờ, thấm khô hạt trên đĩa petri có trải giấy lọc vô trùng.
- Tạo mô sẹo: Hạt đậu tương đã khử trùng được tách lấy phôi sau đó
chuyển vào bình tam giác chứa môi trường MS cơ bản, bổ sung 2,4-D (10mg/l,
11mg/l, 12mg/l), saccaroza 3%, agar 0,8%, pH = 5,8. Mỗi bình cấy 18 phôi.
Nuôi 2 tuần trong tối, 2 tuần dưới ánh sáng đèn trong phòng nuôi cấy với cường
độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy 25
0
C

± 1
0
C.
Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy
Số phôi tạo mô sẹo
% tạo mô sẹo = x 100% (2.1)
Tổng số hạt
2.2.2.2. Xử lý mô sẹo bằng thổi khô
Mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy được đặt lên đĩa petri có lót giấy lọc vô
trùng và được thổi khô bằng luồng khí vô trùng của box cấy ở các ngưỡng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

24
thổi khô khác nhau, từ 3, 5, 7 giờ. Xác định độ mất nước của mô sẹo sau 3,
5, 7 giờ xử lý và đối chứng.
Độ mất nước của mô sẹo sau khi xử lý bằng phương pháp thổi khô được tính
theo công thức:
W
f
–W
d


W
L
= — x 100% (2.2)
W
f

Trong đó:

W
L
: độ mất nước (%)
W
f
: khối lượng mô tươi (mg)
W
d
: trọng lượng mô sau thổi khô (mg)
2.2.2.3. Chọn lọc mô sẹo sống sót sau xử lý bằng thổi khô và tái sinh cây
Mô sẹo sống sót được chuyển lên môi trường tái sinh cây gồm MS cơ
bản, bổ sung saccaroza 3%, agar 0,8%, BAP(2mg/l, 3mg/l, 4mg/l, pH = 5,8).
Mỗi bình 15 mô, nuôi 3 tuần dưới ánh sáng đèn neon trong phòng nuôi cấy
với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ trong phòng
nuôi cấy 25
0
C

± 1
0
C.
Khả năng sống sót của mô sẹo được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy và được
tính theo công thức:
N
sv


S
v

(%) = — x 100% (2.3)
N
t

Trong đó:
S
v
: Tỷ lệ mô sẹo sống sót
N
sv
: Số mô sống sót
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên

25
N
t
: Tổng số mô xử lý
Khả năng tái sinh của cây được đánh giá sau 3 tuần nuôi cấy theo công thức:

N
r


R
c
= — x 100% (2.4)
N
sv

Trong đó:

R
c
: Tỷ lệ tái sinh cây
N
r
: Số mô tái sinh cây
N
sv
: Số mô sóng sót được cấy
2.2.2.4. Tạo cây hoàn chỉnh
Các chồi của đậu tương tái sinh có kích thước khoảng 4- 5cm được tách
ra thành từng dòng và cấy chuyển lên môi trường tạo cây hoàn chỉnh gồm: MS
cơ bản, saccaroza 3%, agar 0,8%, bổ sung α-NAA (0,2mg/l, 0,3mg/l, 0,4mg/l),
pH = 5,8. Mật độ cấy 10 chồi trên một bình. Điều kiện nuôi cấy như mục
2.2.2.1.
2.2.2.5. Ra cây và chế độ chăm sóc
Nuôi cấy trong điều kiện ống nghiệm là cây được phát triển trong điều
vô trùng tối ưu. Khi đưa cây ra ngoài ống nghiệm cây phải chịu những tác
động bât lợi từ môi trường sống. Để tăng khả năng sống của cây thì phải từng
bước cho cây làm quen với môi trường sống bên ngoài.
Các bước ra cây được tiến hành như sau:
- Khi cây non trong bình nuôi cấy đạt 3 lá, rễ dài từ 3cm - 5cm, dùng panh
lấy cây ra khỏi bình cấy, rửa lớp aga bám quanh gốc và rễ bằng nước sạch.
- Cây đậu tương được trồng vào khay có chiều sâu khoảng 10cm với giá thể là
đất ruộng, phun nhẹ dung dịch MS cơ bản pha loãng 10 lần vào gốc.