Tải bản đầy đủ (.pdf) (69 trang)

ĐỀ TÀI: Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của vi khuẩn bacillus anthracis

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.41 MB, 69 trang )

Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
3
MỞ ĐẦU
Bệnh than là một căn bệnh nhiễm khuẩn cấp tính do vi khuẩn
Bacillus anthracis (B. anthracis) gây ra cho gia súc, đặc biệt là cho các
động vật ăn cỏ nh- trâu, bò, dê cừu ngựa Bệnh than có khả năng lây
nhiễm sang người thành dịch với tỷ lệ tử vong cao. Bệnh có nhiều dạng
biểu hiện khác nhau tuỳ theo cách tiếp xúc với bệnh, nhưng nhìn chung,
bệnh than bao gồm 4 dạng: than thể da, than thể hô hấp, than thể tiêu
hoá và than thể màng não.
Bệnh than là một căn bệnh vô cùng nguy hiểm. Nã mang một số
đặc điểm được trung tâm kiểm soát và ngừa bệnh Hoa Kỳ dùng để nhận
biết các trường hợp có thể làm vũ khí sinh học như thời gian lây nhiễm
nhanh, tỷ lệ gây chết cao, tác nhân gây bệnh có thể chống chịu được với
điều kiện khắc nghiệt. Chính vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện, chẩn
đoán bệnh than và tác nhân gây bệnh than là rất quan trọng
Kháng nguyên tái tổ hợp PA là một trong 3 loại độc tố than của vi
khuẩn Bacillus anthracis. PA là nhân tố quyết định tính độc của vi khuẩn
than. Bản thân PA không gây độc nhưng khi kết hợp với nhân tố gây chết
LF hay nhân tố gây phù thũng EF lại sinh sản độc tố gây chết hoặc phù
thũng cho tế bào vật chủ. Ngoài ra, PA còn có chứa vùng liên kết thụ thể
và có khả năng gây đáp ứng miễn dịch chống bệnh than. Chính vì vậy,
hiện nay có nhiều nghiên cứu sử dụng kháng nguyên bảo vệ PA để tạo
protein tái tổ hợp làm nguyên liệu để tạo kit chuẩn đoán bệnh than còng
nh- tạo vaccine phòng chống bệnh than.
Trên thế giới hiện nay đã có rất nhiều công trình công bố về việc
biểu hiện gan pagA mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA. Tuy nhiên, ở Việt
Nam đây vẫn là vấn đề mới đang được quan tâm. Đáp ứng những yêu
cầu cấp bách trong phòng và trừ bệnh than, chúng tôi tiến hành nghiên


cứu đề tài:
Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
4
“Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của vi
khuẩn Bacillus anthracis”
Mục tiêu của đề tài:
 Biểu hiện protein PA của vi khuẩn B. anthracis trong E . coli BL21,
 Thu nhận protein PA với lượng lớn để tinh sạch.
Nhiệm vụ của đề tài:
 Thiết kế vector biểu hiện pET-TRX-FUS mang gen pagA,
 Nghiên cứu tạo chủng E. coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA,
 Tìm ra điều kiện thích hợp cho quá trình biểu hiện về nhiệt độ,
nồng độ IPTG, thời gian,
 Tinh sạch được protein trên cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin .

Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
5
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. Sơ lược về bệnh than
1. Lịch sử xuất hiện và phát triển của bệnh than
Bệnh than hay còn gọi là bệnh nhiệt thán, đã gây ra những thiệt hại vô
cùng to lớn cho ngành chăn nuôi gia súc cũng nh- làm ảnh hưởng tới sức
khoẻ con người. Vì thế mà nó được đặt tên là “Black Bane” nghĩa là thảm hoạ
đen, vì khi bị nhiễm bệnh, vết thương có màu đen [1]. “Bệnh Than” bắt
nguồn từ Hy Lạp “Anthrakos” nghĩa là than, do vết thương trên da có màu

đen. Bệnh than được tìm ra bởi John Bell vào cuối thế kỷ 15.
Năm 1876, Robert Kock đã tìm ra nguốn gốc của bệnh than và quả
trình hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus anthracis (B. anthracis).
Bệnh than thường xuất hiện ở những trang trại vào một thời điểm nhất
định, đặc biệt là những vùng nông nghiệp phía Nam Châu Mỹ và Châu Phi.
Bệnh thường gặp ở những động vật ăn cỏ nh-: cừu, dê, ngựa, trâu bò. Đặc
biệt bệnh có thể lây nhiễm sang người nên được coi là mối hiểm hoạ đe doạ
cho sức khoẻ cộng đồng.
Trận dịch Than được biết đến đầu tiên trong Lịch sử xảy ra năm 1500
Trước Công Nguyên làm chết nhiều vật nuôi của người Ai Cập.
Năm 1491 Trước Công Nguyên, tiếp tục một cơn lốc bệnh Than ở Ai
Cập làm chết nhiều gia súc, và làm nóng lên sự kiện bệnh Than.
Những năm 1960, bệnh than đã làm chết khoảng 60.000 gia súc ở Châu
Âu.
Năm 1789, một trận dịch bệnh than lan tràn ở vùng Tresnobin (Nga).
Tháng 4/1979, ở Sverdlovsk, Liên Xô nay là Ekatarinbua, xảy ra một
trận dịch than thể hô hấp làm chết 66 người [20]. Sau đó vài năm, một trận
dịch tương tự xảy ra ở Paraguay.
Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
6
Năm 1989, ở miền Bắc xứ Wales xảy ra một trận dịch than lớn. Người
ta phải giết 4492 con gia súc bị nhiễm than và áp dụng các biện pháp sát trùng
chất thải, nhà cửa, thiết bị, đường xá, đất đai bằng fomalin.
Năm 1978- 1980, một trận dịch than ở Zimbabwe làm hơn 6000 người
bị nhiễm bệnh và 100 người chết.
Sau sự kiện ngày 11/9/2001, bọn khủng bố sinh học đã dùng bào tử của
vi khuẩn B. anthracis tấn công một số bưu điện của Mỹ bằng các phong bì thư
làm 5 người chết và 17 người bị nhiễm bệnh [1]

Trận dịch Than gần đây nhất là ngày 14/6/2005 xảy ra ở một quốc gia
nhỏ ở Châu Phi làm chết 4 người và hơn 80 người bị nhiễm bệnh [27].
Ở Việt Nam, bệnh Than cũng đã xuất hiện từ lâu nhưng Ýt được thông
báo. Theo số liệu thống kê của Viện Vệ sinh Dịch tÔ Trung ương, năm 1997
có 30 người mắc bệnh Than, năm 1998 có 59 người, năm 1999 có 58 người.
Riêng năm 2000 có 27 người mắc bệnh than, trong đó có 12 ca ở Cao Bằng,
11 ca ở Lai Châu, 4 ca ở Đồng Nai, tuy nhiên không có ca nào bị tử vong.
Hầu hết các ca mắc phải đều tập trung ở miền núi chăn nuôi gia súc lớn nh-
Thanh Hoá, Tuyên Quang, Nghệ An, Lai Châu, Đắk Lăk [1, 2]. Đối với các
trường hợp mắc bệnh than ở nước ta hầu hết do tiếp xúc với động vật ăn cỏ
nh- trâu, bò, những người làm nghề thuộc da chế biến xương [28].

2. Các dạng bệnh than
Bệnh Than thường xuất hiện ở các loài động vật hoang dã cũng nh-
động vật nuôi, đặc biệt là các loại gia súc ăn cỏ nh- trâu, bò cừu, la, ngựa, dê
do chúng hít phải hoặc nhiễm phải bào tử than trong đất. Ở người, nguy cơ
mắc bệnh than là do tiếp xúc với động vật ăn cỏ [29].
Bệnh than có thể nhiễm vào cơ thể vật chủ theo ba con đường: qua da,
qua đường tiêu hoá và đường hô hấp. Bệnh than có thể biến chứng thành thể
than màng não nếu hít vào bào tử than. Tuỳ theo cách thức lây nhiễm mà
Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
7
người ta chia bệnh than thành 4 các thể than khác nhau: Than da, than tiêu
hoá, than hô hấp, than màng não [19].

2.1. Bệnh than thể da
Đây là hình thức thức than phổ biến nhất chiếm hơn 90% và loại bệnh
có khả năng điều trị. Bệnh thường gặp ở những nhóm đối tượng nguy cơ lây

nhiễm cao, thường xuyên tiếp xúc với động vật và các sản phẩm từ gia súc đã
bị nhiễm than, thường là những người nông dân, bác sỹ thú y, người giết mổ
gia sóc hay thịt. Từ các vết thương hở trên da, vi khuẩn hay bào tử B.
anthracis có thể xâm nhập vào.


Hình 1.1: Bệnh than thể da

Triệu chứng của bệnh: Sau 1-2 ngày đầu thấy xuất hiện các vết sẩn
ngứa như côn trùng đốt, dần dần xuất hiện các dấu hiệu ngoại tử trong vùng
tâm. Sau 2-3 ngày sẽ xuất hiện các mụn nhỏ hay nốt nhú tại vị tri nhiễm, xung
quanh xuất hiện các mụn nước. Vài ngày sau, tại vùng trung tâm vết loét sẽ
xuất hiện các nốt đen, khô bắt đầu bong vẩy. Trong khoảng 1-2 tuần kể từ khi
nhiễm bệnh sẽ xuất hiện các mủ và các hiện tượng đau nhức, mệt mỏi, sốt,
bạch cầu tăng, các hạch bạch huyết tăng lên. Sau đó vùng thương tổn sẽ
chuyển sang dạng tự phát. Nếu bệnh nặng thêm vết loét sẽ lan rộng và ăn sâu
Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
8
làm nhiễm trùng máu dẫn đến không thể chữa khỏi. Than da gây tử vong
khoảng 20% các trường hợp không được điều trị.

2.2. Bệnh than thể tiêu hoá
Nguyên nhân của bệnh than thể tiêu hoá là do ăn phải thịt gia súc đã bị
nhiễm bào tử than mà không được nấu chín, thậm chí cả khi được nấu chín thì
khả năng gây bệnh vẫn cao [2]. Người ta tìm thấy vi khuẩn than trong dịch
ruột của bệnh nhân mắc bệnh than. Đầu tiên vi khuẩn sẽ tấn công vào những
vị trí thương tổn của màng ngày ruột và dạ dày. Từ những vị trí này sẽ xuất
hiện những vết loét, lan rộng và lan vào hệ bạch huyết. Bệnh than tiêu hoá

thường Ýt gặp nhưng lại có tỷ lệ tử vong khá cao. Bệnh thường có hai thể lâm
sàng [11]:
Thể bụng: dấu hiệu đầu tiên và rất dễ nhận là có thương tổn xuất huyết
hoại tử ở manh tràng và các vùng lân cận. Triệu chứng ban đầu không đặc
biệt với những cảm giác buồn nôn, biếng ăn, sốt cao. Sau đó là các triệu
chứng đau bụng, tiêu chảy, sốc do nhiễm trùng và tử vong. Bệnh nhân có thể
viêm phúc mạc hoặc viêm lá lách do vi khuẩn tấn công vào khu bạch huyết.
Sau 2-3 ngày kể từ khi xuất hiện dấu hiệu của bệnh sẽ gây tử vong.
Thể họng, miệng: Tại vùng thương tổn thấy xuÊt hiện hoại tử ở vùng
vòm họng, cổ họng cứng, sưng amidan. Bệnh nhân sốt cao, khó nuốt, hạch
vùng cổ sưng to, nhiễm độc máu và đa số dẫn đến tử vong. Dạng than này có
tỷ lệ tử vong cao chiếm 50% mặc dù có được điều trị.


Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
9
Hình 1.2: Manh tràng đã bị nhiễm vi khuẩn than
2.3. Bệnh than hô hấp
Nguyên nhân gây than hô hấp là do hít phải bào tử than. Sau khi vào cơ
thể, các bào tử than sẽ phát triển thành thể hoạt động và di chuyển tới các phế
nang, hạch lympho phổi và trung thất gây xuất huyết hoại tử và phù thũng làm
trung thất giãn rộng ra cả hai bên làm bệnh nhân có cảm giác đau vùng ức, sốt
cao. Các thương tổn xuất huyết và hoại tử lan đến màng phổi gây tràn máu
màng phổi. Khí quản cũng bị ảnh hưởng với các triệu chứng nh- ho khan, co
thắt, vùng phổi bị phù. Vi khuẩn sẽ theo đường máu lan đến phần dưới niêm
mạc của ống tiêu hoá và tạo nên các vết loét ở thành ruột làm bệnh nhân nôn
ra máu, tiêu hoá ra máu hoặc cả hai triệu chứng trên. Một sè nang Lympho
của đường tiêu hoá cũng bị phù và xung huyết, nếu bệnh nặng hơn có thể biến

chứng sang thể màng não gây xuất huyết. Đa số bệnh nhân đều tử vong trong
khoản 1- 2 ngày kể từ khi phát bệnh. Tỷ lệ tử vong của bệnh than này rất cao.


Hình 1.3: Trung thất dãn ra do hít phải bào tử than

2.4. Bệnh than thể màng não
Bệnh thường do biến chứng từ ba thể than trên. Than màng não xuất
hiện khi vi khuẩn B. anthracis tấn công vào hệ thống thần kinh trung ương
theo đường máu và các mạch bạch huyết. Triệu chứng của bệnh là thường sốt
Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
10
cao, mệt mỏi, đau cơ, đau đầu, buồn nôn lên cơn mê sảng khi phát bệnh và
dẫn đến hôn mê. Đa số bệnh nhân thường dẫn đến tử vong sau 1- 2 ngày kể từ
khi mắc bệnh. Thể than này có tỷ lệ tử vong rất cao.


Hình1. 4: Não của người bị nhiễm bệnh than

3. Bệnh than và chiến tranh sinh học
Sức tàn phá của bệnh than là vô cùng to lớn, đồng thời nó dễ chuẩn bị
và phát tán nhanh nên đã được sử dụng nh- một loại vũ khí sinh học làm tê
liệt cả một thành phố, thậm chí cả một quốc gia [24].
Trong chiến tranh thế giới thứ nhất, bệnh than đã được sử dụng nh- một
thứ vũ khí vô cùng lợi hại. Một vài nước nh- Đức, Nhật, Hoa Kỳ, Liên hiệp
Anh, Iraq và Liên Xô cũ đã thừa nhận là sử dụng bệnh than làm phương tiện
của chiến tranh [30].
Năm 1915, Mỹ đã tiêm vi khuẩn bệnh than vào ngựa, la, trâu, bò, để

cung cấp cho các nước trong chiến tranh thế giới thứ nhất.
Năm 1937, Nhật bắt đầu thử nghiệm vũ khí bệnh than ở Mãn Châu Lý
(Trung Quốc).
Năm 1942, Liên hiệp Anh cũng tiến hành thử nghiệm vũ khí bệnh than
ở Gruinard Island, vùng duyên hải Scotland.
Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
11
Năm 1943, Mỹ bắt đầu phát triển vũ khí bệnh than. Sau chiến tranh thế
giới thứ hai, Mỹ vẫn tiếp tục thực hiện chiến tranh sinh học ở Fort Detrick,
Maryland.
Mặc dù năm 1972, quy ước Quốc tế cấm phát triển và dự trữ vũ khí
sinh học nhưng các cuộc chiến tranh và khủng bố vẫn tiếp diễn.
Năm 1979, bào tử than đã được phóng thích ở quân đội Liên Xô cũ làm
chết 68 người.
Năm 1991, lính Mỹ được tiêm phòng vaccine bệnh than để chuẩn bị
cho chiến tranh vùng vịnh.
Năm 1990-1993, nhóm khủng bố Aum Shinrikyo đã phóng thích bệnh
than ở Tokyo nhưng không gây tổn thương.
Năm 1995, Iraq thừa nhận đã tạo ra 8.500 lá thư có chứa tác nhân gây
bệnh than.
Ngày 22/10/2001, những lá thư có chứa bào tử than được chuyển đến
các bưu điện Mỹ làm 5 người chết, và 17 người bị nhiễm bệnh. Sự kiện này
đã làm đau đầu các nhà cầm quyền Mỹ và buộc họ phải chi trả nhiều triệu đô
la cho việc tiêm phòng vaccine.
Tháng 9/2001, sau vụ khủng bố ngày 11/9, tại Cangene xảy ra một vụ
tương tự làm 22 người mắc bệnh trong đó 11 người mắc bệnh than da và 11
người mắc bệnh than hô hấp, 5 người trong số mắc than hô hấp đã chết [31].
Nguyên nhân mà bệnh than được sử dụng như một loại vũ khí sinh học

hiệu quả là do vi khuẩn than phát tán rất nhanh và bào tử của nó có khả năng
chống chịu tốt với điều kiện khắc nghiệt của ngoại cảnh.
Trước tình hình chính trị bất ổn như hiện nay thì nguy cơ xảy ra chiến
tranh sinh học luôn là mối đe doạ lớn. Vì vậy chóng ta cần phải nghiên cứu kỹ
về tác nhân và cơ chế gây bệnh than để ngăn ngừa và chống lại chúng bất cứ
lúc nào.

II. Tác nhân gây bệnh than
Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
12
Năm 1849, lần đầu tiên nguồn gốc bệnh than được nhà nghiên cứu
người Đức Pallender phát hiện ra tác nhân gây bệnh là vi khuẩn B. anthracis.
Năm 1950, ông Daven, nhà nghiên cứu người Pháp cũng tìm ra tác nhân gây
bệnh là B. anthracis. Nhiều năm đó, cũng có nhiều nhà khoa học nghiên cứu
kỹ hơn về loại vi khuẩn này nh- Kock và cộng sù (1876), Pasteur và cộng sự
(1877), Xenkovck và cộng sự (1883). Năm 1877, Kock đã nuôi cấy vi khuẩn
B. anthracis trên môi trường tinh khiết và chứng minh nó có khả năng hình
thành bào tử và có thể gây chết cho động vật. Ông đã chứng minh sự có mặt
của vi khuẩn này trong máu của động vật chết bởi bệnh than. Năm 1822 -
1905, Pasteur và cộng sự đã tìm thấy bào tử B. anthracis ở nơi chôn xác động
vật bị chết bởi bệnh than.

1. Đặc điểm vi khuẩn B. anthracis.
Vi khuẩn B. anthracis thuộc nhóm I, chi Bacillus. Nó tồn tại trong đất,
trong nước và không khí. Vi khuẩn B. anthracis là vi khuẩn gram dương sinh
bào tử (trong điều kiện kị khí hay kị khí bắt bắt buộc) không có lông roi nên
không có khả năng di động. Kích thước tế bào từ 3-5 m, rộng từ 1-2 m. Tế
bào hình que, vuông đầu, sắp xếp với nhau thành chuỗi dài như sợi rơm hoặc

chỉ vài tế bào nối với nhau [19].


Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
13
Hình 1.5: Hình thái tế bào của vi khuẩn Bacillus anthracis

Bào tử B. anthracis có hình elip nằm ở trung tâm tế bào, kích thước
khoảng từ 1- 1,5 m, nang bào tử không phồng, bào tử được hình thành vào
thời kỳ cuối của pha sinh trưởng Logarit [15].


Hình 1.6: Bào tử của vi khuẩn Bacillus anthracis

Khuẩn lạc B. anthracis có màu trắng sữa hoặc trắng xám tới xám, bề
mặt sần sùi, dính, ướt, đường kính 3-5mm [5].
Điều kiện thích hợp cho B. anthracis phát triển là ở điều kiện nhiệt độ
28-32
0
C, pH=7, thời gian nuôi cấy từ 3 - 5 ngày. Khi gặp điều kiện bất lợi tế
bào sinh dưỡng sẽ hình thành nội bào tử. Các nội bào tử nằm bên trong tế bào
mẹ, khi tế bào mẹ phân giải, thì các nội tử sẽ được giải phóng, chúng có thể
tồn tại và phát triển độc lập trong một thời gian dài. Các nội bào tử khá bền
vững, chúng có thể chịu đựng được các điều kiện khắc nghiệt của môi trường
bên ngoài như tia tử ngoại, sự ăn mòn, nhiệt độ môi trường (quá nóng hay quá
lạnh), thiếu hụt chất dinh dưỡng hoặc nước. Khi gặp điều kiện thuận lợi, các
nội bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Các tế bào sinh
dưỡng lại tiếp tục phát triển nếu gặp điều kiện thuận lợi và ngược lại nếu gặp

điều kiện bất lợi nó lại hình thành nên các nội bào tử.
Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
14
Bào tử B. anthracis được hình thành trong điều kiện nhiệt độ 12- 42
0
C
và có khả năng chống chịu tốt với các điều kiện khắc nghiệt. Bào tử B.
anthracis đã được tìm thấy ở rất nhiều nơi trên thế giới. Nó vùi sâu trong lòng
đất và có thể tồn tại ở đó hàng chục năm. Sau những cơn mưa rào hoặc hạn
hán, bào tử sẽ nảy mầm trên bề mặt đất, khi động vật ăn phải sẽ bị nhiễm
bệnh và chết. Bào tử B. anthracis có khả năng chống chịu với điều kiện khắc
nghiệt của ngoại cảnh rất tốt, vì vậy nó được sử dụng nh- một thứ vũ khí lợi
hại trong chiến tranh và khủng bố [8].

2. Đéc tố của vi khuẩn B. anthracis
Các độc tố của vi khuẩn B. anthracis bao gồm độc tố vỏ nhày và các
độc tố than. Độc tố vỏ nhày bản chất là acid poly -

- D- glutamic, đã được
mã hoá bởi các gen capA, capB, capC nằm trên plasmid pXO2 (95kb). Các
độc tố than bao gồm kháng nguyên bảo vệ PA, nhân tố gây chết LF, nhân tố
gây phù nhũng EF. Các độc tố than lần lượt được mã hoá bởi các gen pagA,
lef và cya, các gen này nằm trên plasmid pX01 (185kb) [6, 15].

2.1. Độc tố vỏ nhày
Độc tố vỏ nhày hay vá capsule có bản chất là acid poly -

- D -

glutamic, có trọng lượng phân tử là 215 kDa ở trong tế bào và ở ngoài tế bào
là 20- 55 kDa. Nó được mã hoá bởi các gen cap nằm trên plasmid pXO2 có
trọng lượng phân tử là 95kb [19, 22].
Tất cả các dòng độc của B. anthracis đều tạo ra vỏ nhày. Vỏ nhày giúp
cho vi khuẩn B. anthracis tránh được sự bảo vệ của hệ thống miễn dịch vật
chủ và kích thích gây nhiễm trùng. Vỏ nhày ức chế đại thực bào và gây ra đáp
ứng miễn dịch yếu. Ngoài ra vỏ nhày còn có tác dụng bảo vệ làm tăng tính
độc của vi khuẩn bệnh than. Thông thường các khuẩn lạc xù xì sẽ độc hơn các
khuẩn lạc nhẵn [19].
Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
15
Vỏ nhày không được hình thành khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường
dinh dưỡng thông thường. Nó chỉ hình thành trong môi trường thạch huyết
ngựa hoặc môi trường có bổ sung 0,7 % Na
2
CO
3
, ủ ở 37
0
C, trong điều kiện bị
khí [11]. Bản thân chuỗi Poly -  - D- glutamic không gây độc nhưng có chức
năng bảo vệ vi khuẩn chống lại thành phần diệt khuẩn của huyết thanh và
bạch huyết, chống lại hiện tượng thực bào. Vì vậy, vỏ nhày có vai trò trong
suốt quá trình xâm nhiễm và có vai trò nhất định trong giai đoạn cuối của
bệnh [11].

2.2. Độc tố than
Các độc tố than đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh ở cả

giai đoạn đầu của bệnh cũng như trong suốt quá trình phát triển của bệnh [7].
Độc tè than bao gồm 3 thành phần: Kháng nguyên bảo vệ PA (Protective
antigen), nhân tố gây phù thòng EF (Edema Factor) và nhân tố gây chết LF
(Lethal Factor).

2.2.1. Kháng nguyên bảo vệ PA (Protective Antigen-PA)
Protein độc tố PA hoàn chỉnh có trọng lượng phân tử là 83kDa, bao
gồm 735 acid amin (M
r
82,684), 394 phân tử nước và 2 nguyên tử canxi. Phân
tử PA hoàn chỉnh có 4 vùng chức năng, mỗi vùng có vai trò khác nhau trong
quá trình nhiễm bệnh [19, 22].
Kháng nguyên bảo vệ PA được mã hoá bởi gen pagA nằm trên plasmid
XO1. Bản thân PA không gây độc nhưng khi kết hợp với nhân tố gây chết LF
hay nhân tố gây phù thũng EF lại sinh sản độc tố gây chết hoặc phù thũng cho
tế bào vật chủ. Do đặc tính này mà kháng nguyên bảo vệ PA được xem là một
kênh dẫn truyền gián tiếp cho các nhân tố EF và LF để chúng phát huy độc
lực.

2.2.2. Tác nhân gây phù thũng (Edema Factor - EF)
Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
16
EF được coi nh- mét enzym Adenylate Cyclase (AC), có trọng lượng
phân tử 89 kDa, chứa 767 gốc axid amin. Nó có chức năng chuyển hoá ATP
nội bào thành cAMP, quá trình này được thực hiện khi EF kết hợp với
Calmodulin (CaM- là một thụ quan canxi lớn trong tế bào nhân chuẩn [19,
22]. EF phụ thuộc calmodulin có 3 trình tự được duy trì chặt chẽ, gồm 24
acidamin (303-339) mang vị trí gắn ATP. Trình tự này có liên quan đến quá

trình xúc tác. EF có thể tương tác với màng kép lipid mà không phụ thuộc vào
pH, không giống như LF, EF còn liên kết với các lỗ màng sau khi được
chuyển vào trong tế bào chất [19].
Khi EF được kháng nguyên bảo vệ PA dẫn vào trong tế bào vật chủ độc
tố EF sẽ gây nên hiện tượng mất cân bằng enzym và dẫn đến làm mất tính
thấm của tế bào vật chủ. Dịch tế bào bị dồn ứ và gây nên hiện tượng trương
bào, màng tế bào căng ra mọng nước, đây chính là nguyên nhân gây phù
thũng ở tế bào vật chủ [18].

Hình 1.7: Tác nhân gây phù thũng EF

Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
17
Nhân tố gây phù thũng EF được tạo bởi Ýt nhất 3 vùng chức năng riêng
biệt, trong đó có vùng EF3 (là phức tạp bởi phần enzym của EF với CaM và
adennosine 5’-  - β - Methylene – triphosphat, đây là vùng quan trọng nhất,
nó kết hợp với CaM để gây phù thũng cho tế bào vật chủ.


2.2.3. Nhân tố gây chết (Lethal Factor- LF)
Nhân tố gây chết LF là một protein gồm 776 acid amin, trọng lượng
phân từ 90kDa. Nó được coi là một nhân tố quan trọng do vi khuẩn B.
anthracis tiết ra [19].
LF chứa một loạt 4 trình tự lặp lại không hoàn toàn trong phần trung
tâm, sự mất đoạn trong vùng này làm protein bị bất hoạt hoặc không hoạt
động. Sự đột biến ở những gốc có tính chất quyết định sẽ tiêu huỷ hoạt tính
độc tố gây chết và gắn Zn
2+

với LF [19]. Vì thế, LF được coi là một
metalloprotease kẽm [9]. Gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng LF phân giải
các acid amin đầu N của protein kinase hoạt hoá quá trình phân bào (Mitogen
Activated Protein Kinase- MAPKs) [19]. Sự đột biến ở vùng xúc tác của LF
sẽ làm mất độc tính của đại thực bào và ảnh hưởng đến sự phân bào [6].

Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
18
Hình 1.8: Nhân tố gây chết LF

Khi LF kết hợp với Zn
2+
sẽ làm tăng quá trình sản xuất cytokin trong đại
thực bào và tế bào bạch huyết [18]. Đây chính là nguyên nhân gây phá huỷ
đại thực bào và là thủ phạm chính dẫn đến hiện tượng sốc và tử vong. Sau khi
được vận chuyển vào trong tế bào, độc tố LF sẽ làm tăng tính thấm của các
ion Na
+
và K
+
, sau đó là quá trình thuỷ phân ATP. Quá trình này ức chế sự
tổng hợp các đại phân tử liên quan đến đáp ứng miễn dịch [10]. LF phong toả
hệ thống báo động của cơ thể bằng cách gắn với một cấu trúc protein đặc biệt
của tế bào, vùng metallo- protease của LF sẽ nhằm tới các kênh dẫn truyền tín
hiệu nội bào làm cho những thông tin mà tế bào cần thông báo cho hệ miễn
dịch về sự xuất hiện của yếu tố lạ bị đình chỉ, từ đó các protease sẽ phá huỷ
cấu trúc nội bào gây chết cho tế bào vật chủ.


3. Điều khiển sự biểu hiện của các gen gây độc trong vi
khuẩn B. anthracis
Người ta đã xác định được rằng có hai nhân tố chính điều hoà sự dịch
mã và biểu hiện của gen là atxA và acpA. Gen acpA nằm trên plasmind pXO2
hoạt hoá sự biểu hiện của gen capB (mét trong các gen mã hoá vỏ capsule).
Gen atxA nằm trên plasmind pXO1 hoạt hoá sự biểu hiện của các gen capB
và các gen mã hoá protein độc tố pagA, lef và cya. Gen atxA là nhân tố điều
hoà dương cho sự hoạt hoá quá trình dịch mã của các gen độc tố. Sự hoạt hoá
này phải thực hiện trong môi trường có nồng độ CO
2
/bicacbonat cao. Ngoài ra
atxA còn thực hiện một vai trò khác là điều chỉnh sự biểu hiện của các gen
độc tố khi nó xâm nhiễm vào tế bào vật chủ để gây độc [19, 26].
Để hiểu rõ vai trò của nhân tố điều hoà atxA, người ta tiến hành gây đột
biến để tạo một thể đột biến atxA. Khi nuôi cấy trong môi trường giàu dinh
dưỡng, thể đột biến atxA và chủng gốc có sự phát triển nh- nhau. Nhưng trên
môi trường nghèo dinh dưỡng nh- môi trường tổng hợp XO hoặc các môi
Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
19
trường tương tự khác thì thể đột biến không gây độc chủng Steme (pXO1
+

pXO
2
) rất khó phát triển. Thể đột biến này tạo ra những đám khuÈn lạc nhỏ
hơn so với chủng gốc. Nh- vậy gen atxA có liên quan trực tiếp đến sự tổng
hợp vỏ capsule có nghĩa là nó liên quan đến gen mã hoá vỏ capsule. Đồng
thời sự có mặt của atxA còn có tác dụng rõ rệt đến sự hình thành bào tử. Thể

đột biến atxA của chủng Sterne tạo nhiều bào tử hơn khi phát triển trong môi
trường giàu dinh dưỡng, còn các chủ Sterne ban đầu mang đột biến atxA
nhưng đã loại bỏ các gen độc tố thì không có đặc tiònh trên. Điều đó thể hiện
sự liên quan chặt chẽ của atxA và các gen độc tố [26].
Cùng với hai nhân tố điều hoà acpA và atxA, người ta cũng tìm thấy
một gen pag kích thước 300bp, nó cùng được dịch mãc xuôi chiều với gen
pagA. Gen pagR mã hoá cho mét protein có trình tự acid amin giống các tác
nhân điều hoà dịch mã trong các sinh vật khác. Gen pagR ức chế sự biểu hiện
của gen acpA và atxA. Ngoài ra, gen pagR còn điều khiển sự biểu hiện của
một vài tổ hợp phiên mã promoter- lacZ được hoạt hoá bởi CO
2
/atxA. Sự điều
hoà những tổ hợp này cùng với gen pagA và pagR có thể phụ thuộc vào sự
thay đổi mức độ AtxA hoặc không phụ thuộc vào sự biểu hiện của atxA [26].
Sự dịch mã các gen độc tố và gen mã hoá vỏ capsule tăng lên khi tế bào
phát triển trong môi trường có nồng độ CO
2
/bicacbonat cao và ngược lại, nếu
nồng độ này thấp sẽ ức chế quá trình dịch mã [15].
Hai nhân tố là CO
2
/bicacbonat và nhiệt độ cũng đóng vai trò quan trọng
trong sự biểu hiện của 3 gen độc tố. Sự tổng hợp độc tố thu được nhiều nhất
khi ủ canh trường có nồng độ CO
2
>>5% hoặc bổ sung khí bicacbonat vào môi
trường đã được đậy kín. Sự tổng hợp độc tố khi ủ canh trường ở nhiệt độ 37
0
C
cũng nhiều hơn khi ủ ở 28

0
C [15].
Nh- vậy quá trình dịch mã và biểu hiện của gen độc tố và gen mã hoá
vỏ capsule trong vi khuẩn B. Anthracis được điều khiển bởi ba nhân tố điều
hoà là acpA, atxA và pagR. Đồng thời 2 yếu tố CO
2
/ bicacbonat và nhiệt độ
cũng chi phối sự biểu hiện của các gen độc tố [22, 24].
Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
20

III. Kháng nguyên bảo vệ PA
1. Vai trò của kháng nguyên bảo vệ PA
Kháng nguyên bảo vệ PA là thành phần quan trọng trong quá trình gây
độc của vi khuẩn B. anthracis. Phân tử PA hoàn chỉnh có trọng lượng 83 kDa,
gồm 735 acid amin, kích thước không gian 3 chiều là 100 x 50 x 30A
0
. Kháng
nguyên bảo vệ PA do gen pagA mã hoá, gen này nằm trên plasmid pXO1
(185kb) [19, 24].
Mặc dù bản thân PA không gây độc nhưng nó lại có khả năng truyền
dẫn các độc tố vào bên trong tế bào vật chủ. PA83 có khả năng kết hợp cụ thể
trên bề mặt tế bào. Dưới tác dụng của protease nội bào họ furin, PA83 sẽ bị
phân tách thành 2 phần là PA20 và PA63, để lộ ra vị trí liên kết với LF và EF
[19, 24]. Đây là bước rất nguy hiểm trong quá trình gây độc của PA. Các
nghiên cứu gần đây cho thấy nếu trên phân tử PA83 không chứa vị trí phân
cắt này thì không có khă năng gây độc. Sau đó, các mảnh PA63 sẽ liên kết với
nhau để tạo thành vòng heptam có 7 nhánh. Khi vòng heptam kết hợp với

nhân tố LF sẽ gây chết và kết hợp với nhân tố EF sẽ gây phù nhũng cho tế bào
vật chủ. Vì vậy, kháng nguyên bảo vệ PA được coi là tác nhân gián tiếp gây
ra hiệu quả độc tố của nhân tố gây chết và phù thòng.
Bên cạnh đó PA còn có vai trò chính trong miễn dịch bệnh than. Người
ta đã nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch của nhiều kháng nguyên vi
khuẩn B. anthracis như vá capsule, S - layer hay cá protein khác, kết quả cho
thấy chỉ có các protein hình thành độc tố than mới có khả năng kích thích
miễn dịch sinh kháng thể nhờ khả năng trung hoà độc tố than [9]. Kháng thể
PA sẽ phá huỷ protein PA ở vị trí liên kết với thụ thể trên tế bào vật chủ hoặc
phá huỷ vị trí phân cắt trên vùng I của PA83. Chính nhờ vai trò dẫn truyền
quan trọng của PA cũng như khả năng kích thích cơ thể sản sinh kháng thể
chống bệnh than nên PA đã trở thành tâm điểm chú ý của nhiều nghiên cứu
Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
21
chẩn đoán, phòng ngừa bệnh than cũng như các nghiên cứu sản xuất vaccine
sử dụng nguyên liệu là protein kháng nguyên bảo vệ tái tổ hợp.






2. Cấu trúc kháng nguyên bảo vệ PA


Hình 1.9: Cấu trúc đơn phân kháng nguyên bảo vệ PA

Phân tử PA hoàn chỉnh gồm 735 acid anim (83 kDa). Nó có trình tự

tương đồng với một họ các độc tố nhị nguyên ADP – ribosyltransferase như:
thể nhân B của Clostridium botulinum C
2
(33% tương đồng), Clostridium
difficile cdt (35% tương đồng), Clostridium perfingens iota-toxin-1b (34%
tương đồng), Clostridium spiroforme Sb (33% tương đồng) và protein VIP1
của Bacillus cereus (27% đồng nhÊt). Các con sè này nhằm giải thích cấu trúc
bậc 2, 3, 4 của phân tử PA. Nhưng trình tự tương đồng giữa PA và họ độc tố
Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
22
nhị nguyên ADP - ribosyltransferase không bao gồm vùng IV, điều này chỉ ra
sự khác biệt giữa các thụ thể của các độc tố.
Kháng nguyên bảo vệ PA được tạo thành bởi các cấu trúc đối song song
[17]. Phân tử PA83 hoàn chỉnh gồm 4 phần chức năng:
Vùng 1 (1 - 249): Cấu trúc xoắn

, vùng này chứa 2 ion Ca
2+
và một vị
trí hoạt hoá phân giải của các protease. Sau khi PA được hoạt hoá bởi
protease nội bào, nó sẽ giải phóng ra mảnh PA20 có chứa đầu N và mảnh
PA63. Mảnh PA20 sau khi giải phóng sẽ bị phân giải trong môi trường, 7
mảnh PA63 sẽ liên kết lại với nhau tạo nên vòng heptam cã 7 nhánh (PA63)
7
,
cấu trúc này tan trong nước và xâm nhiễm vào trong tế bào vật chủ [22].
Vùng II (250 – 487): là một


rỗng chứa một cấu trúc nh- cái móc lớn
và linh hoạt. Vùng này liên quan đến sự hình thành vòng heptam [19]. Nó
chứa một vòng xoắn lớn linh hoạt (302-325) liên quan đến sự hình thành lỗ
màng. Ở pH thấp, heptam sẽ biến đổi và chuyển từ dạng tiền lỗ thành lỗ.
Ngoài ra, vùng này còn có liên quan đến sự sắp xếp lại 7 vòng xoắn của
heptam để tạo thành một lõi gồm 14 chuỗi

liên kết với màng. Vòng này có
điểm cắt cho chymotrysin (Phe
313
- Phe
314
) hai gốc này còn có liên quan tới sự
vận chuyển EF và LF vào trong tế bào chất. Vòng hep tam hình thành nên
kênh chọn lọc trong màng nhân tạo và màng tế bào [19].
Vùng III (488 – 594): là vùng nhỏ nhất có cấu trúc

kiểu gấp nếp
[22]. Vùng này chứa một lõi kị nước (282- 328) gồm 101 acid amin của 5
trình tự nhắc lại nối đuôi nhau và dường như được tạo ra thông qua quá trình
sao chép. Vùng này bao gồm 4 tấm

bện chặt hỗn độn và 4 vòng xoắn ốc nhỏ
và 1 khe tương tự nh- ở ferredoxins và vùng A của độ tố gây hội chứng shock
độc 1 [22]. Vùng này liên quan đến sự tương tác giữa các Protein với nhau.
Có nghiên cứu cho rằng vùng III liên quan đến quá trình oligomerization tạo
thành heptam (PA
63
), một nửa liên kết với thụ thể và một nửa gắn với enzym
thuỷ phân [19].

Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
23
Vùng IV (595 - 735): đây là vùng liên kết với thụ thể và chứa vị trí
epitop quyết định kháng nguyên của PA [22, 24]. Vùng này đã được chứng
minh là có khả năng gây đáp ứng miễn dịch. Nó gồm hai vùng là vòng xoắn
lớn (704- 723) và vòng xoắn nhỏ (679-693), trong đó chỉ có vòng xoắn nhỏ là
có trình tự liên kết với thụ thể. Ngoài ra còn có các gốc ở cuối đầu C tham
gia hỗ trợ cho việc liên kết. Nếu loại bá 2 phần là đầu C và vòng xoắn nhỏ sẽ
làm giảm tính độc bằng cách ức chế sự liên kết của PA với thụ thể [24].
Mảnh PA20 sau khi giải phóng sẽ bị phân giải trong môi trường, 7 mảnh
PA63 sẽ liên kết lại với nhau tạo nên vòng heptam có 7 nhánh. Cấu trúc
(PA63)
7
có khả năng liên kết với nhân tố gây chết LF hoặc nhân tố gây phù
thũng EF để gây chết hoặc phù thũng cho tễ bào vật chủ.

Hình 1.10 : Cấu trúc vòng heptam của kháng nguyên bảo vệ PA

3. Cơ chế dẫn truyền độc tố của kháng nguyên bảo vệ PA

Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
24

Hình 1.11: Cơ chế dẫn truyền độc tố của kháng nguyên bảo vệ PA

Sự phân cắt PA83 thành PA63 và PA20 là một bước then chốt trong

quá trình gây độc bởi vì sự mất đi của PA20 sẽ làm lộ ra vị trí liên kết của PA
với hai nhân tố là EF và/ hoặc LF. Đồng thời nó làm giảm sự cản trở của
không gian lập thể và ngăn cản sự oligomer. Sự phân cắt protein có thể hoàn
thành trong cơ thể với nồng độ trypsin thấp. Trypsin phân cắt ở Arg167 được
chứng minh bởi trình tự N cuối và có một giả thuyết đưa ra rằng sự phân cắt
trong cơ thể xảy ra ở gần nhau hặc cùng một vị trí. Để kiểm tra giả thuyêt này,
PA được biến đổi chút Ýt với việc cắt bỏ từ vị trí 163 đến 168, phân tử này
không bị phân cắt bởi Trypsin hoặc protease trong cơ thể và hoàn toàn không
gây độc tế bào khi tiếp xúc với lf. vị trí này trong PA bao gồm bốn phần cơ
bản: Arg
164
- Lys
165
- Lys
166
- Arg
167
. Đây là bằng chứng thể hiện
endoprotease furin phân cắt cùng một vị trí của Arg - X - Lys/ Arg - Arg, giả
thuyết đưa ra rằng furin có khả năng phân cắt PA. Trong thực tế việc phân cắt
PA của furin được quan sát trong ống nghiệm và chất ức chế furin ngăn chặn
sự phân cắt của liên kết thụ thể với kháng nguyên bảo vệ PA trên bề mặt tế
bào.
Đầu tiên các protease fusin sẽ hoạt hoá các protein thuỷ phân trên bề
mặt tế bào của vùng I của PA83 và giải phóng ra mảnh PA20 (20kDa) ở đầu
Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
25
N [6]. Mảnh PA20 (1-157) không có vai trò quan trọng trong sự gây độc và bị

phân giải trong môi trường. Phần chính của vùng I (168-258) hình thành trên
đầu N của mảnh PA63 hoạt động và bộc lộ vị trí liên kết trên PA63 với nhân
tố gây chết và hoặc nhân tố gây phù thũng. Sau đó, các mảnh PA63 liên kết
lại với nhau tạo thành vòng heptam có 7 nhánh. Cấu tróc heptam này hoà tan
trong nước ở pH trung tính hoặc kiềm, vì thế có thể cài lên màng tế bào có pH
acid hình thành nên các kênh cation chọn lọc trong màng kép lipid nhân tạo
và màng tế bào. Do vòng heptam này tan trong nước nên nó hình thành một
vòng lõm có đường kính 160 A
0
, cao 85 A
0
[22]. Mỗi phân tử PA63 có khả
năng liên kết với một phân tử EF hoặc LF. Phức hợp (PA 63)
7
- LF và/hoặc EF
xâm nhập vào đại thực bào thông qua cơ chÕ thẩm bào trung gian thụ thể
(receptor- mediated endocytosis). Phức hợp này được chuyển vào trong mét
nang có tính acid để duy trì hoạt tính và ức chế sự acid hoá của endosome,
cùng với bề mặt có tính acid của kênh truyền dẫn, cho phép nhân tố EF và LF
đi vào bên trong tế bào chất để sinh sản độc tố gây phù thũng và độc tố gây
chết [19, 22].
Nhiều thí nghiệm với furin không loại trừ khả năng rằng các protease
khác cũng hoạt động trên bề mặt tế bào để hoạt hóa PA. Sự thiếu hụt tế bào
CHO của furin gây ra vởi sự phát sinh nhung đột biến hóa học, và ảnh hưởng
đến sự liên kết của PA và ngoại độc tố LF. Một nhân tố của họ furin protease
khác cũng thể hiện khả năng phân cắt PA, nã bao gồm: PCI và PACE4.

IV. Gen mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA
Kháng nguyên bảo vệ PA được mã hoá bởi gen cấu trúc pagA nằm trên
plasmid pXO1. Kháng nguyên bảo vệ PA bản thân nó không có độc nhưng nó

được coi là một thành phần quan trọng của vi khuẩn B.anthracis trong quá
trình gây bệnh vì nó là nhân tố dẫn truyền trung có khả năng liên kết với EF
hoặc LF để gây độc. Đặc biệt, trên bề mặt PA có vị trí liên kết với kháng
nguyên, do đó mà có khả năng gây đáp ứng miễn dịch. Hiện nay việc nghiên
Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
26
cứu để tạo protein tái tổ hợp trong việc chẩn đoán, phòng ngừa bệnh than
còng nh- việc chế tạo vaccine tái tổ hợp là xu hướng có triển vọng. Chính vì
vậy, việc nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên bảo vệ
PA là rất cần thiết.
Trên cơ sở các nghiên cứu về đặc tính di truyền cũng nh- đặc điểm PA
người ta có thể ứng dụng để sản xuất protein tái tổ hợp PA sử dụng trong tạo
vaccine tái tổ hợp phòng bệnh than. Đồng thời cũng có thể hiểu rõ hơn vai trò
của những vùng chức năng khác nhau của PA trong quá trình gắn lên màng tế
bào đích để đưa các nhân tố gây độc LF và EF vào bên trong tế bào chất gây
ra hiệu quả độc tố [26].
Gen mã hoá cho kháng nguyên bảo vệ PA là gen pagA nằm trên
plasmid pXO1. Theo tài liệu nghiên cứu trên thế giới, gen pagA có khung đọc
mở (ORF) dài 2319 codon, trong đó đoạn có kích thước 2205bp mã hoá cho
735 acid amin của PA hoàn chỉnh PA83. Trước vùng mã hoá protein này có
29 codon mã hoá chuỗi peptide tín hiệu có đặc tính tương tự ở những protein
khác do B. anthracis tiết ra. Chúng đều tích điện âm, có đầu cuối N gồm 5
acid amin (Met - Lys - Lys - Arg - Lys), vùng kỵ nước trung tâm (6 - 21), gốc
alanine [26].
Thành phần base của gen pagA có tỷ lệ A + T cao, chiếm 69%, trong
đó, A = 39%, T= 30%, G = 17%, C = 14%. Thành phần base này khác với
những gen mã hoá protein ở những vi khuẩn khác. Gen cấu trúc của protein
hoàn chỉnh PA83 bắt đầu từ vị trí nt 1891, đứng trước vị trí này là 2 codon mở

đầu ATG (mã hoá cho acid amin methionin) nằm ở vị trí nt 1834 và 1804.
Gen mã hoá PA83 không có codon mã hoá cystein [26].
Khi nghiên cứu 26 chủng B. anthracis khác nhau thì thấy xuất hiện 5
đột biến điểm, trong đó có 2 đột biến làm biến đổi aa và 3 đột biến cùng
nghĩa. Theo lý thuyết, tỷ lệ đột biến làm biến đổi acid amin so với đột biến
cùng nghĩa là 1: 5. Tuy nhiên ở đây tỷ lệ này lớn hơn. Những đột biến làm
Khóa luận tốt nghiệp

Lê Thu Trang 04-04
27
biến đổi acid amin nằm ở vùng có tính kháng nguyên cao, nằm ngang phần
giao nhau của vùng III và IV ảnh hưởng tới vùng liên kết với LF [21].


V. Biểu hiện gen pagA
1. Hệ thống biểu hiện
1.1. Vector biểu hiện
Vector biểu hiện gen (expression vector) là những vector tách dòng mang
các promoter mạnh, cho phép biểu hiện đồng thời cả gen chỉ thị và gen tách
dòng tạo nên các protein lai [4].

Hình 1.12: Vector biểu hiện

Vector biểu hiện mạnh là các vector có các đặc điểm:
 Có khả năng tạo số lượng lớn bản sao trong tế bào chủ
 Promoter hoạt động mạnh
 Dịch mã tạo nhiều protein lai
 Đoạn trình tự MCS (Multiple cloning site) có nhiều vị trí
cắt đặc hiệu của nhiều loại enzym giới hạn
 Vector vẫn giữ được hoạt tính khi cài gắn gen tách dòng

có kích thước lớn

×