ĐỀ TÀI: Nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia gamma (nguồn co 60 ) vào giai đoạn callus và giai đoạn hạ

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


1

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

ĐẶT VẤN ĐỀ
LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Lúa gạo là nguồn lương thực chính của khoảng 50% dân số thế giới.
Hơn 90% lúa trồng được phân bố ở Châu Á. Trong những năm gần đây Việt
Nam đã đạt được những thành tựu to lớn trong sản xuất lúa gạo, luôn là một
trong những nước có tỷ trọng xuất khẩu gạo đứng hàng đầu thế giới. Kết quả
xuất khẩu gạo trong năm 2008 đạt 4.679.050 tấn, trị giá FOB đạt 2,663 tỷ
USD [37]. Đạt được những thành tựu đú cú sự góp phần rất lớn của khoa học
công nghệ, đặc biệt là trong công tác chọn tạo giống mới.
Dân số toàn cầu tăng lên một cách đáng kể, từ 2,3 tỉ trong thập niên 1940
đã tăng 6,45 tỉ vào năm 2005 [3]. Tốc độ tăng trung bình 1 tỉ dân trong 14 năm.
Hình ảnh như vậy đã đặt ra cho chúng ta một chiến lược phát triển cây lúa
trong điều kiện tài nguyên tự nhiên ngày một cạn kiệt, đặc biệt tài nguyên
nước, sự ô nhiễm môi trường và sự thay đổi khí hậu toàn cầu. Chính vì vậy
việc nghiên cứu để chọn tạo ra được những giống lúa mới có năng suất cao,
chất lượng tốt và đặc biệt là có khả năng chống chịu được trong những điều
kiện khắc nghiệt đang là một vấn đề cấp bách đặt ra cho các nhà khoa học.
Việc sử dụng các phương pháp truyền thống để chọn tạo giống lúa
mới tốn rất nhiều thời gian, có thể từ 8 đến 10 năm [18]. Chi phí cho việc
chọn tạo giống mới cũng rất tốn kém. Một hướng mới trong công tác chọn
tạo giống mới đó là sự kết hợp giữa nuôi cấy in vitro và xử lý đột biến bằng
phóng xạ, cùng với sự giúp đỡ của các chỉ thị phân tử (chỉ thị Isozyme, chỉ
thị ADN) việc chọn lọc cỏc dũng đột biến có lợi được tiến hành dễ dàng và

chính xác hơn [7], [12].
Gõy đột biến thực nghiệm là một trong những phương pháp được áp
dụng rộng rãi trên thế giới và ở Việt Nam, cung cấp nguồn nguyên liệu đa

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


2

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

dạng và phong phú cho quá trình chọn tạo giống mới. Trong quá trình tạo
giống bằng đột biến thực nghiệm, việc phân tích, đánh giỏ nhằm phát hiện
được kiểu gen mong muốn cũng đòi hỏi chi phí nhiều thời gian và công sức
do tính ngẫu nhiên, vô hướng của đột biến. Hơn nữa, quá trình chọn tạo cỏc
dũng đột biến chủ yếu dựa vào kết quả quan sát kiểu hình, mà các đặc điểm
hình thái lại phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường, trạng thái sinh lý
cây trồng và kinh nghiệm của nhà nghiên cứu. Vì vậy mà nhiều kiểu gen đột
biến quớ, cú tiềm năng có thể bị bỏ sót. Do đó, chỉ thị phân tử là một sự lựa
chọn mới cho việc đánh giá sự sai khác trong bộ gen giữa cỏc dũng, giống đột
biến so với giống gốc và phát hiện kiểu gen mong muốn trong thế hệ đột biến
[17], [24].
Từ cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, nhằm đánh giá ảnh hưởng của
phóng xạ tia gamma (nguồn Co
60
) khi chiếu xạ ở giai đoạn calus và giai đoạn
hạt nảy mầm, chúng tôi tiến hành đề tài "Nghiên cứu ảnh hưởng của liều
chiếu xạ tia gamma (nguồn Co
60
) vào giai đoạn callus và giai đoạn hạt nảy

mầm của một số dòng lúa có triển vọng"
MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy in vitro kết hợp chiếu xạ gây đột biến bằng
tia gamma (nguồn Co
60
) vào giai đoạn callus và giai đoạn hạt nảy mầm của
một số dũng lỳa có triển vọng phục vụ chọn tạo giống lúa chất lượng cao,
kháng bệnh tốt.
NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU
1- Nghiên cứu xõy dựng qui trình nuụi cấy in vitro 4 dòng lúa N18, N46,
N91, NV1.
2- Nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia gamma lên cây lúa tái sinh
từ callus chiếu xạ.

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


3

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

3- Nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia gamma lên cây lúa khi xử lý
phóng xạ vào giai đoạn hạt nảy mầm.
4- Nghiên cứu sự sai khác phổ điện di isozyme POD và EST của cây lúa
sau chiếu xạ.
Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
1- Xây dựng được quy trình nuôi cấy in vitro thích hợp của 4 dòng lúa
nghiên cứu.
2- Bước đầu xác định được ảnh hưởng của chiếu xạ giai đoạn callus đến
tỷ lệ sống sót, tỷ lệ tái sinh chồi, tỷ lệ nhõn chồi và phổ điện di isozyme

POD và EST.
3- Xác định được ảnh hưởng của chiếu xạ vào giai đoạn hạt nảy mầm đến
một số đặc điểm hình thái, thời gian sinh trưởng, và những sai khác trên
phổ điện di isozyme EST và POD của một số cây lúa sau chiếu xạ.
PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu là 4 dòng lúa có triển vọng, nhận từ Trường Đại
học Nông nghiệp I: Dòng N18, N46, N91 và NV1. Một phần hạt giống được
sử dụng để tiến hành chiếu xạ vào giai đoạn hạt nảy mầm (giai đoạn 66h),
một phần được sử dụng để nghiên cứu nuôi cấy in vitro.
Địa điểm nghiên cứu: các thí nghiệm theo dõi hình thái được tiến hành
nghiên cứu tại Vườn thực nghiệm Khoa sinh – Trường Đại học Sư phạm Hà
Nội. Các thí nghiệm nghiên cứu nuôi cấy in vitro được tiến hành tại Bộ môn
Vi sinh – Công nghệ sinh học – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. Cỏc thí
nghiệm phân tích điện di được tiến hành tại Bộ môn Di truyền – Khoa Sinh
học – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 8 năm 2008 đến tháng 10 năm 2009.

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


4

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Khái quát về chi Oryza và vị trí cây lúa trồng trong chi Oryza
Chi Oryza lần đầu tiên được Linne mô tả vào năm 1753. Ông chỉ phát
hiện ra một loài là O. sativa dựa trên các mẫu lúa trồng từ Ethiopia. Qua hai
thế kỷ sau đó, đó cú hơn 100 loài thuộc chi Oryza được các tác giả khác nhau

công bố, điều này cho thấy đây là một chi rất phức tạp về mặt phân loại học.
Các loài trong chi Oryza từ lâu đã gây nên sự chú ý của nhiều nhà khoa
học vì tầm quan trọng đặc biệt của nó. Nhiều nghiên cứu về phân loại học, về
chủng loại phát sinh và các mối quan hệ di truyền của các loài trong chi Oryza
đã được tiến hành. Chi Oryza vô cùng đa dạng, được thể hiện ở các genome
khác nhau, và ở sự khác biệt đáng kể về hình thái trong cùng một loài và giữa
các loài. Mặt khác sự khác biệt lớn trong chi phân định không rõ ràng giữa
một số đơn vị phân loại trong chi Oryza. Do đó các tác giả khác nhau cũng đề
nghị các hệ thống phân loại khác nhau. Điều đó càng làm cho hệ thống phân
loại của các loài trong chi Oryza trở nên rắc rối hơn. Có thể nói, cho đến nay
chưa có hệ thống phân loại nào được tất cả các nhà khoa học trên thế giới
công nhận chung.
Chi Oryza L. thuộc tộc Oryzeae, họ phụ Oryzoideae, họ hòa thảo Poaceae
(Gramineae). Chi này gồm có: hai loài lúa trồng là O. sativa L., O. graberrima
Steud., và 22 loài lúa dại phân bố khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.
Lúa trồng ở châu Á (O. sativa) là cây có ý nghĩa kinh tế quan trọng và
bậc nhất vỡ nó là cây lương thực của hơn một nửa dân số trên thế giới. Tất cả
các loài lúa trong chi Oryza, bao gồm cả lúa dại và lúa trồng tạo nên một vốn
gen (genepool) cực kỳ có giá trị trong việc mở rộng nguồn di truyền trong các
chương trình chọn tạo giống lúa.

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


5

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

Hiện nay trên thế giới có hai loài lúa trồng: O.sativa L. và O.
glaberrima Steud. Loài lúa O. sativa L. được trồng ở châu Á nên được gọi là

lúa trồng châu Á. Loài O. sativa L. có hai thứ là O. sativa var. utitissima A.
Camus (lúa tẻ) và O. sativa var. glutinosa Tanka (lúa nếp). Loài lúa trồng
châu Á O. sativa L. có nguồn gốc từ O. perennis Moench (hay O. rufipogon).
Loài O.glaberrima được thuần hóa ở châu Phi, được trồng ở Tây Phi, xuất
hiện vào khoảng 1500 trước công nguyên, có nguồn gốc từ O. breviligulata
Chev. Hai loài lỳa trờn được thuần hóa thành lúa trồng một cách độc lập với
nhau. Năm 1930 Kato đã phân biệt trong loài O.sativa có hai loài phụ:
O.sativa ssp. Indica Kato và O.sativa ssp. Japonica Kato. Hai nhóm này khác
nhau về hình thái, phân bố địa lý, có hiện tượng khó khăn khi lai giữa hai
nhóm cũng như tính bất thụ của con lai tùy theo các dạng bố mẹ đem lai. Năm
1954, Morinaga lại xác định trong loài O.sativa có thờm nhúm thứ ba là
O.sativa javanica, được tìm thấy ở Indonesia.
Đến nay địa điểm xuất hiện của lúa trồng châu Á được cho là một vết
dài từ chân phía Tây Nam và Đông Nam dãy núi Himalaya, qua Assam, tỉnh
Yunnan của Trung Quốc, Burma, Lào, biên giới Thái Lan – Miến Điện và
vùng Tây Bắc của Việt Nam. Có thể có ba trung tâm xuất hiện sớm nhất của
cây lúa trồng châu Á: trung tâm Assam, trung tâm biên giới Thái Lan – Miến
Điện và trung tâm Tây Bắc Việt Nam. í kiến này đã được nhiều nhà khoa học
trên thế giới về nguồn gốc vùng trồng lúa và cây lúa trồng tán thành.
Địa điểm xuất hiện cây lúa trồng châu Phi đơn giản hơn nhiều. Đó là vùng
đồng bằng Mali, cùng một số nơi khác như vùng đất cao Guinec, đồng bằng ven
biển Casamance, thượng lưu sông Niger, phần Tây Nam bờ biển Guinea.
Hiện nay, lúa đang được trồng trong những điều kiện sinh thái và khí
hậu rất khác nhau. Có thể nói, hầu hết cỏc vựng trồng lỳa trờn thế giới đều là
địa bàn của cây lúa châu Á, kể cả ở châu Phi, dồn cây lúa thuần hóa ở lục địa

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


6

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

này (O.glaberrima Steud) vào Tây Phi và chỉ chiếm một diện tích nhỏ ở
Guyana – Nam Mỹ. Điều này đã cho thấy sự đa dạng rất lớn của nguồn gen
cây lúa châu Á. Đến năm 1995, viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) đó cú một
ngân hàng gen lúa của khắp thế giới với hơn 81000 mẫu giống, trong đó lúa
châu Á có 76200 mẫu, lúa châu Phi có 3000 mẫu và lúa dại có 2400 mẫu.
1.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1. Định nghĩa
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các
loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi
trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng. [18] [20]
Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm:
- Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành.
- Nuôi cấy cơ quan: rễ, thõn, lỏ, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.
- Nuôi cấy phụi: phụi non và phôi trưởng thành.
- Nuôi cấy mô sẹo (callus).
- Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào).
- Nuôi cấy protoplast: nuụi cấy phần bên trong tế bào thực vật tách vỏ,
còn gọi là nuôi cấy tế bào trần
1.2.2. Cơ sở sinh học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào
Haberlandt (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của
một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một
cá thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng
rẽ đó phõn hoỏ đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương

7

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều phát triển
thành một cá thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào (totipotency).
Như vậy, tính toàn năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào
đã được biệt hóa (trừ một số tế bào đã được biệt hóa sõu như ống mạch, mao
dẫn) có khả năng thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có thể trong điều kiện
phù hợp sẽ phát triển theo chu trình giống như sự phát triển phôi dẫn đến sự
hình thành cây hoàn chỉnh mới.
Nền tảng quan trọng trên con đường chứng minh toàn diện về tính toàn
năng của tế bào soma ở thực vật đã ghi nhận vào những năm 60 khi Steward
(1963) và Wetherell và Halperin (1963) đồng thời cùng thông báo rằng những
tế bào cà rốt tự do khi nuôi cấy trên môi trường thạch đã tạo thành hàng nghìn
phôi, các phôi này phát triển qua các giai đoạn giống như quá trình tạo phôi
bình thường.
Từ những khám phá trên, đến nay hàng loạt các thông báo về tính toàn
năng của các tế bào soma đã được công bố. Dường như tế bào của tất cả các
cơ quan đều có khả năng phát triển phụi. Phụi soma đã nhận được ở nhiều
giống cây trồng như: Atrapoda, Begonia, Citrus, Coffea, Cymbidium,
Hordeum, Kalanchoe, Nicotinana, Panax, Pinus, Ranumculus, Solanum,
Oryza, và nhiều loài cõy khỏc nữa.
1.2.2.2. Sự phản phõn hoỏ và phõn hoỏ của tế bào
Cơ thể thực vật trưởng thành là một nhóm chính thể thống nhất bao
gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào
khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào
đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình
thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyờn hoỏ).

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


8

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế
bào chuyờn hoỏ đặc biệt cho cỏc mụ, cơ quan có chức năng khác nhau.
Sự phõn hoỏ tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào
mụ chuyờn hoỏ, đảm nhận các chức năng khác nhau. Ví dụ: Mô dậu làm
nhiệm vụ quang hợp, mụ bỡ làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô dự trữ làm nhiệm
vụ dự trữ, mô dẫn làm chức năng dẫn nước và dẫn dinh dưỡng.
Quá trình phõn hoỏ tế bào có thể biểu thị:
Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào phõn hoỏ có chức năng riêng biệt
Tuy nhiên, khi tế bào đó phõn hoỏ thành các tế bào có chức năng
chuyờn, chỳng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong
trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế
bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phõn hoỏ tế
bào, ngược lại với sự phõn hoỏ tế bào.
Phõn hoỏ tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyờn hoỏ

Phản phõn hoỏ tế bào
Về bản chất thì sự phõn hoỏ và phản phõn hoỏ là một quá trình hoạt
hoá, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá
thể, có một số gen được hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính
trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra

theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi
tế bào khiến quá trình sinh trưởng và phát triển của cơ thể thực vật luôn được
hài hoà.

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


9

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức
chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích
thước của từng khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hoỏ cỏc gen
của tế bào.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực
chất là kết quả của quá trình phõn hoỏ và phản phõn hoỏ tế bào. Kỹ thuật nuôi
cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái
của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô
trùng) một cách định hướng dựa vào sự phõn hoỏ và phản phõn hoỏ của tế
bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh
hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy
hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin.
1.2.3. Lịch sử phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mụ cõy một lá
mầm nhưng không thành công.
Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một
hoocmon thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng
trưởng và phân chia tế bào.
Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng

thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng
(cambium) ở cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục.
Năm 1955, Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp
của kinetin - một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phõn
hoỏ chồi ở mô nuôi cấy.
Đến năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ
các chất auxin : cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


10

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

hoặc chồi). Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/ nồng độ kinetin)
nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mô có xu hướng tạo chồi. Ngược lại khi nồng độ
IAA/ nồng độ kinetin lớn hơn 1 và càng lớn, mụ cú xu hướng tạo rễ. Tỷ lệ
nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phõn hoỏ cả chồi và rễ, tạo
cây hoàn chỉnh.
Năm 1960, Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ
thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan Cymbidium,
mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực vật.
Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo
được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt.
Năm 1971 Takebe và cộng sự đã tái sinh được cây từ tế bào trần mô
thịt lá ở thuốc lá.
Năm 1978, Melcher và cộng sự đã tạo được cây lai soma cà chua –
thuốc lá bằng dung hợp tế bào trần
Năm 1979, Marton và cộng sự đã xây dựng được quy trình chuyển gen

vào tế bào trần bằng đồng nuôi cấy tế bào trần và Agrobacterium.
Từ năm 1980 đến nay, hướng chuyển gen vào tế bào thông qua việc
nuôi cấy mô tế bào và vi khuẩn Agrobacterium được triển khai rộng rãi.
1.3. Tác nhân phóng xạ gây đột biến
1.3.1 Phân loại
Dựa vào khả năng ion hóa vật chất bị nhiễm xạ, có thể chia tác nhân
phóng xạ gây đột biến thành 2 nhóm:
* Nhóm phóng xạ ion hóa: Là loại phóng xạ gây phản ứng hóa phóng xạ, tạo
ra các cặp ion hóa trong môi trường mà chúng thâm nhập hoặc gây ra sự kích
động phõ tử. Nhóm này được chia làm 2 nhóm phụ:

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


11

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

+ Nhóm bức xạ hạt: Nhóm bức xạ hạt được đặc trưng bởi khối lượng
và điện tích khác nhau. Nhóm này gồm các hạt sơ cấp và dòng nguyên tử có
vận tốc không đổi (V = const)
Nhóm bức xạ hạt được chia làm 3 phân nhóm:
- Nhóm hạt mang điện tích: gồm điện tử (e) và positon sinh ra do phản
ứng hạt nhân.
- Nhóm hạt nặng mang điện: gồm proton, hạt α và các hạt khác.
- Nhóm trung tử (nơtron): hạt không mang điện nên có thể thâm nhập
vào mọi hạt nhân nguyên tử.
+ Nhóm bức xạ sóng điện từ: nhóm này đặc trưng bởi vận tốc, độ dài
bước sóng và được biểu thị bằng công thức:
C = T.λ Trong đó: C – Vận tốc

T – Tần số
λ – Bước sóng
Tia Gamma (γ), tia Rơnghen (tia X) thuộc nhóm này. Do bước sóng rất
ngắn (10
12
– 10
-9
A
0
) và vận tốc rất lớn, không có khối lượng và điện tích,
không bị lệch trong điện trường nờn chỳng cú sức xuyờn sõu lớn. Chúng
không có khả năng điện ly trực tiếp mà chỉ có tác dụng gián tiếp. Năng lượng
của tia gamma tùy thuộc vào tần số sóng, được biểu thị bằng công thức:


Ch
E
.


Trong đó: - E: Năng lượng của tia gamma
- h: Hằng số Plăng (h = 6,62.10
-27
erg/s)
- T: Tần số sóng
- C: Tốc độ ánh sáng
-

: Bước sóng

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


12

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

Nguồn xạ thường dùng để tạo tia gamma là Co
60
.
* Nhóm phóng xạ khụng gõy ion hóa:
Đại diện cho nhóm này là tia tử ngoại (

= 10
-7
– 10
-5
A
0
). Khi xuyên qua
cỏc mụ của cơ thể sinh vật, nó khụng gõy ion hóa mà chỉ kích động phân tử, do
sức xuyên thấu yếu nờn nó thường được dùng để xử lý hạt phấn và bào tử.
1.3.2 Ảnh hưởng của tia Gamma (Co
60
) lên vật chất di truyền
1.3.2.1. Tác động của tia Gamma lên vật chất di truyền ở cấp độ phân tử
Theo Oganhexian (1969), tính đặc thù của sự phát sinh đột biến có liên
quan đến đặc điểm của quá trình từ thời điểm bắt đầu xâm nhập của các tác
nhân vào tế bào, vận động đến một thời điểm nào đó trên nhiễm sắc thể, rồi
gây ra biến đổi cấu trúc phân tử của gen dẫn đến trở thành đột biến.

Khi chiếu xạ bằng tia gamma vào dung dịch ADN sẽ gây ra những biến
đổi chủ yếu như sau:
- Gây đứt đơn: đứt một mạch đơn của phân tử ADN, làm phân tử ADN
biến dạng, tạo cuộn, giảm thể tích phân tử.
- Gây đứt kép: phân tử ADN bị giảm chiều dài, giảm độ nhớt của dung dịch.
- Tạo cầu giữa các phân tử: Làm tăng khối lượng phân tử, tăng độ nhớt,
giảm độ hòa tan và tạo cỏc bỳi không tan.
- Tạo các phân tử phân nhánh: do sự gắn một số đoạn của phân tử bị
đứt vào phân tử khác còn nguyên vẹn.
- Tạo liên kết protein-ADN: làm cho phân tử protein bị dính hay liên
kết giữa bazơ pirimidin biến tính với các axit amin.
- Phá hủy cấu trúc không gian của ADN (làm biến tính ADN)
- Gây hiện tượng nhị trùng phân Timin.

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


13

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

- Phá hủy gốc dị vòng chứa Nitơ.
- Hydrat hóa cỏc bazơ nitơ.
- Gây ra hiện tượng hỗ biến: Tia gamma làm thay đổi vị trí của nguyên
tử hidro, dẫn tới hình thành các gốc lactim hay imin, hậu quả là sự sao chép
sai của ADN, tạo ADN đột biến ở các thế hệ sau.
1.3.2.2. Tác động của tia gamma (Co
60
) lên vật chất di truyền ở cấp độ tế bào
* Tác động của tia gamma (Co

60
) lên cấu trúc nhiễm sắc thể
Theo Xvenson, bức xạ ion hóa có thể gây nên sự phân đoạn của nhiễm
sắc thể. Có hai kiểu phân đoạn NST là:
- Loại đứt thật: đứt rời thành từng khúc.
- Loại tiềm tàng: chưa đứt rời mà ở trạng thái tiềm tàng, có thể chuyển
sang đột biến sau một thời gian nhất định hoặc phục hồi lại trạng thái ban đầu.
Crogodin và Lutxomic cho rằng, phóng xạ ion hóa có thể hủy hoại
nhiễm sắc thể một cách trực tiếp và kéo dài. Nếu có các điều kiện tương ứng
và đủ về thời gian thì sự hủy hoại tiềm tàng có thể trở thành hiện thực và đột
biến bắt đầu xuất hiện trong cấu trúc của NST.
Nói chung, khi xử lý các tác nhân phóng xạ ion hóa ở liều lượng trung
bình cho đến liều lượng không qua ngưỡng chịu đựng của tế bào thì ở kỳ sau
của nguyờn phõn thấy xuất hiện cầu, đoạn, vòng khuyên Hiện tượng chuyển
đoạn lớn và nhỏ hoặc đảo đoạn thường được phát hiện trong giảm phân, đó là
sai hình NST. Mức độ sai hình NST thể hiện bằng các kiểu cấu trúc lại NST
tăng dần theo liều chiếu xạ.
* Tác động của tia Gamma (Co
60
) lên quá trình phân chia tế bào
Trong quá trình nguyờn phõn, tia Gamma có thể gõy cỏc hiệu quả sau:

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


14

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

- Làm kìm hãm hay tạm dừng quá trình nguyờn phõn bằng cách kéo dài

một pha nào đó trong chu kỳ tế bào.
- Làm dừng hoàn toàn quá trình nguyờn phõn nhưng khụng gõy chết tế
bào mà làm mất khả năng phân chia tế bào.
- Làm tăng độ nhớt và kết dính NST dẫn đến sự chết tế bào.
- Đôi khi chiếu xạ liều thấp lại kích thích sự phân chia tế bào.
Trong quá trình giảm phân: Khi dùng tia X gây bức xạ ion hóa ở
Longgiforum, Mistra đã thu được kết quả như sau:
- Gây sai hình NST ở diplonem: các bivalent có thể kết dính với nhau tạo
vòng NST lớn, phần lớn cỏc vũng này đều do chuyển đoạn phức tạp tạo nên.
- Gây sai hình NST ở hậu kỳ I hoặc II. Các kiểu sai hình NST thường thấy
trong giảm phân là: đứt đoạn NST, tạo 1 hoặc 2 đoạn NST và cầu NST, đứt cầu
cromatit tạo ra sự lặp đoạn, tạo cầu cromatit, vòng và hai đoạn do chuyển đoạn,
đứt cromatit, tạo nên cầu cromatit, vòng cromatit ở trạng thái kép; tạo NST có 2
tâm và 2 đoạn, hình thành các đoạn riêng rẽ và cầu cromatit ở kỳ sau I. (Mistra
1958, Sutka 1974, Nguyễn Minh Công và cộng sự 1975-1978)
1.3.2.3. Tác dụng của tia phóng xạ đối với thực vật
Khi xử lý phóng xạ có thể tiến hành theo các phương pháp sau:
- Chiếu xạ hạt khô hoặc hạt ướt.
- Ngâm hạt trong dung dịch đồng vị phóng xạ.
- Trồng cây trên đất cú bún chất đồng vị phóng xạ.
- Đưa chất đồng vị phóng xạ vào cây.
- Phóng xạ thực vật trong quá trình sinh trưởng và phát triển.

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


15

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

Ngày nay người ta còn chiếu xạ các cơ quan, bộ phận riêng rẽ của cây
như: chồi, nụ hoa, bao phấn, bầu nhụy, hoặc xử lý cây đang trồng trong từng
thời kỳ bằng trường Gamma hoặc thiết bị chiếu xạ chuyên dùng của các trung
tâm chiếu xạ.
Hiệu quả chiếu xạ thực vật ở thế hệ đầu thể hiện ở những biến đổi
dương tính, đó là những biến đổi về cấu trúc, hình thái, sinh lý, sinh trưởng,
sinh sản và gây chết. Người ta phân biệt tác dụng ngay sau khi sử lý phóng xạ
(hiệu quả tức thời) với những biến đổi sau khi sử lý phóng xạ (hiệu quả chậm
hay hiệu quả kéo dài). Về hiệu quả tức thời có thể kể ra một số hình thức chủ
yếu sau:
- Biến đổi hóa sinh và lý hóa sinh.
- Biến đổi sinh lý giới hạn ở một số cấu trúc trong vật liệu bị phóng xạ.
- Biến đổi vật chất di truyền.
Hiệu quả chậm cũng gây ra những biến đổi như trên, nhưng diễn ra
trong thời gian dài suốt quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật.
Đối với các loài thực vật, chiếu xạ ở liều lượng thấp có tác dụng kích
thích sinh trưởng, còn chiếu xạ ở liều lượng cao lại kìm hãm, cao quá giới hạn
chịu đựng sẽ gây chết tế bào và cơ thể. Ở lúa, khi xử lý hạt khô bằng tia
gamma ở các liều lượng 5krad, 10krad nhiều khi kích thích quá trình sinh
trưởng và phát triển. (Phạm Quang Lộc. Luận án PTS 1981).
Tác dụng của phóng xạ vào hạt có thể gây hiệu quả ở mọi giai đoạn
trong quá trình phát triển cá thể, chẳng hạn:
- Tác động trực tiếp đến chiều hướng và tốc độ các phản ứng sinh hóa,
chi phối sự nảy mầm.

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


16

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

- Tác dụng gây chết phôi mầm, đình chỉ ngay quá trình nguyờn phõn
đầu tiên hoặc ngừng sự sinh trưởng của phôi.
- Tác dụng xa hơn, có thể ở các cấp độ khác nhau như: Kìm hãm một
pha nào đó của quá trình nguyờn phõn, làm suy giảm sức sống của phôi mầm,
lá mầm, rễ mầm, cuối cùng là gây chết ngay ở thời kỳ mạ, hoặc gây chết
muộn hơn ở thời kỳ đẻ nhánh, trỗ, chín; cũng có thể khụng gõy chết ở thời kỳ
muộn mà lại gõy cỏc biến đổi về hình thái, sinh trưởng, phát triển.
1.3.3 Lược sử nghiên cứu hiệu quả gây đột biến của tia gamma (Co
60
) khi
xử lý hạt nảy mầm
Các tác giả Kawai (1965 - 1966); Guud, Fushuhara (1967); Janaka và
Stamura (1968); Siddig và Swaminathan (1968 - 1969); Vũ Tuyên Hoàng 1972;
Satoh và Omura (1979); Phan Hải, Bùi Chi Lăng, Nguyễn Quang Xu (1983);
Trần Duy Quý (1981 - 1988) đã nghiên cứu hiệu quả gây đột biến của tia
gamma khi xử lý hạt ướt (hạt thấm nước, hạt ngâm nước bão hòa), đều đi đến
một kết luận chung là: Hạt ướt cảm ứng phóng xạ cao hơn, cho tần số đột biến
hình thái, sinh trưởng và phát triển cao hơn so với xử lý hạt khô.
Một số tác giả chiếu tia gamma trên hạt lúa hút nước bão hòa hoặc hạt
nảy mầm để nghiên cứu tần số và phổ đột biến cấu trúc NST (Savin,
Swaminathan, Sharma (1968), Trần Duy Quý và cộng sự (1977-1987) ),
hoặc là để nghiên cứu so sánh hiệu quả với trường hợp xử lý hạt khô (Siddig
và Swaminathan (1968), Soriano 1971, Siddig và Swaminathan 1971). Các
công trình cũng đã rút ra kết luận tương tự về so sánh hiệu quả gây đột biến
của tia gamma khi xử lý trên hạt khô so với hạt ướt.
Nhiều tác giả đã chiếu xạ các loại thực vật khác nhau và đã xác định được
độ cảm ứng phóng xạ phụ thuộc vào các pha của chu kỳ tế bào xếp theo thứ tự:

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


17

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

G
2
> M > S > G
1
, Boocdanop (1965), Scott và Ewan (1967), Mitrophanop
(1969), Demin (1974), Kaznadri (1977), Mitrophanop và Olimpienco (1980).
Các nghiên cứu của Trần Duy Quý (1982 - 1985) khi xử lý tia gamma
(Co
60
) trên hạt ẩm và hạt nứt nanh của lúa IR8, IR22, C4-63, rồi cố định rễ mầm
ở các thời điểm khác nhau, đã xác định được mối quan hệ giữa thời điểm cố định
và tần số, phổ sai hình NST. Phạm Quang Lộc, Nguyễn Minh Công (1986).
Đào Xuõn Tõn (1995)[17], nghiên cứu sự phát sinh các đột biến lặn ở
M
2
khi xử lý tia gamma vào các thời điểm khác nhau của hạt nảy mầm ở 5
giống lúa nếp đã đi đến kết luận rằng: Phóng xạ vào thời điểm 72h hoặc 75h
cho tổng tần số đột biến diệp lục cao nhất, tần số đột biến lặn về hình thái
(hình dạng, màu sắc, kích thước của thõn, lỏ, bụng, hạt), về sinh trưởng và
phát triển cao nhất, đặc biệt là các đột biến có ý nghĩa về chọn giống.
1.3.4 Một số thành tựu về chọn giống lúa bằng đột biến thực nghiệm trên
thế giới và ở Việt Nam
Bằng phương pháp cổ điển, muốn tạo được một giống cây trồng mới,

năng suất cao, phẩm chất tốt và ổn định, phải cần từ 6 – 10 thế hệ. Với
phương pháp chọn giống bằng đột biến thực nghiệm, một số giống mới được
tạo ra chỉ trong vòng 6 thế hệ. Việc chọn giống cổ điển chủ yếu dựa vào
nguồn biến dị tự nhiên, nguồn gen hoang dã hoặc những biến dị tổ hợp qua lai
hữu tính, cả 3 nguồn biến dị này đều có những giới hạn. Thêm vào đó, chọn
giống cổ truyền không có được những đột phá cần thiết. Với phương pháp đột
biến thực nghiệm kết hợp với lai tạo và chọn lọc (hoặc lai tạo kết hợp với đột
biến thực nghiệm), đã tạo ra nguồn biến dị phong phú. Sự sai khác di truyền
trong lòng quần thể đã tạo nên vốn gen dồi dào cho việc chọn tạo, cải tiến
giống hoặc phục vụ những mục đích nghiên cứu khác. Ngày nay, chọn giống
bằng phương pháp đột biến thực nghiệm ngày càng trở thành một trong những
phương pháp được ứng dụng rộng rãi trên thế giới và cả ở Việt Nam.

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


18

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

* Trên thế giới:
Theo cơ sở dữ liệu về các giống đột biến của FAO/IAEA (Tổ chức
lương thực và nông nghiệp/ cơ quan năng lượng nguyên tử quốc tế): năm
1960 mới chỉ có 7 giống cây trồng được tạo ra bằng phương pháp chọn giống
đột biến thực nghiệm, đến năm 1965 là 30 giống. Năm 1969, tại Hội thảo về
vấn đề “Bản chất, tạo và sử dụng đột biến thực nghiệm ở thực vật”, tổ chức tại
Pullman (Mỹ), Sigurbjonsson và Micke công bố danh sách 77 giống cây trồng
đột biến. Năm 1991, cũng tác giả trên công bố 1330 giống cây trồng đột biến.
Năm 1995, Maluszynski và cộng sự công bố 1970 giống cây trồng được tạo ra
bằng đột biến thực nghiệm. Tính đến tháng 12 năm 1997, theo dữ liệu thống

kê của FAO/IAEA (dẫn theo Maluszynski và cộng sự 1998), có 1847 giống
(ngũ cốc chiếm 1357 giống). Sáu nước đứng đầu thế giới về số lượng giống
cây trồng tạo ra bằng phương pháp đột biến thực nghiệm là: Trung Quốc (306
giống) chiếm 16,56%, Ấn Độ (249 giống) chiếm 13,48%, Liờn Xụ cũ và Nga
(210 giống) chiếm 11,36%, Hà Lan (176 giống) chiếm 9,52%, Nhật Bản (118
giống) chiếm 6,39%, Mỹ (100 giống) chiếm 5,4%. Trong số 1357 giống ngũ
cốc có 333 giống lúa và trong đó có 225 giống (chiếm 67,6%) được nhân trực
tiếp từ các thể đột biến, số còn lại là do kết hợp với phương pháp lai tạo. Bảy
nước đứng hàng đầu về số lượng giống lúa đột biến là: Trung Quốc (117
giống) chiếm 35,1%, Nhật Bản (46 giống) chiếm 13,8 %, Ấn Độ (31 giống)
chiếm 9,3%, Guana (26 giống) chiếm 7,8%, Cot-di-voa (25 giống) chiếm
7,5%, Mỹ (23 giống) chiếm 6,9%, Việt Nam (14 giống) chiếm 4,2% (dẫn theo
Maluszynski và cộng sự 1998).
Chọn giống bằng phương pháp đột biến thực nghiệm đã tạo ra những
giống lúa mới mang những đặc điểm hình thái và một số tính trạng nông học
quý giá và làm tăng tính đa hình di truyền của lúa trồng: các giống lúa nửa lùn
(129 giống), chín sớm (117 giống), đẻ nhánh khỏe (44 giống), chống bệnh tàn

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


19

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

lụi lá (28 giống), cây cao (25 giống), chất lượng hạt tốt (18 giống), thích ứng
rộng (13 giống), chịu lạnh (13 giống), nội nhũ dẻo (8 giống), chịu mặn (6
giống), cảm ứng quang chu kỳ (3 giống) (theo thống kê của FAO/IAEA
1998 - Maluszynski và cộng sự 1998). Những giống có đặc tính nông học quý
rất được ưa chuộng nờn đó được gieo trồng trên diện tích rộng.

* Việt Nam:
Chọn giống cây trồng bằng phương pháp đột biến thực nghiệm ở Việt
Nam đó cú những đóng góp đáng kể trong việc nâng cao sản lượng lương thực,
trong đó đặc biệt là sản lượng lỳa. Cỏc nghiên cứu đột biến thực nghiệm hiện
nay tập trung vào hướng chiếu xạ hạt khô, hạt nảy mầm, chiếu xạ hạt phấn,
chiếu xạ hợp tử để tạo ra những đột biến có lợi như: thấp cây, đẻ nhánh khỏe,
chống đổ, chín sớm, năng suất cao, không cảm ứng quang chu kỳ, chống chịu
với sâu bệnh và điều kiện bất lợi khác, hàm lượng protein cao, cơm dẻo,
thơm Những đột biến này có thể nhân trực tiếp thành giống hoặc sử dụng
trong lai tạo giống hoặc trong nghiên cứu sự di truyền các tính trạng cây lúa.
Trong số các giống mới được tạo ra tại Việt Nam thì số lượng giống được tạo
ra bằng đột biến thực nghiệm hoặc bằng phương pháp xử lý đột biến kết hợp
với lai giống chiếm một tỷ lệ đáng kể. Viện cây lương thực và Cây thực phẩm
đã tạo được nhiều giống quốc gia và nhiều giống khu vực hóa bằng phương
pháp đột biến thực nghiệm hoặc kết hợp với lai tạo: Xuân số 4, Xuân số 5,
Xuân số 6 (1991), Xuân số 10 (1996), Xuân số 11 và N29 (1998) của tập thể
tác giả Vũ Tuyên Hoàng, Trương Văn Kính và cộng sự. Từ năm 1989 – 2000,
Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam đã công bố 6 giống quốc gia: DT10,
DT11 (1989, 1990); DT13, DT33 (1991 - 1993), DT16 và Nếp thơm DT21
(2000). Trường Đại học sư phạm Hà Nội, Viện Di truyền Nông nghiệp Việt
Nam và Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long đã phối hợp nghiên cứu tạo ra hai
giống quốc gia: Tài nguyên đột biến-100 (1997), Tép hành đột biến (1999),

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


20

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

Tám thơm đột biến (2000). Trường Đại học tổng hợp Hồ Chí Minh và Viện Di
truyền nông nghiệp đã tạo ra giống lúa A20, được công nhận giống Quốc gia
năm 1991. Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam chiếu xạ hạt khô
của giống lúa IR64 bằng tia gamma (Co
60
) đã tạo ra hai giống lúa quốc gia:
VND
95-19
và VND
95-20
(năm 2000). Ngoài ra, các đề tài cấp Nhà nước, cấp Bộ
và các đề tài nghiên cứu sinh đã và đang tạo ra nhiều dũng lỳa đột biến có triển
vọng trong sản xuất, trong cải tạo giống và nghiên cứu di truyền.
1.4. Isozyme và hiện tượng đa hình Isozyme ở thực vật
1.4.1. Isozyme
Enzyme là các chất xúc tác của hệ thống sinh học. Chúng có khả năng
xúc tác đặc biệt, thường là mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác tổng hợp.
Tác dụng xúc tác của chúng mang tính đặc hiệu cao đối với cơ chất, làm tăng
đáng kể tốc độ của các phản ứng hóa học xảy ra trong môi trường nước ở điều
kiện nhiệt độ và pH thích hợp.
Enzyme là một trong các chìa khóa để hiểu biết quá trình hoạt động
sống của tế bào. Hoạt động trong những trật tự có tính tổ chức cao, chúng xúc
tác hàng trăm phản ứng theo trật tự xác định trong các con đường trao đổi
chất mà nhờ đó các chất dinh dưỡng bị phân hủy, năng lượng hóa học được
lưu giữ và biến đổi, các đại phân tử sinh học được tạo ra từ các chất tiền thân
đơn giản [13].
Cùng với sự nghiên cứu về enzyme thì thuật ngữ isozyme xuất hiện
(Muller, 1957) để biểu thị các protein cú cựng hoạt tính cùng loại enzyme
nhưng khác nhau về hàng loạt đặc tính lý, hóa học. Isozyme là những biến
dạng phân tử của enzyme, về phương diện di truyền các isozyme khác nhau về

cấu trúc bậc một và do các locus gen khác nhau hoặc do các alen khác nhau của
cùng một locus xác định. Từ đó có thể chia isozyme thành hai nhóm:

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


21

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

- Isozyme đơn gen: các isozyme này chịu sự kiểm soát của một gen, các
isozyme xác định bởi các alen khác nhau trong cùng một locus được gọi là
allozyme, các allozyme có sự khác nhau về thành phần và trật tự axit amin, do
vậy có thể phân tách được bằng phương pháp điện di.
- Isozyme đa gen: Các isozyme này được mã hóa bởi hai hay nhiều gen
và chúng có thể được phân biệt bằng các đặc điểm hóa miễn dịch hoặc bằng
đặc tính enzyme.
Khi sử dụng các phương pháp điện di trên gel polyacrylamide cho phép
ta phát hiện các biến dạng khác nhau của phân tử enzyme.
1.4.2. Hiện tượng đa hình isozyme ở thực vật
Trong di truyền học, việc sử dụng dẫn liệu đa hình của isozyme có ưu
điểm to lớn mà các dẫn liệu khác không có được. Các hệ thống isozyme đa
hình là mô hình thuận lợi cho các nhà nghiên cứu do bản chất di truyền đơn
giản và đa số trong chỳng cú đặc điểm di truyền đồng trội. Do đó khi sử dụng
các dẫn liệu về đa hình isozyme không những biết kiểu gen của cá thể mà còn
biết được mức độ dị hợp của quần thể. Mặt khác, mỗi biến dị enzyme là một
“marker” của gen. Vì vậy nó được sử dụng trong các nghiên cứu biến dị
tương đồng giữa các loài và là dấu chuẩn để phân biệt các loài. Các dẫn liệu
về tính đa hình của protein enzyme thường được sử dụng trong các nghiên
cứu quần thể và tiến hóa.

Đa hình (Polymorphism) là hiện tượng rất phổ biến trong tự nhiên.
Theo Ford (1945) thì đa hình là sự tồn tại đồng thời một số biến dạng của
cùng một tính trạng trong quần thể mà dạng hiếm thấy nhất trong đó không
được duy trì bằng đột biến ở các locus mà còn là hậu quả của trạng thái dị hợp
của các alen.

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


22

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

Trong phân loại và chọn giống, phương pháp phân tích Isozyme đã ứng
dụng thành công trong nghiên cứu xác nhận cây con lai (Loschiaro và cộng
sự, 1983), phát hiện các biến dị soma (Lassner và Orton, 1983), ước lượng
hiệu quả định lượng gen, ước lượng biến dị di truyền trong quần thể, nghiên
cứu quan hệ chủng loại phát sinh (Crawford, 1982), kiểm tra mức độ thuần
chủng, phân loại các giống cây trồng…
1.4.3. Một số nghiên cứu ứng dụng của isozyme esterase và peroxidase
Sự thành công trong chương trình chọn tạo giống cây trồng phụ thuộc
vào hai yếu tố chính. Đầu tiên là sự có mặt của những gen quy định những
đặc điểm có lợi mà nhà chọn giống quan tâm, và hai là việc sử dụng có hiệu
quả các markers để chọn lọc được những đặc điểm đú. Cỏc nhà chọn giống
truyền thống thường sử dụng các đặc điểm hình thái như là những marker để
lựa chọn những đặc điểm mong muốn. Tuy nhiên, việc sử dụng các đặc điểm
hình thái để chọn tạo giống còn gặp nhiều bất lợi.
Sự tiến triển trong quá trình điện di phân tách protein và khai thác có
hiệu quả công nghệ tái tổ hợp ADN đã làm tăng một cách nhanh chóng số
lượng các marker phân tử được sử dụng trong chọn tạo giống cây trồng.

Trong đó, isozyme là marker protein được sử dụng rộng rãi nhất để chọn tạo
giống cây trồng [25], [31], [37].
Việc nghiên cứu các phương pháp hóa sinh đặc biệt là nghiên cứu về
isozyme đã cung cấp những công cụ vô cùng quý giá cho các nhà nghiên cứu
di truyền về lúa.
Điện di isozyme thường được sử dụng để nhận biết và phân loại giữa
các thứ trong chi Oryza. Oka (1958), Chu (1967), Shahi và cộng sự (1969),
Pai và cộng sự (1973), Pu và Pai (1979) đã chỉ ra sự tồn tại của những alen
đặc trưng cho từng nhóm indica và japonica. [25], [26].

Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


23

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

Trên cơ sở đa hình isozyme, năm 1987 Glazsmann đã chọn tạo được
sáu giống lúa có chất lượng tốt.
Vị trí của isozyme trên nhiễm sắc thể được tiến hành thông qua phân
tích các liên kết (Glaxsmann1985, Nakagahra and Hayashi 1976, Pai và cộng
sự 1975, Sano và Babier 1985, Sano và Morishima 1984, Pham và cộng sự.
1990) và phân tích bộ ba (Ishikawa và cộng sự 1986, Ranjhan và cộng sự
1986, Wu 1987). [29], [37].
Năm 1999, Nguyễn Văn Tạo và cộng sự tiến hành phân tích sự đa dạng
di truyền bằng kỹ thuật isozyme đối với một số giống lúa miền Nam. Sự đa
hình về mặt di truyền của các mẫu giống địa phương đã được phân tích trên
19 loci của 10 isozyme. Các loci có mức đa độ đa hình cao là: Cat-1, Est-1,
Est-2, Est-5, Est-9, Amp-1, Amp-2, Amp-3, Amp-4, Enp-1, Sdh-1, Icd-1, Adh-
1, Got-1, Got-3, Pgi-1, Pgi-2, Pgd-1, Pgd-2. [36].

Nguyễn Như Khanh và cộng sự (1995, 1997, 2000), khi nghiên cứu
phổ điện di isozyme peroxidase trên một số giống lúa chịu hạn và chịu rét
khác nhau đã nhận thấy rằng không có sự khác biệt trong phổ điện di isozyme
của các giống lúa nghiên cứu.
Năm 2001, Nguyễn Như Khanh sử dụng năm giống lúa chịu mặn khác
nhau (TH85, Mộc tuyền, Nếp dóc, Hồng cụng, Tỏm xuân đài) để nghiên cứu
phổ điện di isozyme peroxidase bằng phương pháp điện di trên gel
polyacrylamit. Kết quả đã phát hiện ra sự đa hình trong phổ isozyme
peroxidase ở các giống lúa chịu mặn và chua mặn khác nhau.





Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


24

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là 4 dũng lúa có triển vọng được nhận từ Bộ môn
Công nghệ sinh học, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông nghiệp I gồm:
N46, N18, NV1, N91.
2.1.1. Dòng N18
Được tạo ra khi lai giống Tẻ trung với dòng IRBB4 chứa gen kháng bệnh

bạc lá Xa4. Cây cao khoảng 110 cm, thời gian sinh trưởng vụ mùa: 100 – 105
ngày, vụ xuân 135 – 140 ngày. Đẻ nhánh trung bình, số nhánh hữu hiệu trờn
khúm cao. Chịu thâm canh vừa phải, thích hợp trên chân đất vàn và vàn cao,
đất pha cát, đất cát, đất cằn cỗi. Kháng bệnh bạc lá, nhiễm nhẹ khô vằn. Khả
năng thích ứng chưa cao. Bông to, số hạt trờn bụng khoảng 350 – 450 hạt.
Khối lượng 1000 hạt 23g. Năng suất bình quân 7,0 – 7,5 tấn/ha/vụ. Chất
lượng gạo tốt.
2.1.2. Dòng N46
Là dòng được tạo ra khi lai giống Lúa tẻ thơm với dòng IRBB7 chứa gen
kháng bệnh bạc lá Xa-7. Cây cao khoảng 95 – 100 cm, thời gian sinh trưởng vụ
mùa: 100 – 110 ngày, vụ xuân 135 – 145 ngày. Là giống chịu thâm canh,
kháng bệnh bạc lá, đạo ôn, sâu cuốn lá, cứng cây, bộ lá khỏe, phù hợp trên
nhiều chân đất. Khả năng đẻ nhánh trung bình, số nhánh hữu hiệu trờn khúm
cao. Bông to, số hạt trờn bụng khoảng 200 – 250 hạt. Tỷ lệ hạt chắc cao, chất
lượng gạo tốt, gạo thơm, mềm, ngon hơn gạo tám thơm. Năng xuất trung bình
đạt 6,5 – 7,0 tấn/ha/vụ, thâm canh tốt có thể đạt 7,5 – 7,8 tấn/ha/vụ.


Luận văn Thạc sỹ Sinh học Vũ Xuân Dương


25

Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội

2.1.3. Dòng N91
Được tạo ra khi lai giống (90-50) với dòng IRBB5 chứa gen kháng
bệnh bạc lá Xa-5. Cây cao trung bình 90 – 100cm. Thời gian sinh trưởng vụ
mùa 105-110 ngày, vụ xuân 130-140 ngày. Thân cứng, lá to khỏe chống đổ và
kháng bệnh bạc lá rất tốt, chịu thâm canh cao, thích ứng rộng. Đẻ nhánh khỏe,

tỷ lệ nhánh và bông hữu hiệu trờn khúm cao. Số hạt chắc trờn bụng đạt 250-
300 hạt/bụng, khối lượng 1000 hạt là 24g Năng xuất đạt 6,7 tấn/ha/vụ, thâm
canh tốt có thể đạt 7,3 – 7,5 tấn/ha/vụ.
2.1.4. Dòng NV1
Được tạo ra khi lai giống lúa nếp TK90 và Nếp cẩm vở đỏ, sau đó chọn
lọc các thể nhiều đời chọn ra dòng nếp đặt tên là NV1. Dòng NV1 có thời
gian sinh trưởng dài, vụ xuân từ 140 – 150 ngày, vụ mùa 110 – 120 ngày. Cây
cao khoảng 95 – 100cm, bộ lá đứng, hỡnh lũng mo, chống đổ và chống chịu
bệnh bạc lá và đạo ôn khá, đặc biệt chịu rét rất tốt. Số hạt trờn bụng đạt từ 130
– 160 hạt, khối lượng 1000 hạt là 27,0 gram, tỷ lệ gạo xát trờn 65%, gạo đẹp,
trắng sữa, rất thơm và dẻo.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy mô
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được tiến hành ở Việt Nam từ giữa
những năm 70 của thế kỷ XX. Cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là
tính toàn năng của tế bào thực vật. Tính toàn năng của tế bào thực vật là khả
năng của các tế bào đã biệt hoá (trừ một số loại tế bào đã biệt hoỏ sõu như ống
mạch, mao dẫn) có khả năng thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có thể trong
điều kiện phù hợp sẽ phát triển theo chu trình giống như sự phát triển phôi dẫn
đến hình thành cây hoàn chỉnh mới.