Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm

Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
MỤC LỤC
MỤC LỤC 1
LỜI CẢM ƠN 2
3. Đối tượng nghiên cứu 4
Hình1. Mẫu nấm 660 5
Hình 2. Mẫu nấm 661 5
3.5.3.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột 29
3.5.3.3 Phân loại 30
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC
thành 4 loại: 30
Bình đựng dung môi 31
Bộ khử khí Degasse 32
Bơm (Pump) 32
Bộ phận tiêm mẫu (injection) 32
Cột sắc ký 32
Đầu dò (Detector) 33
Bộ phận ghi tín hiệu 34
In kết quả 34
3.5.3.6. Cách đo HPLC 34
Chương 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52
4.1. Kết luận 52
4.2.Kiến nghị 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 1
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
LỜI CẢM ƠN
Khóa luận được thực hiện tại phòng thí nghiệm Trung tâm Kiểm định An toàn
Thực phẩm và Môi trường, Trường Đại học Vinh.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn đến thầy giáo Th.s

Hoàng Văn Trung - Khoa Hóa, Trường Đại học Vinh đã giao đề tài, tận tình hướng
dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa
luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ths. Chu Thị Thanh Lâm - Khoa Hóa, Trường Đại
học Vinh đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện, hướng dẫn
cách pha hóa chất và cách sử dụng máy HPLC.
Đề tài được hoàn thành nhờ sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài Nghị định thư hợp tác
Việt Nam - Đài Loan của PGS.TS Trần Đình Thắng - khoa Hóa học, trường Đại Học
Vinh.
Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các cán bộ trong
khoa Hoá, trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu
trong một môi trường học tập khoa học, giúp cho tôi có những kiến thức vững vàng
trước khi bước vào đời.
Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè – đặc biệt là các
bạn trong cùng nhóm đồ án thầy Trung hướng dẫn đã giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận
này.
Vinh, ngày tháng năm 2012
Sinh viên thực hiện
Đặng Thị Khánh Hòa
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 2
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
LỜI MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài.
Ngày nay các sản phẩm được chế xuất từ thực vật, thảo dược được đánh giá
cao và được các nhà khoa học nghiên cứu rất nhiều. Ngoài công dụng tốt cho sức khỏe
con người, giúp phòng chống bệnh tật ….thì các sản phẩm hầu như không có tác dụng
phụ ảnh hưởng về sau. Một trong các đề tài được các nhà khoa học quan tâm nghiên
cứu đưa vào ứng dụng trong thực tế là sản phẩm của các loài nấm. Hiện nay nấm trở
thành một trong những khẩu phần chính trong bữa ăn của người dân, bên cạnh mùi vị
thơm ngon, dễ chế biến và giàu dinh dưỡng, nấm còn được xem như là một loài “rau

sạch” và có giá trị dược liệu. Trong số đó có một số loài đã được biết rõ về thành phần
dinh dưỡng. Tuy nhiên một số loài còn lại thành phần này vẫn chưa được công bố
chính thức, đặc biệt là thành phần amino axit. Vì thế, việc xác định thành phần amino
axit trên nấm đối với Việt Nam là điều cần thiết, góp phần phục vụ cho việc khảo sát
nguồn thực phẩm giàu axit amin ở Việt Nam.
Việc xác định amino axit đã được thực hiện trên rất nhiều công cụ khác nhau
như: sắc kí giấy, sắc kí lớp mỏng… Phân tích amino axit trên các công cụ truyền thống
này đòi hỏi nhiều thời gian và rất phức tạp. Ngày nay với sự phát triển của kĩ thuật
phân tích, việc xác định thành phần amino axit trong mẫu sinh hóa đã được đơn giản
hơn rất nhiều bởi hầu hết các công cụ đã được tự động hóa và được nối trực tiếp bộ
phận xử lí số liệu. Hiện nay trên thị trường đang tồn tại rất nhiều kĩ thuật phân tích như
sắc kí lỏng cao áp HPLC, sắc kí trao đổi ion …. Trong đó HPLC là một sắc ký cột
(column chromatograph) đi kèm với một detector nhạy để có thể phát hiện được các
chất tách ra trong quá trình chạy sắc ký. Với những tiến bộ kỷ thuật về cột, detector đã
chuyển sắc ký cột thành phương pháp phân tích có tốc độ nhanh và hiệu suất cao.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu: “Xác định hàm
lượng axit amin trong một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung Bộ bằng sắc ký lỏng
HPLC ”.
2. Nhiệm vụ đồ án.
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 3
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
Trong khóa luận này, tôi có các nhiệm vụ sau:
- Nghiên cứu tổng quan về Nấm, giá trị và thành phần dinh dưỡng của Nấm.
- Nghiên cứu các tính chất vật lý, hóa học và các phương pháp xác định các loại
protein và axitamin.
- Tách và xác định đồng thời các loại axitamin bằng phương pháp HPLC.
- Kiểm tra, đánh giá phương pháp và các điều kiện phân tích với quá trình thực
hiện và kết quả thu được.
- Xử lý kết quả và một số đề xuất kiến nghị.
Tôi hy vọng rằng luận văn sẽ góp phần bổ sung, hoàn thiện số liệu của bảng

thành phần thực phẩm Việt Nam và cung cấp số liệu cho các nghiên cứu dinh dưỡng
về Nấm.
3. Đối tượng nghiên cứu.
Mẫu nấm được thu thập từ các rừng ở địa bàn Bắc Trung Bộ. Mỗi mẫu được
lấy 50g, đựng vào túi nilông sạch. Bao gồm các họ nấm:
- Coriolaceae
- Ganodermataceae
- Lentinaceae
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 4
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
Hình1. Mẫu nấm 660
Hình 2. Mẫu nấm 661
CHƯƠNG1:
TỔNG QUAN
1. Tổng quan về Nấm.
1.1. Giới thiệu về giới nấm.
Nấm là một giới riêng biệt rất lớn với khoảng 1,5 triệu loài,
trong đó đã mô tả
được 69.000 loài (theo
Hawksworth,1991), sống khắp nơi trên Trái đất từ hốc tường
đến thực vật, động vật,
con người; bao gồm nấm men, nấm mốc và các loài nấm lớn.
Ban đầu nấm được xếp vào giới thực vật. Tuy nhiên, quan điểm này ngày nay
không còn thuyết phục nữa và nhiều nhà phân loại học đã đề nghị xếp nấm vào một
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 5
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
giới riêng, gọi là giới nấm. Sở dĩ nấm được xếp vào giới riêng mà không được xếp vào
giới thực vật hay động vật vì nấm có nhiều điểm khác thực vật như:
- Không có lục lạp, không có sắc tố quang hợp nên không thể tự tổng hợp các chất
hữu cơ cho cơ thể từ các cơ thể khác như thực vật, động vật.

- Không có sự phân hoá cơ quan thành thân, rễ, lá, hoa.
- Phần lớn không có chứa cenllulose trong vách tế bào, mà chủ yếu là bằng chitin
và glucan. Chitin là chất gặp nhiều ở động vật hơn thực vật, chủ yếu ở nhóm giáp xác và
côn trùng, tạo thành lớp vỏ hoặc cánh cứng cho các loài này.
- Nấm dự trữ đường dưới dạng glycogen thay vì tinh bột như ở thực vật.
- Nấm cũng không có một chu trình phát triển chung như các loài thực vật.
Nấm cũng không được xếp vào giới động vật vì:
- Nấm sinh sản chủ yếu bằng bào tử (hữu tính hay vô tính) giống hạt phấn của
thực vật.
- Sự sinh dưỡng của nấm liên quan đến hệ sợi nấm. Nấm lấy các chất dinh dưỡng
thông qua màng tế bào của sợi nấm (tương tự như cơ chế ở rễ thực vật).
1.2. Phân loại nấm
Giới Nấm được chia làm 4 giới phụ: Giới phụ Nấm nhầy - Gymnomycetoida;
giới phụ Nấm tảo - Phycomycetoida; giới phụ Restomycetoida và giới phụ Nấm thật -
Eumycetoida.
 Giới phụ Nấm nhầy – Gymnomycetoida
Giới phụ Nấm nhầy - Gymnomycetoida có đặc điểm cơ thể là một khối chất
nguyên sinh lớn, dạng cộng bào, có màu vàng hoặc màu hồng, kích thước có thể tới vài
dm, di chuyển giống như di chuyển của amíp. Nấm nhầy phân bố ở những nơi ẩm thấp,
tối tăm (như hốc cây mục, vỏ cây ).
 Giới phụ Nấm tảo – Phycomycetoida
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 6
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
Giới phụ Nấm tảo - Phycomycetoida có đặc điểm là giai đoạn dinh dưỡng
dạng sợi không có vách ngăn, sống bám và chỉ hình thành vách ngăn khi tạo nên cơ
quan sinh sản.
 Giới phụ Restomycetoida
Giới này gồm những nấm đơn bào, ở nước hoặc ở cạn, sống hoại sinh hay kí sinh
trên cơ thể tảo hoặc thực vật bậc cao.
 Giới phụ Nấm thật - Eumycetoida.

Giới phụ Nấm thật - Eumycetoida có thể dinh dưỡng điển hình là dạng sợi, phân
nhánh, có vách ngăn hoặc không, màng tế bào gồm chủ yếu là kitin, sinh sản
vô tính
bằng bào tử, sinh sản hữu tính bằng nhiều hình thức khác nhau. Nấm thật nguyên
thuỷ sống ở nước, còn tiến hoá cao hơn thì sống ở cạn.
1.3 Các đặc điểm sinh học của nấm
1.3.1 Đặc điểm cấu tạo tế bào
Cơ thể của nấm là một tản, tức là một cơ thể có bộ máy sinh dưỡng chưa phân
hoá thành các cơ quan khác nhau.
Hình 1: Cấu trúc tế bào nấm
1.3.2 Đặc điểm về dinh dưỡng: Có 3 nhóm chính
 Hoại sinh:
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 7
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
Là đặc tính chung của hầu hết các loài nấm, trong đó có nấm trồng. Thức ăn của
chúng là xác bã thực vật hoặc động vật. Chúng có khả năng biến đổi các chất này
thành những thành phần đơn giản để có thể hấp thụ được.
 Ký sinh:
Bao gồm chủ yếu các loài nấm gây bệnh. Chúng sống bám vào cơ thể các sinh
vật khác (động vật, thực vật hoặc các loài nấm khác). Thức ăn của chúng cũng chính là
các chất lấy từ cơ thể kí chủ và do đó làm suy yếu hoặc tổn thương cơ thể kí chủ.
 Cộng sinh:
Đây là nhóm nấm đặc biệt, lấy thức ăn từ cơ thể chủ và ngược lại chúng sẽ cung
cấp các chất khác cho cơ thể chủ. Đây là một hình thức quan hệ qua lại rất chặt chẽ và
có lợi giữa nhiều nhóm sinh vật, hỗ trợ cho nhau cùng phát triển.
1.4. Thành phần dinh dưỡng của nấm.
Nấm được xem là một loại rau nhưng là loại rau cao cấp. Nếu xét về hàm lượng
đạm có thấp hơn thịt cá nhưng lại cao hơn bất kì một loại rau quả nào khác.
Đặc biệt có sự hiện diện gần như đầy đủ các loại axit amin không thay thế,
trong đó có 9 loại axit amin cần thiết cho con người. Nấm rất giàu leusin và lysin là hai

loại axit amin có ít trong ngũ cốc, do đó xét về chất lượng thì đạm ở nấm không thua gì
đạm của động vật .Việc bổ sung đạm trong nguyên liệu trồng nấm có thể làm biến đổi
lượng axit amin nhưng gần như không thay đổi lượng đạm trong nấm.
Nấm chứa ít chất đường và hàm lượng thay đổi từ 3-28% trọng lượng tươi, ở
nấm rơm lượng đường tăng lên trong giai đoạn từ dạng nút sang dạng kéo dài nhưng
lại giảm khi trưởng thành. Đặc biệt nấm có nguồn đường dự trữ dưới dạng glucogen
tương tự như động vật (thay vì tinh bột ở thực vật).
Nấm chứa rất nhiều loại sinh tố (vitamin) như sinh tố B,C,K,A,D,E trong đó
nhiều nhất là sinh tố B như B
1
, B
2
, axit nicotinic, axit pantothenic. Nếu so với rau rất
nghèo sinh tố B12 thì chỉ cần ăn 3g nấm tươi đã đủ cung cấp lượng sinh tố B12 cho
nhu cầu mỗi ngày.
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 8
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
Tương tự như hầu hết các loài rau cải, nấm là nguồn khoáng rất tốt. Nấm được
ghi nhận là giàu K, Ca và Mg chúng chiếm từ 56- 70% lượng tro tổng cộng. Phosphat
và sắt thường hiện diện ở phiến và nhủ nấm. Ở quả thể trưởng thành thì lượng Na và P
giảm trong khi K,Ca và Mg giữ nguyên,ăn nấm bảo đảm bổ sung đầy đủ cho nhu cầu
về khoáng mỗi ngày.
Như vậy ngoài việc cung cấp đạm và đường nấm còn ghóp phần bồi bổ cơ thể
nhờ vào sự dồi dào về khoáng và sinh tố.
1.5. Công dụng của nấm.
Ngoài giá trị cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể, nấm ăn còn có
nhiều tác dụng dược lý khá phong phú như:
- Tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể: Các polysaccharide trong nấm có
khả năng hoạt hóa miễn dịch tế bào, thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của tế
bào lympho, kích hoạt tế bào lympho T và lympho B. Nấm linh chi, nấm vân chi, nấm

đầu khỉ và mộc nhĩ đen còn có tác dụng nâng cao năng lực hoạt động của đại thực bào.
- Kháng ung thư và kháng virus: Trên thực nghiệm, hầu hết các loại nấm ăn
đều có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Với nấm hương, nấm linh chi
và nấm trư linh, tác dụng này đã được khảo sát và khẳng định trên lâm sàng. Nhiều
loại nấm ăn có công năng kích thích cơ thể sản sinh interferon, nhờ đó ức chế được quá
trình sinh trưởng và lưu chuyển của virut.
- Dự phòng và trị liệu các bệnh tim mạch: Nấm ăn có tác dụng điều tiết công
năng tim mạch, làm tăng lưu lượng máu động mạch vành, hạ thấp oxy tiêu thụ và cải
thiện tình trạng thiếu máu cơ tim. Các loại nấm như ngân nhĩ (mộc nhĩ trắng), mộc nhĩ
đen, nấm đầu khỉ, nấm hương, đông trùng hạ thảo… đều có tác dụng điều chỉnh rối
loạn lipid máu, làm hạ lượng cholesterol, triglycerid và beta-lipoprotein trong huyết
thanh. Ngoài ra, nấm linh chi, nấm mỡ, nấm rơm, nấm kim châm, ngân nhĩ, mộc nhĩ
đen còn có tác dụng làm hạ huyết áp.
- Giải độc và bảo vệ tế bào gan: Kết quả nghiên cứu cho thấy, nhiều loại nấm
ăn có tác dụng giải độc và bảo vệ tế bào gan rất tốt. Ví như nấm hương và nấm linh chi
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 9
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
có khả năng làm giảm thiểu tác hại đối với tế bào gan của các chất như carbon
tetrachlorid, thioacetamide và prednisone, làm tăng hàm lượng glucogen trong gan và
hạ thấp men gan. Nấm bạch linh và trư linh có tác dụng lợi niệu, kiện tỳ, an thần,
thường được dùng trong những đơn thuốc Đông dược điều trị viêm gan cấp tính.
- Kiện tỳ dưỡng vị: Nấm đầu khỉ có khả năng lợi tạng phủ, trợ tiêu hóa, có tác
dụng rõ rệt trong trị liệu các chứng bệnh như chán ăn, rối loạn tiêu hóa, viêm loét dạ
dày tá tràng. Nấm bình có tác dụng ích khí sát trùng, phòng chống viêm gan, viêm loét
dạ dày tá tràng, sỏi mật. Nấm kim châm và nấm kim phúc chứa nhiều arginine, có công
dụng phòng chống viêm gan và loét dạ dày.
- Hạ đường máu và chống phóng xạ: Khá nhiều loại nấm ăn có tác dụng làm hạ
đường máu như ngân nhĩ, đông trùng hạ thảo, nấm linh chi… Cơ chế làm giảm đường
huyết của đông trùng hạ thảo là kích thích tuyến tụy bài tiết insulin. Ngoài công dụng
điều chỉnh đường máu, các polysaccharide B và C trong nấm linh chi còn có tác dụng

chống phóng xạ.
- Thanh trừ các gốc tự do và chống lão hóa: Gốc tự do là các sản phẩm có hại
của quá trình chuyển hóa tế bào. Nhiều loại nấm ăn như nấm linh chi, mộc nhĩ đen,
ngân nhĩ… có tác dụng thanh trừ các sản phẩm này, làm giảm chất mỡ trong cơ thể, từ
đó có khả năng làm chậm quá trình lão hóa và kéo dài tuổi thọ.
Ngoài ra, nhiều loại nấm ăn còn có tác dụng an thần, trấn tĩnh, rất có lợi cho
việc điều chỉnh hoạt động của hệ thần kinh trung ương. Gần đây, nhiều nhà khoa học
còn phát hiện thấy một số loại nấm ăn có tác dụng phòng chống AIDS ở mức độ nhất
định, thông qua khả năng nâng cao năng lực miễn dịch của cơ thể.
2. Tổng quan về Protein và axitamin.
2.1. Định nghĩa và phân loại protein
Protein là polyme sinh học của L-
α
- axitamin kết hợp với nhau bằng liên kết
peptit.
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 10
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
Chủng loại protein rất phức tạp, đại đa số các kết cấu hoá học vẫ chưa được làm
rõ, chỉ có thể dựa vào mức độ phức tạp về thành phần hoá học của chúng, mà chia ra
thành hai loại là protein đơn giản và protein phức tạp.
 Protein đơn giản: được tạo thành chỉ từ các α-amino axit , polypeptid
gồm hai hay vài chục amino acid liên kết với nhau.
 Protein phức tạp: được tạo thành từ các protein đơn giản kết hợp với các
phân tử không phải protein (phi protein) như axit nucleic, lipit, cacbohiđrat…
Nếu dựa vào tính chất lý hoá, protein còn có thể được chia thành 7 loại là
anbumin, globulin, prolamin, histon, protamin và scleroprotein.
Về mặt dinh dưỡng học, thường dựa vào giá trị dinh dưỡng của protein để chia
protein thức ăn ra thành: Protein hoàn toàn, protein nửa hoàn toàn, protein không hoàn
toàn.
2.2. Cấu tạo phân tử protein

2.2.1. Thành phần nguyên tố của protein.
Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C, H, O, N. Một số còn chứa một
lượng nhỏ S. Tỷ lệ % khối lượng các nguyên tố này trong phân tử protein như sau:
C: 50 – 55%
N: 15 – 18%
H: 6.5 – 7.3%
S: 0 – 0.24%
O: 21 – 24%
Ngoài các nguyên tố trên, một số protein còn chứa một lượng rất nhỏ các
nguyên tố khác như: P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca…
2.2.2. Đơn vị cấu tạo cơ sở của protein – axit amin.
Tuy protein rất đa dạng về cấu trúc và đảm nhận nhiều chức năng như vậy song
hầu như đều xây dựng nên các đại phân tử của mình chủ yếu từ 20 L-
α
- axitamin bằng
liên kết peptit. Do vậy, cũng có thể xem các axitamin này là sản phẩm cuối cùng của
sự thuỷ phân peptit và protein.
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 11
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
Axit amin là những hợp chất hữu cơ mạch thẳng hoặc mạch vòng trong phân tử
có chứa ít nhất một nhóm amin (-NH
2
) và một nhóm cacboxyl (-COOH).
Các axit amin thường gặp trong các protein (trong tự nhiên) là những L-
α
-
axitamin có nhóm amin dính vào nguyên tử cacbon
α
đứng cạnh nhóm cacboxyl.
Công thức cấu tạo tổng quát của axit amin:

R: được gọi là mạch bên hay nhóm bên, các axit amin chỉ khác nhau ở mạch R.
Đa số các protein được cấu tạo từ 20 L-
α
- axitamin và 2 amit tương ứng.
2.2.2.1. Phân loại axitamin
- Dựa vào khả năng tổng hợp protein trong cơ thể, người ta chia axitamin làm
hai loại: axit amin thiết yếu và axit amin không thiết yếu.
Acid amin thiết yếu
( không thể thay thế)
Acid amin không thiết yếu
( có thể thay thế )
- Cơ thể không thể tổng hợp được chúng
để tạo protein.
- Hoàn toàn phụ thuộc vào sự cung cấp
từ thức ăn bên ngoài đưa vào cơ thể.
- Có 10 loại acid amin thiết yếu:
Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin,
Phenillalanin, Threonin, Tryptophan và
Valin.
- Cơ thể có thể tổng hợp chúng với số
lượng đầy đủ từ các phân tử khác trong cơ
thể.
- Không bắt buộc hiện diện trong chế độ
ăn .
- Các loại acid amin không thiết yếu :
Alanin, Glycin, Serin, Tyrosin, Polin,
Cystein, Cystin.
Dựa vào cấu tạo gốc R để phân 20 axit amin cơ bản thành các nhóm. Một
trong các cách phân loại là 20 axit amin được phân thành 5 nhóm như sau:
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 12

Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
Nhóm 1: các axit amin có gốc R không phân cực kị nước, thuộc nhóm này có 6
axit amin : Gly (G), Ala (A), Val (V), Leu (L), ILe (I), Pro (P)
Nhóm 2: các axit amin có gốc R là nhân thơm, thuộc nhóm này có 3 axit amin :
Phe (F), Tyr (Y), Trp (W)
Nhóm 3: các axit amin có gốc R bazơ, tích điện dương, thuộc nhóm này có 3
axit amin : Lys (K), Arg (R), His (H)
Nhóm 4: các axit amin có gốc R phân cực, không tích điện, thuộc nhóm này có
6 axit amin : Ser (S), Thr (T), Cys (C), Met (M), Asn (N), Gln (Q)
Nhóm 5: các axit amin có gốc R axit, tích điện âm, thuộc nhóm này có 2 axit
amin : Asp (D), Glu (E)
Như vậy cấu tạo của chúng giống nhau ở chỗ cùng có nhóm cacboxyl – COOH
và nhóm amin – NH
2
đều gắn vào nguyên tử C ở vị trí
α
, còn khác nhau ở cấu tạo
mạch bên R.
2.2.2.2 Peptid
Là những phân tử sinh học cấu tạo từ một cho tới vài chục axit amin.Peptid tạo
thành từ những axit amin thông qua phản ứng nối đầu – NH
2
của phân tử này với đầu –
COOH của phân tử kia tạo nên liên kết peptid.
Ngoài liên kết peptid, đôi khi giữa các axit amin xìn có liên kết disunfua nối 2
gốc xystein với nhau. Liên kết này có vai trò quan trọng giúp hình thành cấu trúc
không gian của rất nhiều protein, đặc biệt protein ngoại bào có chức năng sinh học
quan trọng như hocmon, immunoglobulin và kháng thể.
Các peptid bị thủy phân hoàn toàn bởi dung dịch HCL 6M ở 110
o

C trong 24h,
hoặc bởi dung dịch kiềm để cho các axit amin tự do.
Liên kết peptid còn bị thủy phân bởi enzym proteazơ. Chúng có mặt ở tất cả các
tế bào và mô tế bào để thực hiện nhiệm vụ chủ yếu là phân giải protein.
2.3. Cấu trúc phân tử protein
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 13
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
2.3.1. Cấu trúc bậc một của protein
Cấu trúc bậc 1 của protein là sự liên kết giữa các axit amin với nhau thành chuỗi
thông qua liên kết peptit (-CO - NH-), Mạch liên kết này hình thành giữa nhóm COOH
của axit amin trước với nhóm NH
2
của axit amin bên cạnh.
2.3.2. Cấu trúc bậc hai của protein
Cấu trúc bậc 2 của protein là cấu trúc có chu kỳ của chuỗi polypeptit. Chuỗi
polypeptit được sắp xếp gọn lại trong không gian nhất là trong môi trường sinh vật,
trong mô bào theo những hình thù nhất định, bền vững hơn phù hợp với chức năng của
chúng.
Trong cơ thể, xét về cấu trúc bậc 2, protein có thể chia ra làm 3 loại:
- Loại hoàn toàn cấu tạo từ xoắn α.
- Loại hoàn toàn cấu tạo từ gấp nếp β.
- Loại chứa cả xoắn α và gấp nếp β.
2.3.3. Cấu trúc bậc ba của protein
Là cấu hình không gian phức tạp của chuỗi polypeptit do sự gấp khúc, cuộn lại
của cấu trúc bậc 2 tạo cho protein có hình thù nhất định đặc trưng cho từng loại protein
và hình thù đặc trưng này được quyết định từ cấu trúc bậc 1. Sự sắp xếp gọn lại trong
không gian của phân tử protein khi đã có cấu trúc bậc 2 này giúp cho phân tử protein
ổn định trong môi trường sống.
2.3.4. Cấu trúc bậc bốn của protein
Các protein chứa trong phân tử từ 2 chuỗi polypeptit trở lên thể hiện sự phức

tạp hơn về mức độ cấu trúc phân tử được gọi là cấu trúc bậc 4. Protein có trạng thái tổ
hợp hình thành từ nhiều tiểu phần protein gọi là protein olygomeric. Mỗi chuỗi
polypeptit trong một protein như vậy được gọi là là tiểu đơn vị (sub unit) hay là một
protomer. Mỗi tiểu đơn vị đều có cấu trúc bậc 1, 2, 3 riêng của nó.
2.4. Một số tính chất hóa lý của protein và axit amin.
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 14
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
2.4.1 Tính chất biến tính.
Protein dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như nhiệt độ cài, áp suất lớn hoặc
các tia UV, tia X hoặc các chấn động cơ học, các tác nhân hóa học (kiềm hay axit), ion
kim loại nặng Cu
2+
, Pb
2+
,… làm cho cấu trúc bậc 2,3,4 bị phá hủy cón cấu trúc bậc 1
vẫn giữ nguyên làm cho tính chất của protein bị thay đổi đó là hiện tượng protein bị
biến tính.
Tính chất của protein sau khi bị biến tính như sau:
 Giảm khả năng hòa tan do làm lộ các
nhóm kỵ nước.
 Giảm khả năng giữ nước.
 Mất các hoạt tính sinh học.
 Tăng khả năng tấn công protease.
 Làm giảm sức căng bề mặt.
 Tăng độ nhớt nội tại.
 Mất khả năng kết dính.
2.4.2. Tính chất lưỡng tính:
Axit amin và protein đều có tính chất lưỡng tính tức là vừa có tính axit vừa có
tính bazơ. Phân tử axit amin có nhóm amin và nhóm carboxyl trong phân tử. Ở pH
trung tính axit amin tồn tại ở dạng ion lưỡng cực và trạng thái ion phụ thuộc vào pH

của môi trường. Khi đặt axit amin trong điện trường thì tùy thuộc vào pH mà di
chuyển về catot hay anot, ở một pH nào đó thì axit amin không di chuyển về bên nào,
đó là điểm đẳng điện của axit amin.
Như vậy, protein cũng là lưỡng tính vì trong phân tử có nhiều nhóm axit amin.
2.4.3. Tính kị nước:
Dựa vào độ kỵ nước trung bình của một protein có thể biết trước được mức độ
đắng của dịch thủy phân (hydrolyzat) từ protein đó, hoặc biết trước được vị trí của một
protein màng nào đó là ở trong hay ngoài màng phospholipit.
2.5. Tính chất hóa học của protein và axit amin.
Do trong phân tử protein có nhiều chuỗi polypeptid nên ta có thể chia thành các
nhóm phản ứng sau:
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 15
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
- Phản ứng của nhóm liên kết peptid.
- Phản ứng thủy phân bởi enzym.
- Phản ứng đặc trưng của một số gốc axit amin trong phân tử.
- Phản ứng của nhóm
α
- amin tự do của chuỗi polypeptid.
Phản ứng Biure:
Là phản ứng đặc trưng của liên kết peptid, tất cả các chất có chứa từ hai liên kết
peptid trở lên đều cho phản ứng này (axit amin và dipeptid đều không có phản ứng
này). Trong môi trường kiềm mạnh, liên kết peptid trong phân tử protein phản ứng với
CuSO
4
tạo thành phức chất màu tím hoặc tím đỏ.
Phản ứng này được ứng dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng protein. Độ
nhạy của phản ứng tăng lên nhiều lần khi có thuốc thử Folin – ciocalteau.
Phản ứng với thuốc thử Folin – ciocalteau:
Thuốc thử Folin – ciocalteau có chứa axit phosphomolipdic và axit

phosphovolframic. Các chất này một mặt làm tăng độ nhạy phản ứng biure, mặt khác
phản ứng với gốc Tyr và Trp trong phân tử protein. Các gốc axit amin mày tham gia
trong quá trình tạo phức chất màu. Phức được tạo thành có màu xanh da trời, cường độ
màu tỷ lệ với hàm lượng protein trong một giới hạn nhất định và có thể đo được bằng
máy đo quang và dựa vào đường chuẩn ta có thể xác định được hàm lượng của protein
thành phần.
Phản ứng thủy phân với enzym:
Dưới tác dụng của enzym, protein bị thủy phân thành axit amin và mỗi phản
ứng cần một enzym đặc hiệu cho phản ứng đó.
Phản ứng với ninhidrin:
Phản ứng màu đặc trưng và quan trọng để định tính và định lượng axit amin.
Tất cả các
α
- axit amin của protein đều phản ứng với ninhidrin tạo thành hợp
chất màu xanh tím, riêng aminoaxit như prolin tạo thành màu vàng. Phản ứng này rất
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 16
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
nhạy, có thể phát hiện đến ppm, vì vậy được dùng nhiều trong phân tích định tính và
định lượng axit amin. Cơ chế phản ứng khá phức tạp và có nhiều chỗ chưa thống nhất.
Phản ứng của nhóm
α
- axit amin với formaldehit:
Đây là phản ứng quan trọng thường dùng để đánh giá mức độ thủy phân
protein. Formaldehit phản ứng với nhóm amin tạo thành dẫn xuất metilen của axit
amin theo phản ứng sau:
Phương pháp xác định nitơ theo phương pháp này gọi là phương pháp đinh
lượng nitơ formol.
Ngoài ra axit amin còn có một số tính chất khác như sau:
• Axit amin có khả năng kết tinh
• Bền với nhiệt độ khoảng 100

0
C đến 200
0
C trong 2 giờ
• Khá bền trong môi trường axit, không bền trong môi trường kiềm (trong
môi trường axit chỉ có trytophan bị phá hủy)
• Tính chất đồng phân quang học
• Tất cả các axit amin đều có đồng phân quang học (trừ Glycin)
• Đa số các axit amin tự nhiên đều tồn tại ở dạng L – axit amin (chỉ ở dạng
này thì các axit amin mới có giá tị dinh dưỡng cho con người và động vật).
2.6. Chức năng, vai trò của protein và axit amin.
2.6.1. Chức năng của protein.
Protein là nền tảng của mọi quá trình sống, điều này được thể hiện ở các chức
năng của nó đối với sự sống, cụ thể như sau:
 Chức năng tạo hình
Protein là thành phần cấu tạo của các tế bào kể từ siêu vi khuẩn đến tế bào có
nhân, các mô và dịch sinh vật. Nhờ chức năng tạo hình của protein mà sinh vật có hình
dáng ổn định đặc trưng, đặc biệt trong các cấu trúc nâng đỡ.
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 17
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
 Chức năng xúc tác sinh học
Hầu hết các quá trình trao đổi chất đặc trưng đối với cơ thể sống đều tiến hành
dưới sự xúc tác bởi những chất có hoạt tính sinh học đặc biệt đó là các enzym có bản
chất là protein.
 Chức năng điều hòa chuyển hóa:
Một số peptit hoặc protein có khả năng tăng cường hoặc kìm hãm hoạt động
của enzym,tham gia điều hòa tốc độ và sự cân bằng các quá trình sinh học trong cơ thể.
 Chức năng vận chuyển các chất:
Nnhiều phân tử nhỏ và các ion được vận chuyển bởi các protein đặc hiệu.
 Protein có vai trò trong việc co duỗi, vận động

Protein là thành phần chủ yếu của cơ. Sự co cơ được thực hiện bởi chuyển động
trượt của 2 loại protein sợi: actin và miosin.
 Chức năng bảo vệ:
Cơ thể sống có khả năng tổng hợp những protein đặc hiệu, biệt hóa cao gọi là
các kháng thể, chúng có khả năng nhận biết và kết hợp với các yếu tố ngoại lai (các
kháng nguyên) như các vi rút, vi khuẩn, độc tố vi khuẩn, trombin, fibrin là các yếu tố
đông máu, một số protein chống đông.
 Chức năng dẫn truyền thông tin
Protein là chất thụ cảm của hocmon và các phân tử báo hiệu khác.
 Chức năng cung cấp năng lượng và dự trữ
Sự chuyển hóa của một bộ khung cacbon của axit amin trong chu trình Krebs
cũng đóng góp một phần năng lượng cho cơ thể.
2.6.2. Vai trò của axit amin.
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 18
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
Axitamin là cấu tử cơ bản của protein, hay nói một cách khác, axitamin là
những “viên gạch” để xây nên “các toà lâu đài muôn hình vẽ” của phân tử protein. Vai
trò cụ thể của một số axit amin như sau :
 PHENYLALANINE: Có chức năng bồi bổ cho não, tăng cường trí nhớ, tác
động trực tiếp đến não bộ, tạo ra vitamin D nuôi dưỡng làn da.
 LEUCINE: Rất quan trọng trong quá trình điều chỉnh hàm lượng đường
trong máu; tốt cho bệnh nhân mắc chứng “hyperglycemia” hoặc những người mong
muốn đốt cháy chất béo nhanh chóng. Hơn nữa, loại acid amin này còn có chức năng
duy trì lượng hormone tăng trưởng để thúc đẩy quá trình phát triển mô cơ.
 ISOLEUCINE: Đóng vai trò sống còn trong quá trình phục hồi sức khỏe sau
thời gian luyện tập thể dục thể thao. Đồng thời giúp điều tiết lượng đường glucose
trong máu, hỗ trợ quá trình hình thành hemoglobin và đông máu.
 THREONINE: Chức năng chính là hỗ trợ hình thành collagen và elastin -
hai chất liên kết các tế bào trong cơ thể. Ngoài ra, nó rất tốt cho hoạt động gan, tăng
cường hệ miễn dịch và thúc đẩy cơ thể hấp thụ mạnh các dưỡng chất.

 VALINE: Loại acid amin này chữa lành tế bào cơ và hình thành tế bào mới,
đồng thời giúp cân bằng nitơ cần thiết. Ngoài ra, nó còn phân hủy đường glucose trong
cơ thể.
 TRYPTOPHAN: Có hai chức năng quan trọng, một là được gan chuyển hóa
thành niacin (vitamin B3), hai là cung cấp tiền chất của serotonin, một chất dẫn truyền
thần kinh giúp cơ thể điều hòa sự ngon miệng, giấc ngủ và tâm trạng.
 METHIONINE: chứa lưu huỳnh có tác dụng bảo vệ đặc hiệu tế bào gan,
chống nhiễm độc. Methionine còn được dùng như một yếu tố ngăn ngừa tế bào gan
thoái hóa mỡ.
2.7. Lượng nhu cầu của các axit amin cần thiết đối với con người.
Bảng 1: Trị số ước lượng về đòi hỏi các axit amin cần thiết (mg/kg cân nặng/ngày):
Axit amin Trẻ dưới Trẻ 2 10 – 12 Người lớn Tỷ lệ
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 19
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
1 tuổi tuổi tuổi
Histidin 28 8-12 2.9
Isoleucin 70 31 30 10 2.9
Leucin 161 73 45 14 4.0
Lysin 103 64 60 12 3.4
Methionin + Cystin 58 27 27 13 3.7
Phenylalanin + Tyrosin 125 69 27 14 4.0
Threonin 87 37 35 7 2.0
Tryptophan 17 12.5 4 3.5 1.0
Valin 93 38 33 10 2.9
Tổng cộng 714 352 261 84
* Tính theo người lớn:
Trị số ước lượng về nhu cầu axit amin được tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ
chức Nông nghiệp và Lương thực thế giới (FAO) đưa ra căn cứ theo các tài liệu nghiên
cứu khác nhau.
Bảng 2: Đối chiếu các loại axit amin thiết yếu:

Axit amin
Gạo
Tỷ lệ đòi hỏi các axit amin
thiết yếu ở người lớn
Hàm lượng
(%)
Tỷ lệ
Isoleucin 5.4 2.1 2.9
Leucin 9.0 5.6 4.0
Lysin 3.8 2.4 3.4
Methionin + Cystin 4.1 2.7 3.7
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 20
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
Phenylalanin + Tyrosin 4.7 2.9 4.0
Threonin 3.9 2.4 2.0
Tryptophan 1.6 1.0 1.0
Valin 5.5 3.4 2.9
2.8. Nguồn protein và axitamin.
2.8.1. Trong thực phẩm.
Các thức ăn chủ yếu cung cấp protein cho cơ thể có thể là: các loại thịt gia cầm.
gia súc, các loại thủy sản, hàm lượng protein trong đó thường là 10 – 20%; trong sữa
tươi các loại là 1,5 – 3,8%; trong trứng các loại là 11 – 14%; trong đậu khô các loại là
20 – 40% - là loại có hàm lượng protein tương đối cao trong các loại thức ăn từ thực
vật; các loại quả cứng như hồ đào, hạt sen… cũng chứa 15 – 30% protein; hạt cố các
loại thường chỉ chứa 6 – 10% protein; khoai lang chiếm 2 – 3%.
Thực phẩm nguồn gốc động vật (thịt, cá, trứng, sữa) là nguồn protein quý, nhiều
về số lượng, và cân đối hơn về thành phần và đậm độ axit amin cần thiết cao. Thực
phẩm nguồn gốc thực vật (đậu tương, gạo, mì, ngô, các loại đậu khác ) là nguồn
protein quan trọng. Hàm lượng axit amin cần thiết cao trong đậu tương còn
cácloại khác thì hàm lượng axit amin cần thiết không cao, tỉ lệ các axit amin

kém cân đối hơn so với nhu cầu cơ thể. Nhưng việc có sẵn trong thiên nhiên
một khối lượng lớn với giá rẻ nên protein thực vật có vai trò quan trọng đối với
khẩu phần ăn của con người.
2.8.2. Protein và axit amin trong trong nấm.
Nấm được xem là một loại rau nhưng là loại rau cao cấp. Nếu xét về hàm lượng
đạm có thấp hơn thịt cá nhưng lại cao hơn bất kì một loại rau quả nào khác.
Đặc biệt có sự hiện diện gần như đầy đủ các loại axit amin không thay thế. Nấm
rất giàu leusin và lysin là hai loại axit amin có ít trong ngũ cốc, do đó xét về chất lượng
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 21
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
thì đạm ở nấm không thua gì đạm của động vật .Việc bổ sung đạm trong nguyên liệu
trồng nấm có thể làm biến đổi lượng axit amin nhưng gần như không thay đổi lượng
đạm trong nấm.
3. Tổng quan về phương pháp định lượng protein và axit amin
Các phương pháp thông thường chủ yếu dựa vào sự có mặt của nitơ trong phân
tử axit amin. Vì khối lượng phân tử của các axit amin khác nhau nên kết quả thường
biểu thị bằng nitơ axit amin.
3.1. Định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl
Phương pháp định lượng nitơ toàn phần bằng phương pháp Kjeldahl đơn giản
và dễ thực hiện.
Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số.
Nitơ có trong thành phần axit amin của protein là nitơ protein. Nitơ không có trong
thành phần của protein như các muối vô cơ, axit nitric, các amin tự do, các peptit, urê
và các dẫn suất của urê, các ancaloit, các bazơ purin và pyrimidin… là nitơ phi
protein…
Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein
Để định lượng nitơ protein người ta thường xác định nitơ tổng số và nitơ phi
protein theo phương pháp Kjeldahl, sau đó lấy hiệu số giữa hai dạng nitơ này rồi nhân
với hệ số tương ứng.
3.1.1. Xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl

Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H
2
SO
4
đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc
tác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:
OHSOH
242
22
→
+
↑
2
2SO
+ O
2
Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxy hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa
nitơ dưới tác dụng của H
2
SO
4
tạo thành NH
3
. Ví dụ như các protein bị thủy phân thành
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 22
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
các axit amin, cacbon và hydro của axit amin tạo thành CO
2
và H
2

O, còn nitơ được giải
phóng dưới dạng NH
3
kết hợp với H
2
SO
4
dư tạo thành (NH
4
)
2
SO
4
tan trong dung dịch.
NH
3
+ H
2
SO
4

→
(NH
4
)
2
SO
4
Sau khi vô cơ hóa nitơ tồn tại dưới dạng muối amoni sunfat (NH
4

)
2
SO
4
, dùng
một kiềm mạnh (NaOH hoặc KOH) để đẩy NH
3
từ muối (NH
4
)
2
SO
4
thành NH
3
tự do
và định lượng NH
3
bằng axit.
(NH
4
)
2
SO
4
+ 2NaOH
→
Na
2
SO

4
+ H
2
O + 2NH
3
2NH
4
OH + H
2
SO
4

→
(NH
4
)
2
SO
4
+ H
2
O
Từ số ml axit dùng để chuẩn độ tính ra được nitơ toàn phần trong mẫu thử.
3.1.2. Xác định nitơ phi protein
Để xác định nitơ phi protein cần dùng dung môi thích hợp để chiết rút tất cả các
dạng nitơ phi protein (ví dụ dung môi là etanol 70%). Tuy nhiên, trong dịch chiết vẫn
còn lẫn một vài loại protein, vì vậy cần dùng chất kết tủa để tách phần protein hòa tan
trong quá trình chiết rút. Sau khi đã loại bỏ kết tủa dịch lọc chỉ còn dạng nitơ phi
protein . Đem vô cơ hóa dịch này và tiếp tục tiến hành xác định hàm lượng nitơ theo
phương pháp Kjeldahl.

3.1.3. Định lượng protein trong nguyên liệu
Nitơ tổng số bao gồm nitơ phi protein và nitơ protein. Muốn xác định hàm
lượng nitơ trong nguyên liệu cần xác định nitơ phi protein và nitơ tổng số.
Hàm lượng protein trong mẫu được tính theo công thức sau:
Protein (mg) = (N
tổng số
- N
phi protein
). 6,25
Hoặc
Protein (mg) = (N
tổng số
- N
phi protein
). 5,95
3.2. Định lượng protein hòa tan:
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 23
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
Phương pháp định lượng protein hòa tan dựa vào việc tách và kết tủa protein ra
khỏi chất thử, rồi định lượng nitơ trong kết tủa protein bằng phương pháp Kjeldahl.
3.2.1. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp thông thường.
 Phương pháp Stutzer-Barnstein
Chiết protein từ thực phẩm bằng cách đun sôi với nước. Kết tủa protein bằng
CuSO
4
trong môi trường kiềm. Tách kết tủa bằng cách lọc qua giấy lọc, rửa sạch kết
tủa bằng nước cất. Định lượng nitơ toàn phần trong kết tủa bằng phương pháp Kjedahl.
 Phương pháp dùng axit tricloacetic (theo Greenwald)
Chiết protein từ thực phẩm bằng nước đun sôi. Kết tủa protein bằng axit
tricloacatic để qua đêm. Tách kết tủa bằng cách lọc qua giấy lọc, rửa sach kết tủa bằng

axit tricloacetic loãng. Định lượng nitơ toàn phần bằng phương pháp Kjendahl.
 Phương pháp sử dụng tananh (theo Mothes)
Chiết protein từ thực phẩm bằng nước đun sôi. Kết tủa protein bằng
tananh. Tách kết tủa bằng cách lọc qua giấy lọc, rửa sạch kết tủa bằng nước cất. Định
lượng nitơ toàn phần bằng phương pháp Kjendahl
 Phương pháp sử dụng natrisulfat và cồn ở môi trường axit
Kết tủa protein bằng dung dịch ntrisulfat bão hòa và cồn 78
o
C ở trong môi
trường axit. Định lượng phần nitơ phi protein trong dịch lọc bằng phương pháp
Kjedahn. nitơ protein được tính bằng nitơ tổng số trừ đi nitơ phi protein.
3.2.2. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp so màu
Trong môi trường kiềm protein kết hợp với Cu
2+
thành phức chất màu tím (phản
ứng Biure)
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 24
Đề tài : Xác định hàm lượng protein và axit amin trong nấm
Màu sắc của phức tỷ lệ với số lượng mạch peptid (-CONH-) của protein gần
như không phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin và globulin. Dựa vào việc
so sánh tỷ lệ màu của dãy chuẩn protein và mẫu thử protein đã được tách ra khỏi thực
phẩm bằng máy quang kế ở bước sóng
λ
= 550 nm tính được hàm lượng protein hòa
tan trong thực phẩm.
3.3. Định lượng protein tiêu hóa bằng pepsin
Mẫu thực phẩm được trộn trực tiếp với men pepsin trong một cốc thủy tinh, ủ
trong tủ ấm 37 – 40
0
C trong 48 giờ, thỉnh thoảng lắc. Lọc lấy phần không hòa tan loại

protein không tiêu hóa bằng pepsin, định lượng nitơ trong phần không hóa tan bằng
phương pháp Kjeldahl. Nitơ của protein tiêu hóa bằng pepsin được tính bằng hiệu nitơ
toàn phần trừ đi nitơ của phần không hòa tan.
3.4. Định lượng nitơ axit amin bằng phương pháp chuẩn độ
3.4.1. Định lượng nitơ formol (hóa sinh học)
Axit amin hòa tan trong nước có tính chất muối nội phân tử, các nhóm amin và
cacboxyl trung hòa lẫn nhau. Nhóm –COO
-
của axit amin bị cản trở bởi nhóm amin
nên không thể chuẩn độ trực tiếp được. Trong formandehit, nhóm amin của axit amin
phản ứng với nhóm andehit cho metylen. Kết quả của phản ứng là nhóm amin mất tính
chất cơ bản của nó, ngược lại nhóm cacboxyl trong axit amin tồn tại dạng metylen
không bị cản trở và có thể chuẩn độ.
Số nhóm cacboxyl tự do bằng số nhóm amin liên kết với fomandehit, khi chuẩn
độ nhóm cacboxyl thì xác định được nhóm amin. Vì vậy cho phép định lượng được
axit amin có trong dung dịch nghiên cứu.
3.4.2. Định lượng nitơ axit amin bằng Iốt
Trong môi trường dung dịch đệm borat hoặc phosphat, các axit amin phản ứng
với muối đồng tạo thành một phức chất “axit amin – đồng” hòa tan, theo phản ứng:
GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung Page 25